JPH09157184A - アンチトロンビンｉｉｉ含有組成物およびその製造方法 - Google Patents
アンチトロンビンｉｉｉ含有組成物およびその製造方法Info
- Publication number
- JPH09157184A JPH09157184A JP7326116A JP32611695A JPH09157184A JP H09157184 A JPH09157184 A JP H09157184A JP 7326116 A JP7326116 A JP 7326116A JP 32611695 A JP32611695 A JP 32611695A JP H09157184 A JPH09157184 A JP H09157184A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- iii
- composition
- insoluble carrier
- virus
- antithrombin iii
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 実質的に夾雑ウイルスが不活化され、かつパ
イロジェンの除去が十分になされた安全性に優れたアン
チトロンビンIII （ＡＴ−III ）含有組成物およびその
製造方法を提供する。 【解決手段】 次の各工程を含むＡＴ−III 含有組成物
の製造方法およびそれにより製造されたＡＴ−III 含有
組成物。ウイルス夾雑の可能性のあるＡＴ−III 含有
液状組成物を、ＡＴ−III と親和性を有するリガンドが
結合された不溶性担体に接触・吸着させる工程、次
に、ＡＴ−III を不溶性担体に吸着させた状態で、実質
的にウイルスが不活化されるまで液状加熱処理する工
程、さらに、液状加熱処理したＡＴ−III を不溶性担
体から溶出・回収する工程。
イロジェンの除去が十分になされた安全性に優れたアン
チトロンビンIII （ＡＴ−III ）含有組成物およびその
製造方法を提供する。 【解決手段】 次の各工程を含むＡＴ−III 含有組成物
の製造方法およびそれにより製造されたＡＴ−III 含有
組成物。ウイルス夾雑の可能性のあるＡＴ−III 含有
液状組成物を、ＡＴ−III と親和性を有するリガンドが
結合された不溶性担体に接触・吸着させる工程、次
に、ＡＴ−III を不溶性担体に吸着させた状態で、実質
的にウイルスが不活化されるまで液状加熱処理する工
程、さらに、液状加熱処理したＡＴ−III を不溶性担
体から溶出・回収する工程。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ウイルス夾雑の可
能性のあるアンチトロンビンIII （以下、ＡＴ−III と
いう）含有液状組成物から製造され、実質的にウイルス
が不活化され、かつパイロジェンが含まれないＡＴ−II
I 含有組成物およびその製造方法に関する。
能性のあるアンチトロンビンIII （以下、ＡＴ−III と
いう）含有液状組成物から製造され、実質的にウイルス
が不活化され、かつパイロジェンが含まれないＡＴ−II
I 含有組成物およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】人血液由来の蛋白質含有組成物には、例
えば、肝炎ウイルス、ＡＩＤＳウイルスなどのウイルス
が夾雑してくる可能性がある。これらのウイルス伝播を
防ぐために、蛋白質含有液状組成物を加熱処理する方法
が知られている（特開昭５５−１４５６１５号公報、同
５６−１３９４２２号公報、同５６−１０６５６９号公
報他）。
えば、肝炎ウイルス、ＡＩＤＳウイルスなどのウイルス
が夾雑してくる可能性がある。これらのウイルス伝播を
防ぐために、蛋白質含有液状組成物を加熱処理する方法
が知られている（特開昭５５−１４５６１５号公報、同
５６−１３９４２２号公報、同５６−１０６５６９号公
報他）。
【０００３】また他に、蛋白質含有液状組成物を加熱処
理後に、当該蛋白質と親和性を有するカラムで処理する
精製方法が報告されている。例えば、特開昭６３−２３
８９６号公報他には、血漿蛋白質一般、特にＡＴ−III
についての精製方法が開示されている。これらの手段は
加熱処理時に使用した高濃度の安定化剤の除去、および
加熱処理により生じた変性物（重合物）の除去等をその
目的とするものである。しかしながら、上記の方法で
は、パイロジェンおよび変性物の除去を充分に行えない
等の点で問題がある。
理後に、当該蛋白質と親和性を有するカラムで処理する
精製方法が報告されている。例えば、特開昭６３−２３
８９６号公報他には、血漿蛋白質一般、特にＡＴ−III
