JP4772905B2

JP4772905B2 - アンチトロンビン組成物の製造方法

Info

Publication number: JP4772905B2
Application number: JP2009507556A
Authority: JP
Inventors: 努杉原; 摂子小野寺; 知也浦久保; 敏行須澤
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2007-04-02
Filing date: 2008-04-02
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2028-04-02
Also published as: EP2141178A4; WO2008120801A1; US20100113754A1; US8076462B2; JPWO2008120801A1; EP2141178A1

Description

本発明はアンチトロンビン組成物の製造方法に関する。より詳しくは、アンチトロンビン含有水溶液より所望のα体含有率またはβ体含有率を有する、アンチトロンビン組成物の製造方法に関する。

アンチトロンビンは血中における重要な血液凝固阻害系因子（セリンプロテアーゼ阻害剤）であり、血液凝固などに関わるセリンプロテアーゼと１分子対１分子で安定な複合体を不可逆的に形成することにより活性を阻害する。アンチトロンビンは、主として肝臓で合成され、ヒト血漿中に約１５０ｍｇ／Ｌ存在する（非特許文献１）。

アンチトロンビンは４３２個のアミノ酸残基よりなる分子量約５９０００〜６５０００の糖蛋白質であり、分子内に３個のジスルフィド結合（Ｃｙｓ８−Ｃｙｓ１２８、Ｃｙｓ２１−Ｃｙｓ９５およびＣｙｓ２４７−４３０）を有している。アンチトロンビンのＮ末端から９６番目、１３５番目、１５５番目および１９２番目の４箇所のアスパラギン残基（それぞれＡｓｎ９６、Ａｓｎ１３５、Ａｓｎ１５５およびＡｓｎ１９２と表す）にＮ−グリコシド結合により糖鎖が付加する。ヒト血漿中に存在するアンチトロンビンには、４本のＮ−グリコシド結合糖鎖を有するα体（又はα型）およびＡｓｎ１３５へのＮ−グリコシド結合糖鎖の付加がなく３本の糖鎖しか有さないβ体（またはβ型）の２種類のアイソフォームが存在する（非特許文献２、非特許文献３）。アンチトロンビンにＮ−グリコシド結合した糖鎖は、Ｎ−アセチルグルコサミン、シアル酸、ガラクトースおよびマンノースから構成される複合糖鎖であり、末端にはシアル酸が結合する。糖蛋白質は、糖鎖末端に結合したシアル酸結合数が多いほど、血液中の半減期が長い。これは、シアル酸が脱離すると非還元末端に露出したガラクトース残基が、肝臓などに局在するアシアロ糖蛋白質受容体（ガラクトース受容体）に捕捉され、速やかに分解されるためといわれている（非特許文献４、非特許文献５）。また、アンチトロンビンは熱などの物理的ストレスまたは酸などの化学的ストレスにより、容易に不活性体（ｌａｔｅｎｔ体）を形成する（非特許文献６）。

ヒト血漿中のアンチトロンビンは、９０〜９５％がα体、残りの５〜１０％がβ体で構成される（非特許文献２）。またヒト血漿中のアンチトロンビンに結合した糖鎖の約７０％にシアル酸が一糖鎖あたり２分子、残り約３０％にシアル酸が一糖鎖あたり１分子結合している（非特許文献１、非特許文献７）。

ヒト血漿より精製されたアンチトロンビンは、先天性アンチトロンビン欠乏に基づく血栓症、およびアンチトロンビン低下を伴う汎用性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の治療薬として用いられている。しかし、ヒト血漿より精製されたアンチトロンビンは、ＡＩＤＳウイルス、ヒトパルボウイルスなどの血液由来ウイルス、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、伝播性海綿状脳症（ＴＳＥ）の因子などが混入する恐れがある。このような背景から、近年、遺伝子組換え技術を応用し、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などの動物細胞や、トランスジェニック動物を用いた組換えアンチトロンビンの生産が試みられている。

アンチトロンビン生産遺伝子組換えＣＨＯ細胞やトランスジェニック動物より得られたアンチトロンビンは、ヒト血漿由来アンチトロンビン精製物とは異なり、α体、β体、不活性体、不活性前駆体（ｐｒｅｌａｔｅｎｔ体）、会合体または宿主由来不純物などの混合物として得られる。また、糖鎖末端のシアル酸結合数も不均一である（非特許文献８、非特許文献９）。

アンチトロンビンの精製方法として、ヘパリンクロマトグラフィ（非特許文献３）、陽イオン交換クロマトグラフィ（特許文献１）、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ（特許文献２）または疎水クロマトグラフィ（非特許文献８、非特許文献９、特許文献３、特許文献４）などが知られている。しかし、α体、β体、不活性体、不活性前駆体または会合体の混合物から所望のα体またはβ体含有率を有するアンチトロンビン組成物を調製する方法は知られていない。
続医薬品の開発，２０，１８５（１９９２）血栓止血誌，１０，９３（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，６１０（１９８５）ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｏｆｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｔｅｒｅｓｔＦｏｕｒｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ（１９８７）Ｂｌｏｏｄ，７３，８４（１９８７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２，２５７（１９９４）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２０３，４５８（１９８０）ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，４１，３２３（２００５）Ｂｌｏｏｄ，９１，４５６１（１９９８）特表２００３−５２０８０５特表２００３−５２０８０６特許第２８５２３０７号特許第２６７８２４９号

本発明は、アンチトロンビン含有水溶液より所望のα体またはβ体含有率を有するアンチトロンビン組成物を高収率で製造する方法を提供することを目的とする。

本発明は以下の（１）〜（１１）に関する。
（１）アンチトロンビン含有水溶液をセルファインサルフェイトクロマトグラフィ担体に接触させ、所望のα体またはβ体含有率を有するアンチトロンビン組成物を調製することを特徴とする、アンチトロンビン組成物の製造方法。
（２）アンチトロンビン含有水溶液をセルファインサルフェイトクロマトグラフィ担体に接触させ、該担体に吸着したアンチトロンビン組成物を溶出液の導電率を上げることにより溶出させ、該溶出液より所望のα体またはβ体含有率を有するアンチトロンビン組成物を調製することを特徴とする、アンチトロンビン組成物の製造方法。
（３）導電率を調整したアンチトロンビン含有水溶液をセルファインサルフェイトクロマトグラフィ担体に接触させ、該担体への非吸着画分より所望のα体またはβ体含有率を有するアンチトロンビン組成物を調製することを特徴とする、アンチトロンビン組成物の製造方法。
（４）さらに陰イオン交換クロマトグラフィおよび／または疎水クロマトグラフィを行うことを含む、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）（１）〜（３）に記載の調製を行った後に、疎水クロマトグラフィを行う、（４）に記載の方法。
（６）アンチトロンビン組成物が、糖鎖を有するアンチトロンビンからなる組成物であって、該組成物中に含まれるアンチトロンビンに結合する糖鎖１本あたり平均１個以上３個以下のシアル酸分子を有するアンチトロンビン組成物である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）アンチトロンビン組成物が、糖鎖を有するアンチトロンビンからなる組成物であって、該組成物中に含まれるアンチトロンビンに結合する糖鎖１本あたり平均１．５個以上２．５個以下のシアル酸分子を有するアンチトロンビン組成物である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（８）アンチトロンビンに結合している糖鎖が３本または４本である、（６）または（７）に記載の方法。
（９）アンチトロンビン組成物が、糖鎖を有するアンチトロンビンからなる組成物であって、該組成物中に含まれるアンチトロンビン１分子あたり平均３個以上１２個以下のシアル酸分子を有するアンチトロンビン組成物である、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）アンチトロンビン組成物が、糖鎖を有するアンチトロンビンからなる組成物であって、該組成物中に含まれるアンチトロンビン１分子あたり平均６個以上８個以下のシアル酸分子を有するアンチトロンビン組成物である、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の方法。
（１１）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法で製造されるアンチトロンビン組成物。

本発明により、アンチトロンビン含有水溶液より、所望のα体含有率またはβ体含有率を有するアンチトロンビン組成物を高収率で製造する方法が提供される。本発明により製造されたアンチトロンビン組成物は、医薬品として有用である。

