KR0139049B1 - 안티트롬빈-iii의 정제 방법 및 이 안티트롬빈-iii를 함유한 안티트롬빈-iii 제제 - Google Patents

안티트롬빈-iii의 정제 방법 및 이 안티트롬빈-iii를 함유한 안티트롬빈-iii 제제

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Abstract

내용없음

Description

안티트롬빈-Ⅲ의 정제 방법 및 이 안티트롬빈-Ⅲ을 함유한 안티트롬빈-Ⅲ 제제
제1도는 크로마토그래피용 소수성 담체로 처리전 및 후의 겔여과에 의한 안티트롬빈-Ⅲ 함유 분획의 용출 패턴을 나타내는 것이다.
본 발명은 안티트롬빈-Ⅲ 제제 및 그의 제조방법, 더욱 특별하게는 안티트롬빈-Ⅲ의 정제 방법 및 비루스가 비활성화되고 오염물질이 실제적으로 제거된 상기 방법에서 수득된 인간 혈장-유래 안티트롬빈-Ⅲ-함유 안티트롬빈-Ⅲ 제제에 관한 것이다.
안티트롬빈-Ⅲ은 혈장에 존재하는 α2-글로불린에 속하는 당단백질의 일종이며, 65,000∼68,000의 분자량을 가지며, 프로테아제 억제활성을 가지며, 트롬빈의 응고활성을 강하게 억제한다.
더욱이, 안티트롬빈-Ⅲ은 트롬빈 억제활성 뿐만 아니라 활성인자 Ⅹ, 활성인자 Ⅸ 등의 억제활성을 나타낸다. 또한, 안티트롬빈-Ⅲ은 플라스민 또는 트립신을 억제한다는 것이 보고되어 있다.
이러한 억제활성은 일반적으로 헤파린의 존재하에 더 가속된다.
이런 약리활성을 갖는 안티트롬빈-Ⅲ은 비정상적으로 강화된 응고, 더욱 특별하게는 전파된 혈관내 응고(DIC)를 교정하는데 사용될 수 있다.
안티트롬빈-Ⅲ 정제 단계에서, 피로겐 또는 단백질 불순물과 같은 오염이 생기며, 이러한 오염물을 제거하기 위한 각종 방법이 연구되고 있다. 또 다른 새로운 문제점은 혈장 단백질 성분에 포함될 수 있는 간염 비루스 등을 비활성화시키기 위해 수행되는 액체 상태에서 60℃로 10시간동안 열처리함으로써 형성된 열변성 단백질의 존재이다. 열변성 단백질을 제거하기 위해 고정 헤파린을 사용하여 다시 안티트롬빈-Ⅲ을 처리하는 방법이 최근 제안되었다[일본국 특허출원 공개 제63-23896(EP-A-0252392)호]. 그러나, 이 방법은 피로겐 등을 제거하는데는 매우 비효과적임이 명백하다.
이러한 상황하에서, 본 발명자들은 연구를 계속한 결과, 안티트롬빈-Ⅲ-함유 수용액을 크로마토그래피용 소수성 담체로 처리함으로써 더욱 우수한 안전성을 갖는 안티트롬빈-Ⅲ 제제를 제조할 수 있다는 것을 발견하였다. 그럼으로써 본 발명이 완성되었다.
본 발명에 따라, 인간 혈장으로부터 유래된 안티트롬빈-Ⅲ의 수용액을 리간드로서 소수성기를 함유한 불용성 담체와 접촉시키고, 미흡착된 용액을 회수함을 특징으로 하는 안티트롬빈-Ⅲ의 정제방법이 제공된다.
또한, 본 발명에 따라, 비루스가 비활성화되고, 적어도 피로겐 오염물 및 비활성화에 의해 형성된 열변성 단백질을 실제적으로 함유하지 않은 안간 혈장-유래 안티트롬빈-Ⅲ을 함유한 안티트롬빈-Ⅲ 제제가 제공된다.