についての精製方法が開示されている。これらの手段は
加熱処理時に使用した高濃度の安定化剤の除去、および
加熱処理により生じた変性物（重合物）の除去等をその
目的とするものである。しかしながら、上記の方法で
は、パイロジェンおよび変性物の除去を充分に行えない
等の点で問題がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ＡＴ
−III の活性を実質的に失うことなく、実質的に夾雑ウ
イルスが不活化され、かつパイロジェンが十分に除去さ
れた安全性に優れたＡＴ−III 含有組成物およびその製
造方法を提供することである。
−III の活性を実質的に失うことなく、実質的に夾雑ウ
イルスが不活化され、かつパイロジェンが十分に除去さ
れた安全性に優れたＡＴ−III 含有組成物およびその製
造方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究した結果、夾雑ウイルスの可能
性のあるＡＴ−III 含有液状組成物をＡＴ−III と親和
性を有するリガンドが結合された不溶性担体に接触・吸
着させ、次いで不溶性担体に吸着された状態のＡＴ−II
I を液状加熱し、次いで不溶性担体から溶出・回収する
ことにより上記問題を解決するに至った。
解決するために鋭意研究した結果、夾雑ウイルスの可能
性のあるＡＴ−III 含有液状組成物をＡＴ−III と親和
性を有するリガンドが結合された不溶性担体に接触・吸
着させ、次いで不溶性担体に吸着された状態のＡＴ−II
I を液状加熱し、次いで不溶性担体から溶出・回収する
ことにより上記問題を解決するに至った。
【０００６】即ち、本発明は、次の〜の工程を含む
ＡＴ−III 含有組成物の製造方法およびそれによって製
造されるＡＴ−III 含有組成物である。 ウイルス夾雑の可能性のあるＡＴ−III 含有液状組成
物を、当該ＡＴ−III と親和性を有するリガンドが結合
された不溶性担体に接触・吸着させる工程、 次に、ＡＴ−III を不溶性担体に吸着させた状態で、
実質的にウイルスが不活化されるまで液状加熱処理する
工程、 さらに、液状加熱処理したＡＴ−III を不溶性担体か
ら溶出・回収する工程。 ここで、実質的にウイルスが不活化された、とは、プラ
ーク形成法によるウイルスの感染価が、５０ｐｆｕ／ｍ
ｌ未満または１０1.5 ＴＣＩＤ1.5 未満であることを意
味する。
ＡＴ−III 含有組成物の製造方法およびそれによって製
造されるＡＴ−III 含有組成物である。 ウイルス夾雑の可能性のあるＡＴ−III 含有液状組成
物を、当該ＡＴ−III と親和性を有するリガンドが結合
された不溶性担体に接触・吸着させる工程、 次に、ＡＴ−III を不溶性担体に吸着させた状態で、
実質的にウイルスが不活化されるまで液状加熱処理する
工程、 さらに、液状加熱処理したＡＴ−III を不溶性担体か
ら溶出・回収する工程。 ここで、実質的にウイルスが不活化された、とは、プラ
ーク形成法によるウイルスの感染価が、５０ｐｆｕ／ｍ
ｌ未満または１０1.5 ＴＣＩＤ1.5 未満であることを意
味する。
【０００７】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明において原料として用いられるウイルス夾
雑の可能性のあるＡＴ−III含有液状組成物は、特に制
限されず、例えば、血漿または組織抽出液、血漿または
組織抽出液を各種分画法によって処理して得られた画分
からなる溶液、遺伝子組み換え宿主または組織の培養に
より得られた培養液、市販のＡＴ−III 製剤（液状また
はそれを溶液としたもの）などが挙げられる。例えば、
コーンの冷アルコール分画法によって得られる第II＋II
I 上清画分、第IV沈澱画分、第IV−１沈澱画分、第IV−
４沈澱画分等を用いることができる。
する。本発明において原料として用いられるウイルス夾
雑の可能性のあるＡＴ−III含有液状組成物は、特に制
限されず、例えば、血漿または組織抽出液、血漿または
組織抽出液を各種分画法によって処理して得られた画分
からなる溶液、遺伝子組み換え宿主または組織の培養に
より得られた培養液、市販のＡＴ−III 製剤（液状また
はそれを溶液としたもの）などが挙げられる。例えば、
コーンの冷アルコール分画法によって得られる第II＋II
I 上清画分、第IV沈澱画分、第IV−１沈澱画分、第IV−
４沈澱画分等を用いることができる。
【０００８】本発明に使用される、ＡＴ−III との親和
性を有するリガンドが結合された不溶性担体としては、
以下に例示されたリガンドを不溶性担体に共有結合さ
せ、固定化させたものが用いられる。リガンドとして
は、ヘパリン、その他の硫酸多糖類等が挙げられる。ヘ
