MXPA00002622A - Preparado farmaceutico que contiene factores individuales dependientes de la vitamina k - Google Patents

Abstract

Se describe un preparado de complejo de protrombina farmacéuticamente separado, que cuando menos contiene dos factores sanguíneos individuales dependientes de vitamina K, altamente purificados.

Description

PREPARADO FARMACÉUTICO QUE CONTIENE FACTORES INDIVIDUALES DEPENDIENTES DE LA VITAMINA K Campo de la Invención La invención se refiere a un preparado farmacéutico que contiene factores individuales que dependen de la vitamina K . Antecedentes de la Invención Las proteínas que dependen de la vitamina K se caracterizan porque para su biosintesis requieren de forma esencial a la vitamina K. Así por ejemplo la protrombina (factor II) , que se forma por el efecto de los antagonistas de vitamina , contrariamente a la protrombina normal, no se enlazan con CaY La protrombina normal contiene en el extremo terminal N ?-carboxiglutamato, también un segundo grupo carboxilo en el radical glutamato . En el transcurso de la biogénesis de protrombina funcional se carboxilan en la región terminal en amino de la proteína los diez primeros radicales de glutamato de un sistema enzimático dependiente de la vitamina K, dando ?-carboxiglutamato. Este grupo ? carboxiglutamato es un quelante para los iones de calcio. A través de esos iones de Ca2* ligados se liga la protrombina a las membranas de fosfolípidos, que se originan en las membranas celulares, por ejemplo de los glóbulos rojos, para obtener así la topología correcta para iniciar la coagulación sanguínea. REF. : 33048 No solo la protrombina posee radicales de ?-carboxiglutamato, sino también los factores de coagulación VII, IX y X son carboxilados en radicales glutamato específicos, para así formar una alta afinidad frente a los iones de calcio. Pero también otras de las proteínas que participan en la cascada de coagulación, como por ejemplo la proteína C, proteína S y la proteína Z requieren a la vitamina K para su biosintesis. Los factores individuales que dependen de la vitamina K, en especial los factores II, VII, IX y X. presentan propiedades físico-químicas similares, como por ejemplo pesos moleculares similares, pl; movilidad electroforética, etc., y por lo tanto se obtienen conjuntamente en forma de complejo de protrombina (otra denominación: complejo de factor IX o PPSB) . Debido a las características similares de lae proteínas, es difícil preparar individualmente los factores . La preparación de preparados de complejo de protrombina con el aislado simultaneo de todos los factores obtenidos fue por lo tanto preferido en el estado de la técnica frente a la preparación de concentrados de factores sanguíneos en la producción de preparados farmacéuticos (ver Brummelhuis en: Methods of Plasma Protein Fractionation, ed. Curling, 1980, Academic Press, páginas 117-128) . Se mostró también que los factores de complejos de proteína debido a su diferente estabilidad o vida medida, nunca pueden obtenerse en proporciones fisiológicas (cada vez l de la proteína) (ver Müller et al., Krankenhauspharmazie 13 (11), (1992), 528-531; Kóhler et al . , Thro bosis Research 60 (1990) , páginas 63-70) . En EP-A-O 700 684 se describe un concentrado de complejo de protrombina junto con cuando menos otro componente promotor de la coagulación sanguínea como antídoto para los coagulantes sanguíneos . Existe el peligro de que los concentrados de complejo de protrombina debido a su purificación a partir de mezclas proteínicas complejas, contengan factores de coagulación activados que en su mayoría son proteasas de serina activas . Algunos pacientes no deben coagular ya que podría ser fatal la formación de trombosis. Aun cuando solo estén presentes solo huellas de esos factores de coagulación activados, en especial trombina, en un preparado de ese tipo, se llega a la inactivación proteolítica de los factores individuales, que dependiendo de la estabilidad individual de los factores individuales puede tener consecuencias agravantes. En general los concentrados de complejos de protrombina tienden a la inestabilidad y no son adecuados para el almacenamiento prolongado. Estas reacciones de degradación en especial por medio de trombina se presentan incluso en estado solido, esto quiere decir que también el secado o la liofilización de los preparados no conduce a una estabilidad al almacenamiento confiable. Además los concentrados de complejo de protrombina debido a sus proporciones relativas de los factores individuales obtenidos son extremadamente poco flexibles . No hay posibilidades de modificar esas proporciones relativas en el transcurso de la purificación del complejo de protrombina, que sobre todo es desventajoso cuando en determinados factores se desea un complejo de protrombina enriquecido . Descripción Detallada de la Invención La tarea de la presente invención es por lo tanto proporcionar preparados de combinación farmacéuticos de proteínas dependientes de vitamina K, cuya composición es o puede ser definida exactamente, presenten una alta estabilidad, en esencial en almacenamientos prolongados, y que tengan una alta flexibilidad en la variación de su composición . Esta tarea se resuelve de acuerdo con la invención por medio de un preparado de complejo de protrombina farmacéuticamente separado que contiene cuando menos dos factores individuales dependientes de vitamina K cromatográficamente purificados, como substancias activas. Sobre todo la preparación de acuerdo con la invención debe contener factor IX altamente purificado en combinación con cuando menos otro factor individual dependiente de vitamina K altamente purificado. Contrariamente al estado de la técnica en el cual el complejo de protrombina siempre se purifica como complejo y no se preparó por medio de la combinación de factores individuales y además en el mejor de los casos se encuentra solo con una pureza intermedia, mas bien moderada, la presente invención propone un preparado el cual contiene factores sanguíneos individuales en una forma altamente purificada, que está libre de impurezas problemáticas, en especial de actividad de trombina. En especial los factores individuales a combinar de acuerdo con la invención, se purifican por medio de procedimientos de purificación cromatográficos, como por ejemplo cromatografía por intercambio de iones, cromatografía hidrófoba, cromatografía de afinidad y/o cromatografía de exclusión molecular, a partir de plasma o células recombinantes. Así pueden obtenerse para la mayoría de los factores individuales dependientes de la vitamina , sendas actividades específicas de cuando menos 50% de la pureza teórica, preferentemente cuando menos 70%, en especial cuando menos 90%, hasta una pureza teórica para los factores individuales. Correspondientemente, también se prefiere utilizar factores que en lo esencial estén libres de productos de desnaturalización (<. 