本発明は、アンチトロンビン含有水溶液をセルファインサルフェイトクロマトグラフィ担体に接触させ、所望のα体またはβ体含有率を有するアンチトロンビン組成物を調製することを特徴とする、アンチトロンビン組成物の製造方法に関する。

本発明において、アンチトロンビン含有水溶液としては、アンチトロンビンが含まれる水溶液であればいずれでも良く、例えばα体、β体、不活性体、不活性前駆体、会合体、Ｎ末あるいはＣ末端の欠失体、アミノ酸改変体、糖鎖置換体、アンチトロンビン誘導体、宿主細胞由来不純物、または製造工程由来不純物などが含まれる水溶液があげられる。さらに、アンチトロンビン含有水溶液には、各種添加物、例えばシアル酸などのシアリダーゼ阻害剤などが含まれていてもよい。シアリダーゼ阻害剤としては、シアル酸の一種であるＮ−アセチルノイラミン酸や２，３−デヒドロ−２−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（５−アセタミド−２，６−アンヒドロ−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノン酸、Ｎｅｕ５Ａｃ２ｅｎあるいは２，３−Ｄともいう）などのＮ−アセチルノイラミン酸誘導体［ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｎｚｙｍｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ３^ｒｄ，ｒｅｖｉｓｅｄａｎｄｅｎｌａｒｇｅｄｅｄｉｔｉｏｎＰａｒｔＡ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（１９９９）、ＵＳ５５１０２６１、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，３，２０１，（１９９３）］、塩化銅［Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５５，３９０（１９９７）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３，６９２（１９９５）、ＵＳ６５２８２８６］またはシアリダーゼに対する抗体（特表平８−５１０１３３、ＷＯ２００７／１０８４６４）などがあげられる。

本発明において、アンチトロンビンとしては、例えば、ヒト型アンチトロンビン、ヒト型アンチトロンビンのアミノ酸改変体、付加体、欠失体、置換体、糖鎖改変体またはアンチトロンビン誘導体などがあげられる。さらに具体的には、血漿あるいは尿など生体から得られたアンチトロンビン、遺伝子組換え技術あるいは細胞融合技術を用いて樹立されたアンチトロンビンを生産する細胞を培養して得られたアンチトロンビン、またはトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物などから得られたアンチトロンビンなどがあげられる。

アンチトロンビンを生産する細胞としては、ヒトアンチトロンビン遺伝子が組み込まれた形質転換細胞があげられる。具体的には、動物細胞、植物細胞あるいは酵母細胞などの細胞株、さらに具体的には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞、胚性幹細胞、または受精卵細胞などにアンチトロンビン遺伝子を導入した細胞があげられる。

アンチトロンビンを生産する細胞を培養する培地としては、各々の細胞の培養に適した培地であればいずれも用いられるが、例えば動物細胞を培養する培地としては、通常の動物細胞の培養に用いられる基礎培地が用いられる。例えば、血清含有培地、血清アルブミンあるいは血清分画物などの動物由来成分を含まない培地、無血清培地、または無蛋白培地など、いずれの培地も用いられるが、好ましくは無血清培地または無蛋白培地が用いられる。例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地［ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆｔｈｅＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒｔｈｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］、Ｆ１２培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）］、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）［Ｊ．ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）］、ＥＸ−ＣＥＬＬ^ＴＭ３０２培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ^ＴＭ−ＣＤ−ＣＨＯ、ＥＸ−ＣＥＬＬ^ＴＭ３２５培地（以上、エスエーエフシーバイオサイエンス社製）、ＣＤ−ＣＨＯ^ＴＭ培地、ＣＤＤＧ４４^ＴＭ培地（以上、インビトロジェン社製）、ＩＳＣＤ−ＣＨＯ^ＴＭ培地（アーバインサイエンティフィック社製）、またはこれらの改変培地、混合培地あるいは濃縮培地などが挙げられ、好ましくはＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ^ＴＭ３０２培地、ＣＤ−ＣＨＯ^ＴＭ培地またはＩＳＣＤ−ＣＨＯ^ＴＭ培地などが用いられる。

また、必要に応じてアンチトロンビン組成物を生産する細胞の生育に必要な生理活性物質または栄養因子などを添加することができる。これらの添加物は、培養前に予め培地に含有させるか、さらに／または培養中に添加培地または添加溶液として培養液へ適宜追加供給する。追加供給の方法は、１溶液または２種以上の混合溶液などいかなる形態でもよく、また、添加方法は連続または断続のいずれでもよい。

また、ヒトアンチトロンビン遺伝子が組み込まれ形質転換された動物細胞を培養する際に、細胞の培養やアンチトロンビン組成物の生産に適した浸透圧は２００〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、好ましくは２５０〜５００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、より好ましくは２５０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇである。

アンチトロンビンを生産するトランスジェニック非ヒト動物または植物としては、ヒトアンチトロンビン遺伝子が細胞内に組み込まれた非ヒト動物または植物があげられる。用いられる動物の具体例としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはサルなどがあげられ、植物としてはタバコ、ポテト、トマト、ニンジン、ソイビーン、アブラナ、アルファルファ、コメ、小麦、大麦またはコーンなどがあげられる。

また、本発明において、アンチトロンビン含有水溶液としては、アンチトロンビンを含有する血漿または尿など生体から得られたものの他、精製する工程で得られるアンチトロンビン水溶液も含まれる。具体的には、細胞除去液、アルコール分画液、塩析分画液、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィ溶出液、イオン交換クロマトグラフィ溶出液、イオン交換膜溶出液、ゲルろ過クロマトグラフィ溶出液または疎水クロマトグラフィ溶出液などがあげられる。

細胞除去液としては、血漿あるいは尿など生体から得られたアンチトロンビン含有水溶液、トランスジェニック非ヒト動物または植物より得られたアンチトロンビン含有水溶液、遺伝子組換え技術を用いて樹立された細胞より得られたアンチトロンビン含有水溶液、または精製する工程で得られるアンチトロンビン含有水溶液より、細胞を除去した溶液などがあげられる。具体的には、細胞培養液より遠心分離法、クロスフローろ過法（タンジェンシャルフローろ過法）、デプスフィルターによるろ過法、メンブレンフィルターによるろ過法、透析法、またはこれらの方法を組み合わせた方法などによって細胞を除去して得られる溶液があげられる。

アルコール分画液としては、血漿あるいは尿など生体から得られたアンチトロンビン含有水溶液、トランスジェニック非ヒト動物または植物より得られたアンチトロンビン含有水溶液、遺伝子組換え技術を用いて樹立された細胞より得られたアンチトロンビン含有水溶液、または精製する工程で得られたアンチトロンビン含有水溶液より、アルコールなどを添加することで調製された分画液などがあげられる。具体的には低温エタノール分画法などの手法で得られる分画液があげられる。

塩析分画液としては、血漿あるいは尿など生体から得られたアンチトロンビン含有水溶液、トランスジェニック非ヒト動物または植物より得られたアンチトロンビン含有水溶液、遺伝子組換え技術を用いて樹立された細胞より得られたアンチトロンビン含有水溶液、または精製する工程で得られたアンチトロンビン含有水溶液より、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムなどの塩を添加し、アンチトロンビンを析出させることで調製された分画液などがあげられる。

ヘパリンアフィニティークロマトグラフィ溶出液としては、血漿あるいは尿など生体から得られたアンチトロンビン含有水溶液、トランスジェニック非ヒト動物または植物より得られたアンチトロンビン含有水溶液、遺伝子組換え技術を用いて樹立された細胞より得られたアンチトロンビン含有水溶液、または精製する工程で得られたアンチトロンビン含有水溶液より、アンチトロンビンに親和性を有する分子、例えばヘパリンなどを、ベース担体、例えば、セルロース、アガロース、シリカまたはキトサンなどで構成されたポリマーに結合した担体に吸着させ、適当な溶出液で溶出すること、または非吸着させることにより得られた、アンチトロンビン溶出液などがあげられる。ヘパリンアフィニティークロマトグラフィ担体としては、ＨｅｐａｒｉｎＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）、プロセップ−ヘパリン（ミリポア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＡＦ−Ｈｅｐａｒｉｎ−６５０（東ソー社製）またはＨｅｐａｒｉｎＨｙｐｅｒＤ（ポール社製）などがあげられる。