본 발명에 따라 제공된 안티트롬빈-Ⅲ 제제는 하기의 특성을 갖는다.
(1) 이 제제는 인간 혈장으로부터 유래된 안티트롬빈-Ⅲ을 함유한다.
(2) 비루스가 비활성화 된다.
(3) 이 제제는 불순물 또는 오염물을 실제적으로 함유하지 않는다.
오염물 또는 불순물의 예로는 피로겐, 열변성 단백질, 안티트롬빈-Ⅲ 이외의 혈장 단백질(예를 들면, 셀룰로플라스민, 트렌스퍼린, 알부민, 합토글로빈, α2-마크로글로불린, α1-안티트립신, IgA, IgG 등) 등이 있다.
(4) 안티트롬빈-Ⅲ의 비활성은 약 6∼7단위/mg 단백질이다.
본 발명에 사용된 안티트롬빈-Ⅲ은 인간으로부터 유래되었고 약으로 사용할 정도로 정제된 것이며 특별히 제한되지 않는다. 안티트롬빈-Ⅲ은 예를 들면 인간전혈액, 혈장, 혈청 또는 응고된 혈액으로부터 채취된 혈청 등으로부터 정제될 수 있다.
안티트롬빈-Ⅲ을 제조하기 위한 출발물질로는 예를 들면 혈장, 콘의 냉에탄올 방법에 의해 수득된 분획 Ⅳ, Ⅳ-1, Ⅳ-4 및 Ⅳ-1+Ⅳ-4 ; 혈액응고인자 Ⅷ을 시트레이트-함유 혈장으로부터 회수한 후에 남아 있는 잔류 분획 등이 있다.
안티트롬빈-Ⅲ의 정제를 위해, 예를 들면 일본국 특허출원 공개 제48-35017호(미합중국 특허 제3,842,061호) 및 일본국 특허출원 공고 제59-7693호(미합중국 특허 제4,340,589호)에 기재된 방법을 사용한다.
안티트롬빈-Ⅲ의 순도는 특별히 제한되지 않으며, 높은 순도를 나타내는 것일수록 우수한 효과를 제공한다.
안티트롬빈-Ⅲ-함유 수용액의 단백질 농도는 일반적으로 약 0.1∼10(w/v)%이다.
안티트롬빈-Ⅲ-함유 수용액은 본 발명에 따라 크로마토그래피용 소수성 담체로 처리하기 전에 열처리(50∼70℃, 약 5∼30시간) 하는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 소수성기를 리간드로 함유하는 불용성 담체는 하기에 설명한다.
소수성기의 예로는 임의 치환될 수 있는 페닐기, 알킬기(약 1∼10 탄소원자, 바림직하게는 약 3∼5 탄소원자를 갖는) 등이 있다.
불용성 담체의 예로는 셀룰로오즈, 아가로오즈, 덱스트란, 폴리아크릴아미드, 아미노산 공중합체, 폴리비닐계 중합체, 폴리스티렌계 중합체 등이 있다.
소수성기를 리간드로 함유하는 불용성 담체로는 알킬계 세파로스(예. 옥틸계 세파로스 등), 페닐계 세파로스, 알킬계 폴리비닐(예. 부틸계 폴리비닐 등) 등이 시판되고 있다.
상술한 것 이외의 불용성 담체도 시판 제품의 제조방법과 같은 방법으로 용이하게 제조될 수 있다.
본 발명에서 정제단계는 일반적으로 안티트롬빈-Ⅲ-함유 수용액을 소수성기를 리간드로 함유하는 불용성 담체와 접촉시킴으로써 수행된다. 이 단계는 컬럼 방법 또는 회분식 방법에 의해 수행될 수 있다.
접촉은 pH 약 6∼9 및 염농도 약 1∼5M의 조건하에 수행될 수 있다. 이러한 조건에 적당한 용매로는 3M 염화나트륨을 함유한 20mM 소듐 시트레이트 완충액(pH7.5), 2M 염화나트륨을 함유한 50mM 포스페이트 완충액(pH7.5) 등이 예시된다.