5%) . En la preparación farmacéutica de preparaciones de proteínas de la coagulación sanguínea, por lo regular se utilizan tres grados de pureza diferentes; bajo, intermedio y alto. Tabla 1 vida media in pureza teórica vivo Factor II 60 h 0.1 U/mg factor VII 2-2.5 h 2000 (1667-2500) Factor IX 18-4 h 250 (200 - 333) Factor X 40 h 118 (100-143) En especial al determinar la actividad del factor II debido a la presencia de huellas del factor lia siempre se obtienen resultados erróneos, ya que solo huellas del factor lia trastornar la determinación de la concentración del factor II de tal forma que pueden determinarse valores varias veces mayores a la pureza teórica. En el factor VII por esto son los valores algo menores frente a otros factores, ya que el factor VII y es una proteína muy lábil, que se transforma extremadamente rápido a factor Vlla. Por esto ya una preparación de factor VII que presente mas del 10% de la pureza teórica, se considera como altamente pura. El preparado de acuerdo con la invención en especial en vista de su actividad o grado de pureza se compone de preparaciones de factores individuales exactamente definidas, puede ajustarse la proporción de los factores individuales entre si de manera óptima. Así pueden evitarse anticipadamente los problemas, que se dan en el estado de la técnica, en el transcurso de la psst-elaboración de los concentrados de complejos de proteínas enteras, por ejemplo por medio de la perdida de actividad durante la inactivación viral, pero también por medio de procesos que se presentan en el transcurso del procedimiento de purificación, ya que después de la purificación de los factores individuales altamente purificados a un preparado de acuerdo con la invención, preferentemente ya no se realizan otros pasos de elaboración. El preparado de acuerdo con la invención presenta también la ventaja de la capacidad de estandarización. Por medio de la cual se garantiza que los factores individuales en cuestión mantienen la concentración dada en el preparado +/- un 10% de variación. Los factores individuales preferidos se seleccionan de acuerdo con la invención, del grupo consistente del factor II, factor VII, factor IX, factor X, proteína C, proteína S y proteína Z . Los métodos de preparación preferido para los preparados altamente purificados de esas proteínas se encuentran por ejemplo en EP 0 796 623 (factores II y X) , A 594/97 (factor VII) , la EP 0 496 725 (factor IX) , la EP O 533 209 (proteína C) y la EP 0 406 216 (proteína S) . En el preparado de acuerdo con la invención se agregan cuando menos los factores II, VII, IX y X a partir de factores individuales altamente purificados, agregándose además eventualmente los factores individuales altamente purificados, proteína C, proteína S y/o proteína Z, para poder prepara un complejo de protrombina lo mas fisiológico posible, esto es un complejo de protrombina que corresponda en su composición al fisiológico, no solo sin las proteínas adicionales problemáticas, que en el trascurso de la purificación del complejo de protrombina surgen del plasma, como por ejemplo trombina. Los factores individuales, pueden ser purificados a partir de plasma, en especial plasma humano o pueden preparase de forma recombinante . Ya que en la preparación por medio de tecnología de ADN recombinante no se requiere una separación de los factores estructural y fisioquímicamente muy similares, el preparado de acuerdo con la invención se compone preferentemente de factores individuales recombinantes altamente purificados. El factor puede prepararse también transgénicamente; puede ser un derivado, en especial un péptido y/o un fragmento. Los factores individuales dependientes de vitamina K, factor II, factor VII, factor IX, factor X, proteína S y C se clonaron y secuenciaron, y su representación se describe por ejemplo en Fal ner et al., Thrombosis and Haemostasis 68 (2) (1992) , páginas 119-124. para proteínas dependientes de vitamina K. De acuerdo con la invención las proporciones relativas de los factores individuales altamente purificados pueden ajustarse fácilmente y con la relación deseada entre si en el preparado, por ejemplo en proporciones las cuales corresponden a las proporciones naturales en la sangre, también aproximadamente que por unidad del factor, hay una unidad del otro factor. Un preparado preferido de acuerdo con la presente invención tiene así los factores individuales altamente purificados, factor II, factor VII, factor IX y factor X en una proporción relativa; en relación a las unidades internacionales de (0.5 a 2): (0.5 a 2) : 0.5 a 2) : (0.5 a 2) . Están presentes en el preparado también la proteína C, la proteína S y/o la proteína Z, así los factores individuales presentan de manera mas preferida proporciones preferidas de 0.5 a 2. Por otro lado de acuerdo con la invención también es posible, ajustar loe factores individualee en razón a sus estabilidades relativas, en especial en relación a sus valores de vida media relativos, esto es que de un factor menos estable se provee mas y de un factor estable, correspondientemente menos . Así puede ponderarse la duración prevista del uso o el efecto, esto es entre mayor sea la duración, mayor deberán ser las proporciones relativas. También las proteínas recombinantes con por ejemplo o diferentes vidas medias pueden estandarizarse de manera correspondiente. También otros factores como por ejemplo la recuperación in vivo, pueden considerarse en la estandarización de los factores. Un preparado preferido a eete reepecto abarca por lo tanto los factores individuales factor II, factor VII, factor IX y factor X en una proporción relativa, en relación a las unidades internacionales de (0.5 a 2):(5 a 35) : (0.5 a 7) : (0.5 a 5), que los tiempos de vida medios del factor IX es de 20 horas y del factor X 40 horas. Un preparado preferido con esos factores contiene por lo tanto los factores individuales, factor II, factor VII, factor IX, factor X, proteína C y proteína S en una proporción relativa, en relaciona las unidades internacionales de (0.5 a 2) : (5 a 35) : (0.5 a 7) : (0.5 a 5) : (l a 15) : (1 a 15) . Ya que el factor II es estabilizado de esos factores y que en su forma activa de trombina porta el mayor riesgo de eetabilidad, ee una preparación preferida que no contiene protrombina. El factor VII se considera como muy inestable y por lo tanto se prevé en forma mas preferida en el preparado de acuerdo con la invención en una medida aumentada, por ejemplo en una concentración de diez veces (en relación a las unidades internacionales) . Un preparado especialmente preferido contiene así el factor individual VII y el factor individual II en una proporción mayor a 10:1. Preferentemente con el presente preparado se provee un complejo de protrombina o un complejo de protrombina parcial de factores individuales altamente purificados. Si embargo es preferido que los factores individuales en el preparado no formen complejos. Esto puede mostrarse por ejemplo por medio de cromatografías de intercambio de iones analítica sobre Q-Sepharose (Pharmacia) , pudiendo ser eluidos discretamente por elución con gradientes de sal, los factores individuales. Contrariamente a esto los complejos se encuentran como en la protrombinasa o en la proprotombinasa. La protrombinasa es un complejo de substrato enzimático, que se forma en una superficie de fosfolípido y permite la activación de la protrombina. La protrombinasa consiste de acuerdo con la definición del factor II (protrombina) , el factor X (factor Xa) , el cofactor V o Va, fosfolípidos y iones de calcio. Esos factores se encuentran in vivo como complejos transitorioe para la activación de la protrombina y la formación de la trombina. Una pro-protombinaea correspondiente se define como complejo de factores; que por lo menos parcialmente se encuentran modificados o activados para la formación de protrombinasa. La pro-protrombinasa por lo tanto debe coneiderarse como un precursor de la protrombinasa y como complejo, en el cual se encuentran uno o varios de los componentes en forma de sus precursores, como zimogenes o como proformas y que se forma debido a las afinidades de los componentes entre ei. Por razones de estabilidad es ventajoso, evitar la presencia de cualquier factor de