イオン交換クロマトグラフィ溶出液またはイオン交換膜溶出液としては、血漿あるいは尿など生体から得られたアンチトロンビン含有水溶液、トランスジェニック非ヒト動物または植物より得られたアンチトロンビン含有水溶液、遺伝子組換え技術を用いて樹立された細胞より得られたアンチトロンビン含有水溶液、または精製する工程で得られたアンチトロンビン含有水溶液より、イオン交換基を有する分子、例えば硫酸基、メチル硫酸基、スルフォフェニル基、カルボキシメチル基、４級アンモニウム基、４級アミノエチル基またはジエチルアミノエチル基などを、ベース担体、例えば、セルロース、アガロース、シリカまたはキトサンなどで構成されたポリマーに結合した担体または膜に吸着させ、適当な溶出液で溶出すること、または非吸着させることにより得られた、アンチトロンビン溶出液などがあげられる。イオン交換担体またはイオン交換膜としては、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ、ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ、ＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ、ＣａｐｔｏＱ、ＣａｐｔｏＳ（ＧＥヘルスケア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＤＥＡＥ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＳｕｐｅｒＱ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＱＡＥ−５５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＳＰ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＣＭ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＳＰ−５５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＭｅｇａＣａｐＳＰ−５５０（以上、東ソー社製）、Ｍａｃｒｏ−ＰｒｅｐＨｉｇｈＳ、ＵＮＯｓｐｈａｒｅＳ、Ｍａｃｒｏ−ＰｒｅｐＣＭ、ＭａｃｒｏＰｒｅｐＨｉｇｈＱ、ＵＮＯｓｐｈａｒｅＱ、Ｍａｃｒｏ−ＰｒｅｐＤＥＡＥ（以上、バイオ・ラッド社製）、ＤＥＡＥＳｐｈｅｒｏｄｅｘ、ＳＰＳｐｈｅｒｏｄｅｘ、ＤＥＡＥＴｒｉｓａｃｒｙｌ、ＣＭＴｒｉｓａｃｒｙｌ、ＳＰＴｒｉｓａｃｒｙｌ、ＱＨｙｐｅｒＺ、ＣＭＨｙｐｅｒＺ、ＱＣｅｒａｍｉｃＨｙｐｅｒＤ、ＳＣｅｒａｍｉｃＨｙｐｅｒＤ、ＤＥＡＥＣｅｒａｍｉｃＨｙｐｅｒＤ、ＣＭＣｅｒａｍｉｃＨｙｐｅｒＤ、ＭｕｓｔａｎｇＱ、ＭｕｓｔａｎｇＳ（以上、ポール社製）、ＳａｒｔｏｂｉｎｄＳ、ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ、ＳａｒｔｏｂｉｎｄＣ、ＳａｒｔｏｂｉｎｄＤ（以上、ザルトリウス社製）、フラクトゲルＴＭＡＥ（Ｍ）、フラクトゲルＴＭＡＥ（Ｓ）、フラクトゲルＴＭＡＥＨｉＣａｐ（Ｍ）、フラクトゲルＤＥＡＥ（Ｍ）、フラクトゲルＤＥＡＥ（Ｓ）、フラクトゲルＤＭＡＥ（Ｍ）、フラクトゲルＤＭＡＥ（Ｓ）、ラクトゲルＳＯ３−（Ｍ）、フラクトゲルＳＯ３−（Ｓ）、フラクトゲルＳＥＨｉＣａｐ（Ｍ）、フラクトゲルＣＯＯ−（Ｍ）、フラクトゲルＣＯＯ−（Ｓ）（以上、メルク社製）、ＤＥＡＥセルロファインＡ−５００、ＱＡセルロファインＱ−５００（以上、チッソ社製）、キトパール“ベーシック”、ＤＥＡＥキトパール、カルボキシル化キトパール、スルホン化キトパール（以上、富士紡ホールディングズ社製）などがあげられる。

ゲルろ過クロマトグラフィ溶出液としては、血漿あるいは尿など生体から得られたアンチトロンビン含有水溶液、トランスジェニック非ヒト動物または植物より得られたアンチトロンビン含有水溶液、遺伝子組換え技術を用いて樹立された形質転換細胞より得られたアンチトロンビン含有水溶液、または精製する工程で得られたアンチトロンビン含有水溶液より、ベース担体、例えば、セルロース、アガロース、シリカまたはキトサンなどで構成されたポリマーに吸着させ、適当な溶出液を用いて溶出し、分子量により分画されたアンチトロンビン溶出液などがあげられる。ゲルろ過クロマトグラフィ担体としては、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｒｅｐｇｒａｄｅ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｒｅｐｇｒａｄｅ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ｐｒｅｐｇｒａｄｅ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２ｐｒｅｐｇｒａｄｅ、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１００ＨＲ、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００ＨＲ、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００ＨＲ、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−４００ＨＲ、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−５００ＨＲ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−４０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−５５、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−６５、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−７５（以上、東ソー社製）、バイオゲルＰ（バイオ・ラッド社製）、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（以上、ポール社製）、フラクトゲルＢｉｏＳＥＣ（メルク社製）、セルロファインＧＨ−２５（チッソ社製）などがあげられる。

疎水クロマトグラフィ溶出液としては、血漿あるいは尿など生体から得られたアンチトロンビン含有水溶液、アンチトロンビン産生トランスジェニック非ヒト動物または植物より得られたアンチトロンビン含有水溶液、遺伝子組換え技術を用いてアンチトロンビンを生産する細胞より得られたアンチトロンビン含有水溶液、またはアンチトロンビンを精製する工程で得られたアンチトロンビン含有水溶液より、疎水性を有する分子、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、オクチル基、エーテル基またはフェニル基などを、ベース担体、例えば、セルロース、アガロース、シリカまたはキトサンなどで構成されたポリマーに結合した担体に吸着させ、適当な溶出液を用いて溶出すること、または非吸着させることで得られる、アンチトロンビン溶出液などがあげられる。疎水クロマトグラフィ担体としては、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（ｈｉｇｈ−ｓｕｂ）、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（ｌｏｗ−ｓｕｂ）、ＯｃｔｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦａｓｔＦｌｏｗ、ＢｕｔｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦａｓｔＦｌｏｗ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨｅｘｙｌ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＢｕｔｙｌ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＰｈｅｎｙｌ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＥｔｈｅｒ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＰＰＧ−６００、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＢｕｔｙｌ−６００、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＳｕｐｅｒＢｕｔｙｌ−５５０（以上、東ソー社製）、Ｍａｃｔｒｏ−Ｐｒｅｐｔ−Ｂｕｔｙｌ、Ｍａｃｒｏ−ＰｒｅｐＭｅｔｈｙｌ（以上、バイオ・ラッド社製）、ＱＭＡＳｐｈｅｒｏｓｉｌ、ＭｅｔｈｙｌＣｅｒａｍｉｃＨｙｐｅｒＤ（以上、ポール社製）、フラクトゲルＰｈｅｎｙｌ（Ｓ）、フラクトゲルＰｒｏｐｙｌ（Ｓ）（以上、メルク社製）、フェニル−セルロファイン（チッソ社製）、ブチル化キトパール、フェニル化キトパール（以上、富士紡ホールディングズ社製）等があげられるが、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ（ｌｏｗ−ｓｕｂ）、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ（ｈｉｇｈ−ｓｕｂ）、ＥｔｈｅｒＴＯＹＯＰＥＡＲＬなどが好ましく用いられる。

本発明において、セルファインサルフェイトクロマトグラフィ担体としては、セルファインサルフェイトｍ、セルファインサルフェイトｃ、硫酸化セルロファインｍ、硫酸化セルロファインｃ、硫酸化セルファインｍまたは硫酸化セルファインｃ（以上、チッソ社製）などがあげられる。

本発明において、所望のα体またはβ体含有率を有するアンチトロンビン組成物は、アンチトロンビン含有水溶液をセルファインサルフェイトクロマトグラフィ担体に接触させて、調製することが出来るが、調製方法としては、該担体へのアンチトロンビン組成物の吸着画分からの回収であっても、該担体へのアンチトロンビン組成物の非吸着画分からの回収であってもよい。例えば、所望のα体またはβ体含有率を有するアンチトロンビン組成物は、アンチトロンビン含有水溶液をセルファインサルフェイトクロマトグラフィ担体に接触させ、アンチトロンビン組成物を該担体に吸着させた後、導電率を調整した緩衝液で溶出させて得られた分画液の任意の画分を統合することで調製できる。

