KR20120118028A - 혈액 응고 인자의 정제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인자 IX (FIX)와 같은, 비타민 K 의존적 혈액 응고 인자의 정제와 관련된다. 특히, 본 발명은 감마-카르복시글루탐산의 다른 함량을 갖는 상기 인자의 종의 혼합물을 포함하는 샘플의 감마-카르복시글루탐산의 원하는 함량을 갖는 인자 IX를 정제하는 방법을 제공하고, (a) 상기 인자 IX 샘플을 감마-카르복시글루탐산에 대한 결합 분획에 커플링된 면역친화성 크로마토그래피 재료에 로딩하는 단계; (b) 상기 인자 IX를 용리하는 단계; 및 (c) 분획의 폴리펩티드가 감마-카르복시글루탐산의 원하는 함량을 갖는, 상기 용리액으로부터 얻은 분획을 선택하는 단계를 포함하는 상기 방법은 상기 샘플 내에 인자 IX의 전체 농도가 면역친화성 크로마토그래피 재료의 결합력을 초과하는 것으로 특징지어진다.

Description

혈액 응고 인자의 정제{PURIFICATION OF BLOOD COAGULATION FACTORS}

본 발명은 인자 IX (FIX)와 같은, 단백질/폴리펩티드 특이적으로 비타민 K-의존적인 혈액 응고 인자의 감마 카르복실화형태의 정제와 관련된다. 특히, 본 발명은 면역친화성 크로마토그래피를 활용하는 방법과 관련되는데, 이것에 의해 단백질/폴리펩티드, 인자 IX (FIX)와 같은, 특이적으로 비타민 K-의존적인 혈액 응고 인자의 다른 감마 카르복실화형태가 정제될 수 있다.

혈액 응고는 다양한 혈액 성분, 또는 인자의, 복합체 상호작용으로 구성되는 과정인데, 이것은 결국 피브린 응고를 일으킨다. 일반적으로, 응고 "캐스케이드"로서 나타난 것에 참여하는 혈액 성분은 자체로 활성화된 응고 인자인, 활성화제에 의한 작용에 의해 단백질 가수분해 효소로 전환되는, 효소로 불활성화된 단백질인 프로효소 또는 지모겐이다. 이러한 전환을 경험한 응고 인자는 일반적으로 "활성 인자"로 나타나고, 소문자 "a" 접미사의 추가에 의해 지정된다 (예를 들어, 인자 VIIa).

활성화된 인자 X ("Xa")는 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환하는 것이 필요한데, 이것은 피브린 응고 형성의 마지막 단계로서 피브리노겐을 피브린으로 전환한다. 인자 X의 활성화를 촉진하는 두 개의 시스템, 또는 경로가 있다. "고유의 경로"는 혈장에만 존재하는 인자의 활용을 통해 트롬빈 형성으로 이끄는 그들의 반응을 나타낸다. 프로테아제-매개된 활성화의 시리즈는 궁극적으로 인자 IXa를 발생시키는데, 이것은, 인자 VIIIa와 접합으로, 인자 X를 Xa로 쪼갠다. 혈액 응고의 "외부의 경로"에서 동일한 단백질 가수분해는 인자 VIIa 및 그것의 보조 인자, 조직 인자에 의해 영향을 받는다. 조직 인자는 막 결합 단백질이고 혈장에서 정상적으로 순환하지 않는다. 하지만, 혈관 장애시 Ca^{2 +} 및 인지질의 존재에서 인자 X 활성화 또는 인자 IX 활성화를 촉매 작용하는 것은 인자 VIIa와 복합체를 형성할 수 있다. 지혈에서 두 개의 응고 경로의 상대적인 중요성은 여전히 불확실하다.

인자 IXa (FIXa)는, X아제 복합체의 일부로서, 적절한 트롬빈 형성을 지원하기 위해 필수적인 대분획의 인자 Xa의 발생에 의해 지혈에 중요한 역할을 제공하는 트립신-유사 세린 프로테아제이다 (Hoffman M . and Monroe D. M ., Ill (2001) A cell-based model of hemostasis. Thromb Haemost 85, 958-965에서 재검토됨). 인자 IXa 활성의 선천적 결핍은 약 1:100,000 수컷에 영향을 주는 X-연결된 출혈성 질환 혈우병 B의 원인이다. 이 혈우병 환자는 현재 재조합 또는 혈장-유도된 응고 인자 IX로 대체 치료에 의해 치료된다.

인자 IX는 인자 VII, 인자 X, 및 단백질 C와 구조적인 유사성이 있는 비타민 K-의존적인 응고 인자이다. 약 18-30시간의 혈장 반감기를 갖는, 순환하는 지모겐 형태는 N 말단 γ-카르복시글루탐산이 풍부한 (Gla) 도메인, 두 개의 EGF 도메인, 및 C-말단 트립신-유사 세린 프로테아제 도메인을 포함하는 네 개의 뚜렷한 도메인으로 나누어진 415 아미노산으로 구성된다. 인자 IX의 활성화는 제한된 단백질 가수분해에 의해 35-아미노산 분획을 방출하는 Arg¹⁴⁵-Ala¹⁴⁶ 및 Arg¹⁸⁰-Val¹⁸¹, 소위 활성화 펩티드에서 발생한다 (Schmidt A. E. 및 Bajaj S. P. (2003) Structure-function relationships in Factor IX and Factor IXa. Trends Cardiovasc Med 13, 39-45). 두 개의 N-결합된 글리칸 및 네 개까지의 O-결합된 글리칸을 함유하는 활성화 펩티드는 크게 글리코실화된다.

γ-카르복시글루탐산 (Gla)는 칼슘과 결합하는 독특한 아미노산이다. 그것은 글루탐산 (Glu)의 변형된 형태이고 글루타메이트 잔기의 번역 후 변형에 의해 생체 내에서 생산될 수 있다. 이 방법에서 글루탐산의 카르복실화는 칼슘 결합을 가능하게 하고 인지질에 응혈원 및 항응혈제와 같은 단백질의 부착을 허용한다. γ-카르복실화 (감마 카르복실화)로 알려진, 이 효소-매개된 반응은 보조 인자로서 비타민 K를 필요로 한다.

이 방법에서 일부 성숙한 단백질은 γ-카르복시글루탐산으로 전환된 아미노산이 풍부한 도메인을 함유한다. 이것은 GLA 도메인으로 알려져 있다. 이 GLA 도메인은 종종 단백질에 의한 칼슘이온의 높은-친화도의 결합에 대한 책임이 있다. 이러한 GLA 도메인은 다양한 다른 단백질에서 발견될 수도 있다. 예를 들어, 혈액 응고 인자 VII, IX 및 X 및 프로트롬빈은 모두 많은 Gla 아미노산 잔기를 포함하는 GLA 도메인을 포함한다.

Van Cott et A1 (1996) Journal of Molecular Recognition 9, 407-414는 재조합 사람 단백질 C의 생물학적으로 활성형 및 불활성형의 친화도 정제를 설명한다.

재조합 산물의 FIX의 Gla 도메인에서 12개의 Glu 잔기의 전체 감마-카르복실화는 큰 도전을 대표한다. 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 생산된 FIX는 세포주로부터 발현된 FIX의 감마-카르복실화의 정도와 연관성이 있는 활성 레벨인, 약 50%의 FIX의 특이적 활성을 나타낸다. 그러므로 차선의 감마-카르복실화Gla 도메인이 있는 FIX 종을 제거하기 위해 다운스트림 분리 방법을 발달시킬 필요가 있다.

본 발명자는 다른 종의 감마 카르복실화의 양 또는 그들이 함유한 감마 카르복시글루탐산 잔기의 수가 다른 경우, 인자 IX의 다른 종을 분리하고 정제하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 본 발명은 특히 감마 카르복시글루탐산의 다른 함량을 갖는, 인자 IX 종의 크로마토그래픽의 분리를 말한다.

따라서, 본 발명은 감마-카르복시글루탐산의 다른 함량을 갖는 상기 인자 IX의 종의 혼합물을 함유하는 샘플의 감마-카르복시글루탐산의 원하는 함량을 갖는 인자 IX를 정제하는 방법을 제공하는데,

(a) 상기 인자 IX 샘플을 감마-카르복시글루탐산에 대한 결합 분획을 갖는, 커플링된 항체를 함유하는 면역친화성 크로마토그래피 재료에 로딩하는 단계;

(b) 상기 인자 IX를 용리하는 단계;

(c) 분획의 인자 IX 폴리펩티드가 감마-카르복시글루탐산의 원하는 함량을 갖는, 상기 용리액으로부터 얻은 분획을 선택하는 단계;

를 포함하는 상기 방법은 상기 샘플 내에 인자 IX의 전체 농도가 면역친화성 크로마토그래피 재료의 결합력을 초과하는 것으로 특징지어졌다.

방법은 정제된 샘플에서 인자 IX의 #1-11-Gla 및/또는 #1-12-Gla 형태의 비율과 비교하여 인자 IX의 #1-11-Gla 및/또는 #1-12-Gla 형태의 비율의 증가를 갖는 상기 용리액으로부터 얻은 분획을 선택하는 단계를 포함할 수도 있다.

방법은 정제된 샘플에서 인자 IX의 #1-10-Gla 형태의 비율과 비교하여 인자 IX의 #1-10-Gla 형태의 비율의 감소를 갖는 상기 용리액으로부터 얻은 분획을 선택하는 단계를 포함할 수도 있다.

본 발명은 또한 여기에 설명된 바와 같은 방법에 의해 얻은 인자 IX 제형으로 확장한다. 즉, 종의 감마 카르복실화범위, 또는 그들이 함유한 감마 카르복시글루탐산 잔기가 다른 경우, 인자 IX의 하나 이상의 종의 양의 제형이 변화되었다.

도 1a는 확인된 서브도메인을 갖는 사람 인자 IX의 일차 구조를 나타낸다. GLA 도메인은 아미노산 1-46에서 발견된다; EGF1 도메인은 아미노산 47-83에서 발견되고, EGF2 도메인은 아미노산 84 내지 124에서 발견된다. 활성화 펩티드는 아미노산 146 내지 180에서 발견되고 프로테아제 도메인은 아미노산 181 내지 415에서 발견된다. 잠재적으로 감마-카르복실화의 대상인 GLA 도메인의 12 아미노산은 "γ"로 표지되고 아미노산 7, 8, 15, 17, 20, 21, 26, 27, 30, 33, 36 및 40에 위치한다.
도 1b는 사람 인자 VII, 인자 IX 및 인자 X 폴리펩티드의 아미노산 서열의 일부의 정렬을 나타낸다. 이 정렬은 이 폴리펩티드 각각의 GLA 도메인으로부터 유도되고 *과 같이 GLA 잔기의 위치를 나타낸다.
도 2는 실시예 1에서 설명된 ELISA 검정에서 평가된 바와 같이 Gla에 관련된 mAB 3F14A3B6에 FIX Gla#1-8 - #1-12의 칼슘 의존적인 결합을 나타낸다.
도 3은 실시예 2에서 설명된 바와 같이 FIX의 샘플의 면역친화성 크로마토그래피로부터 얻은 크로마토그램을 나타낸다.