본 발명의 정제 단계는 하기에 특별히 설명한다. 회분식 방법의 경우, 상술한 조건으로 조절된 안티트롬빈-Ⅲ-함유 수용액을 같은 조건으로 평형된 크로마토그래피용 소수성 담체와 접촉시킨다. 더욱 상세하게는 1ml의 담체를 2∼20℃에서 약 30분∼약 2시간동안 1∼100ml의 수용액과 혼합한다. 그 후, 원심분리하여 상층액을 회수한다.
컬럼 방법의 경우, 상술한 조건으로 조절된 안티트롬빈-Ⅲ-함유 수용액을 같은 조건하에서 평형된 컬럼에 패킹된 크로마토그래피용 소수성 담체로 전개하고, 미흡착 분획을 회수한다.
이렇게 수득된 안티트롬빈-Ⅲ은 통상의 방법에 의해 제제화될 수 있다. 바람직하게는, 흡착된 분획을 음이온 교환기로 처리하여 회수한 후, 상술한 미흡착 분획을 더 정제한다.
음이온 교환기의 예로는 DEAE형(예. DEAE-아가로즈, DEAE-덱스트란, DEAE-셀룰로오즈 등), QAE형(예. QAE-아가로즈, QAE-덱스트란 등) 등이 있다.
접촉은 예를 들면 pH 약 6∼8, 염농도 약 0.01∼0.1M의 조건하에 수행된다. 이러한 조건에 적당한 용매로는 0.05M 염화나트륨을 함유한 0.01M 시트레이트 완충액(pH7) 등이 예시된다.
용출 조건은 예를 들면 pH 약 6∼8 및 염농도 약 0.1∼0.3M이다. 이러한 조건에 적당한 용매로는 0.17M 염화나트륨을 함유한 0.01M 시트레이트 완충액(pH7)이 예시된다.
용출은 컬럼 방법 또는 회분식 방법에 의해 수행될 수 있다.
회분식 방법의 경우, 상술한 조건으로 조절된 안티트롬빈-Ⅲ-함유 수용액을 같은 조건하에 평형된 음이온 교환기와 접촉시킨다. 더욱 상세하게는 1ml의 음이온 교환기를 2∼20℃에서 30분∼약 2시간동안 1∼100ml의 수용액과 혼합한다. 그 후, 원심분리하여 교환기를 회수한다. 또한, 상술한 용출 용매를 교환기에 가한다. 혼합조건은 접촉조건과 동일하다. 생성된 혼합물을 원심분리하여 상층액을 회수한다.
한편, 컬럼 방법에서, 상술한 조건으로 조절된 안티트롬빈-Ⅲ-함유 수용액을 같은 조건하에 평형된 컬럼에 패킹된 음이온 교환기와 접촉시키고, 미흡착 분획을 제거한다. 필요하다면 컬럼을 세척한 후, 용출 용매를 흘려보내 흡착분획을 회수한다.
필요 및 바람직하다면, 수득된 안티트롬빈-Ⅲ을 더 정제하여 통상의 방법으로 제제화 할 수 있다. 제제형의 예로는 수용액, 현탁액, 동결 건조제제 등이 있다. 이러한 제제를 제조하기 위해, 약학적으로 수용가능한 첨가제(희석제, 등장화제, 표면활성제 등)를 통상의 방법으로 안티트롬빈-Ⅲ와 적당히 혼합한다. 이들 제제는 정맥내, 피하 등의 경로로 투여될 수 있다. 동결 건조제제는 사용시 주사용 증류수로 용해시켜 사용한다.
본 발명의 정제 방법에 따라, 안티트롬빈-Ⅲ-함유 수용액에 포함될 수 있는 피로겐, 단백질 불순물 및 열처리에 의해 형성된 열변성 단백질이 수용액으로부터 효과적으로 제거될 수 있다. 그러므로, 우수한 안전성을 갖는 안티트롬빈-Ⅲ 제제가 제공될 수 있다.