本発明において、アンチトロンビン組成物のセルファインサルフェイト担体への吸着条件は、ｐＨ５〜９であり、好ましくはｐＨ５〜８である。担体１ｍＬ当たりのアンチトロンビン負荷量としては、０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましく、より好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｍＬである。導電率は０．０１ｍＳ／ｃｍ〜５０ｍＳ／ｃｍが好ましく、より好ましくは０．１〜２０ｍＳ／ｃｍである。緩衝液を構成する塩として、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳまたはＴｒｉｃｉｎｅなどがあげられる。これらの塩の濃度は好ましくは０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．０２ｍｏｌ／Ｌである。また上記の塩は、例えば０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムなどの他の塩と組み合わせて用いた場合、０．００１ｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。緩衝液の具体的な組成として、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）などがあげられる。

セルファインサルフェイト担体に吸着したアンチトロンビン組成物は、緩衝液の導電率を上げることにより溶出される。所望の組成物を得るためには、適当なｐＨおよび導電率の緩衝液で溶出すればよい。溶出する緩衝液は、好ましくはｐＨ５〜９であり、より好ましくはｐＨ５〜８である。導電率は好ましくは０．０１〜３００ｍＳ／ｃｍであり、より好ましくは０．１〜２５０ｍＳ／ｃｍである。溶出方法としては段階的に塩濃度を上げていきアンチトロンビンを溶出させる方法、連続的に塩濃度を上げていきアンチトロンビンを溶出させる方法（グラジエント法）の何れでも良い。溶出させるための緩衝液は、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳまたはＴｒｉｃｉｎｅなどがあげられる。これらの濃度は０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは０．０２ｍｏｌ／Ｌである。また上記の塩は、例えば０．００１ｍｏｌ／Ｌ〜４ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムのような他の塩と組み合わせても利用できる。具体的には１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）などがあげられる。

また、例えば、所望のα体またはβ体含有率を有するアンチトロンビン組成物は、アンチトロンビン含有水溶液をセルファインサルフェイトクロマトグラフィ担体に接触させ、該担体への非吸着画分を回収して得られた分画液の任意の画分を統合することでも調製できる。

具体的には、予めアンチトロンビン含有水溶液の導電率および担体の単位体積あたりのアンチトロンビン吸着量を調整し、該担体に接触させることにより、セルファインサルフェイトクロマトグラフィ担体にアンチトロンビン組成物を吸着させず、非吸着画分にアンチトロンビン組成物を回収することができる。接触させるアンチトロンビン含有水溶液の導電率は０．０１ｍＳ／ｃｍから１００ｍＳ／ｃｍであることが好ましく、より好ましくは０．１ｍＳ／ｃｍから５０ｍＳ／ｃｍである。担体１ｍＬ当たりのアンチトロンビン負荷量としては、０．０１〜５０ｍｇ／ｍＬが好ましく、より好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｍＬである。また、ｐＨは５〜９であることが好ましく、より好ましくは５〜８である。緩衝液を構成する塩として、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅなどがあげられる。これらの濃度は０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．０２ｍｏｌ／Ｌである。また上記の塩は、例えば０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの他の塩と組み合わせて用いることもできる。具体的には０．０１ｍｏｌ／Ｌから０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、０．０１ｍｏｌ／Ｌから０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）などがあげられる。

本発明において、α体含有率とは、アンチトロンビン組成物中のα体とβ体の合計に対するα体が占める割合をいう。本発明により所望のα体含有率を有するアンチトロンビン組成物が得られるが、α体含有率としては、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上である。

本発明において、β体含有率とは、アンチトロンビン組成物中のα体とβ体の合計に対するβ体が占める割合をいう。本発明により所望のβ体含有率を有するアンチトロンビン組成物が得られるが、β体含有率としては、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上である。

本発明において、セルファインサルフェイトクロマトグラフィから回収される分画液のα体含有率またはβ体含有率を測定し、任意の画分を統合することで、所望のα体含有率またはβ体含有率を有するアンチトロンビン組成物を高収率で得ることができる。具体的には、α体含有率が９０％のアンチトロンビン組成物を、α体回収率として５０％以上、好ましくは７５％以上で得ることができる。また、β体含有率が９０％以上のアンチトロンビン組成物を、β体回収率として５０％以上、好ましくは７５％以上で得ることができる。

本発明において、アンチトロンビンのα体含有率およびβ体含有率は、ヘパリンＨＰＬＣ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，６１０（１９８５）］、ハイドロキシアパタイトＨＰＬＣ［ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２８，１９６（２００３）、特表２００３−５２０８０６］、ミセラー・エレクトロキネティック・クロマトグラフィー［Ｊ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＡ，９２４，３０７，（２００１）、特開２００２− １９６００４］などにより測定することができる。

また、本発明は、該セルファインサルフェイトクロマトグラフィに、さらに陰イオン交換クロマトグラフィおよび／または疎水クロマトグラフィを組み合わせる、アンチトロンビン組成物の製造方法に関する。

本発明において、該セルファインサルフェイトクロマトグラフィと、陰イオン交換クロマトグラフィおよび／または疎水クロマトグラフィとの組み合わせの順番は特に限定しないが、該セルファインサルフェイトクロマトグラフィを行った後に疎水クロマトグラフィを行う方が好ましい。

該セルファインサルフェイトクロマトグラフィと疎水クロマトグラフィとを組み合わせる場合、本発明において、該セルファインサルフェイトクロマトグラフィを行った後のアンチトロンビン組成物または該セルファインサルフェイトクロマトグラフィを行う前のアンチトロンビン含有水溶液（以下、両者をまとめてアンチトロンビン含有水溶液という）を疎水クロマトグラフィ担体に接触させる条件は、通常ｐＨ５〜９であり、好ましくはｐＨ５〜８である。導電率は通常２０ｍＳ／ｃｍ以上であり、好ましくは５０ｍＳ／ｃｍ以上である。緩衝液を構成する塩として、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳまたはＴｒｉｃｉｎｅなどがあげられる。これらの濃度は０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．０２ｍｏｌ／Ｌである。また上記の塩は、０〜４ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムなどの他の塩と組み合わせて用いることもできる。具体的には２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．４）などがあげられる。

疎水クロマトグラフィ担体に吸着したアンチトロンビン組成物は、緩衝液の導電率を下げることにより溶出される。溶出方法としては、段階的に塩濃度を下げていきアンチトロンビン組成物を溶出させる方法（ステップワイズ法）、連続的に塩濃度を下げていきアンチトロンビン組成物を溶出させる方法（グラジエント法）の何れでも良い。溶出させるための緩衝液は、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＢｉｃｉｎｅまたはＴｒｉｃｉｎｅなどがあげられる。これらの濃度は０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０２ｍｏｌ／Ｌである。また上記の塩は、０〜４ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムなどの他の塩と組み合わせて用いることもでる。具体的には２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．４）などがあげられる。

また、疎水クロマトグラフィ担体にアンチトロンビン含有水溶液を接触させ、該担体への非吸着画分から高純度のアンチトロンビン組成物を得ることもできる。疎水クロマトグラフィ担体への接触条件は通常ｐＨ５〜９であり、好ましくはｐＨ５〜８である。導電率は通常１〜３００ｍＳ／ｃｍであり、好ましくは２０〜２００ｍＳ／ｃｍである。緩衝液は、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＢｉｃｉｎｅまたはＴｒｉｃｉｎｅなどがあげられる。これらの濃度は通常０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０２ｍｏｌ／Ｌである。また上記の塩は、０〜２ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムなどの他の塩と組み合わせて用いることもできる。具体的には１ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）などがあげられる。

本疎水クロマトグラフィにより、不活性体、会合体、宿主細胞由来不純物、製造工程由来不純物などが除去された、高純度のアンチトロンビン組成物を得ることができる。また、該セルファインサルフェイトクロマトグラフィを行った後に疎水クロマトグラフィを行った場合であっても、該セルファインサルフェイトクロマトグラフィで得られたアンチトロンビン組成物のα体またはβ体含有率、もしくはシアル酸結合数は維持される。