본 발명은 감마 카르복실화의 다른 레벨을 갖는 인자 IX 종이 다른 레벨의 활성을 가질 수도 있고 이러한 다른 종이 정제되거나 면역친화성 크로마토그래피를 사용하여 분리될 수 있다는 발견으로부터 유래된다. 같은 샘플에서 더 활성화된 인자 IX 종의 비율을 증가시킴으로써 및/또는 덜 활성화되거나 불활성화된 인자 IX 종의 비율을 감소시킴으로써, 이것은 증가된 특이적 활성을 갖는 정제된 제형의 생산을 초래할 수 있다.

특히, 도 1a는 사람 인자 IX 단백질의 일차 구조를 나타낸다. 이 단백질은 아미노산 1 내지 46에서 GLA 도메인을 포함한다. 이 도메인은 글루타메이트로부터 Gla로 변형될 수 있는 12 아미노산 잔기를 포함한다. 이것들은 위치 7, 8, 15, 17, 20, 21, 26, 27, 30, 33, 36 및 40에 위치한다. 그러므로 그것은 12개까지의 Gla 잔기를 포함할 수 있다. 그러므로 본 발명의 정제되는 폴리펩티드는 인자 IX이다. 도 1b는 사람 인자 VII, IX 및 X 단백질의 Gla 도메인에 기초한 정렬을 나타낸다. 각각의 서열에서 글루타메이트로부터 Gla로 변형될 수 있는 아미노산 잔기의 위치는 *와 같이 확인된다.

본 발명의 정제 과정은 알려진 감마 카르복실화단백질의 GLA 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 똑같이 적용될 수도 있다는 것이 인정될 것이다. GLA 도메인을 포함하는 많은 폴리펩티드가 알려져 있다. 프로트롬빈, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 프로트롬빈, 단백질 C 및 단백질 S를 포함하는, 많은 혈액 응고 및 조절 단백질은 Gla 잔기를 포함한다. 이 단백질들은 성숙한 단백질의 N-말단의 처음 40개의 잔기 내에 위치한, GLA 도메인에 10개 내지 12개의 감마 카르복시글루탐산 잔기를 함유할 수 있다. 오스테오칼신 및 기질 GLA 단백질과 같은 뼈 단백질 및 성장 정지-특이적-6 (Gas6), 단백질 Z, 프롤린-리치-Gla-1 (PRGP1), 프롤린-리치-Gla-2 (PRGP2), 프롤린-리치-Gla-3 (PRGP3) 및 프롤린-리치-Gla-4 (PRGP4)와 같은 다른 포유동물 비타민 K 의존적 단백질 또한 다양한 Gla 잔기를 포함한다. 감마 카르복시글루탐산 잔기는 또한 코노펩티드 코난토킨 G 및 코난토킨 T와 같은, 비-포유동물 단백질에서 발견되었다. 이 폴리펩티드들 중 어느 것도 본 발명에 따라 정제될 수 있다.

하기 더 논의된 바와 같이, 본 발명의 방법은 감마 카르복실화의 다른 레벨이 발생한 인자 IX의 다른 분자 종의 정제를 허용한다. 여기에 언급된 숫자는 인자 IX에 존재할 수도 있는 Gla 잔기의 전체 숫자이다. 즉, 만약 인자 IX가 완전히 감마 카르복실화되면, 이 숫자는 존재하는 Gla 잔기의 숫자를 나타낸다. 예를 들어, 감마 카르복실화가 GLA 도메인에서 일어날 경우, 이 숫자들은 번역된 인자 IX에서 Glu 잔기의 전체 숫자 또는, γ-글루타밀 카르복실라제와 같은, 효소의 작용에 의해 생산될 수도 있는 Glu 잔기의 최대 숫자와 같은, 그 GLA 도메인의 감마 카르복실화에 대한 가능 부위의 전체 숫자를 나타낸다. 같은 인자 IX 개체의 추가적인 종은 또한 이 최대가 존재하는 것보다 더 적은 감마 카르복시글루탐산 잔기로 존재할 수도 있다.

그러므로 인자 IX는 그것의 번역된 아미노산 서열의 N-말단 40개의 잔기에서 다양한 Glu 잔기를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 발현된 인자 IX의 아미노산 서열은 인자 IX의 N 말단에 가장 가까운 40개의 아미노산에서, 또는 성숙한 단백질의 N 말단에 가장 가까운 40개의 아미노산에서 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 이상의 Glu 잔기를 포함할 수도 있다.

감마 카르복실화는 효소를 사용하여 이루어질 수도 있다. 이러한 γ-글루타밀 카르복실라제 효소는 생체 내에서 많은 폴리펩티드의 감마 카르복실화에 수반되는 것으로 알려져 있다. γ-글루타밀 카르복실라제는 많은 비타민 K 의존적인 응고 인자의 GLA 도메인에서 번역 후 Glu를 Gla로 변형을 촉매작용하는, 내부원형질의 효소이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 인자 IX 폴리펩티드는 그것들이 γ-글루타밀 카르복실라제에 의해 감마 카르복실화되는지 결정함으로써 확인될 수도 있다.

γ-글루타밀 카르복실라제 효소는 카르복실화되는 글루타메이트 잔기의 아미노 말단 측면에서 서열 모티프를 통해 그것의 기질 단백질에 결합하는 것으로 생각된다. 효소는 기질을 방출하기 전, 그 지역에서 다양한 글루타메이트 잔기, 예를 들면, GLA 도메인에서 모든 글루타메이트 잔기를 카르복실화할 수도 있다. 그러므로 본 발명에서 사용되는 인자 IX 폴리펩티드는 γ-글루타밀 카르복실라제에 의해 또는 감마 카르복실화할 수 있는 또 다른 효소에 의해 인식되는 모티프 또는 부위를 포함한다. 이 인식 부위는 인자 IX의 N-말단 영역에, 예를 들어, 번역된 바와 같이, 인자 IX의 N 말단, 또는 성숙한 단백질의 N 말단인 것에 가장 가까운 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35 또는 40 아미노산 내에 위치할 수도 있다. 인식 부위는 카르복실화될 글루타메이트 잔기의 아미노 말단 측면에 위치할 것이다. 예를 들어, 자연스럽게 발생하는 많은 감마 카르복실화 단백질에서, γ-글루타밀 카르복실라제 효소는 프로펩티드 영역의 부위를 인식하고 이에 결합한다. 그 영역은 그 다음에 번역 후 과정 중 인자 IX의 나머지로부터 분열된다. 그러므로 감마 카르복실화인식 부위는 성숙한 단백질에 없을 수도 있다.

인자 IX에서, γ-글루타밀 카르복실라제 효소의 인식에 수반되는 부위는 잔기 -18, -17, -15, -15 및 -10에 의해 정의된다. -16 위치에 페닐알라닌 및 -10 위치에 알라닌은 카르복실라제 기질의 프로펩티드 내에 잘 보존되고, 이소루신, 루신 및 발린과 같은 지방족 잔기는 위치 -17 및 -15에 있다. 위치 -16의 루신, 발린 또는 리신은 또한 카르복실화를 지원할 수도 있다. 본 발명의 과정은 인자 IX, 인자 X, 인자 VII, 또는 다른 알려진 감마 카르복실화단백질 중 어느 것의 감마 카르복실화인식 부위와 같이, 알려진 감마 카르복실화단백질의 감마 카르복실화인식 부위를 포함하는 폴리펩티드의 정제에 똑같이 적용될 수도 있다는 것이 인정될 것이다. 예를 들어, γ-글루타밀 카르복실라제에 의해 폴리펩티드의 적합한 번역 후 과정을 허용하기 위해 감마 카르복실화인식 부위를 포함하는, 어느 이러한 단백질의 프로펩티드 영역도 번역된 폴리펩티드의 N 말단에 존재할 수 있다.

인자 IX의 감마 카르복실화가 발생하기 위해서, 인자 IX는 바람직하게 세포에서 발현된다. 본 발명에 사용되는 인자 IX는 이러한 세포에서 발현에 의해 합성될 수도 있다. 바람직하게, 인자 IX가 발현되는 세포는 인자 IX의 감마 카르복실화를 허용하기 위해 필요한 세포기계 (cellular machinary)를 포함한다. 예를 들어, 세포는 γ-글루타밀 카르복실라제를 발현할 수도 있다. 바람직하게 인자 IX가 합성되는 세포는 조면소포체와 연관된 감마 카르복실라제 엔자임을 갖는다. 세포는 비타민 K와 같은 효소 보조인자의 존재시 배양될 수도 있다. 바람직하게 인자 IX가 합성되는 세포는 세포 내 비타민 K를 포함한다.

본 발명의 방법은 다른 정도의 감마 카르복실화를 갖는 인자 IX의 다른 종으로부터 인자 IX의 하나 이상의 종의 정제를 수반한다.

인자 IX가 하나 이상의 부위에서 카르복실화될 수 있는 경우, 인자 IX의 다른 종은 다른 수의 감마 카르복시글루타메이트 아미노산 잔기가 존재하거나, 감마 카르복시글루타메이트 잔기가 인자 IX 분자 내에 다른 가능한 위치에 존재하는 곳에 존재할 수도 있다.

예를 들어, 인자 IX의 일부 종은 완전히 감마 카르복실화될 수도 있다. 즉, 예를 들어, GLA 도메인의 모든 Glu 잔기에서 감마 카르복실화가 가능한 경우, 인자 IX의 모든 잔기에서 글루타메이트에서 감마 카르복시글루타메이트로 전환할 수도 있다. 인자 IX의 다른 종은 분획적으로 감마 카르복실화될 수도 있다. 즉, GLA 도메인의 일부에서, 하지만 모든 Glu 잔기는 아닌 것과 같이, 이것이 가능한 경우 인자 IX의 일부에서 감마 카르복실화는 글루타메이트를 감마 카르복시글루타메이트로 전환시킬 수도 있지만 모든 잔기에서는 아니다.

다양한 다른 분획적으로 감마 탈카르복실화된 종이 확인될 수도 있다. 이것은 다양한 방법으로 분류될 수도 있다. 예를 들어, 감마 탈카르복실화의 레벨은 인자 IX의 잔기가 감마 탈카르복실화되는 것에 의해 정의될 수도 있거나, 폴리펩티드에 존재하는 감마 카르복시글루타메이트 아미노산의 전체 숫자에 의해 정의될 수도 있다. 후자의 분류는 인자 IX의 많은 구조적으로 다른 분자의 종이 그들이 함유한 감마 카르복시글루탐산의 전체 숫자에 기초하여 함께 고려되는 것을 의미한다. 예를 들어, 하나를 제외한 모든 가능한 감마 카르복시글루타메이트 잔기가 존재하는 인자 IX의 종은 인자 IX의 다양한 다른 아종을 함유할 수도 있는데, 이것에서 글루타메이트가 감마 카르복실화될 수도 있는 다른 위치에 유지된다.

γ-글루타밀 카르복실라제의 작용의 메카니즘 때문에, 감마 카르복실화는 일반적으로 감마 카르복실화인식 부위에 가장 가까운 Glu 잔기에서 시작하고 인자 IX의 말단에서 떠나서 진행한다. 인자 IX가 완전히 감마 카르복실화되지 않은 경우, 이것은 일반적으로 감마 카르복실화가 중단되거나, 가장 먼 Glu 잔기가 전환되기 전, 효소가 인자 IX로부터 방출되기 때문이다. 그것은 일반적으로 분획적으로 감마 카르복실화되지 않은 인자 IX에서 감마 카르복실화되지 않은 감마 카르복실화결합 부위로부터 가장 먼 또는 인자 IX의 N 말단으로부터 가장 먼 Glu 잔기이다.