coagulación activado en el preparado de acuerdo con la invención. Una forma de realización preferida por lo tanto se caracteriza porque el preparado no contiene factores de coagulación activados, en especial factores lia, IXa, Xa y eventualmente Vlla. Los preparados preferidos de acuerdo con la invención contienen menos de 0.1 U de factor VIII :C o factor VlII:Ag/mg proteína y/ menos de 0.1 U factor IIA/unidad de protrombina y/o menos de 0.1 U de factor Xa/unidad de factor X. Para conservar la excelente estabilidad del preparado de acuerdo con la invención, lo mas posible, es ventajoso el preparar la preparación de acuerdo con la invención en forma liofilizada. Así es posible, el almacenar el preparado de acuerdo con la invención durante períodos muy prolongados sih limitaciones y a pesar de eso reconstituirlo como liofilizado en el transcurso de un período corto en una solución lista para usarse. Correspondiendo a otra forma de realización preferida, la preparación de acuerdo con la invención contiene además iones de magnesio. Esos iones compiten con los iones de calcio y pueden eliminar a los iones de calcio sobre todo en los complejos de protrombina completos o parciales . Así se evita en gran medida la formación de trombina prematura en una solución de la preparación de acuerdo con la invención y con esto se eetabiliza de tal forma que permanece estable hasta en solución acuosa durante muchas horas . Se ha determinado que la preparación farmacéutica de acuerdo con la invención puede prepararse también como solución de infusión estable, sobe todo cuando se-- haya garantizado que no contiene iones de calcio libres. El contenido de iones de calcio libres puede determinarse fácilmente por medio de métodos de titulación de iones conocidos y otros métodos analíticos. Para complejar los iones de calcio son adecuados por ejemplo formadores de quelato farmacéuticamente aceptables, preferentemente EDTA, y substancias relacionadas como citratos . Preferentemente el preparado de acuerdo con la invención contiene además antitrombina III en cantidades en las cuales se había utilizado en concentrados de complejos de protrombina como estabilizantes, eventualmente junto con heparina. Aunque esas medidas debido al alto grado de pureza de los factores individuales no parecen necesariae, pueden considerarse ventajosas por razones farmacéuticas o por los requisitos de las farmacopeae y otras indicacionee, consideran los concentrados de complejos de protrombina de acuerdo con el estado de la técnica. En otra forma de realización preferida, la preparación esta libre de albúmina y/o estabilizadores como en especial antitrombina III y/o heparina. En especial el preparado de acuerdo con la invención esta también libre de fosfolípidos . El preparado farmacéutico de acuerdo con la invención de acuerdo con una forma de realización preferida, se trata para la inactivación de virus infecciosos y otros agentes infecciosos . Este tratamiento para la inactivación viral se garantiza preferentemente por medio de un tratamiento con tensoactivos y/o térmico, por ejemplo por medio de un tratamiento térmico en estado solido, en especial un tratamiento con vapor de acuerdo con EP-0 159 311, EP-0 519 901 O EP-0 674 531. Otros tratamientos para la inactivación de virus abarcan también el tratamiento con métodos químicos o químico/físicos, por ejemplo con materiales caotropicos de acuerdo con W094/13329, DE 44 34 538 o EP-0 131 740 (solvente) o la fotoinactivación.

La nanofil ración o la nanofiltración con amplificación de anticuerpos (ver PCT/AT97/00075) representa igualmente un procedimiento preferido para la reducción de virus en el marco de la presente invención. Preferentemente el preparado de acuerdo con la invención contiene además substancias amortiguadoras o estábilzadoras farmacéuticamente aceptables, por ejemplo las substancias provistas en la farmacopea para concentrados de complejos de protrombina.

Una variante especialmente preferida para garantizar la ausencia de virus en el producto de acuerdo con la invención, consiste en que esta conformado de factores individuales altamente purificados dependientes de la vitamina K, que por un lado ya están viralmente inactivados y que eventualmente han sido liberados de los productos de desnaturalización formados y de estabilizadores, de tal forma que pueden estar en forma viralmente inactiva y a pesar de todo en una forma exactamente definida en relaciona a su actividad. Ya que sobre todo en el caso de procedimientos de inactivación viral térmicos pueden presentarse procesos de inactivación parciales de los factores de protrombina, que dependiendo de la estabilidad de los factores individuales pueden conducir a diferentes rendimientos y actividades específicae deepuée de la realización del tratamiento térmico de los preparados de complejo de protrombina; una forma de realización del procedimiento de acuerdo con la invención, permite ajustar las proporciones en la mezcla de factores individuales de tal forma que después de realizar el tratamiento térmico los factores se encuentran en lae proporcionee deeeadas entre si. Cuando por ejemplo se eabe que el tratamiento térmico de la protrombina no esta asociado a una perdida de actividad, mientras que en el preparado de combinación , los factores contenidos, factor X y factor IX son inactivados en un 20%, puede ajustarse un "complejo" mezclado con virus inactivados térmicamente, en el cual ee combinan loe factores II, IX y X en una proporción de actividad de 1:1.25:1.25. Después de ese ajuste de las proporciones puede realizarse la inactivación viral, y de esto reeulta directamente un preparado que contiene esos factores en proporciones 1:1:1. El factor X se utiliza preferentemente en su forma y/o ß. También es objeto de la presente invención un preparado diagnostico el cual este conformado de acuerdo con la invención de factores individuales dependientes de vitamina K, altamente purificados. También para el diagnoetico es ventajosa la capacidad de definición de la variabilidad de las proporcionee de concentración y la estabilidad. El preparado farmacéutico de acuerdo con la invención puede utilizarse obviamente para todas las indicaciones existentes del complejo de protrombina. Por lo tanto también es objeto de la presente invención el uso del preparado de acuerdo con la invención para la producir una preparación para el tratamiento de problemas de coagulación sanguínea adquiridos o heredadoe, para el tratamiento de fuertes hemorragias, para la "profilaxis de hemorragias, en especial por la presencia de problemas de coagulación sanguínea hereditarioe, para la terapia de substitución y para el tratamiento de hemofilia B. También se indica el preparado de acuerdo con la invención en el caso de problemas del funcionamiento hepático. Para la administración en pacientes debe partirse en la dosificación de los regímenes de administración existentes, siendo ein embargo ventajoso la definición exacta de los preparados de acuerdo con la invención. La presente invención se explicara con la ayuda de los siguientes ejemplos a los cuales sin embargo no se debe limitar. Ejemplos : Ejemplo 1: Producción de preparaciones de factores individuales 1.1 Producción de preparaciones de factores individuales de factor plasmático X y de factor plasmático II: La preparación de factores de complejo de protrombina liofilizados, que contienen los factoree II. IX, X así como la proteína C y S se preparó de acuerdo con el método de Brummelhuis, H.G.J., Preparation of the Prothrombincomplex . In: Methods of Plasma Protein