該セルファインサルフェイトクロマトグラフィと陰イオン交換クロマトグラフィとを組み合わせる場合、本発明において、アンチトロンビン含有水溶液を陰イオン交換クロマトグラフィ担体に接触させる条件は、通常ｐＨ４〜１０であり、好ましくはｐＨ６〜９である。導電率は０．０１ｍＳ／ｃｍ〜５０ｍＳ／ｃｍが好ましく、より好ましくは０．１ｍＳ／ｃｍ〜２０ｍＳ／ｃｍである。緩衝液を構成する塩として、例えば、リン酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳまたはＴｒｉｃｉｎｅなどがあげられる。これらの塩の濃度は０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．０２ｍｏｌ／Ｌである。また上記の塩は、０．００１ｍｏｌ／Ｌ〜４ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムなどの他の塩と組み合わせて用いることもできる。緩衝液の具体的な組成として、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．４）などがあげられる。

陰イオン交換クロマトグラフィ担体に吸着したアンチトロンビン組成物は、緩衝液の導電率を上げることにより溶出される。溶出方法としては、一定時間連続的に通塔して目的物を溶出させる方法、段階的に塩濃度を上げていきアンチトロンビン組成物を溶出させる方法（ステップワイズ法）、連続的に塩濃度を上げていきアンチトロンビンを溶出させる方法（グラジエント法）の何れでも良い。溶出させるための緩衝液は、好ましくはｐＨ４〜１０であり、より好ましくはｐＨ５〜９である。緩衝液を構成する塩としては、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳまたはＴｒｉｃｉｎｅなどがあげられる。これらの濃度は０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは０．０２ｍｏｌ／Ｌである。また上記の塩は、０．００１ｍｏｌ／Ｌ〜４ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムなどの他の塩と組み合わせて用いることもできる。具体的には１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．４）などがあげられる。

また、陰イオン交換クロマトグラフィ担体にアンチトロンビン含有水溶液を接触させ、該担体への非吸着画分から高純度のアンチトロンビンを得ることもできる。疎水クロマトグラフィ担体への接触条件は通常ｐＨ４〜１０であり、好ましくはｐＨ５〜９である。導電率は通常０．０１〜１００ｍＳ／ｃｍであり、好ましくは０．１〜５０ｍＳ／ｃｍである。緩衝液は、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＢｉｃｉｎｅまたはＴｒｉｃｉｎｅなどがあげられる。これらの濃度は通常０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０２ｍｏｌ／Ｌである。また上記の塩は、０．００１ｍｏｌ／Ｌ〜２ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムなどの他の塩と組み合わせて用いることもできる。具体的には１ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）などがあげられる。

本陰イオン交換クロマトグラフィにより、不活性体、会合体、宿主細胞由来不純物、製造工程由来不純物などが除去された、高純度のアンチトロンビン組成物を得ることができる。また、該セルファインサルフェイトクロマトグラフィを行った後に陰イオン交換クロマトグラフィを行った場合であっても、アンチトロンビン組成物のα体またはβ体含有率、もしくはシアル酸結合数は維持される。

本発明において、アンチトロンビンの不活性体含有率は、疎水ＨＰＬＣ法［ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２１，１４９（２００１）］またはヘパリンＨＰＬＣ法［ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，３３，３３９（２００４）］などにより測定することができる。

本発明において、アンチトロンビンの会合体含有率は、ゲルろ過ＨＰＬＣ法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、光散乱法または超遠心法などにより測定することができる。

本発明は、アンチトロンビン組成物が、糖鎖を有するアンチトロンビンからなる組成物であって、該組成物中に含まれるアンチトロンビンに結合する糖鎖１本あたり平均１個以上３個以下のシアル酸分子を有するアンチトロンビン組成物である、アンチトロンビン組成物の製造方法に関する。

また、本発明は、アンチトロンビン組成物が、糖鎖を有するアンチトロンビンからなる組成物であって、該組成物中に含まれるアンチトロンビン１分子あたり平均３個以上１２個以下のシアル酸分子を有するアンチトロンビン組成物である、アンチトロンビン組成物の製造方法に関する。

本発明において、シアル酸結合数とは組成物を構成するアンチトロンビン１分子あたりに有するシアル酸分子の平均値をいう。アンチトロンビン１分子には糖鎖が３本または４本結合するため、糖鎖１本あたり０〜３個のシアル酸分子が結合した場合、シアル酸結合数は０個〜１２個となる。

本発明により得られるアンチトロンビン組成物の糖鎖１本あたりのシアル酸分子の数は、好ましくは平均１個以上３個以下であり、より好ましくは平均１．５個以上２．５個以下である。また、本発明のアンチトロンビン組成物は、アンチトロンビン１分子あたり平均３個以上１２個以下のシアル酸分子を有することが好ましく、アンチトロンビン１分子あたり平均６個以上８個以下のシアル酸分子を有することがさらに好ましい。

本発明において、糖鎖１本あたりのシアル酸分子の数は、以下の計算式により算出される。

（糖鎖１本あたりのシアル酸分子の数）＝（シアル酸結合数）／［４×（α体含有率）＋３×（β体含有率）］

本発明において、アンチトロンビンのシアル酸結合数は、蛍光ＨＰＬＣ法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６４，１３８（１９８７）］またはレゾルシノール法などにより測定することができる。また、等電点電気泳動法、キャピラリー等電点電気泳動法などによりシアル酸結合数を測定することもできる。

以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
アンチトロンビン含有水溶液の取得（１）
アンチトロンビンを生産するＣＨＯ細胞株（ＦＥＲＭＢＰ−８４７２）をＥＸ−ＣＥＬＬ^ＴＭ３０２培地（エスエーエフシーバイオサイエンス社製）に、メトトレキセート（シグマ・アルドリッチ・ファインケミカル社製）５００ｎｍｏｌ／ＬおよびＬ−グルタミン（和光純薬工業社製）０．８７５ｇ／Ｌを添加し、浸透圧を３３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、ｐＨ７．１に調整した培地中、３７℃にて２週間培養した。得られた培養液（２０Ｌ）をデプスフィルター（キュノ社製、ゼータプラスマキシマイザー）に透過させることによりアンチトロンビン含有水溶液１を得た。

アンチトロンビン含有水溶液の取得（２）
アンチトロンビンを生産するＣＨＯ細胞株（ＦＥＲＭＢＰ−８４７２）をＥＸ−ＣＥＬＬ^ＴＭ３０２培地（エスエーエフシーバイオサイエンス社製、添付説明書に記載されている濃度の１．３倍の濃度に調製）に、メトトレキセート（シグマ・アルドリッチ・ファインケミカル社製）５００ｎｍｏｌ／ＬおよびＬ−グルタミン（和光純薬工業社製）１．７５ｇ／Ｌを添加し、浸透圧を３３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、ｐＨ７．１に調整した培地中、３７℃にて２週間培養した。得られた培養液をデプスフィルター（キュノ社製、ゼータプラスマキシマイザー）に透過させることによりアンチトロンビン含有水溶液２を得た。

アンチトロンビン含有水溶液の取得（３）
アンチトロンビン含有水溶液１（６．２Ｌ）を、緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、１４ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）で平衡化したヘパリンカラム（ＧＥヘルスケア社製ＨｅｐａｒｉｎＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ、カラム体積５２４ｍＬ、担体１ｍＬ当たりのアンチトロンビン組成物の負荷量４ｍｇ）に通過させ、アンチトロンビン組成物をカラムに吸着させた。カラムを緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、１４ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、１０カラム体積）で洗浄した後、緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、１４ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）と緩衝液（２．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、１４ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を用いた直線塩濃度勾配（１０カラム体積）により溶出させ、アンチトロンビン含有水溶液３（３．６８Ｌ）を得た。

アンチトロンビン含有水溶液の取得（４）
アンチトロンビン含有水溶液１（３６．１Ｌ）を、限外ろ過膜（ミリポア社製、バイオマックス３０）で１．６５Ｌまで濃縮した後、精製水を６．６Ｌ加えた。これを緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で平衡化した陰イオン交換カラム（ＧＥヘルスケア社製、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ、カラム体積７６ｍＬ）を通過させることによりアンチトロンビン組成物をカラムに吸着させた。カラムを緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、５カラム体積）で洗浄した後、緩衝液（１６０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、５カラム体積）で溶出し、アンチトロンビン含有水溶液４（５０５ｍＬ）を得た。