パリンは、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−
イズロン酸から成る多糖のＮ−硫酸、Ｎ−アセチルおよ
びＯ−硫酸置換体であり、分子量１万〜１０万、好まし
くは２万程度であるような酸性多糖類の硫酸エステル体
が好適に使用される。前記不溶性担体としては、デキス
トラン系（商品名、セファデックス）、アガロース系
（商品名、セファロース）、セルロース系（商品名、セ
ルロファイン）、親水性ビニルポリマー系（商品名、ト
ヨパール）、シリカゲル系等が例示される。
性を有するリガンドが結合された不溶性担体としては、
以下に例示されたリガンドを不溶性担体に共有結合さ
せ、固定化させたものが用いられる。リガンドとして
は、ヘパリン、その他の硫酸多糖類等が挙げられる。ヘ
パリンは、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−
イズロン酸から成る多糖のＮ−硫酸、Ｎ−アセチルおよ
びＯ−硫酸置換体であり、分子量１万〜１０万、好まし
くは２万程度であるような酸性多糖類の硫酸エステル体
が好適に使用される。前記不溶性担体としては、デキス
トラン系（商品名、セファデックス）、アガロース系
（商品名、セファロース）、セルロース系（商品名、セ
ルロファイン）、親水性ビニルポリマー系（商品名、ト
ヨパール）、シリカゲル系等が例示される。
【０００９】好ましくは、ヘパリンを不溶性担体に共有
結合させてなる固定化ヘパリンが好ましく用いられる。
固定化ヘパリンにおいて、ヘパリンの不溶性担体に対す
る結合率は、不溶性担体１ｍｌ容に対し、通常０．１ｍ
ｇ〜１００ｍｇ程度であることが好ましい。このような
固定化ヘパリンとして、ヘパリン−トヨパール（商品
名、東ソー社製）等を用いることができる。
結合させてなる固定化ヘパリンが好ましく用いられる。
固定化ヘパリンにおいて、ヘパリンの不溶性担体に対す
る結合率は、不溶性担体１ｍｌ容に対し、通常０．１ｍ
ｇ〜１００ｍｇ程度であることが好ましい。このような
固定化ヘパリンとして、ヘパリン−トヨパール（商品
名、東ソー社製）等を用いることができる。
【００１０】ＡＴ−III 含有液状組成物を前記リガンド
が固定化された不溶性担体に接触・吸着させる方法とし
ては、カラム法、バッチ法のいずれを用いてもよい。
が固定化された不溶性担体に接触・吸着させる方法とし
ては、カラム法、バッチ法のいずれを用いてもよい。
【００１１】以下、本発明に固定化ヘパリンを用いてな
るカラムを使用する場合について具体的に説明する。固
定化ヘパリンの使用量は、ＡＴ−III １ｇに対し０．１
リットル容〜１０リットル容（ゲル）の固定化ヘパリン
であることが好ましい。ＡＴ−III 含有液状組成物の濃
度は、０．１W/V%〜１０W/V%程度であることが好まし
い。
るカラムを使用する場合について具体的に説明する。固
定化ヘパリンの使用量は、ＡＴ−III １ｇに対し０．１
リットル容〜１０リットル容（ゲル）の固定化ヘパリン
であることが好ましい。ＡＴ−III 含有液状組成物の濃
度は、０．１W/V%〜１０W/V%程度であることが好まし
い。
【００１２】ＡＴ−III 含有液状組成物と固定化ヘパリ
ンの接触・吸着処理条件として、ｐＨとしては、通常６
〜９程度、好ましくは６〜８程度、塩濃度としては通常
０．２Ｍ以下、好ましくは、０．０１Ｍ〜０．１５Ｍ程
度が例示される。ｐＨが６未満の場合、ＡＴ−III 活性
が失活する傾向、およびＡＴ−III のカラムに対する吸
着能が低下する傾向があり、ｐＨが９を越える場合、Ａ
Ｔ−III 活性は安定であるが、該吸着能が低下する傾向
がある。
ンの接触・吸着処理条件として、ｐＨとしては、通常６
〜９程度、好ましくは６〜８程度、塩濃度としては通常
０．２Ｍ以下、好ましくは、０．０１Ｍ〜０．１５Ｍ程
度が例示される。ｐＨが６未満の場合、ＡＴ−III 活性
が失活する傾向、およびＡＴ−III のカラムに対する吸
着能が低下する傾向があり、ｐＨが９を越える場合、Ａ
Ｔ−III 活性は安定であるが、該吸着能が低下する傾向
がある。
【００１３】また、塩濃度が０．２Ｍより大きいと、Ａ
Ｔ−III と固定化ヘパリンとの親和性が弱くなり、吸着
能が低下する傾向があり好ましくない。またエタノール
が１０V/V%〜４０V/V%、好ましくは、１５V/V%〜３０V/
V%程度共存することが好ましい。
Ｔ−III と固定化ヘパリンとの親和性が弱くなり、吸着
能が低下する傾向があり好ましくない。またエタノール
が１０V/V%〜４０V/V%、好ましくは、１５V/V%〜３０V/
V%程度共存することが好ましい。
