ES2576109T3 - Purificación de polipéptidos - Google Patents

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ES2576109T3 ES09793497.0T ES09793497T ES2576109T3 ES 2576109 T3 ES2576109 T3 ES 2576109T3 ES 09793497 T ES09793497 T ES 09793497T ES 2576109 T3 ES2576109 T3 ES 2576109T3
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Abstract

Un método para purificación de un polipéptido que tiene un contenido deseado de ácido gammacarboxiglutámico a partir de una muestra que comprende una mixtura de especies de dicho polipéptido que tienen contenidos diferentes de ácido gamma-carboxiglutámico, comprendiendo dicho método los pasos de: a) cargar dicha muestra sobre un material de cromatografía de intercambio aniónico; (b) eluir dicho polipéptido utilizando una solución con un pH comprendido entre 5,0 y 8,5 que comprende al menos una sal seleccionada del grupo constituido por acetato de amonio, cloruro de amonio y acetato de sodio; y (c) seleccionar una fracción obtenida por dicha elución, que tiene un aumento en la proporción de formas 1-10-Gla y/o 1-11-Gla de Factor VII o Factor VIIa comparada con la proporción de formas 1-10-Gla y/o 1-11-Gla de Factor VII o Factor VIIa en la muestra que se purifica.

Description

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DESCRIPCION
Purificacion de polipeptidos Campo de la Invencion
La presente invencion se refiere a la purificacion de polipeptidos. En particular, la presente invencion se refiere a metodos que utilizan cromatograffa de intercambio ionico, por la cual pueden purificarse diferentes formas de polipeptidos gamma-carboxiladas.
Antecedentes de la Invencion
El acido Y-carboxiglutamico (Gla) es un aminoacido singular que se fija al calcio. Es una forma modificada de acido glutamico (Glu) y puede producirse in vivo por la modificacion postraduccional de residuos glutamato. La carboxilacion del acido glutamico de esta manera hace posible la fijacion de calcio y permite la union de protemas tales como procoagulantes y anticoagulantes a los fosfoffpidos. Esta reaccion mediada por enzimas, conocida como Y-carboxilacion (gamma-carboxilacion), requiere vitamina K como cofactor.
Algunas protemas maduras tienen un dominio que es rico en aminoacidos que se han convertido en acido y- carboxiglutamico de esta manera. Este se conoce como dominio GLA. Este dominio GLA es en muchos casos responsable de la fijacion con afinidad alta de los iones calcio por la protema. Un dominio GLA de este tipo puede encontrarse en una diversidad de protemas diferentes. Por ejemplo, los factores de coagulacion de la sangre VII, IX y X y la protrombina incluyen todos ellos un dominio GLA que comprende cierto numero de residuos de aminoacido Gla.
Gillis S. et al., Protein Science, Vol. 6, No. 1, (1997) describe diversos polipeptidos del Factor IX humanos con diferentes cantidades de residuos gla.
Malhotra et al., Biochemical et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymologie, vol. 746, No. 1-2, (1983) describe que las protrombinas tienen diferentes cantidades de residuos gla.
EP 0 363 126 da a conocer un metodo para purificacion de protemas dependientes de vitamina K ejemplificadas por protema C humana, utilizando cromatograffa de intercambio ionico.
Yan S.C.B. et al. Bio/Technology, Vol. 8, No. 7 (1 julio 1990) describe que la actividad de Protema C depende del grado de gamma-carboxilacion.
EP 0 617 049 describe un proceso para el aislamiento de factores IX, X y II altamente purificados a partir de complejo de protrombina o plasma humano.
Sumario de la Invencion
Los autores de la presente invencion han encontrado que es posible separar o purificar diferentes especies de un polipeptido en el cual las diferentes especies vanan en la cantidad de gamma-carboxilacion, o el numero de residuos de acido gamma-carboxiglutamico que contienen las mismas. La invencion aborda en particular la separacion cromatografica de especies de polipeptidos que tienen contenidos diferentes de acido gamma-carboxiglutamico.