예를 들어, 도 1에 나타난 바와 같이, 사람 인자 IX는 12개까지의 감마 카르복시글루타메이트 잔기를 포함한다. 존재하는 Gla 잔기의 실제 숫자는 분자가 경험한 감마 카르복실화에 의한 번역 후 변화의 정도에 의존적으로 다른 폴리펩티드 분자에서 다를 것이다. 이것은 사람 인자 IX의 샘플이 완전히 감마 탈카르복실화되는, 즉, 모든 12개의 가능한 감마 카르복시글루타메이트 잔기 (#1-12-Gla)를 갖는 인자 IX의 종을 포함할 수도 있다는 것을 의미한다.

그것은 또한 가능한 12개의 감마 카르복시글루타메이트 잔기의 11개를 갖는 인자 IX의 하나 이상의 종을 포함할 수도 있다. 이것들 중, 대분획은 폴리펩티드의 N 말단에 가장 가까운 11개의 Glu 잔기가 Gla로 전환되지만, 도 1에서 나타난 바와 같이 위치 40에서, 12번째 Glu 잔기는 Glu로 남아있는 상황이다. 따라서, 이 상황에서, 1 내지 11개의 Glu 잔기만 Gla로 전환되었다 (#1-11-Gla).

그것은 또한 가능한 12개의 감마 카르복시글루타메이트 잔기의 10개를 갖는 인자 IX의 하나 이상의 종을 포함할 수도 있다. 이것들 중에, 대분획은 폴리펩티드의 N 말단에 가장 가까운 10개의 Glu 잔기가 Gla로 전환되지만, 11번째 및 12번째 Glu 잔기는, 도 1에 나타난 바와 같이 위치 36 및 40에서, Glu로 남아있는 상황이다. 따라서, 이 상황에서, 1개 내지 10개의 Glu 잔기만 Gla로 전환되었다 (#1-10-Gla).

그것은 또한 #1-9-Gla와 같이 가능한 12개의 감마 카르복시글루타메이트 잔기의 9개를 갖는 인자 IX의 하나 이상의 종을 포함할 수도 있다. 그것은 또한 12개의 감마 카르복시글루타메이트 잔기의 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개 또는 아무것도 없는 것과 같이, 9개 미만을 갖는 인자 IX의 하나 이상의 종을 포함할 수도 있다.

본 발명은 인자 IX의 이러한 종을 정제하는 방법을 제공한다. 특히, 인자 IX의 종은 샘플에서 인자 IX의 다른 종에 관하여 정제될 수도 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 인자 IX의 샘플에서 흥미로운 종의 비율에 관하여 증가로 이끌 수도 있다. 이것은 샘플의 인자 IX의 하나 이상의 다른 종을 제거하고 흥미로운 종으로부터 형성된, 전체에 비해 인자 IX의 비율을 증가시킴으로써 성취될 수도 있다. 이것은, 샘플로부터 흥미로운 종이 아닌 한 이상의 종의 제거에 의해, 또는 흥미로운 종의 비율이 원래의 샘플에서보다 더 낮은 샘플의 분획을 제거함으로써, 샘플로부터 하나 이상의 특정 종의 특이적 제거를 통해 성취될 수도 있다. 이 접근들 중 어느 것이라도 흥미로운 종의 비율의 전체적인 증가로 이끌 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 인자 IX의 다른 종의 혼합물을 포함하는 샘플에서 인자 IX의 특정 종의 비율의 증가 또는 감소로 이끌 수도 있다.

인자 IX 종의 비율의 증가는 전체로서 인자 IX의 샘플에서 그 종의 비율의 5%까지, 10%까지, 20%까지, 30% 이상의 증가일 수도 있다. 인자 IX 종의 비율의 감소는 전체로서 인자 IX의 샘플에서 그 종의 비율의 5%까지, 10%까지, 20%까지, 30%까지, 50%까지, 70%까지, 90%까지 또는 그 이상의 감소일 수도 있다. 인자 IX 종의 비율의 감소는 원래의 샘플에 존재하는 양과 비교하여 존재하는 그 종의 양의 5%까지, 10%까지, 20%까지, 30%까지, 50%까지, 70%까지, 90%까지 또는 그 이상의 감소일 수도 있다. 인자 IX 종의 비율의 감소는 샘플로부터 그 종의 완벽한 또는 상당한 제거일 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 모든, 또는 실질적으로 모든, 검출가능한, 샘플의 특정 종의 인자 IX를 제거함으로써 인자 IX의 샘플을 정제할 수도 있다. 샘플에 남아있는 이러한 종의 양은 원래의 샘플에 존재하는 양의 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만일 수도 있다.

따라서 본 발명의 방법의 목적은 바뀐 인자 IX의 샘플에서 다른 종의 상대적인 비율을 허용하는 것이다. 다른 종은 다른 비율 또는 다른 활성을 가질 수도 있다. 인자 IX의 샘플에서 이러한 종의 양 또는 비율을 변화시킴으로써, 전체로서 샘플의 비율 또는 활성이 바뀔 수도 있다. 예를 들어, 인자 IX의 다른 종이 다른 레벨의 활성을 갖는 경우, 더 높은 레벨의 활성을 갖는 종의 비율을 증가시키기 위해 다른 종의 비율을 변화시킴으로써 및/또는 활성이 더 낮거나 활성이 없는 종의 비율을 감소시킴으로써, 샘플의 특이적 활성, 예를 들어 인자 IX의 분자당 평균 활성 또는 인자 IX의 양에 대해 최대 가능한 활성의 퍼센트는 증가할 수도 있다.

예를 들어, 재조합으로 생산된 사람 인자 IX (고FIX)는 약 50%의 특이적 활성을 나타내는 것이 발견되었다. 이러한 샘플의 분획화는 그것이 #1-8-Gla, #1-9-Gla, #1-10-Gla, #1-11-Gla 및 #1-12-Gla가 우세한 개개의 rhFIX를 함유하는 것을 나타내었다. #1-11-Gla 및 #1-12-Gla가 응혈 검정 및 2-단계 활성 검정에서 완전히 활성화되는 것이 발견되었다. #1-8-Gla, #1-9-Gla 및 #1-10-Gla 종은 사용된 검정에 의존적으로 약 2-5%, 14-22% 및 27-36% 감소된 활성을 나타내었다.

그러므로 그들의 감마 카르복실화의 정도만 다른, rhFIX의 다른 종이 다른 레벨의 활성을 나타내는 것을 볼 수 있다. 더 높은 비율의 #1-11-Gla 및/또는 #1-12-Gla를 갖는 샘플은 그 종의 더 낮은 비율을 갖는 샘플보다 더 높은 특이적 활성을 나타낼 것으로 예상된다. 더 높은 비율의 #1-8-Gla 및/또는 #1-9-Gla 및/또는 #1-10-Gla를 갖는 샘플은 그 종의 더 낮은 비율을 갖는 샘플보다 더 낮은 특이적 활성을 나타낼 것으로 예상된다.

따라서, 인자 IX의 샘플의 전체의 특이적 활성은 샘플 내에 이러한 종의 비율을 변화시킴으로써 변화할 수도 있다. 이 경우에서, 인자 IX의 샘플의 전체의 특이적 활성은 다음의 어느 하나 이상에 의해서도 증가할 수 있다는 것을 예상할 수 있다:

- 샘플에서 #1-12-Gla의 비율 증가;

- 샘플에서 #1-11-Gla의 비율 증가;

- 샘플에서 #1-10-Gla의 비율 감소;

- 샘플에서 #1-9-Gla의 비율 감소;

- 샘플에서 #1-8-Gla의 비율 감소;

- 샘플에서 #1-7-Gla의 비율 감소;

- 샘플에서 #1-6-Gla의 비율 감소;

- 샘플에서 #1-5-Gla의 비율 감소;

- 샘플에서 #1-4-Gla의 비율 감소;

- 샘플에서 #1-3-Gla의 비율 감소;

- 샘플에서 #1-2-Gla의 비율 감소; 및

- 샘플에서 #1-1-Gla의 비율 감소.

이 변화의 어느 하나 이상도 본 발명의 인자 IX의 샘플을 정제할 때 선택될 수 있다.

인자 IX의 우선적인 샘플은 #1-11-Gla 및 #1-12-Gla만 포함할 것이고 #1-10-Gla, #1-9-Gla 및 #1-8-Gla 종과 같은, 이것보다 더 낮은 정도의 감마 카르복실화를 갖는 종이 부족하거나 실질적으로 부족할 것이다.

이 접근은 hFIX의 존재하는 조성물에 적용될 수도 있다. 여기에 설명된 방법이 이러한 조성물에서 #1-11-Gla 및/또는 #1-12-Gla의 비율을 증가시키기 위해 사용될 수도 있다는 것을 볼 수 있다. 여기에 설명된 바와 같이 방법은 이러한 제형에서 #1-10-Gla, #1-9-Gla 및 #1-8-Gla와 같은 덜 감마 카르복실화종의 비율을 감소시키기 위해 사용될 수도 있다. 이것은 이러한 제형에서 hFIX의 특이적 활성을 향상시키는 것으로 예상된다.

다른 Gla-함유하는 폴리펩티드와 관련된 유사한 접근이 사용될 수도 있다. 예를 들어, 인자 VII 및 인자 X는 11개까지의 Gla 잔기를 포함할 수도 있다.

따라서 본 발명은 인자 IX의 종이 인자 IX의 다른 종으로부터 정제되는 것을 허용하는 방법을 제공하는데, 여기서 종은 그들이 감마 카르복실화되는 규모에 따라, 또는 그들의 아미노산 서열에서 Gla 잔기의 수에 따라 달라진다.

본 발명의 방법은 면역친화성 크로마토그래피에 기초한다. 본 발명은 특히 인자 IX가 비드에 커플링된 Gla에 관련된 항체를 함유하는 면역친화성 재료에 결합하는 방법과 관련이 있고 면역친화성 재료에서 인자 IX의 용리는 완충액을 사용하여 수행된다.

면역친화성 재료는 크로마토그래피 레진에 커플링된 GLA에 관련된 항체를 의미한다. 그러므로 면역친화성 재료는 항체 또는 감마-카르복실화 잔기에 대한 항체 유래된 결합 모티프를 갖는다. 항체는 고체상에 부착될 수도 있다. 예를 들어, 고체상은 정제 컬럼, 입자 또는 비드, 막 또는 필터일 수도 있다. 상업적으로 이용 가능한 여기에 설명된 바와 같이 사용될 수도 있는 커플링 재료는 예를 들어, CNBr Sepharose™ Fast Flow, NHS Sepharose™ Fast Flow, Epoxy Sepharose™ 6B, Thiol Sepharose™ Fast Flow, EAH Sepharose™ Fast Flow, Epoxy Poros® EP, A1dehyde Poros® A1, Epoxy Poros® EP 및 Hydroxylated Poros® OH를 포함한다.