【００１４】上述のようにＡＴ−III をカラムに吸着さ
せた後、該カラムの洗浄を行う。洗浄条件としては、ｐ
Ｈ６〜９程度、好ましくは６〜８程度、塩濃度は１Ｍ以
下、好ましくは、０．１Ｍ〜０．７Ｍ程度が例示され
る。ｐＨが６未満の場合、ＡＴ−III が失活する傾向、
およびＡＴ−III が洗浄溶液中に流出する傾向がある。
ｐＨが９を越える場合、洗浄効率が低下する傾向があ
る。また、塩濃度が１Ｍより大きい場合には、ＡＴ−II
I が洗浄溶液中に流出する傾向があり好ましくない。
せた後、該カラムの洗浄を行う。洗浄条件としては、ｐ
Ｈ６〜９程度、好ましくは６〜８程度、塩濃度は１Ｍ以
下、好ましくは、０．１Ｍ〜０．７Ｍ程度が例示され
る。ｐＨが６未満の場合、ＡＴ−III が失活する傾向、
およびＡＴ−III が洗浄溶液中に流出する傾向がある。
ｐＨが９を越える場合、洗浄効率が低下する傾向があ
る。また、塩濃度が１Ｍより大きい場合には、ＡＴ−II
I が洗浄溶液中に流出する傾向があり好ましくない。
【００１５】洗浄工程に次いで液状加熱処理工程を行
う。液状加熱処理は、通常３０℃〜１００℃、好ましく
は５５℃〜８５℃において、通常１時間〜１００時間、
好ましくは５時間〜３０時間実施される。液状加熱処理
時の温度が３０℃未満であると、ウイルスが充分に不活
化されないおそれがあり、１００℃を越えると、ウイル
スは不活化されるが、ＡＴ−III の活性が低下する傾向
にあり好ましくない。また、加熱時間が１時間未満の場
合には、ウイルスが充分に不活化されず、１００時間を
越えるとＡＴ−III の活性が低下する傾向にある。
う。液状加熱処理は、通常３０℃〜１００℃、好ましく
は５５℃〜８５℃において、通常１時間〜１００時間、
好ましくは５時間〜３０時間実施される。液状加熱処理
時の温度が３０℃未満であると、ウイルスが充分に不活
化されないおそれがあり、１００℃を越えると、ウイル
スは不活化されるが、ＡＴ−III の活性が低下する傾向
にあり好ましくない。また、加熱時間が１時間未満の場
合には、ウイルスが充分に不活化されず、１００時間を
越えるとＡＴ−III の活性が低下する傾向にある。
【００１６】なお、ＡＴ−III を熱から保護するため、
液状加熱処理は安定化剤の存在下で行ってもよい。安定
化剤としては、例えば、糖〔単糖類（例えば、グルコー
ス、フルクトース、マンノース等）、二糖類（例えば、
ラクトース、スクロース、マルトース等〕、糖アルコー
ル（例えば、ソルビトール、イノシトール、マンニトー
ル等）、アミノ酸（中性アミノ酸、例えば、グリシン、
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等、酸性ア
ミノ酸、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）、有
機カルボン酸〔一塩基酸（例えば、酢酸ナトリウム
等）、二塩基酸（例えばリンゴ酸、シュウ酸、マロン
酸、コハク酸、アジピン酸、ガラクタル酸等）、三塩基
酸（例えば、クエン酸等）〕またはその塩などが挙げら
れる。
液状加熱処理は安定化剤の存在下で行ってもよい。安定
化剤としては、例えば、糖〔単糖類（例えば、グルコー
ス、フルクトース、マンノース等）、二糖類（例えば、
ラクトース、スクロース、マルトース等〕、糖アルコー
ル（例えば、ソルビトール、イノシトール、マンニトー
ル等）、アミノ酸（中性アミノ酸、例えば、グリシン、
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等、酸性ア
ミノ酸、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）、有
機カルボン酸〔一塩基酸（例えば、酢酸ナトリウム
等）、二塩基酸（例えばリンゴ酸、シュウ酸、マロン
酸、コハク酸、アジピン酸、ガラクタル酸等）、三塩基
酸（例えば、クエン酸等）〕またはその塩などが挙げら
れる。
【００１７】安定化剤の添加量としては、５ｗ／ｖ％〜
５０ｗ／ｖ％、好ましくは１０ｗ／ｖ〜３０ｗ／ｖ％程
度である。この添加量の割合が、５ｗ／ｖ％未満である
と、加熱処理時にＡＴ−III 活性が失活する傾向があ
り、５０ｗ／ｖ％を越えると、ＡＴ−III が固定化ヘパ
リンに吸着しなくなる傾向があり好ましくない。ｐＨと
しては６〜９程度、好ましくは６〜８程度が例示され
る。
５０ｗ／ｖ％、好ましくは１０ｗ／ｖ〜３０ｗ／ｖ％程
度である。この添加量の割合が、５ｗ／ｖ％未満である
と、加熱処理時にＡＴ−III 活性が失活する傾向があ
り、５０ｗ／ｖ％を越えると、ＡＴ−III が固定化ヘパ
リンに吸着しなくなる傾向があり好ましくない。ｐＨと
しては６〜９程度、好ましくは６〜８程度が例示され
