JPH10168100A - アンチトロンビン−iiiの精製法 - Google Patents
アンチトロンビン−iiiの精製法Info
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Abstract
温加熱処理によりウイルスが不活化されており且つ、実
質的に熱変性物を含まないアンチトロンビン−IIIを得
ること。 【解決手段】原料ヒト血漿または誘導ヒト血漿画分をヘ
パリン・アフィニティークロマトグラフィー(A)、強
陰イオン交換体処理(B)およびウイルス不活性化のた
めの乾燥加熱処理(C)を施すことにより所期の目的が
達成された。
Description
アンチトロンビン−IIIを高度に精製しうる方法の提供
に関する。
によりフィブリンを生じ血栓が形成される止血機構は既
によく知られている。アンチトロンビン−IIIは血漿中
に存在するα2グロブリンに属する糖蛋白質の一種で、
プロテアーゼ阻害活性を有し、トロンビン、活性化X因
子などのプロテアーゼを阻害することで血液凝固活性を
阻害する。またこのアンチトロンビン−IIIの血液凝固
阻害活性は、ヘパリンの共存下において顕著に増大す
る。このような薬理作用を有するアンチトロンビン−II
Iは、血液凝固異常亢進症、たとえばDICと称される
汎発性血管内凝固症候群の予防ならびに治療に不可欠の
ものである。ヘパリンによるアンチトロンビン−IIIの
活性増大は、主としてヘパリンとアンチトロンビン−II
Iとが特異的に結合して複合体を形成することに起因し
ている。この両者の結合が高度に特異的であることか
ら、その性質を利用して不純物を含む血漿由来のアンチ
トロンビン−III含有溶液を、固定化されたヘパリンを
吸着支持体とするアフィニティークロマトグラフィーに
付すことにより、アンチトロンビン−IIIを精製する方
法がアンダーソン(Anderson)らにより提供され(米国
特許第3842061号参照)、その効果は広く認めら
れている。
ヒト血漿または誘導ヒト血漿画分、特にアンチトロンビ
ン−IIIを豊富に含んでいるコーン低温エタノール分画
法による上清Iや画分IV−1は、多量のリポ蛋白質およ
び他の成分も含んでいるので単一のヘパリン・アフィニ
ティークロマトグラフィーに付しただけでは夾雑物の除
去は充分ではない。また、ヒト血漿や誘導ヒト血漿画分
はエイズウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒトパルボウイ
ルスB19などのウイルスにより汚染されている可能性
がある。そこで原料ヒト血漿や誘導ヒト血漿画分を60
℃、10時間溶液状態で加熱することによりアンチトロ
ンビン−IIIを不活性化することなくウイルスを不活性
化する方法が提案された(Tabor ら、“ Thrombosis R
esearch ”22巻 233-238(1981))。しかしこのアンチ
トロンビン−III溶液の低温殺菌法によるウイルス不活
化も、その加熱処理の間に無視し得ないアンチトロンビ
ン−IIIの熱変性物の生成が観測された(Tabor および
Barrowcliffe ら、“ Fr. J. Haematology”, 55巻、37-
46(1983 ))。このアンチトロンビン−IIIの熱変性物、
すなわち熱変性蛋白質の注射による体内投与は、抗原・
抗体反応を誘発する恐れがあり、またサイトカインの過
剰な生産を誘発する恐れもある。そこで、固定化された
ヘパリン・アフィニティークロマトグラフィー、それに
続く低温殺菌法によるウイルス不活化工程、その後さら
にヘパリン・アフィニティークロマトグラフィーを行う
という方法が提案されている(特開平6−321994
号公報)。
1994号公報に記載の方法は、低温殺菌法によるウイ
ルス不活化工程の前と後に2度にわたるヘパリン・アフ
ィニティークロマトグラフィーを実施する方法である
が、第1回目のヘパリン・アフィニティークロマトグラ