예를 들어, 본 발명의 인자 IX의 정제는 전형적으로 GLA에 대한 결합 분획 (즉, FIX 항체 3F14A3B6)와 커플링된 Sepharose FF 친화도 재료 (즉, CNBr Sepharose 4 FF)를 포함할 것이다.

본 발명이 친화도 크로마토그래피 과정에 기초하는 것이 입증될 것인데, 이것은 원칙적으로 표적 단백질의 정제를 위해 리간드 상호작용을 사용하는 것을 의미한다. 따라서, 용어 친화도는 리간드 및 표적 단백질 사이의 특이적 분자의 상호작용에 제한하지 않는 것을 나타낸다. 상호작용은 단백질 또는 리간드의 특이적 폴딩 상태에 의존적일 수도 있다. 리간드는 상기 설명된 바와 같이 레진에 고정될 수도 있다. 사용된 레진은 적합한 크로마토그래피의 비드에 고정된 Gla에 대한 결합 분획을 포함한다. 한 구체예에서, Gla에 대한 결합 분획은 Gla 관련된 항체를 포함한다.

이 구체예에서, 항체에 의해 인식된 에피토프는 폴드된 Gla 도메인인데, 이것은 놀랍게도 #1-8-Gla 이상의 FIX 종에 대해서만 발생하는 것으로 나타났다. 상기 샘플 내에 인자 IX의 전체 농도가 면역친화성 크로마토그래피 재료의 결합력을 초과하는 것을 인정함으로써 면역친화성 컬럼이 오버로드된다는 것이 인정될 것이다. 예를 들어, 오버로딩의 개념은 컬럼에 로드된 FIX의 양이 문제의 컬럼의 FIX 수용력보다 더 높다는 것을 의미한다.

한 구체예에서, 면역친화성 크로마토그래피 재료의 결합 능력은 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 140, 150, 200, 250, 500 750 또는 1000%의 어느 하나보다 더 큰 것, 특히 120%보다 더 큰 것 (즉, 122%) 또는 150%보다 더 큰 것 (즉, 170%) 또는 250%보다 더 큰 것 (즉, 334%)에 의해 초과된다. 추가적인 구체예에서, 면역친화성 크로마토그래피 재료의 결합 능력은 100%보다 더 크지만 500%보다 작은 것, 즉, 450, 400, 350, 300, 250, 200 또는 150%의 어느 하나보다도 낮은 것 (또는 100-400%, 100-200% 또는 100-150%와 같이, 그 사이의 어느 범위에서도)에 의해 초과된다. 본 발명의 대안의 양태에 따라, 감마-카르복시글루탐산의 다른 함량을 갖는 상기 폴리펩티드의 종의 혼합물을 포함하는 샘플로부터 감마-카르복시글루탐산의 원하는 함량을 갖는 폴리펩티드를 정제하는 제공된 방법이 있고,

(a) 상기 폴리펩티드 샘플을 감마-카르복시글루탐산에 대한 결합 분획과 커플링된 면역친화성 크로마토그래피 재료에 로딩하는 단계;

(b) 상기 폴리펩티드를 용리하는 단계; 및

(c) 분획의 폴리펩티드가 감마-카르복시글루탐산의 원하는 함량을 갖는, 상기 용리액으로부터 얻은 분획을 선택하는 단계;

를 포함하는 상기 방법은 상기 샘플 내에 폴리펩티드의 전체 농도가 100 및 400% 사이에 의해 면역친화성 크로마토그래피 재료의 결합능력을 초과하는 것으로 특징지어진다. 본 발명의 대안 양태의 한 구체예에서, 폴리펩티드는 인자 IX와 같은 인자 IX, VII 또는 X이다. 본 발명의 대안 양태의 한 구체예에서, 면역친화성 크로마토그래피 재료의 결합 능력은 350, 300, 250, 200 또는 150%의 어느 하나보다도 낮다 (또는 100-200% 또는 100-150%와 같이, 그 사이의 어느 범위에서도). 본 발명의 면역친화성 크로마토그래피 양태의 추가적인 이점은 활성화된 FIX (FIXa)의 아주 적은 양으로 아주 순수한 FIX의 일정한 전달이다.

본 발명에 사용될 수도 있는 Gla에 관련된 항체의 예는 Liebman HA (1993) Eur. J . Biochem. 212 : 339-345, Liebman HA et A1 (1987) J . Biol. Chem. 262 : 7605-7612 및 Gillis S et A1 (1997) Protein Sci. 6: 185-96에서 설명된 것들을 포함한다. 한 구체예에서, Gla 관련된 항체는 3F14A3B6이다. 이름 3F14A3B6은 단클론성 항체가 생산된 잡종세포 클론을 나타낸다. FIX Gla에 관련된 단클론성 항체를 생산하는 3F14A3B6 잡종세포 클론은 불멸화된 마우스 골수종 세포주와 융합된 FIX 면역화된 마우스로부터 얻은 지라세포로부터 입증된 잡종세포 풀을 선별함으로써 확인되었다. 잡종세포는 수확되었고 전체 RNA는 분리되었고 상업적으로 이용 가능한 DNA 및 cDNA 제조 키트를 사용하여 cDNA를 제조하는데 사용되었다. 따라서, 클로닝된 3F14A3B6-LC 및 3F14A3B6-HC cDNA 서열을 얻었다. 서열 데이터로부터 항-FIX 항체가 쥐 IgG1 항체인 것이 입증되었다. 3F14A3B6-HC 및 3F14A3B6-LC의 cDNA에 해당하는 아미노산 잔기는 각각 SEQ ID NOS: 1 및 2에 나타난다. 서열에 기초하여, 표준 일시적인 및 안정한 재조합 발현이 수행되었다. 항체는 고전적인 단백질-A 기초한 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제되었고 0.1 M Na₂CO₃, 0.5M NaCl, pH 8.3과 같은 적절한 완충액에서 제형에 의한 레진 커플링을 위해 제조된다.

오버로딩 원칙의 유효성은 본 발명에 사용된 항체 또는, Fab 또는 scFv 분획과 같은, 항체 유도체에 의해 인식된 Gla 도메인의 특이적 에피토프에 의존적일 것이다. 본 발명에 사용된 우선적인 항체는 칼슘, 마그네슘 또는 다른 이가 양이온의 존재 시 Gla 도메인의 폴딩에 민감한 항체 및/또는 특이적 Gla 잔기를 함유하는 에피토프를 인식하는 항체이다. 예는 항체의 에피토프가 Gla#1, Gla#2, Gla#3, Gla#4, Gla#5, Gla#6, Gla#7, Gla#8, Gla#9, Gla#10, Gla#11, Gla#12 또는 상기 Gla 잔기의 어느 것과 겹침 및/또는 다른 이웃하는 비-Gla 잔기를 인식하는, FIX일 수도 있다. 응고 인자에 특이적으로, Gla 도메인과 관련된, 칼슘-의존적인 항체는 일반적으로 두 범주: (I) 칼슘에 대한 절대적인 필요를 가진 것들, 및 (II) 결합을 포함하지 않고 칼슘이 마그네슘 또는 다른 이가 양이온과 치환될 수 있는 것들로 나눌 수 있다 (Liebman, H .A. et A1 (1987) JBC 262 : 7605-7612). 구조적 연구는 클래스 I 항체는 Gla-도메인의 N 말단 분획에 결합하지만, 클래스 II는 C 말단 분획에 결합한다는 것을 보여주었다. 에피토프의 Gla 도메인의 다른 영역으로 지역화는 칼슘이 전체 Gla 도메인의 폴딩을 유발할 수 있지만, 마그네슘은 EGF1 도메인과 인접한 먼 분획의 폴딩을 지원하기만 하고 N-말단 ω-루프를 구조화하지 않은 채로 내버려둔다는 것을 증명하는 NMR 분광학에 의해 합리화되었다 (Freedman, S.J . et A1 (1996) JBC 271 : 16227-16236; Freedman, S.J . et A1 (1995) JBC 270 : 7980-7987; Huang, M. et A1 (2004) JBC 279 : 14338-14346).

오버로딩 원칙이 항체 3F14A3B6에 대해 활용될 때, FIX Gla 종 #1-8 - #1-10은 FIX Gla 종 #1-11 - #1-12에 의해 대체될 수 있다. 적절한 세척 단계 후 컬럼이 최종적으로 용리될 때, 낮은 FIX Gla 종 #1-8 - #1-10의 전체 양은 컬럼 수용력이 초과하지 않은 경우의 과정과 비교하여 많이 감소된다. 한 구체예에서, Gla에 관련된 항체 (즉, 3F14A3B6)는 사전-활성화된 세파로스 비드, 특히 CNBr-세파로스 4 FF와 같은, 세파로스 비드에 고정된다.

전통적인 면역 친화도 크로마토그래피 정제 과정은 보통 면역친화성 재료의 평형, 샘플의 적용 또는 로딩, 하나 이상의 세척 단계, 용리 및 면역친화성 재료의 재생으로부터 선택된 하나 이상의 단계로 구성된다. 친화도 크로마토그래피의 표준 방법은, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences에서 발견될 수도 있다.

면역친화성 레진은 바람직하게 인자 IX 샘플을 로딩하기 전 평형화된다. 이 평형 단계의 목적은 방법의 다음 단계에서 사용되는 것들과 더 많이 비슷하도록 면역친화성 재료의 조건을 조정하는 것이다. 크로마토그래피 중 이동상의 조성물에서 변화를 피하기 위해, 면역친화성 재료는 시작 완충액의 pH 및 이온 조성 (예를 들어, 전도성, 완충액 조성)과 평형화되어야 한다. 예를 들어, 평형 완충액의이온 강도 (예를 들어, 전도성, pH)는 폴리펩티드 및/또는 세척 완충액 (들)의 로딩에 사용된 버퍼와 같이, 방법의 나중 단계에서 사용되는 완충액의 이온 강도와 가능하면 비슷하게 선택될 수도 있다.

그러므로 면역친화성 재료는 다음 단계에 사용되는 완충액 또는 제형에 밀접하게 기초한 완충액을 사용하여 평형화될 수도 있다. 예를 들어, 면역친화성 재료의 평형화 및 샘플의 로딩을 위해 같은 완충액이 사용될 수도 있다. 같은 완충액은 면역친화성 재료의 평형화 및 샘플의 로딩 후 면역친화성 재료의 세척에 사용될 수도 있다. 평형화 완충액은 로딩 제형 및/또는 세척 완충액과 같은 전도도를 가질 수도 있다. 평형화 완충액은 로딩 제형 및/또는 세척 완충액과 같은 완충 재료 농도를 가질 수도 있다. 평형화 완충액은 로딩 제형 및/또는, 세정제와 같은, 세척 완충액에 또한 존재하는 추가적인 성분을 포함할 수도 있다.

평형화 완충액의 pH는 정제된 특정 폴리펩티드에 의존적으로 결정될 수도 있다. 예를 들어, 인자 IX와 같이, 많은 폴리펩티드에 대해, 9.0 이상의 pH는 최선이 아닌데, 폴리펩티드의 자동활성화 및/또는 분해가 이 pH 값에서 관찰될 수도 있기 때문이다.