る。
【００１８】尚、液状加熱処理前に、上記安定化剤を含
む緩衝溶液（例えば、クエン酸ナトリウムおよびグルタ
ミン酸ナトリウム含有の緩衝溶液等）でカラムを平衡化
しておくことが好ましい。
む緩衝溶液（例えば、クエン酸ナトリウムおよびグルタ
ミン酸ナトリウム含有の緩衝溶液等）でカラムを平衡化
しておくことが好ましい。
【００１９】液状加熱処理後に、吸着していたＡＴ−II
I を上記カラムから溶出・回収する。その溶出・回収条
件は、公知の条件を適用できる。例えば、ＡＴ−III の
溶出条件としては、ｐＨ６〜９程度、好ましくは６〜８
程度、塩濃度は１．５〜３．０Ｍ程度が例示される。ｐ
Ｈ６未満の場合、ＡＴ−III が失活するおそれがあり、
ｐＨ９を越える場合、洗浄効果が低下し、ＡＴ−III と
共に夾雑物が溶出されるおそれがある。また、塩濃度が
１．５Ｍ未満であると、ＡＴ−III の回収率が低下する
傾向があり、３．０Ｍより大きいと、ＡＴ−III と共に
夾雑物が溶出されるおそれがある。なお、液状加熱処理
する工程と、ＡＴ−III を該カラムから溶出・回収する
工程との間に再度洗浄を行ってもよい。洗浄条件として
は、ｐＨ６〜９程度、好ましくは６〜８程度、塩濃度は
１Ｍ以下、好ましくは０．１Ｍ〜０．７Ｍ程度が例示さ
れる。
I を上記カラムから溶出・回収する。その溶出・回収条
件は、公知の条件を適用できる。例えば、ＡＴ−III の
溶出条件としては、ｐＨ６〜９程度、好ましくは６〜８
程度、塩濃度は１．５〜３．０Ｍ程度が例示される。ｐ
Ｈ６未満の場合、ＡＴ−III が失活するおそれがあり、
ｐＨ９を越える場合、洗浄効果が低下し、ＡＴ−III と
共に夾雑物が溶出されるおそれがある。また、塩濃度が
１．５Ｍ未満であると、ＡＴ−III の回収率が低下する
傾向があり、３．０Ｍより大きいと、ＡＴ−III と共に
夾雑物が溶出されるおそれがある。なお、液状加熱処理
する工程と、ＡＴ−III を該カラムから溶出・回収する
工程との間に再度洗浄を行ってもよい。洗浄条件として
は、ｐＨ６〜９程度、好ましくは６〜８程度、塩濃度は
１Ｍ以下、好ましくは０．１Ｍ〜０．７Ｍ程度が例示さ
れる。
【００２０】
【実施例・実験例】本発明をより詳細に説明するために
実施例および実験例を挙げるが、本発明はこれらにより
何ら限定されるものではない。 実施例１ コーンの冷アルコール分画法によって得られた第II＋II
I 上清画分を固定化へパリン（へパリン−親水性ビニル
ポリマー、商品名：へパリン−トヨパール、東ソー社
製）カラムにアプライし、カラムに接触・吸着させた。
その後、２０ V/V% エタノール、０．１Ｍ塩化ナトリウ
ム含有１０ｍＭクエン酸ナトリウム塩緩衝溶液（ｐＨ
６．８）で当該カラムを洗浄し、さらに０．４Ｍ塩化ナ
トリウム含有１０ｍＭクエン酸ナトリウム塩緩衝溶液
（ｐＨ６．８）で洗浄した。当該カラムを５％クエン酸
ナトリウムおよび１０％グルタミン酸ナトリウム含有緩
衝溶液（ｐＨ７．８）で平衡化した後に、該カラムを６
０℃、１０時間加熱処理した。その後、２Ｍ塩化ナトリ
ウム含有１０ｍＭクエン酸ナトリウム塩緩衝溶液（ｐＨ
６．８）でカラムに吸着していたＡＴ−III を溶出・回
収した。調製されたＡＴ−III の純度は９９．７％以上
であり、ＨＰＬＣ（High Performance LiquidChromatog
raphy: 高速液体クロマトグラフィー）によっても重合
体は認められなかった。なお、ＡＴ−III の回収率は、
ＡＴ−III 活性でみた場合、７８％であった。
実施例および実験例を挙げるが、本発明はこれらにより
何ら限定されるものではない。 実施例１ コーンの冷アルコール分画法によって得られた第II＋II
I 上清画分を固定化へパリン（へパリン−親水性ビニル
ポリマー、商品名：へパリン−トヨパール、東ソー社
製）カラムにアプライし、カラムに接触・吸着させた。
その後、２０ V/V% エタノール、０．１Ｍ塩化ナトリウ
ム含有１０ｍＭクエン酸ナトリウム塩緩衝溶液（ｐＨ
６．８）で当該カラムを洗浄し、さらに０．４Ｍ塩化ナ
トリウム含有１０ｍＭクエン酸ナトリウム塩緩衝溶液
（ｐＨ６．８）で洗浄した。当該カラムを５％クエン酸
ナトリウムおよび１０％グルタミン酸ナトリウム含有緩
衝溶液（ｐＨ７．８）で平衡化した後に、該カラムを６
０℃、１０時間加熱処理した。その後、２Ｍ塩化ナトリ
ウム含有１０ｍＭクエン酸ナトリウム塩緩衝溶液（ｐＨ
６．８）でカラムに吸着していたＡＴ−III を溶出・回
収した。調製されたＡＴ−III の純度は９９．７％以上
であり、ＨＰＬＣ（High Performance LiquidChromatog