フィーで除去しきれなかった成分は、第1回目と同じヘ
パリンをリガンドとする第2回目のヘパリン・アフィニ
ティークロマトグラフィーにおいても除去は困難であ
る。またアンチトロンビン−IIIを含む溶液の60℃、
10時間の加熱処理は、多くはないが無視できない量の
アンチトロンビン−IIIの熱変性物を生成するので、そ
の後の1度のヘパリン・アフィニティークロマトグラフ
ィー処理のみによってこれらの熱変性物を完全に除去す
ることはできない。
が不活性化され、且つアンチトロンビン−IIIの熱変性
物を実質的に含有しない高度に精製されたアンチトロン
ビン−IIIを比較的簡単な操作で、且つ高い収率で得る
方法について鋭意研究を重ねてきた結果、遂にその目的
を達成した。すなわち本発明は、(1)ヒト血漿または
誘導ヒト血漿画分をヘパリン・アフィニティークロマト
グラフィーに付す工程(A)、工程(A)に付した後、
アンチトロンビン−IIIを含む溶液を強陰イオン交換体
による吸脱着処理に付す工程(B)および工程(B)に
付した後、乾燥状態のアンチトロンビン−IIIをウイル
スが不活化されるまで加熱する工程(C)を含むことを
特徴とするアンチトロンビン−IIIの精製法、(2)誘
導ヒト血漿画分がコーン低温エタノール分画法における
上清Iである前記(1)記載の精製法、(3)強陰イオ
ン交換体が4級アミノ基含有強陰イオン交換体である前
記(1)記載の精製法、(4)工程(B)と(C)の
間、または工程(C)の後にアンチトロンビン−III含
有溶液をヘパリン・アフィニティークロマトグラフィー
に付す工程(D)を加えた前記(1)記載の精製法、お
よび(5)誘導ヒト血漿画分がコーン低温エタノール分
画法における上清Iであり、強陰イオン交換体が4級ア
ミノ基含有強陰イオン交換体であり、工程(B)と
(C)の間に工程(D)を行う前記(1)記載の精製
法、である。
て用いられるものはヒトアンチトロンビン−IIIを含有
するヒト血漿または誘導ヒト血漿画分であり、それらと
しては、たとえば、ヒト血漿やコーン低温エタノール分
画法で得られる上清I,上清II+III,画分IV−1、ク
エン酸含有血漿から血液凝固第VIII因子を回収した後の
残渣画分等ヒト血漿から誘導された画分が挙げられる。
これらの中で上清Iは特に好適な原料である。本発明に
おいてはまず、この原料ヒト血漿または誘導ヒト血漿画
分を、ヘパリン・アフィニティークロマトグラフィーに
付す(工程A)。この工程自体は前述のごとく公知であ
るが、本発明において好適に用いられる吸着支持体は、
たとえばヘパリンがセルロース、アガロース等の不溶性
担体に共有結合したものである。この工程(A)により
大部分の夾雑物を除去することができる。得られたアン
チトロンビン−IIIを含む溶液は、必要により自体公知
の限外濾過に付し、ついで強陰イオン交換体による吸脱
着処理工程(B)に付される。本発明において使用され
る強陰イオン交換体としては、その解離度(pKa)が
通常10.3以上、好ましくは10.5以上のものであ
る。その構造的特徴として、4級アミノ基を有するも
の、特にトリアルキルアミノアルキル基を有するものが
好適に使用される。強陰イオン交換体の具体例として
は、たとえばトリメチルアミノメチル基、ジエチルヒド
ロキシプロピルアミノエチル基などのトリアルキルアミ
ノアルキル基を有するものが挙げられる。これらの中で
もトリメチルアミノメチル基を有するものが特に好まし
い。
は、たとえばセルロース、アガロース、デキストラン、
ポリアクリルアミド、アミノ酸共重合体、ポリビニル共
重合体、ポリスチレン共重合体などが挙げられる。アン
チトロンビン−III含有液と強陰イオン交換体との接触
条件はpH6〜8程度、塩濃度0〜0.5M程度が好ま
しく、このような条件を具有する溶媒としては、たとえ
ば0.05M塩化ナトリウム含有0.01Mリン酸緩衝液
(pH6.5〜7.5)等が挙げられる。また、溶出条件
はpH6〜8程度、塩濃度0.1〜0.5M程度のものが