본 발명에 사용된 평형화 완충액은 예를 들어, pH 5.0 내지 pH 8.5와 같은, 약 5.0 내지 약 8.5의 pH에서 제형될 수도 있다. 평형화 완충액의 pH는 약 5.0보다 높을 수도 있고, 약 5.5보다 높을 수도 있고, 약 6.0보다 높을 수도 있고, 약 6.5보다 높을 수도 있고, 약 7.0보다 높을 수도 있고, 약 7.5보다 높을 수도 있고, 약 8.0보다 높을 수도 있다. 평형화 완충액의 pH는 약 8.5보다 낮을 수도 있고, 8.0보다 낮을 수도 있고, 7.5보다 낮을 수도 있고, 7.0보다 낮을 수도 있고, 6.5보다 낮을 수도 있고, 6.0보다 낮을 수도 있고, 5.5보다 낮을 수도 있다. 이러한 종점의 어느 조합도 결합 될 수 있다. 예를 들어, 평형화 완충액의 pH는 약 7.0보다 높고 8.5보다 낮다. pH는 약 7.5와 같이, 예를 들어, 약 pH 7.0, 7.5, 8.0 또는 8.5일 수도 있다.

이 pH 값은 여기에 설명된 바와 같이 인자 IX, 인자 VII 또는 인자 X와 같은, 폴리펩티드의 정제에 대해 면역친화성 재료의 평형화에 대해 적합할 수도 있다.

평형화 완충액에 대해 적합한 성분은 완충 재료, 예를 들어, Tris, 인산염, MES, Hepes 또는 카르보네이트를 포함할 수도 있다. 이러한 완충 재료는 평형화 완충액을 상기 정의된 바와 같은 pH로 유지하기 위해 사용될 수도 있다. 한 구체예에서, 같은 완충 재료 및 완충 재료 농도는 면역친화성 크로마토그래피 과정 동안 사용될 수도 있다. 예를 들어, 평형화 완충액, 세척 완충액 (들) 및 용리 완충액은 모두 같은 완충 재료를 같은 완충 재료 농도로 포함할 수도 있다. 완충 재료 농도는 면역친화성 과정 중에 완충 수용력 및 일정한 pH를 유지하기 위해 충분해야 한다. 예를 들어, 완충 재료 및 완충 재료 농도는 샘플의 적용 및 용리 중에 안정한 pH 및 완충 수용력을 유지하게 위해 선택될 수도 있다. 적합한 완충 재료 농도는 예를 들어, 10 mM 및 40 mM 사이와 같이, 5 mM 및 50 mM 사이일 수도 있다. 적합한 완충 재료 농도는 예를 들어, 20 mM과 같이, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM 또는 25 mM일 수도 있다.

평형화 완충액은 하나 이상의 추가적인 성분을 포함할 수도 있다. 평형화 완충액은 에틸렌 글리콜, 에탄올, 요소 또는 단백질의 가용성을 증가시키기 위해 사용된 세정제와 같은 첨가제를 포함할 수도 있다. Tween 80, Tween 20 또는 Triton X100과 같은, 비-이온성 세정제는 예를 들어, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 농도로 사용될 수도 있다. NaCl과 같은, 비-완충 염은 완충액의이온 강도를 조절하기 위해 사용될 수도 있다.

한 구체예에서 평형화 완충액은 추가적으로 염화칼슘과 같은, 칼슘이온을 포함한다. 한 구체예에서, 칼슘이온은 0.5 mM보다 높은 농도 (예를 들어, 0.5, 1.0, 1.5, 또는 2.0 mM 염화칼슘, 3.0, 5.0, 8.0 또는 10.0 mM 염화칼슘과 같은, 특히 2 또는 5 mM 염화칼슘)로 존재한다. 다른 구체예에서, 칼슘이온은 0.5-10 mM, 1-8 mM, 1-5, 및 2-5 mM의 범위에서 존재한다. 여기에 나타난 데이터에 의해 증명된 바와 같이, 이 결과들은 종 #1-8 - #1-9는 종 #1-11 - #1-12와 비교하여 많이 감소된 협동성 및 증가된 칼슘 의존성을 나타낸다는 것을 가리킨다. 이 데이터들은 오버로딩이 더욱 좋은 Gla 프로파일을 산출하는 경로의 오버로딩 원칙과 조합하여 사용할 수 있다.

인자 IX를 포함하는 샘플은 면역친화성 재료에 로딩된다. 이것은 샘플을 적절한 조건 (칼슘의 존재, 전도도 및/또는 pH와 같은) 하에 인자 IX가 면역친화성 재료 내에 또는 위에 고정되는 것과 같이 면역친화성 재료에 노출함으로써 성취된다. 이 고정 또는 결합은 인자 IX의 GLA 도메인의 칼슘 특이적 폴딩 및 GLA-특이적 항체 3F14A3B6에 의해 성취된다. 이러한 결합은 GLA 도메인이 충분히 폴딩될 때만 발생한다.

본 발명의 방법에서 정제되는 샘플은 상기 설명된 바와 같이 인자 IX를 포함하는 어느 샘플일 수도 있다. 바람직하게 같은 것은 같은 폴리펩티드의 복수의 다른 종을 포함하는데 종은 그들의 감마 카르복실화의 정도 및/또는 위치에 따라 변한다.

상기 언급된 바와 같이, 인자 IX는 어느 통상적인 과정을 사용하여도 얻을 수 있다. 예를 들어, 인자 IX는 동물로부터와 같이, 생체 내 공급원으로부터 얻을 수도 있거나, 시험관 내에서, 예를 들어 조직 또는 세포에서, 생산될 수도 있다. 인자 IX는 예를 들어, 세포에서 인자 IX의 발현을 유발함으로써, 재조합으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 인자 IX는 인자 IX를 암호화하고, 발현할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 트랜스포메이션 또는 트랜스펙션한 숙주세포에서 생산될 수도 있다. 이러한 숙주 세포는 인자 IX의 발현이 허용된 조건 하에 배양될 수도 있다. 인자 IX는 배양 배지 또는 숙주 세포 자체로부터 회수될 수도 있다.

인자 IX는 면역친화성 레진에 적용되기 전 정제될 수도 있다. 예를 들어, 인자 IX는 침전, 면역침전, 등전점전기영동 (isoelectric focusing), 여과, 원심분리 또는 음이온 또는 양이온 크로마토그래피 같은 크로마토그래피와 같은 하나 이상의 정제 단계를 가질 수도 있다.

예를 들어, 면역친화성에 기초한 오버로딩 방법을 사용하여 단백질/폴리펩티드를 함유하는 Gla를 정제하는 설명된 방법은 음이온 크로마토그래피 기초한 방법을 사용하여 Gla 종이 더 분리/정제되는 두 번째 단계와 결합될 수도 있다. 한 이러한 방법은 예를 들어, 단백질/폴리펩티드 Gla 종을 분리하기 위해 암모늄 아세테이트를 활용하는 방법일 수 있는데, 예를 들어 이것은 면역친화성 기초한 오버로딩 방법을 사용하여 완전히 분리되지 않는다. 특이적 예는 예를 들어, 개개의 방법 단독의 각각으로부터 얻은 Gla 프로파일과 비교할 때, 예를 들어 Gla#1-12, Gla#2-12, Gla#3-12, Gla#4-12, Gla#5-12, Gla#6-12, Gla#7-12, Gla#8-12 및 Gla#9-12와 같은, 낮은 Gla 종의 함량이 예를 들어, Gla#10-12, Gla#11-12 또는 Gla#12-12와 같은, 높은 Gla 종과 분리되는, 암모늄 아세테이트, 염화암모늄, 나트륨 아세테이트 또는 염화나트륨을 함유하는 용리와 결합된, 첫 번째 면역친화성 기초한 오버로딩 방법을 사용하고 두 번째 음이온 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제된 FIX Gla 종일 수도 있다.

이러한 정제는 샘플의 하나 이상의 오염재료를, 분획적으로 또는 완전히, 제거하고, 그렇게 함으로써 인자 IX의 순도를 증가시킨다. 오염재료는 인자 IX가 아닌 어느 분자도 될 수 있다. 예를 들어, 오염재료는 다른 폴리펩티드, 핵산 또는 내독소일 수도 있다. 오염재료는 끝이 잘리거나 연장된 폴리펩티드, 인자 IX의 탈아미드 형태, 부정확하게 폴드된 폴리펩티드 또는 원하는 글리코실화를 갖는 폴리펩티드의 형태와 같은, 다양한 인자 IX일 수도 있다. 오염재료는 면역친화성 크로마토그래피를 방해하는 분자일 수도 있다.

바람직하게 인자 IX는 적어도 75% 순수하고, 더 바람직하게 적어도 80%, 적어도 90% 이상 순수하다. 더 바람직하게 인자 IX는 적어도 95%, 적어도 97% 또는 저어도 99% 순수한 것과 같이, 적어도 90% 순수하다. 순도는 인자 IX로 구성된 전체 건조 중량의 비율을 나타내는 것을 목적으로 한다. 상기 설명된 바와 같이 샘플은 25 중량% 미만, 더 바람직하게 20 중량% 미만, 10 중량% 미만, 5 중량% 미만, 3 중량% 미만 또는 1 중량% 미만과 같이, 오염재료의 25 중량% 미만을 포함할 수도 있다. 샘플은 인자 IX의 순수하거나 실질적으로 순수한 샘플일 수도 있다. 샘플은 인자 IX의 분리되거나 실질적으로 분리된 샘플일 수도 있다.

이러한 인자 IX의 샘플은 재조합으로 인자 IX를 생산하는 세포의 배양 배지의 샘플 또는 인자 IX를 발현하는 용해된 세포의 샘플의 형태와 같이, 인자 IX 합성으로부터 직접적으로 얻은 형태로 면역친화성 재료에 적용될 수도 있다. 인자 IX의 샘플은 여기에 설명된 바와 같이 정제되거나 분획적으로 정제된 형태로 면역친화성 재료에 적용될 수도 있다. 여기에 설명된 바와 같이 샘플은 면역친화성 재료에 적용 전 더 제형될 수도 있다. 예를 들어, 인자 IX (또는 정제된 인자 IX)가 고체의 형태로 제공되는 경우, 면역친화성 재료에 적용을 위해 액체 조성물로 제형될 수도 있다. 예를 들어, 물, 완충액 또는 또 다른 용매로 제형될 수도 있다. 바람직하게, 액체 조성물은 수성이다. 상기 설명된 바와 같이 인자 IX 또는 정제된 인자 IX가 액체 또는 수성 형태로 제공되는 경우, 또는 고체 인자 IX 샘플이 액체 형태로 제형되는 경우, 샘플의 제형은 면역친화성 재료에 적용되기 전 조정될 수도 있다.