Fractionation, Curling, J.M. ed. 117-128, Academic Press, Nueva York (1980) , y se trata térmicamente de acuerdo con EP 159 311 para la inactivación viral. Correspondientemente el liofilizado (1000 U factor X/g, 1200 U factor Il/g) se dieuelve en agua deetilada, de tal forma que contenía 50000 U de factor X/l, y ee ajueto a un pH de 7.0. Deepuée de la adición de 12% (v/v) TWEEN®' 80 ee agito durante 1 hora a la temperatura ambiente . Subsecuentemente se diluyo con una eolución de amortiguador de Tris-HCl 20 mM, pH 7.0, a 1:5 y la fracción de proteína de complejo de protrombina se adsorbió en fosfato de calcio (Ca3(P04)2) en una concentración de 30 g de Ca3(P04). por litro de solución de complejo de protrombina por medio de agitación durante 1 hora a la temperatura ambiente. A continuación se separó la faee eolida por medio de centrifugación, 20 minutoe a 500 rpm, y el precipitado se lavó dos veces con amortiguador de Tris-HCl 20 mM, pH 7.0 que contenía 10% de sulfato de amonio, por medio de resuspeneión y repetida centrifugación. Un tercer lavado ee realizó de manera análoga con amortiguador Tris-HCl 20 mM, pH 7.0, que contenía NaCl 150 mM. La elución de la fracción de complejo de protrombina se realizó con solución de fosfato de sodio ÍM, pH 7.0, agitando 25 ml de esa solución por g de fosfato de calcio durante 1 hora a la temperatura ambiente y subsecuentemente el precipitado formado se separó por medio de centrifugación como se describe antes. El residuo se sometió subsecuentemente a una precipitación en sulfato de amonio con 366 g de sulfato de amonio por litro, durante 15 horas a 4°C. El precipitado que contenía la fracción de complejo de protrombina, se centrífugo como se describe antes . El precipitado ee tomo en un amortiguador de clorhidrato de benzamidina 1 mM, pH 6.0, y se liberó del amortiguador en una columna rellena con Sephadex® G-25, a 5°C con un flujo lineal de l cm/min frente a amortiguador de dihidrato de citrato trisódico 25 mM, que contenía 100 mM de NaCl y 1 mM de clorhidrato de benzamidina, pH 6.0, para eeparar el sulfato de amonio. Aquí se midió en la corriente de eluato la absorción UV a 280 nm y la conductividad eléctrica. Las fracciones que contenían proteína se purificaron y subeecuentemente se sometieron a una cromatografía de intercambio de iones sobre DEAE-Sepharose FF®, Firma Pharmacia. Las fracciones se transfirieron a una columna (diámetro interno: altura del lecho de gel = 1:1.3) con un volumen de gel de 8.2 litros, 0.55 g de proteína/1 gel, a un flujo lineal de 0.36 cm/min. La cromatografía se realizó a 22°C. Antes de la transferencia, la columna se equilibró con un amortiguador de dihidrato de citrato trisódico, que contenía 100 mM NaCl, clorhidrato de benzamidina 1 mM, pH 6.0. La elución de las fracciones de proteína se realizó en varias etapas con un amortiguador 1 (dihidrato de citrato trisódico 25 mM, clorhidrato de benzamidina lmM, NaCl 245 mM, pH 6.0). Amortiguador 2 (dihidrato de citrato trisódico 25 mM, clorhidrato de benzamidina lmM, NaCl 270 mM, pH 6.0) y un amortiguador 3 (dihidrato de citrato trisódico 25 mM, clorhidrato de benzamidina lmM, NaCl 400 mM, pH 6.0) . La elución con amortiguador l se realizó con 2.4 volúmenes de columna, con esto se separaron las proteínas inertes . La elución se realizó con 5.6 volúmenes de columna con el amortiguador 2, colectándose aquí las fracciones, analizándose el contenido del factor II, el factor X, la proteína C y el factor IX. Las fracciones que contenían al factor X, que estaban libres de factor II, IX y proteína C se purificaron. Esa preparación de factor X altamente purificada presento una actividad específica de 60 U/mg de proteína. Por medio de la elución con amortiguador 3 (1.9 volúmenes de columna) se desorbio el factor II, volviéndose a colectar las fracciones y analizándose el contenido de factor X, factor IX y factor II. Las fracciones que contenían al factor II se reúnen. La reserva obtenida tanto de factor II, como también del factor X pudo someterse eventualmente por medio de la adición de KSCN ÍM e incubación a 22 °C durante varias horas y un tratamiento adicional para la inactivación de impurezas patógenas . La reserva de factor II así obtenida por medio de la adición de cloruro de sodio se ajusto a NaCl 1.8 M y el valor de pH se corrigió a 7.0. Esa solución se absorbió subsecuentemente por medio de interacción hidrófoba en un gel, Phenylsepharose High Perfomance®, firma Pharmacia, ligándose 3 g de proteína /l gel. En una columna con una proporción entre diámetro interior: altura del lecho de gel = 1:1.9 a un flujo lineal de 0.25 cm/min se adsorbió la fracción de proteínas y subsecuentemente se liberó de la proteína inerte por medio de lavado con un amortiguador (25 mM Tris-HCl, 3M NaCl, pH 7.4) . Por medio de elución de gradientes con 11.5 volúmenes de columna de NaCl 3M-0.9 M bajo la colección simultanea de fracciones, se eluyó el factor II de la columna, reuniéndose aquellae fracciones que presentaban actividad de factor II, pero que eran libres de factor X y factor IX. Esas fracciones de factor II recolectadae ee concentraron diez veces subeecuentemente por medio de ultra-/diafiltración a través de una membrana de ultrafiltración con un corte de 30 kD, y se liberó del amortiguador frente a un amortiguador que contenía 4g de dihidrato de citrato trieódico/ 1, 8 g NaCl/1, pH 7.0. Una preparación de factor II así producida presenta una actividad específica de 6.9 U/mg de proteína. La determinación de la actividad factor II se realizó con el método de i etapa, en base al tiempo de tromboplastina, utilizando un plasma con carencia de factor II frente al estadar internacional de factor II utilizando la combinación de reac ivoe de IMMUNO, Viena. Otroe factores de coagulación solo pudieron determinarse en huellas en ios análisie de coagulación o no pudieron determinarse (factor VII < 0.00002 U/U factor II, factor IX 0.0002 U/U factor II, factor X 0.004 U/U factor II, proteína C 0.003 U/U factor II y factor VIII < 0.0002 U/U factor II). Como procedimiento de preparación alternativa para un factor II altamente purificado, se utilizó también un procedimiento en el cual a partir de un preparado de factores de complejo de protrombina liofilizado por medio de cromatografía hidrófoba primero se separa el factor IX, a continuación se aisla el factor II y este luego se purifica altamente por medio de cromatografía en hidroxilapatita. La preparación de factores de complejo de protrombina se disuelve como antes se describe y con detergentes se incubó durante 1 hora a la temperatura ambiente. A continuación por medio de cromatografía por intercambio de iones sobre DEAE-Sepharose FF®, Firma Pharmacia, ee aisló una fracción que contenía factor II, IX y X. De esta por medio de interacción con Butyl-Toyopearl®, firma Toso Haas, se separó la fracción que contenía al factor IX. El residuo de adsorción se purificó por medio de posterior cromatografía de interacción hidrófoba sobre Phenylsepharose High Perfomance®, firma Pharmacia, con lo cual pudieron absorberee aproximadamente 4 g de proteína/1 gel. En una columna con una proporción diámetro interno :_ altura del lecho de gel = 1:1.9 se absorbió la fracción de proteína a un flujo lineal de 0.25 cm/min, a continuación por medio de lavado con 20 mM Tris-HCl 2M NaCl, pH 7., 4, se retiro la proteína inerte y finalmente por medio de elución escalonada se aisló la fracción que contenía el factor II, que se desorbio al reducirse la conductividad en NaCl 1.9 M. La fracción que contenía el factor II se adsorbió directamente en Ceramik-Hydroxilapatit®, firma Biorad. Esto se realizó en una columna con una proporción diámetro interior: altura del lecho de gel = 1:4.8. La elución se realizó a un flujo lineal de 3 cm/min. Por medio de la elución con un gradiente salino pudo desorberee el factor II de la columna. Las fracciones que contenían al factor II se colectaron y se concentraron por medio de ultra- (diafiltración a través de membranas de polisulfonas con un corte de 30 kB hasta una concentración de factor II de 50-100 U/ml . Una preparación de factor II así preparada presenta una actividad específica de cuando menos 7 U/mg proteína. Otros factores de coagulación, en especial el factor IX y el factor VIII, solo pudieron determinarse en huellae o no pudieron determinarse . Por medio de la selección de un amortiguador de diafiltración adecuado se transfirió la preparación del factor II en un amortiguador farmacéuticamente aceptable (por ejemplo 4 g de dihidrato de citrato trisódico/ 1, 8 g NaCl/1, pH 7.0). 