よく、具体例としては、溶媒として0.17M塩化ナト
リウム含有0.01リンM酸緩衝液(pH7)などが挙
げられる。接触方法はカラム法、バッチ法のいずれでも
よい。バッチ法にて行う場合、上記接触条件に調製した
アンチトロンビン−III含有水溶液を、同じ条件で平衡
化した当該強陰イオン交換体に接触させる。その条件と
しては、該交換体1mlに対して該水溶液1〜100m
lを用い、2〜20℃で30分〜2時間程度混和した後
に遠心分離して、該交換体を回収する。さらに、該交換
体に上記溶出用溶媒を添加する。混和条件は接触時と同
じであるが、遠心分離して上澄を回収する。一方、カラ
ム法にて行う場合、上記の接触条件に調製したアンチト
ロンビン−III含有水溶液を、同じ条件で平衡化され、
且つカラムに充填された当該強陰イオン交換体に通し、
非吸着画分を廃棄する。必要に応じてカラムを洗浄した
後、溶出用溶媒を流して溶出画分を回収する。この工程
(B)により、ヘパリン・アフィニティークロマトグラ
フィーによっても除去しきれなかったヘパリンと親和性
を有する夾雑物および熱抵抗性の強いヒトパルボウイル
スB19を含む各種ウイルスがかなり除去されることが
判明した。
が行われる。加熱に先立ち、工程(B)で得られたアン
チトロンビン−III含有組成物は水分含量が5%以下、
望ましくは3%以下となるよう乾燥される。通常の凍結
乾燥により、この条件は満たされる。乾燥された組成物
の形状は、水分含有量が5%以下であれば粉末状、ケー
キ状または他のいずれの形態でもよい。加熱温度は50
〜80℃、好ましくは55〜75℃、さらに好ましくは
60〜70℃であり、加熱時間は24〜120時間、好
ましくは72〜108時間、さらに好ましくは84〜1
00時間程度である。加熱時の雰囲気としては通常大気
圧の空気が用いられるが必要により減圧空気、窒素その
他の不活性ガス中で行っても差し支えない。また加熱時
のアンチトロンビン−IIIの熱変性を極力防止する目的
で有機酸塩類、無機酸塩類等を溶液中に添加しておき、
それを乾燥して加熱処理に付してもよい。加熱はどのよ
うな手段でもよいが、オーブン、赤外線照射、砂浴また
は水浴などの手段が適宜使用される。この工程(C)の
操作によりウイルスは不活性化される。前述の工程
(B)と(C)の間、または(C)の後にさらに工程
(D)を挿入することにより、目的物の純度を一層向上
させることができる。
ビン−IIIは、さらに必要によりウイルス除去膜処理等
ののち製剤化される。製剤としては、水溶液、懸濁剤、
凍結乾燥製剤等が挙げられ、これらの製剤化は、医薬上
許容される添加剤(希釈剤、等張化剤、界面活性剤等)
を適宜混合し、製剤上の常套手段により行うことができ
る。また、該製剤は静脈注射等の注射剤として用いら
れ、凍結乾燥製剤は用時に注射用蒸留水等に溶解して用
いられる。本発明により得られる高度に精製されたアン
チトロンビン−IIIは、汎発性血管内凝固症候群(DI
C)をはじめ、手術後、肝炎・肝硬変、膵炎、新生児呼
吸窮迫症候群等により血液中のアンチトロンビン−III
レベルが低下した患者に投与して血栓の発生を防止する
ことができる。
に説明するが、本発明はそれらによって限定されるもの
ではない。 実施例1 コーン低温エタノール分画の上清I約17.5リットル
をDEAE陰イオン交換体処理後、未吸着画分をプール
として集めた。0.02Mのリン酸緩衝液(pH7.3)
で前もって平衡化したヘパリン−セファロースゲル約3
70mlを充填したカラムに前述のプール画分を負荷し
た。引き続き、0.02Mのリン酸緩衝液、0.3M塩化
ナトリウム溶液(pH7.3)3.0リットルで洗浄した
後、0.02Mリン酸緩衝液、2.0M塩化ナトリウム溶
液(pH7.3)3.0リットルでアンチトロンビン−II
Iを溶出した。次いで、ヘパリン−セファロースゲルか
ら溶出したアンチトロンビン−III画分を限外濾過装置
(フィルトロン社製 ポアサイズ10K)を用い、0.