Asf pues, la invencion proporciona un metodo para purificacion de un polipeptido que tiene un contenido deseado de acido gamma-carboxiglutamico a partir de una muestra que comprende una mixtura de especies de dicho polipeptido que tienen contenidos diferentes de acido gamma-carboxiglutamico, comprendiendo dicho metodos los pasos de:
(a) cargar dicha muestra sobre un material de cromatograffa de intercambio anionico;
(b) eluir dicho polipeptido utilizando una solucion con un pH menor que pH 9,0 que comprende al menos una sal seleccionada de acetato de amonio, cloruro de amonio y acetato de sodio;
(c) seleccionar una fraccion obtenida por dicha elucion, en donde los polipeptidos de la fraccion tienen el contenido deseado de acidos gamma-carboxiglutamicos.
Un metodo preferido de este tipo comprende los pasos siguientes:
(a) equilibrar un material de intercambio anionico con un tampon a un pH menor que 9,0;
(b) cargar dicha muestra sobre el material de intercambio anionico;
(c) opcionalmente, lavar el material de intercambio anionico con un tampon a un pH menor que 9,0;
(d) eluir dicho polipeptido del material de intercambio anionico utilizando una solucion con un pH menor que 9,0 que comprende al menos una sal seleccionada de acetato de amonio, cloruro de amonio y acetato de sodio; y
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(e) seleccionar una fraccion obtenida por dicha elucion en la cual los polipeptidos de la fraccion tienen el contenido deseado de acidos gamma-carboxiglutamicos.
Polipeptidos adecuados para purificacion de esta manera incluyen Factor IX, Factor VII, Factor VIIa, Factor X, protrombina, Protema-S, Protema-C, Protema-Z, Osteocalcina, Protema Matriz-Gla, 6-espedfica de la detencion del crecimiento, Gla-1 rico en Prolina, Gla-2 rico en Prolina, Gla-3 rico en Prolina y Gla-4 rico en Prolina. En un metodo preferido, el polipeptido es Factor IX, Factor X, Factor VII o Factor VIIa.
Donde el polipeptido es Factor IX, el metodo puede comprender seleccionar una fraccion obtenida por dicha elucion que tiene un aumento en la proporcion de formas #1-11 -Gla y/o #1-12-Gla de Factor IX comparada con la proporcion de formas #1-11 -Gla y/o #1-12-Gla de Factor IX en la muestra que se purifica.
Donde el polipeptido es Factor X o Factor VII, el metodo puede comprender seleccionar una fraccion contenida por dicha elucion que tiene un aumento en la proporcion de formas #1-10-Gla y/o #1-11-Gla de Factor X o Factor VII comparada con la proporcion de formas #1-10-Gla y/o #1 -11 -Gla de Factor X o Factor VII en la muestra que se purifica.
Donde el polipeptido es Factor IX, el metodo puede comprender seleccionar una fraccion obtenida por dicha elucion que tiene una disminucion en la proporcion de forma #1-10-Gla del Factor IX comparada con la proporcion de forma #1-10-Gla de Factor IX en la muestra que se purifica.
Donde el polipeptido es Factor X o Factor VII, el metodo puede comprender seleccionar una fraccion obtenida por dicha elucion que tiene una disminucion en la proporcion de forma #1-9-Gla del Factor X o Factor VII comparada con la proporcion de forma #1-9-Gla de Factor X o Factor VII en la muestra que se purifica.
En los metodos de la invencion, puede aplicarse uno cualquiera o mas de lo siguiente:
- el tampon de elucion puede tener un pH entre 5,0 y 8,5;
- acetato de amonio, cloruro de amonio o acetato de sodio pueden estar presentes en el patron de elucion en una proporcion entre 0,1 M y 2,0 M, con preferencia a aproximadamente 0,6 M.
- la cromatograffa de intercambio ionico puede utilizar un tampon de equilibracion a un pH entre 5,0 y 8,5.