アンチトロンビン含有水溶液の取得（５）
アンチトロンビン含有水溶液１（１０００ｍＬ）を、限外ろ過膜（ミリポア社製、バイオマックス３０）を用いて２００ｍＬまで濃縮した。このうち１５０ｍＬの濃縮液に精製水を２００ｍＬ添加した。このうち３１０ｍＬを緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で平衡化された陰イオン交換クロマトカラム（ＧＥヘルスケア社製、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ、カラム体積５０ｍＬ）に通塔することにより、アンチトロンビンをカラムに吸着させた。カラムを緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で洗浄した後、緩衝液（２２０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で溶出し、アンチトロンビン含有組成物５を得た。

アンチトロンビン含有水溶液の取得（６）
アンチトロンビン含有水溶液１を限外ろ過膜（ミリポア社製、バイオマックス３０）を用いて６倍濃縮した。シアル酸溶液（３０９．２７ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０および緩衝液（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびリン酸トリブチルを含有する２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を添加した後、さらに精製水を添加して導電率を４．８ｍＳ／ｃｍに調整した。この溶液を緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で平衡化された陰イオン交換クロマトカラム（ＧＥヘルスケア社製、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ）に通塔することにより、アンチトロンビン組成物をカラムに吸着させた。カラムを緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で洗浄した後、緩衝液（１８０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で溶出し、アンチトロンビン含有水溶液６を得た。

アンチトロンビン含有水溶液の取得（７）
アンチトロンビン含有水溶液１（６５０ｍＬ）を、限外ろ過膜（ミリポア社製、バイオマックス１０）を用いて３３ｍＬまで濃縮した。このうち１５．５ｍＬに緩衝液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、１４ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を２３．２ｍＬ添加し、さらに緩衝液（３ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を３８．７ｍＬ添加した。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分間）し、上清を回収した。このうち７４ｍＬを緩衝液（１．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）で平衡化された疎水カラム［ＧＥヘルスケア社製、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（ｈｉｇｈ−ｓｕｂ）、カラム体積４ｍＬ］に通塔することにより、アンチトロンビン組成物をカラムに吸着させた。カラムを緩衝液（１．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）で洗浄した後、緩衝液（１．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）と緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を用い直線塩濃度勾配により溶出し、アンチトロンビン含有水溶液７を得た。

（実施例２）
セルファインサルフェイトクロマトグラフィによるアンチトロンビン組成物の調製１
実施例１で得られたアンチトロンビン含有水溶液４（アンチトロンビン組成物量：１６．０ｍｇ）に緩衝液（２００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５）および緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）を添加し、ｐＨ６．０、導電率６．１ｍＳ／ｃｍに調整した。これを緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で平衡化したセルファインサルフェイトｍカラム（チッソ社製、カラム体積４ｍＬ）を通過させることによりアンチトロンビンを吸着させた。緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、５カラム体積）で洗浄した後、緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）と緩衝液（１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）を用いた直線塩濃度勾配（１０カラム体積）によりアンチトロンビン組成物を溶出させた。溶出液は、溶出開始時より２ｍＬずつ均等に分画した。各フラクションのアンチトロンビン組成物量は逆相ＨＰＬＣ法［Ｊ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ，６６２，２０９（１９９４）］、α体含有率はハイドロキシアパタイトＨＰＬＣ法［ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２８，１９６（２００３）、特表２００３−５２０８０６）］、シアル酸結合数は蛍光ＨＰＬＣ法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６４，１３８，（１９８７）］を用いて測定した。その結果を表１に示した。

表２に、表１に示した各溶出フラクションを混合することにより得られたアンチトロンビン組成物のα体含有率、α体回収率およびシアル酸結合数を示した。表２に示したように、例えばフラクション１１〜１７を混合することにより、α体含有率９４．５％、シアル酸結合数６．３３（糖鎖１本当たりのシアル酸分子の数１．６１）のアンチトロンビン組成物をα体の回収率８８．７％で得た。以上より、各溶出フラクションを混合することにより所望のα体含有率およびシアル酸結合数を有するアンチトロンビン組成物を高収率で得ることができる。

次に、表３に、表１に示した溶出フラクションを混合することにより得られたアンチトロンビン組成物のβ体含有率、β体回収率およびシアル酸結合数を示した。表３に示したように、例えばフラクション１８〜２１を混合することにより、β体含有率９０．６％、シアル酸結合数４．９５（糖鎖１本当たりのシアル酸分子の数１．６０）のアンチトロンビン組成物をβ体の回収率として８４．９％で得られた。以上より、各溶出フラクションを混合することにより所望のβ体含有率およびシアル酸結合数を有するアンチトロンビン組成物を高収率で得ることができる。

（実施例３）
セルファインサルフェイトクロマトグラフィによるアンチトロンビン組成物の調製２
実施例１で得られたアンチトロンビン含有水溶液４［アンチトロンビン組成物量：１９６ｍｇ（表４に示す精製例１）または１１７ｍｇ（表４に示す精製例２）］に、緩衝液（２００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５）と緩衝液（１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）を添加し、ｐＨおよび導電率を調整した。緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、塩化ナトリウムを加えて導電率を調整）で平衡化したセルファインサルフェイトｍカラム（チッソ社製、カラム体積２０ｍＬ）に接触させ、非吸着画分を回収することにより、アンチトロンビン組成物を得た。非吸着画分のアンチトロンビン組成物量は逆相ＨＰＬＣ法［Ｊ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ，６６２，２０９（１９９４）］、α体含有率はハイドロキシアパタイトＨＰＬＣ法［ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２８，１９６（２００３）、特表２００３−５２０８０６］、シアル酸結合数は蛍光ＨＰＬＣ法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６４，１３８（１９８７）］を用いて測定した。

表４に、アンチトロンビン含有水溶液の導電率と担体１ｍＬ当たりのアンチトロンビン組成物の負荷量、非吸着画分のα体含有率、シアル酸結合数およびα体回収率を示した。表４に示したように、アンチトロンビン含有水溶液の導電率と担体の単位体積当たりの負荷量を調整することにより、９０％以上のα体含有率および糖鎖１本当たりのシアル酸分子の数が１．５以上のアンチトロンビン組成物を非吸着画分に高い回収率で得ることができた。

（比較例１）
ヘパリンクロマトグラフィによるアンチトロンビン組成物の調製（１）
実施例１で得られたアンチトロンビン含有水溶液１（アンチトロンビン組成物量：１７．７ｍｇ）を緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、１４ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）で平衡化したヘパリンカラム（ＧＥヘルスケア社製、ＨｅｐａｒｉｎＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ、カラム体積４ｍＬ）を通過させることにより、アンチトロンビン組成物をカラムに吸着させた。緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、１４ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、１０カラム体積）で洗浄した後、緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、１４ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）と緩衝液（２．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、１４ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を用いた直線塩濃度勾配（１０カラム体積）によりアンチトロンビン組成物を溶出した。溶出液は、溶出開始時より２ｍＬずつ均等に分画した。各フラクションのアンチトロンビン組成物量は逆相ＨＰＬＣ法［Ｊ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ，６６２，２０９（１９９４）］、α体含有率はハイドロキシアパタイトＨＰＬＣ法［ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２８，１９６（２００３）、特表２００３−５２０８０６］、シアル酸結合数は蛍光ＨＰＬＣ法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６４，１３８（１９８７）］を用いて測定した。その結果を表５に示した。

表６にα体を主に含む溶出フラクションを混合して得られたアンチトロンビン組成物のα体含有率、α体回収率およびシアル酸結合数を示した。表６に示したように、溶出フラクション１０〜１２を混合することにより、α体含有率９３．０％、シアル酸結合数７．４４（糖鎖１本当たりのシアル酸分子の数１．８９）のアンチトロンビン組成物を調製することができたが、α体回収率は３６．４％であった。

また、表７にβ体を主に含む溶出フラクションを混合して得られたアンチトロンビン組成物のβ体含有率、β体回収率およびシアル酸結合数を示した。表７に示したように、溶出フラクション１６から１８を混合することにより、β体含有率８６．７％、シアル酸結合数５．１４（糖鎖１本当たりのシアル酸分子の数１．６４）のアンチトロンビン組成物を調製することができたが、β体回収率は２４．３％であった。