1M以下の塩濃度になるよう脱塩し、約200mlにな
るまで濃縮した。前記画分を0.01Mのリン酸緩衝液
(pH7.0)で約1.0リットルに希釈した。前もって
0.01Mのリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したQ
−セファロースFFゲル(トリメチルアミノメチル/ア
ガロース、ファルマシア社製)約340mlに前述の希
釈液を負荷した。次いで、0.01Mのリン酸緩衝液、
0.12M塩化ナトリウム溶液(pH7.0)を6.0リ
ットル送液して洗浄した後、0.01Mのリン酸緩衝
液、0.17M塩化ナトリウム溶液(pH7.0)を3.
0リットル送液しアンチトロンビン−IIIを溶出した。
この溶出画分をさらに精製するため、再度ヘパリン−セ
ファロースゲル処理を行った。0.02Mのリン酸緩衝
液、pH7.3で前もって平衡化したヘパリン−セファ
ロースゲル約370mlを充填したカラムに、前述のQ
−セファロースFFゲルの溶出液を負荷した。引き続
き、0.02Mのリン酸緩衝液、0.3M塩化ナトリウム
溶液(pH7.3)3.0リットルで洗浄した後、0.0
2Mのリン酸緩衝液、2.0M塩化ナトリウム溶液(p
H7.3)3.0リットルでアンチトロンビン−IIIを溶
出した。次いで、ヘパリン−セファロースゲルから溶出
した溶液を前述のものと同一の限外濾過装置を用い、濃
縮・緩衝液交換を行った。交換緩衝液として、0.02
Mクエン酸緩衝液、0.07M塩化ナトリウム溶液(p
H7.0)を用い、280nmの吸光度にて10になる
よう希釈・調製した。本溶液を小型ステンレス製皿に流
し込み、凍結乾燥機にて凍結乾燥を行った。乾燥終了
後、引き続き棚温度を上昇させ、品温66±1℃にて9
6時間の加熱処理を行った。加熱処理終了後、約1.0
gの粉末を採取した。得られた粉末の比活性は蛋白質1
mg当たり7.7国際単位であった。本粉末を注射用水
で溶解後、L−グルタミン酸ナトリウム10mg/ml
となるよう調製し、ウイルス除去膜(旭化成製 プラノ
バ35N)処理を実施した。さらに約50単位/mlに
なるよう調製し、充填,凍結乾燥した。
DEAE陰イオン交換体処理後、未吸着画分をプールと
して集めた。 ヘパリン−セルロファインゲル約560
mlを充填したカラムを、前もって0.02Mのリン酸
緩衝液(pH7.3)で平衡化し、後に前述のプール画
分を負荷した。引き続き、平衡化溶液2.5リットルで
洗浄した後、0.02Mのリン酸緩衝液、0.05M塩化
ナトリウム溶液(pH7.3)2.5リットルにて洗浄
し、さらに0.02Mのリン酸緩衝液、1.0M塩化ナト
リウム溶液(pH7.3)液3.5リットルにてアンチト
ロンビンを溶出した。次いで、ヘパリンーセファロース
ゲルから溶出した溶液を限外ろ過装置(フィルトロン社
製、ポアサイズ10K)を用い、0.1M以下の塩濃度
になるよう脱塩し、約500mlまで濃縮した。次に、
Q−セファロースFFゲル(ファルマシア社製)約30
0mlを充填したカラムを、前もって0.01Mのリン
酸緩衝液、pH7.0にて平衡化し、その後に前述の濃
縮液を負荷した。次いで、0.01Mのリン酸緩衝液、
0.12M塩化ナトリウム溶液(pH7.0)を2.5リ
ットル送液して洗浄した後、0.01Mのリン酸緩衝
液、0.15M塩化ナトリウム溶液(pH7.0)を2.