La presente invencion se extiende tambien a formulaciones de polipeptidos obtenidas por los metodos descritos en esta memoria, es decir formulaciones en las cuales la cantidad de una o mas especies del polipeptido se han alterado, donde las especies difieren en la extension de gamma-carboxilacion, o en el numero de residuos de acido gamma-carboxiglutamico que contienen las mismas.
Breve Descripcion de las Figuras
La Figura 1A muestra la estructura primaria del Factor IX humano con sub-dominios identificados. El dominio GLA se encuentra en los aminoacidos 1-46; el dominio EGF1 se encuentra en los aminoacidos 47-83, el dominio EGF2 se encuentra en los aminoacidos 84 a 124, el peptido de activacion se encuentra en los aminoacidos 146 a 180 y el dominio de proteasa se encuentra en los aminoacidos 181 a 415. Los 12 aminoacidos en el dominio Gla que estan sujetos posiblemente a gamma-carboxilacion estan marcados como "y" y estan localizados en los aminoacidos 7, 8, 15, 17, 20, 21,26, 27, 30, 33, 36 y 40.
La Figura 1B muestra un alineamiento de parte de las secuencias de aminoacidos de los polipeptidos humanos Factor VII, Factor IX y Factor X. Estos alineamientos se derivan del dominio GLA de cada uno de estos polipeptidos y muestran la localizacion de residuos Gla como *.
La Figura 2 muestra el cromatograma obtenido por cromatograffa de cambio de aniones de una muestra de rhFIX como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 3 muestra una subseccion expandida de la Figura 2.
La Figura 4 muestra un analisis de la distribucion de especies Gla antes y despues de la separacion por cromatograffa de intercambio anionico del Ejemplo 2. Antes = distribucion de especies Gla en la muestra de rhFIX utilizada como "Aplicacion" en el Ejemplo 2. Esta muestra se habfa purificado por captura de inmunoafinidad para producir una muestra de rhFIX con pureza mayor que 95%. Despues = distribucion de especies Gla en el conjunto de fracciones C12-D3 obtenidas en el Ejemplo 2.
La Figura 5 muestra el cromatograma obtenido por cromatograffa de intercambio anionico de una muestra de rhFIX como se describe en el Ejemplo 3. La Figura 6 muestra una subseccion expandida de la Figura 5.
La Figura 7 muestra el cromatograma obtenido por cromatograffa de intercambio de aniones de una muestra de FVII como se describe en el Ejemplo 4. La Figura 8 muestra una subseccion expandida de la Figura 7.
La Figura 9 muestra el cromatograma obtenido por cromatograffa de intercambio de aniones de una muestra de rhFIX como se describe en el Ejemplo 5. La Figura 10 muestra una subseccion expandida de la Figura 9.
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La Figura 11 muestra el cromatograma obtenido por cromatograffa de intercambio de aniones de una muestra de rhFIX como se describe en el Ejemplo 6. La Figura 12 muestra una subseccion expandida de la Figura 11.
La Figura 13 muestra el cromatograma obtenido por cromatograffa de intercambio de aniones de una muestra de FX como se describe en el Ejemplo 7.
Descripcion Detallada de la Invencion
La presente invencion se deriva de los hallazgos de que especies de polipeptidos que tienen niveles diferentes de gamma-carboxilacion pueden tener diferentes niveles de actividad, y que tales especies diferentes pueden purificarse o separarse utilizando cromatograffa de intercambio ionico. Por aumento de la proporcion de especies de polipeptidos mas activas, y/o por disminucion de la proporcion de especies de polipeptidos menos activas o inactivas en una muestra, esto puede dar como resultado la produccion de una formulacion purificada que tenga actividad espedfica incrementada.
Un "polipeptido" se utiliza en esta memoria en su sentido mas amplio para hacer referencia a un compuesto de dos o mas subunidades de aminoacidos, analogos de aminoacidos, u otros peptidomimeticos. El termino "polipeptido" incluye asf secuencias pepffdicas cortas ademas de polipeptidos mas largos y protemas. Como se utiliza en esta memoria, el termino "aminoacido" se refiere a aminoacidos naturales y/o no naturales o sinteticos que incluyen glicina y los dos isomeros opticos D o L, y analogos de aminoacidos y peptidomimeticos. Una protema "madura" es un polipeptido que ha sido sometido a procesamiento postraduccional, tal como carboxilacion, glicosilacion o la escision de regiones propepffdicas tales como secuencias de direccionamiento. Un polipeptido de la invencion que se encuentra en forma de una protema madura puede haber sido sometido por tanto a gamma-carboxilacion y puede hacer tenido uno o mas residuos Glu en su secuencia traducida convertidos en Gla.