（実施例４）
セルファインサルフェイトクロマトグラフィと疎水クロマトグラフィとの組合せによる高純度のアンチトロンビン組成物の調製（１）
実施例１で得られたアンチトロンビン含有水溶液４（アンチトロンビン組成物量：１６ｍｇ）より、実施例２に示す方法と同様にしてアンチトロンビン組成物を調製した。セルファインサルフェイトクロマトグラフィにおいて得られた溶出フラクション１１〜１７を混合し、緩衝液（３ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．７）を添加し、硫酸アンモニウムの終濃度が２ｍｏｌ／Ｌとなるように調整した。これを緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８）で平衡化した疎水カラム［ＧＥヘルスケア社製、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ（ｌｏｗ−ｓｕｂ）、カラム体積４ｍＬ］に通過させることでアンチトロンビンをカラムに吸着させた。緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８、３カラム体積）で洗浄した後、緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８）と緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８）を用い、直線塩濃度勾配（１０カラム体積）により溶出し、アンチトロンビン組成物を得た。該組成物に含まれる不活性体含有率を疎水ＨＰＬＣ法［ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２１，１４９（２００１）］、会合体含有率をゲルろ過ＨＰＬＣ法により測定した。また、α体含有率をハイドロキシアパタイトＨＰＬＣ法［ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２８，１９６（２００３）、特表２００３−５２０８０６］、シアル酸結合数を蛍光ＨＰＬＣ法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６４，１３８（１９８７）］を用いて測定した。その結果を表８に示した。表８に示したように、セルファインサルフェイトクロマトグラフィの吸着画分から得られたアンチトロンビン組成物に、さらに疎水クロマトグラフィを行うことにより、α体含有率およびシアル酸結合数を維持したまま、純度を向上させたアンチトロンビン組成物が調製された。

（実施例５）
セルファインサルフェイトクロマトグラフィと疎水クロマトグラフィとの組合せによる高純度のアンチトロンビン組成物の調製（２）
実施例１で得られたアンチトロンビン含有水溶液４（アンチトロンビン組成物量：１８０ｍｇ）より、実施例３に示す方法（カラム体積：２０ｍＬ、担体１ｍＬ当たりのアンチトロンビン負荷量：９ｍｇ、アンチトロンビン組成物の導電率：１９．７ｍＳ／ｃｍ）と同様にして非吸着画分よりアンチトロンビン組成物を調製した。該画分に緩衝液（３ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．７）を添加し、終濃度２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム溶液に調製した。これを緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８）で平衡化した疎水カラム［ＧＥヘルスケア社製、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ（ｌｏｗ−ｓｕｂ）、カラム体積４ｍＬ］に通過させることによりアンチトロンビン組成物をカラムに吸着させた。緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８、３カラム体積）で洗浄した後、緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８）と緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８）を用いた直線塩濃度勾配（１０カラム体積）により溶出し、アンチトロンビン組成物を得た。該組成物に含まれる不活性体含有率を疎水ＨＰＬＣ法［ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２１，１４９（２００１）］、会合体含有率をゲルろ過ＨＰＬＣ法により測定した。また、α体含有率をハイドロキシアパタイトＨＰＬＣ法［ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２８，１９６（２００３）、特表２００３−５２０８０６］、シアル酸結合数を蛍光ＨＰＬＣ法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６４，１３８（１９８７）］を用いて測定した。その結果を表９に示した。表９に示したように、セルファインサルフェイトクロマトグラフィの非吸着画分からで得られたアンチトロンビン組成物に、さらに疎水クロマトグラフィを行うことにより、α体含有率ならびにシアル酸結合数を維持したまま、純度を向上させたアンチトロンビン組成物が調製された。

（実施例６）
セルファインサルフェイトクロマトグラフィと疎水クロマトグラフィとの組合せによる高純度のアンチトロンビン組成物の調製（３）
実施例１で得られたアンチトロンビン含有水溶液５（アンチトロンビン組成物量：７６．０ｍｇ）に緩衝液（２００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５）および緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）を添加し、ｐＨ６．０、導電率７ｍＳ／ｃｍ以下に調整した。本溶液を緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で平衡化されたセルファインサルフェイトｍカラム（チッソ社製、カラム体積１９ｍＬ）に通過させることにより、アンチトロンビンをカラムに吸着させた。カラムを緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で洗浄した後、緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）と緩衝液（１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）を用いた直線塩濃度勾配により、アンチトロンビン組成物を溶出させた。溶出液は０．５カラム体積（９．５ｍＬ）ずつ均等に分画した。分画液５ｍＬに対し１ｍＬの割合で緩衝液（１００ｇ／Ｌグリシン緩衝液、ｐＨ９．０）を添加した。各分画液のアンチトロンビン組成物量は逆相ＨＰＬＣ法［Ｊ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ，６６２，２０９（１９９４）］、α体およびβ体含有率はハイドロキシアパタイトＨＰＬＣ法［ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２８，１９６（２００３）、特表２００３−５２０８０６］を用いて測定した。α体含量が９０％以上となる画分を統合し、アンチトロンビン組成物Ａとした。またβ体含量が８５％以上となる画分を統合し、アンチトロンビン組成物Ｂとした。

得られたアンチトロンビン組成物Ａ（アンチトロンビン量：８．０ｍｇ）に緩衝液（１．５ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を添加し、終濃度１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウムを含む組成物に調製した。本溶液を緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で平衡化された疎水カラム［ＧＥヘルスケア社製、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（ｌｏｗ−ｓｕｂ）、カラム体積４ｍＬ］に通過させることにより、アンチトロンビン組成物をカラムに吸着させた。カラムを緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で洗浄した後、緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）と緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を用いた直線塩濃度勾配により溶出させ、アンチトロンビン組成物Ｃを得た。該組成物に含まれるアンチトロンビン組成物量を逆相ＨＰＬＣ法［Ｊ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ，６６２，２０９（１９９４）］、不活性体含有率を疎水ＨＰＬＣ法［ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２１，１４９（２００１）］、会合体含有率をゲルろ過ＨＰＬＣ法により測定した。また、α体含有率をハイドロキシアパタイトＨＰＬＣ法［ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２８，１９６（２００３）、特表２００３−５２０８０６］、シアル酸結合数を蛍光ＨＰＬＣ法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６４，１３８（１９８７）］を用いて測定した。

（比較例２）
ヘパリンクロマトグラフィによるアンチトロンビン組成物の調製（２）
実施例１で得られたアンチトロンビン含有水溶液５（アンチトロンビン組成物量：７４．０ｍｇ）に緩衝液（２００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５）および緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）を添加し、ｐＨ６．０、導電率７ｍＳ／ｃｍ以下に調整した。本溶液を緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で平衡化されたヘパリンカラム（ＧＥヘルスケア社製、ＨｅｐａｒｉｎＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ、カラム体積１８．５ｍＬ）に通過させることにより、アンチトロンビンをカラムに吸着させた。カラムを緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で洗浄した後、緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）と緩衝液（２．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）を用いた直線塩濃度勾配により、アンチトロンビン組成物を溶出させた。溶出液は０．５カラム体積（９．２５ｍＬ）ずつ均等に分画した。分画液５ｍＬに対し１ｍＬの割合で緩衝液（１００ｇ／Ｌグリシン緩衝液、ｐＨ９．０）を添加した。各分画液のアンチトロンビン組成物量は逆相ＨＰＬＣ法［Ｊ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ，６６２，２０９（１９９４）］、α体およびβ体含有率はハイドロキシアパタイトＨＰＬＣ法［ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２８，１９６（２００３）、特表２００３−５２０８０６］を用いて測定した。α体含量が９０％以上となる画分を統合し、アンチトロンビン組成物Ｄとした。またβ体含量が８５％以上となる画分を統合し、アンチトロンビン組成物Ｅとした。