덧붙여, 본 발명에 따라, 처리 단계가 단순하며 안티트롬빈-Ⅲ 제제의 대량생산에 적당하다. 그러므로, 본 발명은 공업적 규모의 생산에 극히 유용하다.
본 발명은 하기 실시예를 참고로 더욱 상세히 설명되며, 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
100ℓ의 생리식염수에 콘의 냉알콜 분획화에 의해 수득된 분획 Ⅳ-1의 페이스트 10kg을 현탁시킨다. 이 현탁액에 5(w/v)% 농도의 황산 바륨을 가한다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하여 황산 바륨에 존재하는 미량의 프로트롬빈을 흡착시키고, 이를 제거한다. 상층액의 pH를 6.5로 조절하고, 13(w/v)% 농도의 폴리에틸렌 글리콜 #4,000을 상층액에 가한다. 형성된 침전물을 원심분리 제거한다. 30(w/v)% 농도의 폴리에틸렌 글리콜 #4,000을 더 가하고, 형성된 침전물을 원심분리에 의해 회수한다. 침전물을 약 20ℓ의 냉 생리식염수에 용해시킨다. 이 용액을 미리 생리식염수로 평형된 헤파린 처리 세파로스 컬럼에 채워 컬럼에 안티트롬빈-Ⅲ을 흡착시킨다. 컬럼을 0.4M 염화나트륨 용액으로 세척하여 단백질 불순물을 제거한다. 그 후 2.0M 염화나트륨 용액을 컬럼에 통과시키고, 용출액을 회수한다.
0.6M 농도의 소듐 시트레이트를 안티트롬빈-Ⅲ의 수용액에 가한다. 혼합물의 pH를 7.8로 조절한 후, 60℃에서 10시간동안 열처리한다. 이어서 염화나트륨(최종 농도 3M) 및 소듐 시트레이트(최종 농도 20mM)를 혼합물에 가한다. 생성된 혼합물의 pH를 7.5로 조절한다. 한편 안티트롬빈-Ⅲ-함유 수용액을 3M 염화나트륨을 함유한 20mM 소듐 시트레이트 완충액으로 평형된 부틸계 폴리비닐 담체(BUTYL TOYOPEARL 650, 도요소다사제)와 접촉시키고, 상술한 완충액으로 전개하여 미흡착 분획을 회수한다. 이어서, 0.9% 염화나트륨 용액을 투석하면서, 미-흡착 분획을 농축하여 1(w/v)% 안티트롬빈-Ⅲ 수용액을 수득한다. 필요 및 바람직하다면, 원심분리를 수행하여 투명한 용액을 수득한다.
1(w/v)% 안티트롬빈-Ⅲ 수용액에 2(w/v)%의 만니톨 및 0.2(w/v)% 소듐 시트레이트를 가한다. 혼합물을 염화나트륨 농도가 0.5%가 되도록 소량의 냉증류수로 희석한다.
수산화나트륨에 의해 그의 pH를 7.6으로 조절한 후, 멸균 마이크로 포어 필터를 통해 무균여과를 수행한다. 각각 500단위씩 충전하고, 동결 건조하여 건조제제를 수득한다.
[실시예 2]
분획 Ⅳ-1 페이스트 대신 분획 Ⅳ-1+Ⅳ-4를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 유사한 방법으로 실시예 1과 유사한 안티트롬빈-Ⅲ 제제를 제조한다.
[실시예 3]
분획 Ⅳ-1 페이스트 대신 저온에서의 시트레이트-함유 혈장의 처리를 통해 혈액응고 인자 Ⅷ을 회수한 후 남아 있는 분획을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 유사한 방법으로 실시예 1과 유사한 안티트롬빈-Ⅲ 제제를 제조한다.