Los metodos descritos en esta memoria pueden utilizarse para la purificacion de cualquier polipeptido que esta, o puede estar, gamma-carboxilado.
El polipeptido para uso en los metodos de la invencion puede ser un polipeptido que comprende uno o mas residuos de acido gamma-carboxiglutamico. Un polipeptido de este tipo puede identificarse por investigacion de la secuencia de aminoacidos del polipeptido y determinacion de si esta presente Gla.
Se conocen cierto numero de polipeptidos que comprenden acido gamma-carboxiglutamico. Cierto numero de protemas de la coagulacion de la sangre y reguladoras, que incluyen protrombina, Factor VII (con inclusion de Factor Vila), Factor IX, Factor X, protema C y protema S, incluyen residuos Gla. Estas protemas pueden contener 10 a 12 residuos de acido gamma-carboxiglutamico en el dominio GLA, localizados dentro de los primeros 40 residuos del termino N de la protema madura. Las protemas de huesos tales como osteocalcina y protema Matriz Gla y otras protemas de mairnfero dependientes de vitamina K tales como 6-espedfica de la detencion del crecimiento (Gas6), protema Z, Gla-1 rico en Prolina (PRGP1), Gla-2 rico en Prolina (PrGp2), Gla-3 rico en Prolina (PRGP3) y Gla-4 rico en Prolina (PRGP4) comprenden tambien residuos Gla multiples. Se han encontrado tambien residuos de acido gamma-carboxiglutamico en protemas no de mamffero, tales como los conopeptidos Conantokina G y Conantokina T. Cualquiera de estos polipeptidos puede purificarse con arreglo a la invencion.
El polipeptido para uso en los metodos de la invencion puede ser un polipeptido que puede estar modificado postraduccionalmente para incluir uno o mas residuos de acido gamma-carboxiglutamico. Por ejemplo, tales residuos pueden producirse por gamma-carboxilacion de residuos acido glutamico en el polipeptido. La secuencia de aminoacidos del polipeptido puede comprender por tanto uno o mas residuos de acido glutamico (Glu). Un polipeptido que puede modificarse postraduccionalmente de este modo puede ser un polipeptido existente naturalmente. Un polipeptido de este tipo puede derivarse de cualquier organismo adecuado. Por ejemplo, el polipeptido puede ser un polipeptido de mamffero existente naturalmente, tal como un polipeptido de roedor, primate, gato, perro, oveja, vaca, cerdo u otro mamffero. Preferiblemente, el polipeptido es un polipeptido de raton, rata, o humano. Muy preferiblemente, el polipeptido es un polipeptido humano. El polipeptido puede derivarse de una especie de no-mamffero. Por ejemplo, algunas conotoxinas pueden comprender gamma-carboxiglutamato. El polipeptido puede ser por tanto un polipeptido existente naturalmente de un molusco tal como un gasteropodo. El gasteropodo puede ser un caracol tal como un caracol conico. Un polipeptido que puede modificarse postraduccionalmente de este modo puede ser una variante de un polipeptido existente naturalmente, tal como una variante de una de las protemas gamma-carboxiladas conocidas indicadas anteriormente, un polipeptido generado artificialmente, tal como un polipeptido sintetico o una protema mutante o variante producida recombinantemente.
El polipeptido puede ser un polipeptido que tiene un dominio GLA. El dominio GLA es un dominio protemico que contiene modificaciones postraduccionales de residuos glutamato (Glu) multiples para formar gamma- carboxiglutamato (Gla). Estos residuos Gla estan localizados generalmente en una sola region o dominio del polipeptido. Este esta localizado en muchos casos en el termino N del polipeptido o de la protema madura.