예를 들어, 추가된 칼슘과 같이, 샘플 또는 제형된 샘플의 전도도 및/또는 pH는 일상적인 방법 전에 조정될 수도 있다. 샘플의 pH는 면역친화성 재료의 평형화 및/또는 면역친화성 재료의 세척에 사용되는 완충액의 그것과, 같거나, 실질적으로 같도록 조정될 수도 있다. 샘플의 전도도는 면역친화성 재료의 평형화 및/또는 면역친화성 재료의 세척에 사용되는 완충액의 그것과, 같거나, 실질적으로 같도록 조정될 수도 있다. 샘플은 평형화 완충액의 조성물과 관련된 상기 논의된 완충 재료의 하나와 같은, 완충 재료과 함께 제형될 수도 있다. 샘플은 면역친화성 재료의 평형화 및/또는 면역친화성 재료의 세척에 사용된 같은 완충액으로 제형될 수도 있다. 샘플은 면역친화성 재료 및/또는 면역친화성 재료의 세척에 사용된 완충액과 같은 완충 재료 및/또는 같은 완충 재료 농도 및/또는 같은 pH 및 또는 같은 전도도로 제형될 수도 있다. 한 구체예에서, 그것을 사용되는 평형화 완충액과 동일한 완충액을 함유하는, 칼슘과 결합시킴으로써 인자 IX는 면역친화성 재료에 적용을 위해 제형된다.

인자 IX는 면역친화성 재료에 인자 IX의 오버로딩을 허용하는 조건 하에 면역친화성 재료 전반에 걸쳐 인자 IX의 적절한 제형을 통과시킴으로써 면역친화성 재료에 로딩된다. 이러한 방법은 업계에서 일상적이다. 예를 들어, 컬럼의 수용력은 활성 인자 IX에 기초하여 측정되고 g/L의 특정 값이 할당된다. 샘플은 상기 정의된 바와 같이 100% 이상에 의해 g/L의 수용력을 초과하는 값으로 로딩된다.

한 번은 인자 IX는 면역친화성 컬럼에 로딩되는데, 컬럼은 하나 이상의 세척과 관련될 수도 있다. 세척은 면역친화성 재료 전반에 걸쳐 적절한 용액을 통과시킴으로써 성취된다. 이러한 세척의 목적은 면역친화성 재료에 결합되지 않는 인자 IX 또는 다른 성분을 제거하는 것; 인자 IX보다 낮은 친화도로 면역친화성 재료에 결합하는 불순물을 제거하는 것을 포함할 수도 있다.

한 구체예에서, 면역친화성 재료에 인자 IX의 로딩 후, 면역친화성 재료는 결합되지 않은 인자 IX, 오염재료 또는 불순물을 제거하기 위해 완충액으로 세척된다. 예를 들어, 세척 완충액은 인자 IX가 면역친화성 재료에 로딩하기 위해 제형된 완충액과 동일하거나, 실질적으로 동일할 수도 있다. 예를 들어, 세척은 평형화 완충액과 같은 완충액 또는 인자 IX를 제형하기 위해 사용된 같은 완충액을 사용하여 수행될 수도 있다. 세척은 평형화 완충액 또는 인자 IX를 제형하기 위해 사용된 완충액과 같거나 실질적으로 같은 pH 및/또는 같거나 실질적으로 같은 전도도를 갖는 완충액을 사용하여 수행될 수도 있다. 세척은 평형화 완충액에 사용된 또는 인자 IX의 제형을 위해 사용된 것과 같은 또는 실질적으로 같은 농도의 같은 완충 재료를 포함하는 완충액을 사용하여 수행될 수도 있다.

다른 세척은 대안으로 또는 추가적으로 평형화 완충액과 다른 완충액을 사용하여 수행될 수도 있다. 예를 들어, 인자 IX보다 덜 강하게 면역친화성 재료에 결합된 면역친화성 재료의 오염재료를 제거하는 것이 가능할 수도 있다. 이러한 오염재료는 인자 IX보다 더 쉽게 면역친화성 재료로부터 방출될 것이다. 예를 들어, 면역친화성 재료는 평형화 완충액 및/또는 인자 IX가 로딩된 제형보다 더 큰 전도도 또는이온 강도를 갖는 완충액으로 세척될 수도 있다. 완충액의이온 강도를 증가시킴으로써, 면역친화성 재료의 성분의 용리가 성취될 수도 있다. 바람직하게 세척 완충액은 인자 IX가 면역친화성 재료로부터 용리되지 않는 충분히 작은 부피로 선택되거나, 사용된다.

세척을 위한 완충액은 특정 샘플 및 흥미로운 폴리펩티드의 성질에 의존적으로 숙련자에 의해 선택될 수도 있다. 예를 들어, 흥미로운 폴리펩티드보다 덜 강하게 레진과 결합하는 특정 폴리펩티드 또는 불순물의 제거가 허용되는 특정 pH 또는 전도도를 갖는 완충액이 선택될 수도 있다. 이러한 완충액이 선택될 수도 있고 그들의 사용은 간단한 일상적인 실험에 의해, 예를 들어, 컬럼으로부터 제거된 용액의 조성을 관찰함으로써 최적화될 수도 있다.

세척 완충액의 pH는 정제된 특정 폴리펩티드에 의존적으로 결정될 수도 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 자동활성화 및/또는 분해가 이 pH에서 관찰될 수도 있기 때문에, 인자 IX와 같은, 일부 폴리펩티드에 대해, 9.0 이상의 pH는 최선이 아니다. 본 발명에서 사용에 적합한 세척 완충액은, 예를 들어, pH 5.0 내지 pH 8.5와 같이, 약 5.0 내지 약 8.5의 pH에서 제형될 수도 있다. 세척 완충액의 pH는 약 5.0보다 더 크고, 약 5.5보다 더 크고, 약 6.0보다 더 크고, 약 6.5보다 더 크고, 약 7.0보다 더 크고, 약 7.5보다 더 크거나 약 8.0보다 더 클 수도 있다. 세척 완충액의 pH는 약 8.5보다 더 작고, 약 8.0보다 더 작고, 약 7.5보다 더 작고, 약 7.0보다 더 작고, 약 6.5보다 더 작고, 약 6.0보다 더 작거나 약 5.5보다 더 작을 수도 있다. 이러한 종점의 어느 조합도 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 세척 완충액의 pH는 약 7.0보다 더 크고 약 8.5보다 더 작을 수도 있다. pH는, 예를 들면, 7.5와 같이 약 pH 7.0, 7.5, 8.0 또는 8.5일 수도 있다.

이 pH 값은 여기에 설명된 바와 같이, 인자 IX, 인자 VII 또는 인자 X와 같은, 폴리펩티드의 정제를 위한 면역친화성 재료의 세척에 적합할 수도 있다.

세척 완충액에 적합한 성분은 완충 재료, 예를 들면, Tris, 인산염, MES, 헤페스 또는 카르보네이트를 포함한다. 이러한 완충 재료는 상기 정의된 바와 같은 pH에서 세척 완충액을 유지하기 위해 사용될 수도 있다. 적합한 완충 재료 농도는, 예를 들어, 10 mM 및 40 mM과 같이, 5 mM 및 50mM 사이일 수도 있다. 적합한 완충 재료 농도는, 예를 들어, 20 mM과 같이, mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 또는 20 mM일 수도 있다.

세척 완충액은 하나 이상의 추가적인 성분을 포함할 수도 있다. 세척 완충액은 에틸린 글리콜, 에탄올, 요소 또는 단백질의 가용성을 증가시키기 위해 사용된 세정제와 같은 첨가제를 포함할 수도 있다. Tween 80, Tween 20 또는 Triton X100과 같은, 비-이온성 세정제는, 예를 들어, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 농도로 사용될 수도 있다. NaCl과 같은, 비-완충 염은 완충액의이온 강도를 조정하기 위해 사용될 수도 있다.

한 구체예에서, 세척 완충액은 추가적으로 염화칼슘과 같은, 칼슘이온, 또는 유사한 이가이온, 예를 들어 마그네슘이온, 스트론튬이온, 베릴륨이온, 아연이온, 니켈이온, 및 구리이온을 포함한다. 한 구체예에서, 칼슘이온은 1 mM보다 큰 농도로 존재한다 (즉, 2 mM 염화칼슘, 특히 1.5 mM 염화칼슘 같은, 1 mM 염화칼슘보다 큰). 실시예 2에서 여기에 나타난 데이터에 의해 증명된 바와 같이, 이 데이터들은 종 #1-8 - #1-9가 #1-11 - #1-12와 비교하여 많이 감소된 협동작용 및 증가된 칼슘 의존성을 보인다는 것을 나타낸다. 이 데이터들은 오버로딩이 더 나은 Gla 프로파일을 산출하는 방법으로 오버로딩 원칙과 결합될 수도 있다.

면역친화성 재료로부터 분자를 용리하는 것은 면역친화성 재료로부터 분자를 제거하는 것을 의미한다. 이것은 일반적으로 완충액 첨가제의 추가 및/또는 제거, 전도도, pH 및/또는 온도 변화에 의해 친화도 재료의 리간드 및 결합된 표적 분자의 상호작용을 방해함으로써 성취된다. 친화도 재료에 대한 분자의 결합력이 감소하였고 그것은 떨어진다. 면역친화성 재료의 용리는 또한 일부 경우에서 표적 단백질, 예를 들어 인자 IX의 구조를 변화시키는 분자를 사용함으로써 성취될 수도 있고, 따라서 결합력이 감소하고 면역친화성 재료로부터 표적분자가 방출되는 것의 원인이 된다. 이 첨가제는 킬레이트 시약, 예를 들어 EDTA, EGTA 또는 시트레이트일 수 있는데, 이것은 칼슘과 강하게 결합해서 인자 IX로부터 칼슘이온의 분리로 이끈다. 결국, 인자 IX의 GLA 도메인은 언폴드될 것이고, 특이적으로 결합이 폴드된 GLA 도메인, 즉, 항체 리간드 3F14A3B6을 필요로 할 때, 인자 IX에 대해 방해된 리간드 결합을 초래한다.

용리 완충액의 pH는 정제된 폴리펩티드에 의존적으로 결정될 수도 있다. 폴리펩티드의 자동활성화 및/또는 분해가 이 pH에서 관찰될 수도 있기 때문에, 예를 들어, 인자 IX와 같은, 일부 폴리펩티드에 대해, 9.0 이상의 pH는 최선이 아니다.

본 발명에서 사용에 적합한 용리 완충액은, 예를 들어, pH 5.0 내지 pH 8.5와 같이, 약 5.0 내지 약 8.5의 pH에서 제형될 수도 있다. 용리 완충액의 pH는 약 5.0보다 더 크고, 약 5.5보다 더 크고, 약 6.0보다 더 크고, 약 6.5보다 더 크고, 약 7.0보다 더 크고, 약 7.5보다 더 크거나 약 8.0보다 더 클 수도 있다. 용리 완충액의 pH는 약 8.5보다 더 작고, 약 8.0보다 더 작고, 약 7.5보다 더 작고, 약 7.0보다 더 작고, 약 6.5보다 더 작고, 약 6.0보다 더 작거나 약 5.5보다 더 작을 수도 있다. 이러한 종점의 어느 조합도 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 용리 완충액의 pH는 약 7.0보다 더 크고 약 8.5보다 더 작을 수도 있다. pH는, 예를 들면, 7.5와 같이 약 pH 7.0, 7.5, 8.0 또는 8.5일 수도 있다.

이 pH 값은 여기에 설명된 바와 같이, 인자 IX, 인자 VII 또는 인자 X와 같은, 폴리펩티드의 정제를 위한 면역친화성 재료의 용리에 적합할 수도 있다.