[실시예 4]
실시예 1과 유사한 방법으로 소수성 크로마토그래피 처리를 수행한 후, DEAE-덱스트란으로 처리한다. 즉, 소수성 크로마토그래피에 의한 처리를 통해 실시예 1에서 수득된 안티트롬빈-Ⅲ-함유 수용액을 0.05M 염화나트륨 및 0.01M 소듐 시트레이트 농도 및 pH7이 되도록 조절한다. 그리고, 수용액을 0.05M 염화나트륨-함유 0.01M 시트레이트 완충액(pH7)으로 평형된 DEAE-덱스트란(DEAE-세파덱스 A-50, 파마시아사)을 통해 통과시킨다. 컬럼과 같은 용매로 더 헹군 후, 0.17M 염화나트륨-함유 0.01M 시트레이트 완충액(pH7)으로 용출시키고, 용출된 분획을 회수한다. 이어서, 실시예 1과 유사한 방법으로 제제화 공정을 수행하여 안티트롬빈-Ⅲ 제제를 수득한다.
[실시예 5]
실시예 4에서 수득된
안티트롬빈-Ⅲ 건조 분말 500단위
염화나트륨 500mg
소듐 시트레이트 52mg
상기의 조성을 갖는 제제를 사용시 20ml의 주사용 증류수에 용해시킨다. 용액을 정맥내 투여 또는 정맥내 적주시킨다. 1단위는 건강한 지원자의 혈장 1ml에 포함된 안티트롬빈-Ⅲ 농도에 상응한다.
실험 1
(1) 피로겐의 제거
실시예 1과 유사한 방법으로 안티트롬빈-Ⅲ의 소수성 크로마토그래피 처리를 수행한 후, 처리전 및 후에 안티트롬빈-Ⅲ 함유 분획에 포함된 피로겐의 검출 시험을 2번(제1시료 및 제2시료 각각에 수행) 수행한다. 이 시험은 일본 약국방에서 정의된 피로겐 시험 방법에 따라 수행한다. 결과는 표 1에 나타낸다.
표 1
Figure kpo00001
표 1에 나타낸 바와 같이, 전체 온도는 소수성 크로마토그래피 처리를 통해 저하되며, 피로겐이 실제적으로 제거된다.
(2) 단백질 오염물의 제거
(a) 비활성
소수성 크로마토그래피 처리를 실시예 1과 유사한 방법으로 수행한 후, 처리전 및 후의 안티트롬빈-Ⅲ-함유 분획 중의 총 단백질량 및 안티트롬빈-Ⅲ 활성을 측정하여 그의 비활성을 계산한다. 총 단백질량은 켈달 방법에 의해 측정한다. 안티트롬빈-Ⅲ 활성(AT-Ⅲ 활성)은 다음과 같이 측정한다. 시료를 28℃에서 5분 동안 트롬빈과 반응시키고, 피부린을 반응 혼합물에 가한다. 이 경우에 그의 응고시간은 연장 정도를 측정한다. 미리 작성된 눈금 곡선과 비교하여 그의 역가를 결정한다. 1단위는 건강한 지원자의 혈장 1ml에 포함된 안티트롬빈-Ⅲ 농도에 상응한다. 수득된 결과는 표 2에 나타낸다.
표 2
Figure kpo00002
AT-Ⅲ : 안티트롬빈-Ⅲ
표 2에 나타낸 바와 같이, 안티트롬빈-Ⅲ 활성 및 비활성은 소수성 크로마토그래피 처리를 통해 증가된다. 특히, 비활성은 4.9(단위/mg 단백질)에서 6.4(단위/mg 단백질)로 증가된다.
(b) 혈장 단백질 불순물의 제거
안티트롬빈-Ⅲ의 소수성 크로마토그래피 처리를 실시예 1과 유사한 방법으로 수행한 후, 안티트롬빈-Ⅲ-함유 분획 중의 혈장 단백질 불순물의 존재여부를 처리전 및 후에 오터로니(Ouchterlony)의 시험에 의해 검사한다. 결과는 표 3에 나타낸다.
표 3
Figure kpo00003
(c) 겔 여과
안티트롬빈-Ⅲ의 소수성 크로마토그래피 처리를 실시예 1과 유사한 방법으로 수행한 후, 처리전 및 후에 안티트롬빈-Ⅲ-함유 분획을 겔 여과한다. 그리고 그의 용출 패턴을 비교한다. 결과는 제1도에 나타낸다. 겔 여과 조건은 다음과 같다.