Por ejemplo, la Figura 1A muestra la estructura primaria de la protema humana Factor IX. Esta protema incluye un dominio GLA en los aminoacidos 1 a 46. Este dominio incluye 12 residuos de aminoacido que pueden estar modificados de glutamato a Gla. Estos estan localizados en las posiciones 7, 8, 15, 17, 20, 21, 26, 27, 30, 33, 36 y
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40. Por tanto este puede comprender hasta 12 residuos Gla. El polipeptido a purificar conforme a la presente invencion puede ser por tanto Factor IX. La Figura 1B muestra un alineamiento basada en el dominio Gla de las protemas humanas Factor VII, IX y X. Las localizaciones de los residuos de aminoacido que pueden estar modificadas de glutamato a Gla en cada secuencia se identificaron como *. El polipeptido a purificar de acuerdo con la presente invencion puede ser por tanto Factor VII o Factor X.
El polipeptido para uso en la invencion puede comprender un dominio GLA de una protema gamma-carboxilada conocida, tal como un dominio GLA de Factor IX, Factor VI o Factor X, o de cualquiera de las otras protemas gamma-carboxiladas conocidas indicadas anteriormente, tal como de otro factor de coagulacion de la sangre.
El polipeptido para uso en los metodos de la invencion puede ser un polipeptido que comprende o es susceptible de comprender uno o mas residuos de acido gamma-carboxiglutamico. Por ejemplo, el polipeptido puede comprender o ser susceptible de comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 o mas residuos Gla. Preferiblemente, el polipeptido comprende o es susceptible de comprender mas de 1 residuo Gla, tal como mas de 1, mas de 2, mas de 5 o mas de 9 residuos Gla. El polipeptido puede comprender o ser susceptible de comprender hasta 10, hasta 12, hasta 15 o hasta 20 residuos Gla. Como se expone adicionalmente mas adelante, los metodos de la invencion permiten la purificacion de diferentes especies moleculares del polipeptido en las cuales se han producido niveles diferentes de gamma-carboxilacion. Los numeros a que se hace referencia aqu son el numero total de residuos Gla que puede estar presente en dicho polipeptido. Es decir, si el polipeptido esta totalmente gamma-carboxilado, estos numeros indican el numero de residuos Gla que estan presentes. Por ejemplo, donde la gamma-carboxilacion tiene lugar en el dominio GLA, estos numeros se refieren al numero total de sitios posibles para gamma-carboxilacion en dicho dominio GLA, tal como el numero total de residuos Glu en el polipeptido traducido o el numero maximo de residuos Gla que pueden producirse por la accion de una enzima tal como Y-glutamil-carboxilasa. Especies adicionales del mismo polipeptido pueden existir tambien, en las cuales estan presentes menos residuos de acido gamma-carboxiglutamico que este maximo.
El polipeptido puede comprender por tanto residuos Glu multiples en los 40 residuos N-terminales de su secuencia de aminoacidos traducida. Por ejemplo, la secuencia de aminoacidos del polipeptido expresado puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o mas residuos Glu en los 40 residuos de aminoacido mas proximos al termino N del polipeptido, o en los 40 aminoacidos mas proximos al termino N de la protema madura.
La gamma-carboxilacion puede conseguirse utilizando una enzima. Una enzima Y-glutamil-carboxilasa de este tipo se sabe que esta implicada en la gamma-carboxilacion de muchos polipeptidos in vivo. La Y-glutamil-carboxilasa es una enzima endoplasmica que cataliza la modificacion postraduccional de Glu en Gla en el dominio GLA de cierto numero de factores de coagulacion dependientes de vitamina K. Polipeptidos para uso en la presente invencion pueden identificarse asf por determinacion de si los mismos estan gamma-carboxilados por Y-glutamil-carboxilasa.