1.2 Obtención de factor VII plasmático: 30 ml de plasma de citrato humana recién congelada se descongelaron a de 0 a 4°C el crioprecipitado se separó por medio de centrifugación a +2°C. El "crioresiduo" resultante se mezclo con 2 IU heparina/ml. Despuée las proteínas del complejo de protrombina se adsorbieron con DEAE-Sepharose FF®, Firma Pharmacia, en una concentración de 0.5 mg/ml. El complejo de gel-proteína se separó de la solución y se lavó con un amortiguador 1 (4 g/1 Na3 citrato.H_0, 7 g/1 NaCl , 9 g/1 Na2HP04.2H20, 500 IU heparina/1, pH 7.5) y finalmente con amortiguador 2 (4 g/1 Na3 citrato.H20, 7 g/1 NaCl, 9 g/1 Na_HP04.2H20, 500 IU heparina/1, pH 7.5) . Así se separó la fracción de complejo de protrombina que contiene los factores de coagulación protrombina, se separaron fracciones reducidas de factor VII, factor IX y factor X. La parte principal del factor de coagulación VII que permaneció en el residuo después de la adsorción en DEAE-Sephadex® A50, se obtuvo ahora por medio de adsorbción en el hidróxido de aluminio. Así se agregaron por 1 1 de residuo después de la separación del complejo de protrombina, 10 ml de una suspensión al 2% de hidrogel de aluminio y se agito durante 30 minutos a 4°C. A continuación se separa por medio de centrifugación a 500 rpm durante 10 minutos a aproximadamente 4°C en un rotor Sorval RC3B H6000A el complejo de proteína de hidróxido de aluminio, el residuo se desecho y el precipitado se suspendió con 3.5% del volumen del residuo del complejo de protrombina utilizado para la adsorción en una solución de 4 g de Na3citrato .2H20/1 y 7 g NaCl/1, pH 7.5, y se agito durante 30 minutos. Aeí ee desorbio la proteína inerte del hidróxido de aluminio. El factor VII que permaneció en el hidróxido de aluminio se formo en pelets por medio de repetida centrifugación como se describe antes. El residuo se desecho y el precipitado se utilizó para la posterior elaboración. Para la deeorción de la fracción de proteína el complejo de hidróxido de aluminio-factor VII con se agito 1% en vol del residuo de complejo de protrombina utilizado para la adsorción de un 0.3 mol/1 amortiguador de fosfato, pH 8.6 (53.4 g Na_HP04.2H20/1 ajustado con una solución de 41.1 g NaH2P04H20/L a un pH de 8.6) que contenía 1% de TWEEN®-80, durante 30 minutos. A continuación para la inactivación de patógenos se agrego detergente TWEEN®-80,a una concentración final de 15% y finalmente se agito durante 1 hora a 40°C. Despuée de enfriar la eolución a 22 °C se desamortiguo una alícuota de 20 ml sobre Sephadex® G-50 (firma Pharmacia) por medio de cromatografía de columna frente a una solución de 4 g de 4 g de Na3citrato.2H20, pH 7.4 y se diluyo con la misma solución 10 veces. La eolución total ee vertió en una columna que había eido empacada con heparinsefarosa C6B (firma Pharmacia) , con un diámetro de 16 mm y una altura de 10 cm. La tasa de flujo fue de l ml/min. A continuación se eluyó con un gradiente de sal de 0-1 M NaCl en una solución de 4g de Na3citrato.2H20/l, pH 7.4, con 10 veces el volumen de columna. La fracción de proteína se cuantificó por medio de medición de la absorción UV a 280 nm. Simultáneamente se colectaron las fracciones y determinaron en este factor VII con una prueba cromogena de factor VII (factor inmunocrómico VII: 10, IMMUNO AG, Viena) . Las fracciones de las proteínas eluidas, que contenían al factor VIII, se colectaron y purificaron. El volumen de elución de la fracción del factor VII fue de 25 ml . En la fracción de proteína se determinó el contenido de proteínas de acuerdo con el método de Bradford, M.M. (Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976) factor VII, como se describió antes. Igualmente se determinó cuantitativamente el factor Vlla de acuerdo con el método de US 683282. De esto pudo determinarse que la fracción de factor VII eluyente presentan una actividad específica de 98 unidadee/mg de proteína, mientras que el contenido de factor Vlla se encontró por debajo de una unidad/ml . Correpsondientemente pudo obtenerse una preparación de factor VII altamente purificado sin activación esencial del factor Vil. Los rendimientos en la cromatografía fue mayor a 50%. 1.3 Factor plasmático IX 150 ml de complejo de protrombina se purificaron previamente por medio de sulfato de dextrano (Milelich et al.

Analytical Biochemistry 105, 304, (1980)). 20 ml de eluato (912 I.U. factor IX, 160 U:I. factor X) se vierten en una columna con 20 ml de un polímero de agarosa con grupos octilo (0ctyl-Sepharose-CL-4B (Pharmacia, Suecia) ) con una tasa de fluo de 360 ml/h. La columna se equilibró previamente con 80 ml de amortiguador A. Después de lavar el gel cargado con 120 ml de amortiguador A se eluyó la fracción que contenía factor IX con 80 ml de una solución de NaCl 250 mmolar. El rendimiento de factor IX fue del 54% de la actividad inicial. La actividad específica fue de 186 U:I: factor IX/mg proteína. El factor X solo estaba presente en huellas . 1.4 Obtención de proteína C plasmática Proteína C altamente pura se obtuvo a partir de una fracción C de proteína cruda, que se había preparado a partir de concentrado de complejo de protrombina comercial . La purificación se realizó por medio de cromatografía de afinidad por medio de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales anti proteína C, se preparan de la siguiente manera: Ratones BALB/C se inmunizan por medio de inyección intraperitoneal con una diferencia de dos semanas con 100 µg de proteína C humana. Después de seis semanas se inyectaron otra vez 50 µg de la proteína C humana y tres días deepués se realizó la fueión. La familia celular de mieloma (P3-X-63-AG8-653 , 1.5 x 107 célulae) se mezclaron con 1.7 xlO8 células del bazo de un ratón, y se realizó la fusión de acuerdo con el método modificado de Kóhler y Milstein utilizando PEG 1500 (Kóhler G., Milstein C, Nature 256 (1975) , 495-497) . Loe clones positivos analizados por medio de ELISA, ee eubclonaron dos veces . La producción de ascitos se realizó por medio de la inyección de 5 xlO6 células de hibridoma por ratón BALB/C dos semanas después del tratamiento con pristan. La inmunoglobulina se purificó de los ascitos por medio de precipitación en sulfato de amonio y posterior cromatografía por medio de QAE-Sephadex y subsecuente cromatografía en Sephadex G200. Para reducir el riesgo de la transmieión de virus de murina, se sometieron los anticuerpos antes de la inmovilización, todavía a un paso de inactivación de virus. Los anticuerpos monoclonales así obtenidos contra la proteína C se acoplaron en CNBR Sepharose 4B (Pharmacia) . Para la purificación de la proteína C por medio de