得られたアンチトロンビン組成物Ｄ（アンチトロンビン組成物量：８．０ｍｇ）に緩衝液（１．５ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を添加し、終濃度１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウムを含む組成物に調製した。本溶液を緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で平衡化された疎水カラム［ＧＥヘルスケア社製、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（ｌｏｗ−ｓｕｂ）、カラム体積４ｍＬ］に通過させることにより、アンチトロンビン組成物をカラムに吸着させた。カラムを緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で洗浄した後、緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）と緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を用いた直線塩濃度勾配により溶出させ、アンチトロンビン組成物Ｆを得た。該組成物に含まれるアンチトロンビン組成物量を逆相ＨＰＬＣ法［Ｊ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ，６６２，２０９（１９９４）］、不活性体含有率を疎水ＨＰＬＣ法［ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２１，１４９（２００１）］、会合体含有率をゲルろ過ＨＰＬＣ法により測定した。また、α体含有率をハイドロキシアパタイトＨＰＬＣ法［ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２８，１９６（２００３）、特表２００３−５２０８０６］、シアル酸結合数を蛍光ＨＰＬＣ法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６４，１３８（１９８７）］を用いて測定した。

アンチトロンビン含有水溶液５からセルファインサルフェイトクロマトグラフィを用いて調製されたα体含量９０％以上であるアンチトロンビン組成物Ａ、およびアンチトロンビン含有水溶液５からヘパリンクロマトグラフィを用いて調製されたα体含量９０％以上であるアンチトロンビン組成物Ｄの結果を表１０に示した。表１０に示したように、セルファインサルフェイトクロマトグラフィを用いた方が、比較例２で示したヘパリンクロマトグラフィを用いた時に比べて、回収率が１９．１％高かった。α体含有率およびシアル酸結合数は同程度であった。さらにセルファインサルフェイトクロマトグラフィを用いた方が、統合された溶出画分の体積を２／３に削減することができた。

アンチトロンビン含有組成物５からセルファインサルフェイトクロマトグラフィを用いて調製されたβ体含量８５％以上であるアンチトロンビン組成物Ｂ、およびアンチトロンビン含有組成物５からヘパリンクロマトグラフィを用いて調製されたβ体含量８５％以上であるアンチトロンビン組成物Ｅの結果を表１１に示した。表１１に示したように、セルファインサルフェイトクロマトグラフィを用いた方が、比較例２で示したヘパリンクロマトグラフィを用いた時に比べて、回収率が７．０％高かった。β体含有率およびシアル酸結合数は同程度であった。結果を表１１に示した。

さらに、アンチトロンビン含有水溶液５からセルファインサルフェイトクロマトグラフィと疎水クロマトグラフィとを用いて調製されたアンチトロンビン組成物Ｃ、およびアンチトロンビン含有水溶液５からヘパリンクロマトグラフィと疎水クロマトグラフィとを用いて調製されたアンチトロンビン組成物Ｆの結果を表１２に示した。表１２に示したように、セルファインサルフェイトクロマトグラフィと疎水クロマトグラフィとを組み合わせて用いた方が、比較例２で示したヘパリンクロマトグラフィと疎水クロマトグラフィとを組み合わせて用いた時に比べて、アンチトロンビンα体組成物を１２．１％高い回収率で得ることができた。α体含有率、シアル酸結合数、不活性体量および多量体含量は同程度であった。

（実施例７）
セルファインサルフェイトクロマトグラフィと疎水クロマトグラフィとの組合せによる高純度のアンチトロンビン組成物の調製（４）
実施例１で得られたアンチトロンビン含有水溶液５（アンチトロンビン組成物量：２２６ｍｇ）に緩衝液（１．５ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を添加し、終濃度１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウムを含む組成物に調製した。本溶液を緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で平衡化された疎水カラム［ＧＥヘルスケア社製、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（ｌｏｗ−ｓｕｂ）、カラム体積２３．７ｍＬ］に通過させることにより、アンチトロンビン組成物をカラムに吸着させた。カラムを緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で洗浄した後、緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）と緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を用いた直線塩濃度勾配により溶出させ、アンチトロンビン組成物を得た。該組成物に含まれるアンチトロンビン組成物濃度をＵＶ法により測定した。

得られたアンチトロンビン組成物（アンチトロンビン組成物量：７６ｍｇ）を、限外ろ過膜（ミリポア社製、バイオマックス１０）を用いて１０倍濃縮した後、１０倍量の緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）を添加した。本操作を３回繰り返し、脱塩を行った（交換倍率：１０００倍）。得られた脱塩された溶液を緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で平衡化されたセルファインサルフェイトｍカラム（チッソ社製、カラム体積１９ｍＬ）に通過させることにより、アンチトロンビンをカラムに吸着させた。カラムを緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で洗浄した後、緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）と緩衝液（１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）を用いた直線塩濃度勾配により、アンチトロンビン組成物を溶出させた。溶出液は０．５カラム体積（９．５ｍＬ）ずつ均等に分画した。分画液５ｍＬに対し１ｍＬの緩衝液（１００ｇ／Ｌグリシン緩衝液、ｐＨ９．０）を添加した。各分画液のアンチトロンビン組成物量は逆相ＨＰＬＣ法［Ｊ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ，６６２，２０９（１９９４）］、α体およびβ体含有率はハイドロキシアパタイトＨＰＬＣ法［ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２８，１９６（２００３）、特表２００３−５２０８０６］を用いて測定した。α体含量が９０％以上となる画分を統合し、アンチトロンビン組成物Ｇとした。
実施例６で示したアンチトロンビン含有水溶液５からセルファインサルフェイトクロマトグラフィ−疎水クロマトグラフィの順で調製されたアンチトロンビン組成物Ｃ、およびアンチトロンビン含有水溶液５から疎水クロマトグラフィ−セルファインサルフェイトクロマトグラフィの順で調製されたアンチトロンビン組成物Ｇの結果を表１３に示した。表１３に示したように、疎水クロマトグラフィ−セルファインサルフェイトクロマトグラフィの順で調製したアンチトロンビン組成物Ｇの回収率、α体含量、シアル酸結合数および不活性体含量は、実施例６で示したセルファインサルフェイトクロマトグラフィ−疎水クロマトグラフィの順で調製したアンチトロンビン組成物Ｃと同程度であった。多量体含量はアンチトロンビン組成物Ｃの方が低かった。

本発明を詳細に、また特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００７年４月２日出願の日本特許出願（特願２００７−０９６１７９）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

本発明により、アンチトロンビン含有水溶液より、所望のα体含有率またはβ体含有率を有する、アンチトロンビン組成物を製造することができる。

Claims

アンチトロンビン含有水溶液をセルファインサルフェイトクロマトグラフィ担体に接触させ、所望のα体またはβ体含有率を有するアンチトロンビン組成物を調製することを特徴とする、アンチトロンビン組成物の製造方法。
アンチトロンビン含有水溶液をセルファインサルフェイトクロマトグラフィ担体に接触させ、該担体に吸着したアンチトロンビン組成物を溶出液の導電率を上げることにより溶出させ、該溶出液より所望のα体またはβ体含有率を有するアンチトロンビン組成物を調製することを特徴とする、アンチトロンビン組成物の製造方法。
導電率を調整したアンチトロンビン含有水溶液をセルファインサルフェイトクロマトグラフィ担体に接触させ、該担体への非吸着画分より所望のα体またはβ体含有率を有するアンチトロンビン組成物を調製することを特徴とする、アンチトロンビン組成物の製造方法。
さらに陰イオン交換クロマトグラフィおよび／または疎水クロマトグラフィを行うことを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の調製を行った後に、疎水クロマトグラフィを行う、請求項４に記載の方法。
アンチトロンビン組成物が、糖鎖を有するアンチトロンビンからなる組成物であって、該組成物中に含まれるアンチトロンビンに結合する糖鎖１本あたり平均１個以上３個以下のシアル酸分子を有するアンチトロンビン組成物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
アンチトロンビン組成物が、糖鎖を有するアンチトロンビンからなる組成物であって、該組成物中に含まれるアンチトロンビンに結合する糖鎖１本あたり平均１．５個以上２．５個以下のシアル酸分子を有するアンチトロンビン組成物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
アンチトロンビンに結合している糖鎖が３本または４本である、請求項６または７に記載の方法。
アンチトロンビン組成物が、糖鎖を有するアンチトロンビンからなる組成物であって、該組成物中に含まれるアンチトロンビン１分子あたり平均３個以上１２個以下のシアル酸分子を有するアンチトロンビン組成物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
アンチトロンビン組成物が、糖鎖を有するアンチトロンビンからなる組成物であって、該組成物中に含まれるアンチトロンビン１分子あたり平均６個以上８個以下のシアル酸分子を有するアンチトロンビン組成物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。