raphy: 高速液体クロマトグラフィー）によっても重合
体は認められなかった。なお、ＡＴ−III の回収率は、
ＡＴ−III 活性でみた場合、７８％であった。
【００２１】実験例 以下の実験例において、実施例１
において用いられた固定化ヘパリンカラム処理前のＡＴ
−III 含有液状組成物（以下、未処理組成物という）
と、加熱処理後に該カラムから溶出して得られたＡＴ−
III 含有画分（以下、処理後組成物という）についてそ
れぞれ試験を行った。
において用いられた固定化ヘパリンカラム処理前のＡＴ
−III 含有液状組成物（以下、未処理組成物という）
と、加熱処理後に該カラムから溶出して得られたＡＴ−
III 含有画分（以下、処理後組成物という）についてそ
れぞれ試験を行った。
【００２２】実験例１ パイロジェンの除去効果 未処理組成物および処理後組成物のそれぞれについてそ
の中のパイロジェンをそれぞれ測定した。試験方法は日
本薬局方の発熱性物質試験法に準じて行った。その結
果、未処理組成物については体温上昇の合計温度が２．
８℃であったが、処理後組成物は０．１℃に低下してお
り、パイロジェンが除去されていることがわかった。
の中のパイロジェンをそれぞれ測定した。試験方法は日
本薬局方の発熱性物質試験法に準じて行った。その結
果、未処理組成物については体温上昇の合計温度が２．
８℃であったが、処理後組成物は０．１℃に低下してお
り、パイロジェンが除去されていることがわかった。
【００２３】実験例２ 比活性 処理前組成物および処理後組成物のそれぞれについて、
含有される総蛋白量およびＡＴ−III 活性をそれぞれ測
定し、その比活性を算出した。総蛋白量は、ケルダール
法により測定した。また、ＡＴ−III 活性はトロンビン
と試料とを２８℃で５分間反応させ、これにフィブリン
を加えた時の凝固時間の延長の程度を測定し、検量線よ
りその力価を算出することにより求めた。ＡＴ−III １
単位は正常人血漿１ｍｌ中に含まれるＡＴ−III 量に相
当する。未処理組成物の比活性は４．９単位／ｍｇ蛋白
であり、処理後組成物では６．４単位／ｍｇ蛋白であ
り、比活性の上昇が認められた。
含有される総蛋白量およびＡＴ−III 活性をそれぞれ測
定し、その比活性を算出した。総蛋白量は、ケルダール
法により測定した。また、ＡＴ−III 活性はトロンビン
と試料とを２８℃で５分間反応させ、これにフィブリン
を加えた時の凝固時間の延長の程度を測定し、検量線よ
りその力価を算出することにより求めた。ＡＴ−III １
単位は正常人血漿１ｍｌ中に含まれるＡＴ−III 量に相
当する。未処理組成物の比活性は４．９単位／ｍｇ蛋白
であり、処理後組成物では６．４単位／ｍｇ蛋白であ
り、比活性の上昇が認められた。
【００２４】実験例３ 夾雑血漿蛋白の除去 未処理組成物および処理後組成物のそれぞれについて、
夾雑する血漿蛋白の有無をオクタロニー法により調べ
た。蛋白濃度は１００ｍｇ／ｍｌとして実験した。その
結果、未処理組成物には、プレアルブミン、アルブミ
ン、α１−アンチトリプシン、レチノール結合蛋白、ハ
プトグロビン、α２−マクログロブリン、トランスフェ
リン、ＩｇＧ、ＩｇＡに関しての沈降線が認められた
が、処理後組成物にはこれらの血漿蛋白に対して沈降線
は認められず、夾雑血漿蛋白は除去されていることが確
認された。
夾雑する血漿蛋白の有無をオクタロニー法により調べ
た。蛋白濃度は１００ｍｇ／ｍｌとして実験した。その
結果、未処理組成物には、プレアルブミン、アルブミ
ン、α１−アンチトリプシン、レチノール結合蛋白、ハ
プトグロビン、α２−マクログロブリン、トランスフェ
リン、ＩｇＧ、ＩｇＡに関しての沈降線が認められた
が、処理後組成物にはこれらの血漿蛋白に対して沈降線
は認められず、夾雑血漿蛋白は除去されていることが確
認された。
【００２５】実験例４ ゲル濾過 未処理組成物および処理後組成物をそれぞれゲル濾過処
理し、その溶出パターンを比較検討した。また、未処理
組成物をそのまま加熱処理した直後のものを対照として
併せて検討した。ゲル濾過の条件は、担体：ＴＳＫゲル
Ｇ３０００−ＳＷ−ＸＬ（東ソー社製）、溶出液：０．
２Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．８）、検出：２８０ｎｍにおける吸光度であった。
その結果、対照においては、二峰性を示し、この２つの
ピークのうち、高分子画分は、加熱処理前の溶出パター
ンから推測して熱変性蛋白に基づくものと考えられた。
これは、実施例１に示した「重合体」に相当する。な
お、低分子画分（分子量６５０００〜６８０００の画分
に相当）が本来のＡＴ−III である。処理後組成物で
は、高分子画分は認められず、未処理組成物と同様の一