cromatografía de afinidad se utilizó el siguiente amortiguador: Como amortiguador de adsorción: Tris 20 Mm, EDTA 2 MM, ?aCl 0.25M y benzamidina 5 mM; como amortiguador de lavado se utilizó: Tris 20mM, ?aCl ÍM, bezimidina 2mM, EDTA 2 mM; el valor de pH fue 7.4: como amortiguador de elución se utilizó: ?aSC? 3 M, Tris 2OMM, ?aCl ÍM, benzi idina 0.5 mM, EDTA 2 mM. Otro anticuerpo monoclonal adecuado para ia purificación de proteína C se describe en US 5,336,610. Ese anticuerpo se liga al péptido de activación de la proteína C y por lo tanto es adecuado para purificar a la proteína C zimogénica selectivamente de la forma activa. En particular: el concentrado de complejo de protrombina se disolvió en el amortiguador de adsorbcion, en donde se utilizaron aproximadamente 10 g del concentrado de complejo de protrombina se utilizaron para 20 ml de columna de anticuerpos monoclonales . A continuación ee filtró el concentrado de complejo de protrombina dieuelto, ee centrífugo a 20 000 rpm durante 15 minutos y se filtró estéril a través de un filtro de 0.87 µm. El concentrado de complejo de protrombina filtrado estéril y disuelto se vertió en una columna con una tasa de flujo de 10 ml/h. A continuación se lavó la columna con amortiguador de lavado quedando libre de proteínas y finalmente la proteína C ligada se eluyó con el amortiguador de elución a una tasa de flujo de 5 ml/h y las fracciones se recolectaron. La proteína C se dializó frente a un amortiguador (Tris 0.2 M, glicina 0.15 M y EDTA 1 mM, pH 8.3) . El contenido de proteína C se determinó de acuerdo con los antígenoe por medio de los métodos de Laurell y de acuerdo con la actividad según la activación Protac. El eluato de proteína C obtenido se preparó en forma de una preparación aplicable farmacéuticamente de la siguiente manera: El eluato primero se sometió a una etapa de ultrafiltrado y diafilrado. Para el diafiltrado se utilizó un amortiguador con un valor de pH de 7.4, que contenía 150 mM NaCL y 14 mM de citrato trisódico.2H20. El filtrado obtenido se seco por congelación y se inactivo viralmente por medio de in tratamiento con vapor durante una hora a 80°C + 5°C y 1375 ± 35 mbar. El material inactivado viralmente liofilizado se disolvió entonces en una solución de NaCl estéril isotónica y por medio de cromatografía de intercambio de iones en Q-Sepharoee se retiraron los anticuerpos o amiloides de suero P eventualmente preeentes. La solución purificada se concentro por medio de una etapa adicional de ultrafiltración y diafiltración. Después a la solución obtenida se le agregaron 10 albúmina, NaCl 150 mM y citrato trisódico 15 mM. El valor del pH de la solución fue de 7.5 . No se pudo determinar la presencia de la inmunoglobulina de ratón así como de los factores II, VII, IX y X. A continuación se filtró estéril la solución se filtró estéril se envasó y ee liofilizó. La actividad específica fue de 14 unidades de proteína C/mg. Como prueba de actividad se utilizó una prueba amidolítica, en donde se activó la proteína C por medio de Protac (firma Pentapharm) . 1.5 Purificación de proteína S plasmática La proteína S humana ee preparó a partir de concentrado de factor IX (complejo de protrombina STIM-3 IMMUNO AG Viena) por medio de QAE-Sephadex y cromatografía eobre blue Sepharose CL-6B (Pharmacia) de la siguiente forma: El concentrado liofilizado (lOOg) se disolvió en 200 ml de agua estéril libre de iones y se dializó frente a un amortiguador coneistente de 2- (ácido N-morfolinetasulfónico) 0.01M, pH 6.0; NaCl 0.18M, EDTA 10 mM, Benzamidin-HCL 2mM y 0.02% NaN3 (amortiguador inicial) . El material dializado se introdujo entonces sobre una columna QAE-Sephadex (8x19 cm) y se equilibró con el amortiguador mencionado. Como solución de lavado se utilizaron 1.5 1 de amortiguador (amortiguador inicial) . La proteína S se eluyó con 110 ml/h con un gradiente de NaCl lineal, consistente de 1.2 1 de amortiguador inicial y 1.2 1 de otro amortiguador, que se diferencia del primer amortiguador por la adición de NaCl 0.5 M. Las fracciones de proteína S se analizaron en búsqueda de la presencia de proteína S por medio de Fast Flow SDS Page (Pharmacia) y determinación de antígenos (Laurell) , y las fracciones que contenían la proteína S, se colectaron y finalmente ee dializaron frente a un amortiguador, ese amortiguador contenía TRIS-HC1 50 mM, pH 7.4, NaCl 150 mM, 2mM EDTA, 1 M Banzamidin-HCl y 0.2 NaN3. Despuée de la diálisis se vertió el deposito de proteína S sobre una columna de Blue Sepharose CL-6B (2.5 cm x 10.5 cm) y se equilibró con el amortiguador inicial. El lavado se realizó a una velocidad de 15 ml/h con 500 ml de amortiguador inicial. La proteína S pudo así eluirse en un "volumen vacío", mientras que la protrombina se adsorbía en la columna. Las fracciones ricas en proteína S se determinaron otra vez por medio de Fast Flow SDS Page (Pharmacia) y de acuerdo con Laurell (Scand.- J. Clin. Invest. (Suppl.) 29 (1977) 21 (Suppl. 124)). La proteína S así preparada tenía la morfología característica de la proteína S en un SDS-Page reducido, de hecho dos bandas cercanas (doblete) con un peso molecular de aproximadamente 86.000 o 76,000. La concentración de proteína se determinó eepectrofotométricamente con la ayuda de coeficientes de extinción de 0.1 a 280 nm para la proteína humana S, y se comprobó por medio del método de LOWRY (Lowry 0, Rosebrough N. , Frr AL, Randall R., Protein meadurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem. 193 (1951) 265). La proteína S prepurificada así preparada se utilizó para la preparación de antisuero de borrego contra la proteína S, para lo cual se realizaron cuatro inyecciones de inmunización, en donde en las primera dos inyecciones se aplicaron subcutáneamente 100 µg de proteína S con auxiliares de Freund y en las siguientes inyecciones se trabajo con auxiliares incompletos. Despuée de otrae inoculaciones se probo el antisuero por medio de inmunodifueión doble y mostró una precipitación con proteína S purificada y con plasma normal . La fracción IgG de 450 ml de antisuero se obtuvo por medio de precipitación en alcohol y subsecuente adsorbción en Sephadex A 50 en amortiguador de TRIS-HC1, pH 6.8. De los 450 ml de antisuero hubo un residuo de 1.14 g de anti proteína S-IgG. La fracción IgG se acoplo en 450 ml de Sepharose CL-4B, en donde se utilizaron 5.7 mg proteína/ml de Sepharose. El coeficiente de acoplamiento fue de 76%. La columna de anti-proteína S se equilibró con glicina-HCL, pH 3, y amortiguador de adsorbcion, pH 7.5. El amortiguador de adsorción consistió de TRIS 20mM, EDTA 2 mM, NaCl 0.25 M, benzamidina 2mM, 0.02% de Tween® 20 y 0.02% NBaN3 , pH 7.4. La solución amortiguadora de lavado tenía los siguientes contenidos: TRIS 20 mM, EDTA 2mM, NaCl 1.0 M, benzamidina 0.5 mM, 0.01% Tween® 20, 0.02% NaN3 , pH 7.4. El amortiguador de elución se conformo como la solución amortiguadora de lavado, con la variación de que se utilizaron 0.05% de Tween ®20 y adicionalmente 243.3 g ?aSC?, pH 7.4 (una solución de rodanuro 3M) . La solución amortiguadora de diálisis contenía Tris 20 mM, glicina 0.15 mM, EDTA lmM, benzamidina 2mM, pH 8.3. Para la purificación poeterior de la fracción de proteína S, preparada a partir de concentrado de complejo de protrombina se disolvieron lOOg de la fracción en l 1 del amortiguador de adsorbción y se dializaron durante la noche contra una solución amortiguadora de adsorbción. La columna después de la introducción de la muestra con amortiguador de lavado, aprox. 