Se cree que la enzima Y-glutamil-carboxilasa se fija a su protema sustrato por un motivo de secuencia en el lado amino-terminal de los residuos glutamato a carboxilar. La enzima puede carboxilar luego residuos glutamato multiples en dicha area, por ejemplo todos los residuos glutamato en el dominio GLA, antes de la liberacion del sustrato. Un polipeptido para uso en la presente invencion puede comprender por tanto un motivo o sitio que es reconocido por Y-glutamil-carboxilasa o por otra enzima susceptible de gamma-carboxilacion. Este sitio de reconocimiento puede estar localizado en la region N-terminal del polipeptido, por ejemplo dentro de los 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35 o 40 aminoacidos mas proximos al polipeptido tal como se traduce, o al que sera el terminal N de la protema madura. El sitio de reconocimiento puede estar localizado en el lado amino-terminal de los residuos glutamato a carboxilar. Por ejemplo, en muchas protemas gamma-carboxiladas existentes naturalmente, la enzima Y-glutamil-carboxilasa reconoce y se fija a un sitio en la region propeptfdica. Dicha region se escinde subsiguientemente del resto del polipeptido durante el procesamiento postraduccional. El sitio de reconocimiento de la gamma-carboxilasa puede por tanto estar ausente de la protema madura.
En protrombina y Factor IX, el sitio implicado en el reconocimiento de la enzima Y-glutamil-carboxilasa esta definido por los residuos -18, -17, -15, -15 y -10. Un sitio de reconocimiento similar se encuentra en otras protemas gamma- carboxiladas. Una fenilalanina en posicion -16 y alanina en posicion -10 estan bien conservadas dentro de los propeptidos de los sustratos de carboxilasa, como lo son residuos alifaticos tales como isoleucina, leucina y valina en las posiciones -17 y -15. Leucina, valina o lisina en posicion -16 pueden soportar tambien la carboxilacion. El polipeptido para uso en la invencion puede comprender un sitio de reconocimiento de gamma-carboxilacion de una protema gamma-carboxilada conocida, tal como un sitio de reconocimiento de gamma-carboxilacion de Factor IX, Factor X, Factor VII, o cualquiera de las otras protemas gamma-carboxiladas conocidas expuestas anteriormente. Por ejemplo, una region propeptfdica de cualquiera de tales protemas, que comprende un sitio de reconocimiento de gamma-carboxilacion puede estar presente en el terminal N del polipeptido traducido para permitir el procesamiento postraduccional adecuado del polipeptido por Y-glutamil-carboxilasa.
Un polipeptido susceptible de estar gamma-carboxilado cumple preferiblemente uno o los dos criterios siguientes:
(1) el polipeptido comprende un sitio de reconocimiento de gamma-carboxilacion, y
(2) existen residuos de acido glutamico dentro de 40 residuos del sitio de reconocimiento de gamma-carboxilacion.
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Se cree que la enzima Y-glutamil-carboxilasa es activa en el retmulo endoplasmico rugoso. Para que un polipeptido sea gamma-carboxilado por esta enzima, el polipeptido pasa preferiblemente a traves del retmulo endoplasmico rugoso de una celula que expresa la enzima Y-glutamil-transferasa. El polipeptido puede comprender as^ secuencias que permiten el trafico del polipeptido recien sintetizado a traves del retmulo neoplasmico bruto. Secuencias senal susceptibles de direccionamiento de un polipeptido al retmulo endoplasmico son bien conocidas. Tales secuencias senal se encuentran con frecuencia en el termino amino del polipeptido, pueden tener 16 hasta 30 aminoacidos de longitud y pueden comprender 4 a 12 residuos hidrofobos. Tales peptidos senal son escindidos generalmente de la molecula del polipeptido por la peptidasa senal y no estan presentes por tanto en la protema madura.
A fin de que ocurra la gamma-carboxilacion del polipeptido, el polipeptido se expresa preferiblemente en una celula. Un polipeptido para uso en la invencion puede sintetizarse por expresion en una celula de este tipo. Preferiblemente, la celula en la cual se expresa el polipeptido incluye la maquinaria celular necesaria para hacer posible la gamma- carboxilacion de un polipeptido. Por ejemplo, la celula puede expresar Y-glutamil-carboxilasa. Preferiblemente, la celula en la que se sintetiza la protema tiene una enzima gamma-carboxilasa asociada con el retmulo endoplasmico rugoso. La celula puede cultivarse en presencia de cofactores enzimaticos tales como vitamina K. Preferiblemente, la celula en la cual se sintetiza la protema comprende vitamina K intracelular.