峰性を維持することがわかった。
理し、その溶出パターンを比較検討した。また、未処理
組成物をそのまま加熱処理した直後のものを対照として
併せて検討した。ゲル濾過の条件は、担体：ＴＳＫゲル
Ｇ３０００−ＳＷ−ＸＬ（東ソー社製）、溶出液：０．
２Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．８）、検出：２８０ｎｍにおける吸光度であった。
その結果、対照においては、二峰性を示し、この２つの
ピークのうち、高分子画分は、加熱処理前の溶出パター
ンから推測して熱変性蛋白に基づくものと考えられた。
これは、実施例１に示した「重合体」に相当する。な
お、低分子画分（分子量６５０００〜６８０００の画分
に相当）が本来のＡＴ−III である。処理後組成物で
は、高分子画分は認められず、未処理組成物と同様の一
峰性を維持することがわかった。
【００２６】実験例５ ウイルスの不活化 未処理組成物に各種ウイルスを懸濁させた５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７）を添加し、各種ウイルスが添加され
た各未処理組成物それぞれを実施例１に準じてカラム処
理および加熱処理した。処理前後の各組成物における各
種ウイルスの感染性をプラーク形成法により測定した。
その結果を表１に示す。表１中、エコ−ウイルスの単位
はＴＣＩＤ50／ｍｌ、それ以外の単位はｐｆｕ／ｍｌで
ある。
酸緩衝液（ｐＨ７）を添加し、各種ウイルスが添加され
た各未処理組成物それぞれを実施例１に準じてカラム処
理および加熱処理した。処理前後の各組成物における各
種ウイルスの感染性をプラーク形成法により測定した。
その結果を表１に示す。表１中、エコ−ウイルスの単位
はＴＣＩＤ50／ｍｌ、それ以外の単位はｐｆｕ／ｍｌで
ある。
【００２７】
【表１】
【００２８】
【発明の効果】本発明によれば、ＡＴ−III の活性を損
失することなく、効果的にウイルスが不活化され、かつ
パイロジェンが除去されたＡＴ−III 含有組成物を提供
することができる。本発明の製造方法によれば、ＡＴ−
III を不溶性担体に吸着し、その状態で液状加熱を行
い、ウイルスの不活化およびパイロジェンの除去を効率
よく行うことができるため、安全性に優れた医薬品の工
業的製法としてきわめて有用な製造方法を提供すること
ができる。
失することなく、効果的にウイルスが不活化され、かつ
パイロジェンが除去されたＡＴ−III 含有組成物を提供
することができる。本発明の製造方法によれば、ＡＴ−
III を不溶性担体に吸着し、その状態で液状加熱を行
い、ウイルスの不活化およびパイロジェンの除去を効率
よく行うことができるため、安全性に優れた医薬品の工
業的製法としてきわめて有用な製造方法を提供すること
ができる。
Claims (2)
- 【請求項１】 次の各工程を含むアンチトロンビンIII
含有組成物の製造方法。 ウイルス夾雑の可能性のあるアンチトロンビンIII 含
有液状組成物を、当該アンチトロンビンIII と親和性を
有するリガンドが結合された不溶性担体に接触・吸着さ
せる工程、 次に、アンチトロンビンIII を不溶性担体に吸着させ
た状態で、実質的にウイルスが不活化されるまで液状加
熱処理する工程、 さらに、液状加熱処理したアンチトロンビンIII を不
溶性担体から溶出・回収する工程。 - 【請求項２】 請求項１記載の製造方法により得られた
アンチトロンビンIII 含有組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7326116A JPH09157184A (ja) | 1995-12-14 | 1995-12-14 | アンチトロンビンｉｉｉ含有組成物およびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7326116A JPH09157184A (ja) | 1995-12-14 | 1995-12-14 | アンチトロンビンｉｉｉ含有組成物およびその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09157184A true JPH09157184A (ja) | 1997-06-17 |
Family
ID=18184267