5 1, se lavó para retirar las proteínas, subsecuentemente se realizó la elución con NaSCN 3M en la solución amortiguadora de elución. El eluato se dializó inmediatamente, hasta que SCN se encontró por debajo del limite determinable; el eluato tenía una concentración de 500 µg/ml proteína S. Estaba libre de proteína ligante de C4. Los anticuerpos anti-proteína S monoclonales se prepararon de la siguiente manera: Ratones BALB/C se inmunizan por medio de inyección intraperitoneal con una diferencia de dos semanae con 100 µg de proteína S aeí preparada. Después de seis semanae se inyectaron otra vez 50 µg de la próteína S humana y tres días después se realizó la fusión. La familia celular de mieloma (P3-X-63-AG8-653 , 1.5 x 107 células) se mezclaron con 1.7 xlO8 células del bazo de un ratón, y se realizó la fusión de acuerdo con el método modificado de Kóhler y Milstein utilizando PEG 1500 (Kóhler G., Milstein C, Nature 256 (1975) , 495-497) . Loe clones poeitivos analizados por medio de ELISA, se subclonaron dos veces. La producción de ascitos ee realizó por medio de la inyección de 5 xlO6 células de hibridoma por ratón BALB/C dos semanas después del tratamiento con Pristan. La inmunoglobulina se purificó de los ascitos por medio de precipitación en sulfato de amonio y posterior cromatografía por medio de QAE-Sephadex y subsecuente cromatografía en Sephadex G200. La fracción IgG obtenida de los ascitos y previamente purificada en proteína A-Sepharose, se acopló a Sepharose CL-4B. La purificación por cromatografía de afinidad de la proteína S, que se obtuvo de un concentrado de complejo de protrombina, se realizó bajo las condiciones descritae para los anticuerpos de proteína S policlonales. La concentración de proteína S en el eluato fue de 600 µg/ml. Estaba libre de proteína ligante de C4. Las preparaciones de proteína S altamente purificadae por el método de cromatografía de afinidad policlonal o monoclonal ee sometieron a SDS-Page (gradiente de 8 a 12%) y pudieron claeificarse con la ayuda de teñido de Coomassie (Laemmli UK; Cleavage of structural proteins during the assembly of he head of bacteriophage T4, Nature 227 (1970), 680) con una pureza mayor al 95%. Los eluatos subsecuentemente se sometieron a una etapa de ultrafiltración y diafiltración. Para la diafiltración se utilizó un amortiguador con un valor de pH de 7.4, que contenía 150 mM NaCl y 15 mM de citrato trisódico.2H20. Los filtrados obtenidoe ee secaron por congelación y ee inactivaron viralmente por medio del tratamiento con vapor durante 1 hora a 80°C+5°C y 1375 ±35 mbar (con el fin de eliminar la contaminación viral eventualmente preeente de loe anticuerpos policlonales o monoclonales) . El material liofilizado inactivado viralmente entonces se disolvió en solución isotónica estéril de NaCl y por medio de cromatografía de intercambio de iones en Q-Sepharoee se separó de los anticuerpos o arailoides de suero P eventualmente presentee . La solución purificada se concentro por medio de otra etapa de ultrafiltración y diafiltración. Después se agregaron a -la solución obtenida por litro 10 g de albúmina, NaCl 150 mM y citrato trisódico 15 mM. El valor pH de la solución fue de 7.5. Contenía 300 µg/ml de proteína S : Ese contenido de proteína S correspondiendo a un enriquecimiento de 500 veces en comparación al plaema. La inmunoglobulina de ratón aeí como loe factores II, VII, IX y X no pudieron ser detentador. A continuación la solución se filtró estéril, se envasó y se liofilizó. Ejemplo 2: Preparación farmacéutica de proteínas de vitamina K altamente purificadas Los factores individuales altamente purificados, protrombina, factor VII, factor IX, factor X, proteína C y proteína S, se purificaron de tal forma que se formó una solución que contenía 25000 unidades/1, de los factores individuales en solución acuosa de 4 g de Na3citrato.2H20 y 8 g NaCl/1. La solución se filtró estéril a través de un filtro de nilón con un tasa de retención de 0.2 µm y a continuación se envasaron 20 ml en frascos de vidrio esterilizados con un volumen de 50 ml . A continuación se secaron por congelación bajo condiciones estériles y luego los frascos se cerraron estériles . E emplo 3 : Preparación farmacéutica del complejo de protrotribina: Como se describió en el ejemplo anterior, se preparó el complejo de protrombina altamente purificado que contiene a los factores protrombina, factor VII, factor IX y factor X, pero sin proteína C y S, y se envasó estéril. De acuerdo con las recomendaciones internacionales ee agregaron a la solución antes del envasado, 10000 unidades internacionales de heparina/1. Ejemplo 4: Preparación farmacéutica de las proteínas dependientes de vitamina K para la substitución permanente y conservación de un nivel plasmático constante: Después de la substitución con un concentrado de proteína dependiente de vitamina L, en el cual debe obtenerse un nivel de plasma lo mas constante posible de los factores del complejo de protrombina, se presenta la necesidad, debido a los diferentes tiempos de vida medios de los factores individuales, de realizar las tasas de sustitución de esas proteínas en una proporción no equivalente . Correspondientemente se preparó una preparación farmacéutica de la forma antes descrita que contenía protrombina, factor VII, factor IX, factor X, proteína C y proteína S en una proporción de 1:30:3:1.5:6:6. Ejemplo 5: Preparación farmacéutica de un complejo de protrombina parcial : Por medio de los tiempos de vida medios in vivo diferentes de los factores del complejo de protrombina, en especial por el largo tiempo de vida medio de la protrombina de 2-5 días en comparación con el tiempo de vida medio corto del factor VII de 4 a 7 horas, y del factor IX menor a 24 horas, se presenta en la substitución duradera con preparados de complejo de protrombina que en el ajuste de una concentración plasmática normal de 1 unidad de factor VlI/ml, la concentración plasmática después de 24 horas otra vez se ha reducida por debajo de la concentración requerida para la hemostasis funcional de cuando menos 20%, mientras que por ejemplo el nivel plasmático de protrombina es casi normal, esto es i unidad/ml . Por medio de la substitución repetida con un concentrado de complejo de protrombina con la misma composición que la de la substitución primaria, se tiene ahora que la concentración plasmática de protrombina en pacientes se encuentra por encima del valor normal, para alcanzar nuevamente las concentraciones plasmáticas de factor VII o factor IX equivalentes. El aumento de la concentración de protrombina plasmática por encima del rango normal, significa sin embargo un riego de trombosis para los pacientes tratados, porque Poort et al (Blood 88:368-37093, 1996) fue determinado que con un nivel plasmático de protrombina aumentado en solo el 30% esta asociado con un riesgo significantemente aumentado de trombosis venosa. Este problema puede evitarse si para las substituciones secundarias se utilizan preparados de complejo de protrombina combinados especiales . Uno de esos se prepara de la siguiente manera: Como se describe en los ejemplos anteriores, se prepara un concentrado de complejo de protrombina consistente de factor VII, IX y X en una proporción de 30:3:1.5, sin embargo sin protrombina y ee prepara como formulación farmacéutica. Loe recipientes previstos para la administración de ese preparado contenían 500 unidades internacionales de los factores de coagulación VII, IX y X en un volumen de solución de 10 ml después de la reconstitución del polvo liofilizado. Ejemplo 6: Control de calidad del preparado de complejo de protrombina Los factores de coagulación individuales en los recipientes finales de