용리 완충액에 적합한 성분은 완충 재료, 예를 들면, Tris, 인산염, MES, 헤페스 또는 카르보네이트를 포함한다. 면역친화성 크로마토그래피 방법을 위해, Tris와 같은, 양성 완충이온이 준비되었다. 이러한 완충 재료는 상기 정의된 바와 같은 pH에서 용리 완충액을 유지하기 위해 사용될 수도 있다. 적합한 완충 재료 농도는, 예를 들어, 10 mM 및 40 mM과 같이, 5 mM 및 50mM 사이일 수도 있다. 적합한 완충 재료 농도는, 예를 들어, 20 mM과 같이, mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 또는 20 mM일 수도 있다.

용리 완충액은 하나 이상의 추가적인 성분을 포함할 수도 있다. 용리 완충액은 에틸린 글리콜, 에탄올, 요소 또는 단백질의 가용성을 증가시키기 위해 사용된 세정제와 같은 첨가제를 포함할 수도 있다. Tween 80, Tween 20 또는 Triton X100과 같은, 비-이온성 세정제는, 예를 들어, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 농도로 사용될 수도 있다. NaCl과 같은, 비-완충 염은 완충액의이온 강도를 조정하기 위해 사용될 수도 있다. 상기 설명된 바와 같이, 첨가제는 또한 킬레이트 시약, 예를 들어 EDTA, EGTA 또는 시트레이트일 수 있는데, 이것은 칼슘과 결합하고 인자 IX로부터 칼슘을 방출하며, 결국, 인자 IX의 GLA 도메인의 언폴드로 이끈다. 바람직하게 킬레이트 시약의 농도는 용리 전 면역친화성 재료 내에 또는 위에 존재하는 수성 용액, 예를 들어, 평형화 완충액, 세척 완충액 또는 세포 상층액에서 칼슘 농도 이상이어야 한다. 만약 킬레이트 시약이 하나 이상의 칼슘 결합 부위를 소유하면, 킬레이트 시약의 농도는 절대 농도보다 화학량적인 농도를 반영해야한다.

본 발명의 사용에 대해, 용리 완충액은 바람직하게 EDTA, EGTA 또는 시트레이트와 같은, 하나 이상의 추가적인 염을 포함할 것이다. 한 구체예에서, 하나 이상의 염은 적어도 10 mM, 적어도 20 mM, 적어도 25 mM, 적어도 30 mM, 적어도 40 mM 또는 적어도 50 mM와 같이, 10 mM 내지 100 mM의 농도로 용리 완충액에 존재할 수도 있다.

한 구체예에서, 용리 완충액은 용리 완충액이 추가적으로 하나 이상의 염을 포함하고 칼슘 또는 다른 이가이온을 포함하지 않는 것을 제외하고 세척 완충액 및/또는 평형화 완충액과 같은 조성을 갖는다. 우선적인 염은 EDTA이다. 따라서, 용리 완충액은 세척 완충액 또는 평형화 완충액에 대해 여기에 설명된 어느 조성도 가질 수 있지만, 추가적으로 EDTA를 포함하고 칼슘 또는 다른 이가이온을 포함하지 않을 수도 있다.

한 구체예에서, 평형화 완충액 및 세척 완충액은 동일하고 용리 완충액은 용리 완충액이 또한 EDTA를 포함하고 칼슘 또는 다른 이가이온을 포함하지 않는다는 점에서 그들과 다르다.

용리는 EDTA의 등용매 또는 선형 구배와 같은, 킬레이트 시약의 등용매 (isocratic) 또는 선형 구배를 사용하여 수행될 수도 있다. 바람직하게, 용리는 EDTA의 등용매 구배를 사용하여 수행된다. 용리는 완충액에서 EDTA의 농도의 단계적인 변화를 사용하여 수행될 수도 있다. 용리는 이 용리 접근의 어느 조합에 의해서도 성취될 수 있다. 예를 들어, 특정 농도의 EDTA에서 등용매 용리 후 구배 또는 하나 이상의 단계의 형태로 EDTA의 농도가 증가할 수도 있다.

이러한 어느 용리 방법에서도, 다른 성분은 그들의 결합력에 의존적으로 다른 시점에 면역친화성 재료로부터 방출될 것이다. 덜 강하게 결합하는 성분은 더 일찍 또는 더 낮은 EDTA 농도에서 방출될 것이다. 더 강하게 결합하는 성분은 더 오랫동안 또는 더 높은 EDTA 농도에서 면역친화성 재료에 유지될 것이다. 면역친화성 재료를 통과하는 용리는 특정 성분이 용리될 때 식별하기 위해 관찰될 수도 있다. 용리는 다른 시점에서 모일 수도 있고 각 풀에 존재하는 성분들을 결정하기 위해 분석된다. 원하는 제형, 예를 들어, 증가된 농도의 특정 인자 IX 종 또는 감소된 농도의 다른 인자 IX 종을 갖는 특정 풀이 선택될 수도 있다.

여기에 설명된 바와 같이 등용매 용리는 고정된 또는 변함없는 농도의 킬레이트 시약을 사용한다. 상기 논의된 어느 농도와도 같은, 킬레이트 시약의 농도를 포함하는 용리 완충액이 사용된다. 용리 완충액은 면역친화성 재료를 통과하고 용리는 용리가 발생할 때 확인하기 위해 관찰된다. 등용매 용리를 사용하여, 더 작은 부피의 용리 완충액이 사용될 때, 면역친화성 재료에 대한 낮은 결합 친화도를 갖는 성분은 면역친화성 재료를 통과하기 위해 더 큰 부피의 용리 완충액을 필요로 할 수도 있는, 더 높은 결합 친화도를 갖는 성분보다 더 일찍 방출될 것이다. 특정 풀 또는 다른 시점에서 얻은 용리의 배치를 선택함으로써, 인자 IX 종의 다른 조성을 갖는 샘플을 얻을 수도 있다.

구배 용리는 상기 논의된 농도와 같이, 최종 최대 농도의 완충액에서 킬레이트 시약, 예를 들어, EDTA의 농도를 증가시킴으로써 성취될 수도 있다. 예를 들어 선형 구배는 0% 내지 100%의 킬레이트 시약, 예를 들어, EDTA의 최종 농도를 사용할 수도 있다. 이 구배는 10, 20, 30, 40, 50, 70, 100, 150 이상 컬럼 부피와 같은, 일정 기간 동안 면역친화성 재료에 적용될 수도 있다. 이러한 구배 용리를 사용하여, 면역친화성 재료에 대해 낮은 결합 친화도를 갖는 성분은 용리가 발생하기 위해 더 높은 농도의 킬레이트 시약을 필요로 할 수도 있는, 더 높은 결합 친화도를 갖는 성분보다 더 일찍, 더 낮은 농도의 킬레이트 시약, 예를 들어, EDTA에서 방출될 것이다. 특정 풀 또는 다른 시점에서 얻은 용리의 배치를 선택함으로써, 인자 IX 종의 다른 조성을 갖는 샘플을 얻을 수도 있다.

염의 농도를 증가시키는 점진적 구배를 사용하는 것보다 차라리, 단계적인 증가가 사용될 수도 있다. 즉, EDTA의 농도는 하나 이상의 별도의 단계에서 최종 최대 농도로 증가될 수도 있다. 이것은 구배 용리의 효과를 반영하기 위해 사용될 수도 있는데, 여기서 다른 성분은 다른 농도 및 따라서 다른 단계에서 방출된다. 단계적인 용리는 대안으로 등용매 용리와 결합될 수도 있다. 예를 들어, 염 농도의 단계적인 증가는 수많은 용리 완충액의 컬럼 부피에 대해 유지될 수도 있다. 완충액의 부피가 증가하는 바와 같이 용리되는 다른 성분과 함께 발생을 허용하는 농도에서 등용매 용리가 사용된다. 염 농도에서 다음의 추가적인 단계는 또한 사용될 수도 있다.

실시예

실시예 1: Gla에 관련 된 항체 3F14A3B6에 대하여 FIX 의 다른 감마-카르복실화종의 칼슘 의존성의 조사

항체 3F14A3B6에 대한 각각의 FIX Gla 종 #1-8 - #1-12의 칼슘 의존성이 나타났고, 결과는 도 2 및 하기 표에서 볼 수 있다.

* K_{0 .5}는 3F14A3B6과 결합하는 반최대를 일으키는 칼슘 농도이다.

** h는 힐 계수 (Hill Coefficient)인데, 이것은 칼슘의 결합이 협동적인지를 설명한다. h > 1은 협동적인 결합이 존재하는 것을 말하지만, h = 1은 협동성이 존재하지 않는다는 것을 말한다.

이 결과는 종 #1-8 - #1-9가 #1-11 - #1-12와 비교하여 크게 감소된 협동성 및 증가된 칼슘 의존성을 보인다는 것을 나타낸다. FIX Gla 종 #1-10은 중간의 칼슘 의존성을 나타낸다. 이 데이터들은 오버로딩이 더 나은 Gla 프로파일을 산출하는 방법으로 오버로딩 원칙과 결합될 수도 있다.

실시예 2: Gla에 관련 된 항체 3F14A3B6 및 컬럼 오버로딩과 함께 면역크로마토그래피와 관련될 때 FIX 의 다른 감마-카르복실화종의 정제 및 분석

배양 상층액에 350 mM NaCl 및 1.5 mM CaCl₂를 추가하였다. NaCl을 비-가용성 Ca-인산염의 형성을 피하기 위해서 CaCl₂ 전에 추가한다. 수확물이 녹으면, 적용 샘플을 로딩 전에 0.45 um으로 여과한다.

젤

2.5 mg 3F14A3B6 / ml 레진 (GE Healthcare)와 커플링된 CNBr 세파로스 4 FF.

컬럼 처리

컬럼은 적합한 수성 용액, 예를 들어, 평형화 완충액에 포장된다. 보관 후, 평형화를 진행하기 전 세척을 2번 수행하라.

파라미터

침대 높이: > 5 cm

온도: 2-10 °C

유량: 15 (12-18 CV/h)

최대 압력: < 0.1 MPa (< 1 bar)

수용량: 활성 FIX로 측정된 0.3 g/L

로딩 : 활성 FIX로 측정된 0.36 (수용량의 120%) g/L

완충액

A1: 20 mM Tris, 1.5 mM CaCl₂, pH 7.5

A2: 20 mM Tris, 1.5 mM CaCl₂, 0.5% triton x-100, pH 7.5

A3: 20 mM Tris, 2 M NaCl, 1.5 mM CaCl₂, pH 7.5

A4: 20 mM Tris, 20 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH 7.5

A5: 20 mM Tris, pH 9.0, 4.0 M NaCl, 0.01% (v/v) Triton-X 100

A6: 20 mM NaCitrate, pH 5.5, 4.0 M NaCl, 0.01% (v/v) Triton-X 100

용매를 함유한 Tris는 4M HCl로 조정된 pH이다.

컬럼 조작

평형화: 5 CV 82.5% A1 + 17.5% A3 (c.t. 20 mM Tris, 350 mM NaCl, 1.5 mM CaCl₂, pH 7.5)

적용: 언급된 바와 같음. 언급된 수용량의 120%.