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7326116A Pending JPH09157184A (ja) | 1995-12-14 | 1995-12-14 | アンチトロンビンｉｉｉ含有組成物およびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09157184A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2004092218A1 (ja) * | 2003-04-17 | 2006-09-07 | 三菱ウェルファーマ株式会社 | 組換えアンチトロンビンの製造方法 |
-
1995
- 1995-12-14 JP JP7326116A patent/JPH09157184A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2004092218A1 (ja) * | 2003-04-17 | 2006-09-07 | 三菱ウェルファーマ株式会社 | 組換えアンチトロンビンの製造方法 |
| JP2011042667A (ja) * | 2003-04-17 | 2011-03-03 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corp | 組換えアンチトロンビンおよびその製造方法 |
| JP4651536B2 (ja) * | 2003-04-17 | 2011-03-16 | 田辺三菱製薬株式会社 | 組換えアンチトロンビンの製造方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0278422B1 (en) | y-Globulin injectable solutions | |
| JPH09500369A (ja) | 治療用の免疫グロブリンｇ濃厚液および該濃厚液の製造方法 | |
| WO2001072844A2 (en) | A METHOD OF PRODUCING IgG | |
| AU2001273907A1 (en) | A method of producing IgG | |
| CN106349387B (zh) | 一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化α1-抗胰蛋白酶的方法 | |
| US4749783A (en) | Viral inactivation and purification of active proteins | |
| ES2373035T3 (es) | Método para eliminar polímeros de seroalbúmina humana. | |
| JP3471379B2 (ja) | ヒトアンチトロンビン−ｉｉｉの調製方法 | |
| EP0726311B1 (en) | Process for preparing human activated protein c | |
| KR0139049B1 (ko) | 안티트롬빈-iii의 정제 방법 및 이 안티트롬빈-iii를 함유한 안티트롬빈-iii 제제 | |
| JPH0376292B2 (ja) | ||
| JPH09157184A (ja) | アンチトロンビンｉｉｉ含有組成物およびその製造方法 | |
| US5989593A (en) | Method for producing antithrombin-III, method for purifying it, and preparation containing it | |
| US4694074A (en) | Process for the purification of HBsAg | |
| JP2678249B2 (ja) | アンチトロンビン−▲ｉｉｉ▼製剤 | |
| JP3595466B2 (ja) | 精製アンチトロンビン−ｉｉｉおよびその製法 | |
| JP2000103800A (ja) | 免疫グロブリンａの精製方法 | |
| JP2729484B2 (ja) | アンチトロンビン−▲ｉｉｉ▼の精製方法 | |
| JPH10168100A (ja) | アンチトロンビン−ｉｉｉの精製法 | |
| JPH05339297A (ja) | オボトランスフェリンの分離方法 | |
| JPH01196295A (ja) | プロウロキナーゼからの発熱性物質除去方法 | |
| JPS6030293B2 (ja) | 人顆粒球の分化増殖を促進する加熱処理ｈｇｉｇｐ及びｈｇｉｇｐの加熱処理方法 | |
| JPH1053534A (ja) | α２プラスミンインヒビターの製造方法 | |
| JPH02304030A (ja) | 抗ｎａｎｂウイルス抗体陽性静注用免疫グロブリン製剤の製造方法 | |
| JPH09176045A (ja) | 静注用免疫グロブリン製剤 |