담체 : TSK Gel G3000 SW-XL(도소사제)
용리액 : 0.2M 염화나트륨 함유 0.1M 포스페이트 완충액(pH 6.8)
검출 : 280nm에서 흡광도
제1도에 나타낸 바와 같이, 처리전의 분획은 2개의 피이크를 나타낸다. 이들 피이크에서 고분자 분획은 열처리전의 용출패턴으로 보아 열변성 단백질로 간주된다. 소수성 크로마토그래피 처리를 통해 이러한 고분자 분획이 사라지고 1개의 피이크만이 얻어짐을 알 수 있다.
(d) 혈장 단백질 불순물의 제거
소수성 크로마토그래피 처리 및 음이온 교환기 처리를 실시예 4와 유사한 방법으로 수행한다. 상술한 소수성 크로마토그래피 처리전에 수득된 안티트롬빈-Ⅲ-함유 분획 및 안티트롬빈-Ⅲ-함유 수용액에 대하여, 혈장 단백질 불순물의 존재 또는 부재를 오터로니 시험에 의해 검사한다. 시험은 100mg/ml의 단백질 농도에서 수행한다. 결과는 표 4에 나타낸다.
표 4
Figure kpo00004
주 : + : 침강선이 확인된다.
- : 침강선이 확인되지 않는다.
실험 2
실시예 1에서 수득된 안티트롬빈-Ⅲ 동결 건조 제제를 주사용 증류수에 용해시킨다. 이 용액을 4,000단위/kg에 상응하는 양으로 꼬리 정맥을 통해 5마리의 생쥐에게 투여한다. 7일 동안 관찰하였으나 어떠한 비정상도 발견되지 않았다. 더욱이, 이 용액 5000단위/kg을 토끼에게 투여한다. 24시간동안 관찰하였으나 체온의 비정상은 발견되지 않았다.

Claims (7)

  1. 인간 혈장으로부터 유래된 안티트롬빈-Ⅲ의 수용액을 열처리하고, 안티트롬빈-Ⅲ 수용액을 소수성기를 리간드로 함유하는 불용성 담체와 접촉시키고, 그 중 미흡착 분획을 회수함을 특징으로 하는 안티트롬빈-Ⅲ의 정제방법.
  2. 제1항에 있어서, 접촉을 pH 6∼9 및 1∼5M의 염 농도의 조건하에서 수행하는 안티트롬빈-Ⅲ의 정제방법.
  3. 제1항에 있어서, 소수성기가 알킬기인 안티트롬빈-Ⅲ의 정제방법.
  4. 제1항에 있어서, 회수된 미흡착 분획을 음이온 교환기와 접촉시키고, 그의 흡착 분획을 용출시켜 회수하는 안티트롬빈-Ⅲ의 정제방법.
  5. 비루스가 비활성화되고, 적어도 피로겐 및 상기 비활성화에 의해 형성된 열변성 단백질의 오염물을 실제적으로 함유하지 않는, 인간 혈장으로부터 유래된 안티트롬빈-Ⅲ을 함유하는 안티트롬빈-Ⅲ 제제.
  6. 제5항에 있어서, 피로겐, 열변성 단백질 및 안티트롬빈-Ⅲ 이외의 불순물로서 혈장 단백질을 실제적으로 함유하지 않는 안티트롬빈-Ⅲ 제제.
  7. 제5항에 있어서, 불순물로서 피로겐, 열변성 단백질, 알부민, 합토글로빈, α2-마크로글로불린, α1-안티트립신 및 IgA를 실제적으로 함유하지 않는 안티트롬빈-Ⅲ 제제.
KR1019890005684A 1988-04-28 1989-04-28 안티트롬빈-iii의 정제 방법 및 이 안티트롬빈-iii를 함유한 안티트롬빈-iii 제제 KR0139049B1 (ko)

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