세척 1: 3 CV 82.5% A1 + 17.5% A3 (c.t. 20 mM Tris, 350 mM NaCl, 1.5 mM CaCl₂, pH 7.5)

세척 2: 3 CV A3

세척 3: 2 CV A2 (유량 2 CV/ h - 접촉 시간 1시간)

세척 4: 2 CV 97.5% A1 + 2.5% A3 (c.t. 20 mM Tris, 50 mM NaCl, 1.5 mM CaCl₂, pH 7.5)

용리: 10 CV A4 (등용매)

재생 1: 5 CV A5

재생 2: 5 CV A6

보관: A7 (24시간 미만 보관할 때, A1을 사용할 수 있다. A7을 평형화 전에 A3와 함께 씻어낸다)

생성물 수거

시작 수거: A₂₈₀ > 0.05

정지 수거: A₂₈₀ > 0.25 또는 2 CV 후

예

컬럼 오버로딩의 일부 예는 하기 나타난다. 적용시 1.5 mM보다 2 mM CaCl2를 추가하는 것을 제외하고, 이 단락에서 설명된 최상의 방식의 절차를 사용하였다.

IEX-HPLC 방법을 Agilent HPLC 시스템에서 수행된 Gla 함량의 분석을 위해 사용하였다 (방법은 하기 나타난다). HPLC 방법에 기초한 Gla 함량 분석은 N-말단 시퀀싱에 기초한 Gla 함량 결정 및 기본적인 가수분해 분석과 관련이 있다.

0.18 ml/분의 유량으로 MiniQ PC3.2/3 컬럼 (GE Healthcare 카탈로그 번호 17-0686-01)을 사용하였다.

이 시스템에서 사용된 완충액은:

A-완충액: 20 mM Tris, pH 9.0

B-완충액: 20 mM Tris, pH 9.0, 1.5 M 암모늄 아세테이트다.

다음 시그날을 측정하였다.

_● UV280

_● 형광발광 시그날, 예를 들어, ex: 280nm / em : 340nm.

HPLC 과정은 다음과 같았다.

0 - 5분 0 - 30% B

5 - 55분 30 - 55% B

55 - 65분 55 - 100% B

수용량 미만의 로딩 (IEX-HPLC 분석)에서 얻은 Gla 프로파일과 비교할 때 122%의 컬럼 오버로딩 (IEX-HPLC 분석)에서 얻은 Gla 프로파일을 도 3a 및 3b에서 각각 볼 수 있다. 오버로딩 및 낮은 로딩 수용량의 분포의 비교는 하기 표에서 볼 수 있다:

따라서, 상기 설명된 바와 같이 122% 컬럼 오버로딩을 사용한 정제는 원래의 FIX 샘플로부터 모든 검출 가능한 #1-8-Gla의 제거로 이끌었다. 또한 #1-9-Gla 및 #1-10-Gla의 존재시 감소 및 #1-11-Gla 및 #1-12-Gla의 비율에서 중요한 증가가 있었다 (즉, 낮은 컬럼 로딩에서 79.1%와 비교할 때 컬럼 오버로딩에서 활성형 #1-11 및 #1-12의 90.6%를 얻었다).

수용량 미만의 로딩 (IEX-HPLC 분석)에서 얻은 Gla 프로파일과 비교할 때 170%의 컬럼 오버로딩 (IEX-HPLC 분석)에서 얻은 Gla 프로파일을 도 3c 및 3d에서 각각 볼 수 있다. 오버로딩 및 낮은 로딩 수용량의 분포의 비교는 하기 표에서 볼 수 있다:

따라서, 상기 설명된 바와 같이 170% 컬럼 오버로딩을 사용한 정제는 원래의 FIX 샘플로부터 모든 검출 가능한 #1-8-Gla의 제거로 이끌었다. 또한 #1-9-Gla 및 #1-10-Gla의 존재시 감소 및 #1-11-Gla 및 #1-12-Gla의 비율에서 중요한 증가가 있었다 (즉, 낮은 컬럼 로딩에서 68.8%와 비교할 때 컬럼 오버로딩에서 활성형 #1-11 및 #1-12의 91.2%를 얻었다).

수용량 미만의 로딩 (IEX-HPLC 분석)에서 얻은 Gla 프로파일과 비교할 때 334%의 컬럼 오버로딩 (IEX-HPLC 분석)에서 얻은 Gla 프로파일을 도 3e 및 3f에서 각각 볼 수 있다. 오버로딩 및 낮은 로딩 수용량의 분포의 비교는 하기 표에서 볼 수 있다:

따라서, 상기 설명된 바와 같이 334% 컬럼 오버로딩을 사용한 정제는 원래의 FIX 샘플로부터 모든 검출 가능한 #1-8-Gla의 제거로 이끌었다. 또한 #1-9-Gla 및 #1-10-Gla의 존재시 감소 및 #1-11-Gla 및 #1-12-Gla의 비율에서 중요한 증가가 있었다 (즉, 낮은 컬럼 로딩에서 73.7%와 비교할 때 컬럼 오버로딩에서 활성형 #1-11 및 #1-12의 90.0%를 얻었다).

여기에 인용된, 출판물을 포함하여, 모든 참고 문헌, 특허출원, 및 특허는 본원에 그 전문이 참고로 포함되고 각각의 참고 문헌들이 개별적으로 및 특이적으로 참고로 포함되는 것을 나타내고 그것의 전문이 여기에 언급되는 것처럼 같은 함량에 대해 (법에 의해 허용된 최대 함량에 대해), 여기에 독립적으로 제공된 어느 것에 상관없이 특정 문서의 포함은 다른 곳에서 이루어졌다.

용어 "한" 및 "한" 및 "그" 및 본 발명을 설명하는 맥락의 유사한 관계항은 여기에 달리 지시되지 않거나 맥락에 의해 명백히 부정되지 않으면, 단수형 및 복수형 둘 다를 커버하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 구절 "화합물"은 달리 지시되지 않으면, 본 발명의 또는 특정 설명된 양태의 다양한 "화합물"을 나타내는 것으로서 이해되는 것이다.

달리 지시되지 않으면, 여기에 제공된 모든 정확한 값은 해당하는 근사값을 대표한다 (예를 들어, 특정 인자 또는 측정값에 대하여 제공된 모든 정확한 전형적인 값은 적절한 경우, "약"에 의해 변형된, 해당하는 근사한 측정값을 또한 제공하는 것으로 생각될 수도 있다.

요소 또는 요소들을 참조하여, 여기에 설명된 어느 양태 또는 "포함하는", "갖는", "포함하는", 또는 "함유하는"과 같은 용어를 사용하는 본 발명의 양태는 달리 진술되거나 맥락에 의해 명백히 부정되지 않으면, 유사한 양태 또는 본 발명의 양태에 대한 지원을 제공하려고 한다 (예를 들어, 특정 요소를 포함하는 것으로 여기에 설명된 조성물은 달리 진술되거나 맥락에 의해 명백히 부정되지 않으면, 또한 그 요소로 구성된 성분을 설명하는 것으로 이해되어야 한다).

SEQUENCE LISTING <110> NOVO NORDISK A/S <120> PURIFICATION OF BLOOD COAGULATION FACTORS <130> 7915 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 445 <212> PRT <213> Mouse <400> 1 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Ser Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Lys Pro Thr Tyr Asp Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Gly Leu Tyr Asp Gly Tyr Pro Ser Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ala Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 115 120 125 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val 130 135 140 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro 195 200 205 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly 210 215 220 Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu 290 295 300 Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg 305 310 315 320 Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro 340 345 350 Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr 355 360 365 Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly 385 390 395 400 Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu 405 410 415 Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn 420 425 430 His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 2 <211> 213 <212> PRT <213> Mouse <400> 2 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Asn Glu Cys 210

Claims (15)

1. 다른 함량의 감마-카르복시글루탐산을 갖는 단백질/폴리펩티드 종의 혼합물을 포함하는 샘플로부터, 다른 함량의 감마-카르복시글루탐산을 갖는 단백질/폴리펩티드의 조성물을 원하는 함량의 감마-카르복시글루탐산을 갖는 단백질/폴리펩티드의 조성물로 정제하는 방법으로서,
   (a) 상기 단백질/폴리펩티드 샘플을 감마-카르복시글루탐산에 대한 결합 분획에 커플링된 면역친화성 크로마토그래피 재료에 로딩하는 단계;
   (b) 상기 단백질/폴리펩티드를 용리하는 단계; 및
   (c) 분획에서 단백질/폴리펩티드가 감마-카르복시글루탐산의 원하는 함량을 갖는, 상기 용리액으로부터 얻은 분획을 선택하는 단계;
   를 포함하고,
   상기 샘플 내에 단백질/폴리펩티드의 전체 농도가 면역친화성 크로마토그래피 재료의 결합력을 초과하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 단백질/폴리펩티드는 인자 IX인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항 또는 2항 중 어느 한 항에 있어서, 면역친화성 크로마토그래피 재료의 결합력은 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 140, 150, 200, 250, 500, 750 또는 1000%의 어느 하나보다도 더 큰 것, 특히 120%보다 큰 것, 또는 150%보다 큰 것, 또는 250%보다 큰 것임을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3항에 있어서, 면역친화성 크로마토그래피 재료의 결합력은 100-200%, 특히 100-150%와 같은, 100-400% 사이에 의해 초과하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 정제되는 샘플에서 인자 IX의 #1-11-Gla 및/또는 #1-12-Gla 형태의 비율과 비교하여 인자 IX의 #1-11-Gla 및/또는 #1-12-Gla 형태의 비율의 증가를 갖는, 상기 용리액으로부터 얻은 분획을 선택하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5항에 있어서, 상기 방법은 정제되는 샘플에서 인자 IX의 #1-10-Gla 형태의 비율과 비교하여 인자 IX의 #1-10-Gla 형태의 비율의 감소를 갖는, 상기 용리액으로부터 얻은 분획을 선택하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리 완충액 및/또는 평형화 완충액은 7.5와 같이, 5.0 내지 8.5의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 염화나트륨은 50 mM과 같이, 10 mM 내지 100 mM의 농도로 용리 완충액 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, Gla에 대한 결합 분획은 Gla에 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9항에 있어서, 항체는 칼슘, 마그네슘 또는 다른 이가 양이온의 존재시 Gla 도메인의 폴딩에 민감하고 및/또는 항체는 특이적 Gla 잔기를 함유하는 에피토프를 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 9항에 있어서, Gla에 결합하는 항체는 3F14A3B6 (SEQ ID NOS: 1 및 2)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 면역친화성 재료는 사전-활성화된 세파로스 비드, 특히 CNBr-세파로스 4 FF와 같은, 세파로스 비드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 평형화 완충액 및 세척 완충액은 추가적으로 염화칼슘과 같은, 칼슘이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 13항에 있어서, 칼슘이온은 0.5 mM보다 큰 (예를 들어, 3.0, 5.0, 8.0 또는 10.0, 특히 2 또는 5 mM 염화칼슘과 같이, 0.5, 1.0, 1.5, 또는 2.0 mM보다 큰) 농도로 존재하거나, 칼슘이온은 0.5-10 mM, 1-8 mM. 1-5 mM, 및 2-5 mM의 범위 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 면역친화성에 기초한 오버로딩 방법은, Gla 종들이 음이온 크로마토그래피계 방법을 사용하여 더 분리/정제되는 두 번째 단계와 함께 사용될 수도 있는 것을 특징으로 하는 방법.

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