0リットル送液しアンチトロンビン画分を溶出した。次
いで、Q−セファロースFFゲルから溶出した溶液を前
述と同一の限外濾過装置を用い、濃縮・緩衝液交換を行
った。交換緩衝液として、0.02Mクエン酸緩衝液、
0.07M塩化ナトリウム溶液(pH7.0)を用い、濃
縮後最終液量は約6.0リットルであった。本溶液を充
填し、凍結後、凍結乾燥機を用い、凍結乾燥を行った。
乾燥終了後、引き続き温度を上昇させ、品温66±1℃
にて96時間の加熱処理を行い粉末を採取した。
ビン−IIIの分析 実施例1の粉末を約1単位/mlになるように注射用水
で溶解した。この試料を5μl負荷して交叉免疫電気泳
動を実施した。なお、交叉免疫電気泳動法は、Sas らの
方法[British Journal of Haematology, 30巻, 265-27
2(1974)]に従い実施した。得られた結果を〔図1〕に
示す。 ウイルス除去・不活化効果の測定 実施例1の製造工程中の原薬液にウイルス液を添加した
少量のモデル実験を実施し,各工程終了後のウイルス量
を測定した。使用したウイルスは、HIV,C型肝炎ウ
イルスのモデルウイルスであるウシ下痢症ウイルス(B
VDV)、ヒトパルボウイルスB19のモデルウイルス
であるブタパルボウイルス(PPV),ヒトパルボウイ
ルスB19(B19)であり、これらのウイルスを指標
に各製造工程のウイルス除去・不活化効果について調査
した。ウイルス力価の測定法としては,HIV,BVD
V,PPVは培養細胞に対する細胞変性効果により行
い、またB19はPCR法により実施した。その結果を
〔表1〕に示す。ウイルス除去・不活化効果は次式によ
り算出した。
たアンチトロンビン−IIIはウイルス、特にエイズウイ
ルス、C型肝炎ウイルス、パルボウイルスが不活性化さ
れており、加熱処理による熱変性物を実質的に含まな
い。したがって、本発明方法によって得られた精製アン
チトロンビン−IIIの交叉免疫電気泳動図においても単
一のピークを示すのみである。
−IIIの交叉免疫電気泳動図である。
示す。
Claims (5)
- 【請求項1】ヒト血漿または誘導ヒト血漿画分をヘパリ
ン・アフィニティークロマトグラフィーに付す工程
(A)、工程(A)に付した後、アンチトロンビン−II
Iを含む溶液を強陰イオン交換体による吸脱着処理に付
す工程(B)および工程(B)に付した後、乾燥状態の
アンチトロンビン−IIIをウイルスが不活化されるまで
加熱する工程(C)を含むことを特徴とするアンチトロ
ンビン−IIIの精製法。 - 【請求項2】誘導ヒト血漿画分がコーン低温エタノール
分画法における上清Iである請求項1記載の精製法。 - 【請求項3】強陰イオン交換体が4級アミノ基含有強陰
イオン交換体である請求項1記載の精製法。 - 【請求項4】工程(B)と(C)の間、または工程
(C)の後にアンチトロンビン−III含有溶液をヘパリ
ン・アフィニティークロマトグラフィーに付す工程
(D)を加えた請求項1記載の精製法。 - 【請求項5】誘導ヒト血漿画分がコーン低温エタノール
分画法における上清Iであり、強陰イオン交換体が4級
アミノ基含有強陰イオン交換体であり、工程(B)と
(C)の間に工程(D)を行う請求項1記載の精製法。
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CN103059129B (zh) * | 2013-01-28 | 2015-02-11 | 贵州泰邦生物制品有限公司 | 制造人抗凝血酶-iii制品的方法 |
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1996
- 1996-12-06 JP JP34267696A patent/JP4146525B2/ja not_active Expired - Fee Related
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