los preparados de complejo de protrombina se examinaron con una prueba de coagulación de 1 etapa de acuerdo con métodos estándar, utilizando plasmas y reactivos de coagulación deficientes de la firma IMMUNO, Viena, para determinar el contenido de protro bina, factor VIII, factor IX, factor X, proteína C y proteína S. Detalles sobre los métodos utilizados pueden tomarse del trabajo de Müller, H.G. y Bonik K. (Krankenhauspharmazie 13:528-531; 1992). Para determinar el contenido de los factores de complejo de protrombina activadoe ee utilizaron los substratos S-2238, S2222, S-2444, S-2366 y S-2251 de la Firma Chromogenix. Las determinaciones se realizaron utilizando las condiciones de amortiguación dadas por el fabricante. Por medio de los substratos cromogénicos pudieron determinarse los factores activados como trombina, factor Vlla, factor IXa, factor Xa, proteína C activada, que desarrollaron actividades proteolíticas contra los substratos de péptidos utilizados. Despuée de evaluar loe análisis fotométricos de los substratos cromogénicos pudo determinarse que para todos los sustratos, el contenido en las preparacionee antes descritas, que contenían vitamina K, proteínae o los factores seleccionadoe del complejo de protrombina, ee encontraron siempre por debajo de 10 mU/ml . Se hace conetar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los productos a que la misma se refiere.

Claims (34)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: 1.- Preparado farmacéutico separado de complejo de protrombina, caracterizado porque consiste cuando menos de dos factores individuales dependientes de vitamina K cromatográficamente purificados, como eubstancias activas.
2. 2. - Preparado de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque los factores individualee se seleccionan del grupo formado por factor II, factor VII, factor IX, factor X, proteína C, proteína S y proteína Z.
3. 3.- Preparado de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque contiene cuando menos los factores II, VII, IX y X.
4. 4. - Preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque contiene los factores individuales, proteína C y proteína S.
5. 5. - Preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque cuando menos uno de los factores individuales es un factor recombinante, un factor preparado transgenicamente, un derivado, en especial un péptido, y/o un fragmento.
6. 6. - Preparado de acuerdo con una de las reivindicacionee 1 a 5, caracterizado porque contiene a loe factoree individualee en una proporción que en lo esencial corresponde a la proporción de esos factores en la sangre .
7. 7. - Preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque contiene los factores individuales, factor II, factor VII, factor IX y factor X en una proporción relativa, en relación a unidades internacionales de (0.5 a 2):(0.5 a 2) : (0.5 a 2):(0.5 a 2).
8. 8. - Preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque contiene los factores individuales, factor II, factor VII, factor IX, factor X, proteína C y proteína S en una proporción relativa, en relación a unidades internacionales de (0.5 a 2): (0.5 a 2): (0.5 a 2) : (0.5 a 2) : (0.5 a 2) _: (0.5 a 2).
9. 9. - Preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5 , caracterizado porque los factores individuales contenido en una proporción tal que corresponde a los tiempos de vida media de los factores individuales .
10. 10.- Preparado de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque contiene los factores individuales, factor II, factor VII, factor IX y factor X en una proporción relativa, en relación a unidades internacionales de (0.5 a 2): (5 a 35) : (0.5 a 7) : (0.5 a 5).
11. ll . - Preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado porque contiene los factores individuales, factor II, factor VII, factor IX, factor X, proteína C y proteína S en una proporción relativa, en relación a unidades internacionales de (0.5 a 2): (5 a 35): (0.5 a 7) : (0.5 a 5) : (l a 15) : (1 a 15).
12. 12. - Preparado de acuerdo con la reivindicación 1 , 2 , 4 , 5, 6 o 9, caracterizado porque contiene al factor VII y al factor II en una proporción mayor a 10:1.
13. 13. - Preparado de acuerdo con una de lae reivindicacionee 1 a 12, caracterizado porque loe factoree individuales en el preparado no forman complejos.
14. 14. - Preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 13, caracterizado porque contiene un complejo de proteína parcial.
15. 15. - Preparado de acuerdo con una de lae reivindicacionee 1 a 14, caracterizado porque no contiene ningún factor de coagulación activado, seleccionado de lia, IXa, Xa y eventualmente Vlla.
16. 16. - Preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 15 , caracterizado porque contiene menos de 0.1 U de factor VIII :C o factor VIII:Ag/mg de proteína.
17. 17. - Preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque contiene menos de 0.1 U factor lia/ U protrombina.
18. 18. - Preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque contiene menos de 0.1 U factor Xa/ U factor X.
19. 19.- Preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque esta en forma liofilizada.
20. 20.- Preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque contiene iones de magnesio.
21. 21.- Preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque no contienen iones de calcio libres.
22. 22.- Preparado de acuerdo con la reivindicación 21, caracterizado porque contiene un formador de quelato para complejar los iones de calcio libres.
23. 23.- Preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque además contiene antitrombina III en cantidades estabilizantes, eventualmente junto con heparina.
24. 24. - Preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque debido a una inactivación viral o un tratamiento de reducción de virus, esta libre de virus infecciosoe .
25. 25.- Preparado de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizado porque, la ausencia de virus infecciosos se garantiza por medio de dos procedimientos independientes entre si, de inactivación o reducción de virus.
26. 26.- Preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque además abarca substancias amortiguadoras o estabilizantes farmacéuticamente aceptables.
27. 27.- Preparado de acuerdo con una de las reivindicacionee 1 a 26, caracterizado porque consiste de factores individuales dependientes de vitamina K, altamente purificados que están inactivados viralmente .
28. 28.- Preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizado porque contiene al factor individual, factor X en eu forma Q! y/o su forma ß.
29. 29. - Preparado diagnostico caracterizado porque contiene un preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 28.
30. 30.- Uso de un preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 28, para producir una preparación para el tratamiento de problemas de la coagulación sanguínea adquiridas o hereditarias .
31. 31.- Uso de un preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 28, para producir una preparación del tratamiento de hemorragias graves .
32. 32.- Uso de un preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 28, para producir una preparación para la profilaxis de hemorragias, en especial en el caso de la presencia de problemas de coagulación sanguínea hereditarias .
33. 33.- Ueo de un preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 28, para producir una preparación para la terapia de substitución.
34. 34.- Uso de un preparado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 28, para producir una preparación para el tratamiento de hemofilia B.