Polipeptidos que son susceptibles de gamma-carboxilacion pueden identificarse por expresion de los mismos en una celula de este tipo y determinacion de si existe gamma-carboxilacion. Por ejemplo, un polipeptido puede expresarse en una celula como se describe en esta memoria y puede direccionarse al retmulo endoplasmico rugoso de una celula de este tipo, por ejemplo por utilizacion de un peptido senal como se ha descrito arriba. Por expresion del polipeptido en una celula de este tipo y determinacion de si el polipeptido expresado y procesado postraduccionalmente comprende residuos Gla, puede identificarse un polipeptido susceptible de ser gamma- carboxilado.
Los metodos de la invencion implican la purificacion de una o mas especies de un polipeptido de otras especies de dicho polipeptido que tienen grados de gamma-carboxilacion diferentes. En el caso de que un polipeptido pueda estar gamma-carboxilado en mas de un sitio, pueden existir diferentes especies de dicho polipeptido en las cuales esten presentes numeros diferentes de residuos de aminoacido gamma-carboxiglutamato, o en las cuales estan presentes residuos gamma-carboxiglutamato en diferentes localizaciones posibles dentro de la molecula del polipeptido.
Por ejemplo, algunas especies del polipeptido pueden estar totalmente gamma-carboxiladas. Es decir, la gamma- carboxilacion puede haber convertido el glutamato en gamma-carboxiglutamato en todos los residuos del polipeptido en los cuales es posible esto, por ejemplo en todos los residuos Glu en el dominio GLA. Otras especies del polipeptido pueden estar gamma-carboxiladas parcialmente. Es decir, la gamma-carboxilacion puede haber convertido glutamato en gamma-carboxiglutamato en algunos, pero no todos los residuos en el polipeptido en los que es posible esto, tales como algunos, pero no todos los residuos Glu en el dominio GLA.
Pueden identificarse una diversidad de especies parcialmente gamma-descarboxiladas. Estas pueden clasificarse de diversas maneras. Por ejemplo, puede definirse el nivel de gamma-descarboxilacion por el cual los residuos en el polipeptido estan gamma-descarboxilados, o puede definirse por el numero total de aminoacidos gamma- carboxiglutamato presentes en el polipeptido. La ultima clasificacion puede significar que varias especies moleculares estructuralmente diferentes del polipeptido se consideran juntas basadas en el numero total de residuos de acido gamma-carboxiglutamico que contienen las mismas. Por ejemplo, una especie de polipeptido en la cual estan presentes todos menos uno de los residuos gamma-carboxiglutamato posibles y puede contener subespecies diferentes multiples de polipeptido, en las cuales el glutamato esta retenido en posiciones diferentes que podnan haber sido gamma-carboxiladas.
Debido al mecanismo de accion de la Y-glutamil-carboxilasa, la gamma-carboxilacion comienza generalmente en el residuo Glu mas proximo al sitio de reconocimiento de gamma-carboxilacion y progresa alejandose del terminal N del polipeptido. Donde el polipeptido no esta totalmente gamma-carboxilado, esto es debido generalmente a que la gamma-carboxilacion se detiene, o la enzima se desprende del polipeptido, antes que los ultimos residuos Glu hayan sido convertidos. Generalmente, los residuos Glu mas alejados del sitio de fijacion de la gamma-carboxilacion o mas alejados del termino N de la protema son los que no estan gamma-carboxilados en un polipeptido parcialmente gamma-carboxilado.
Por ejemplo, como se muestra en la Figura 1, el Factor IX humano incluye hasta 12 residuos gamma- carboxiglutamato. El numero real de residuos Gla presentes variara en diferentes moleculas polipeptfdicas dependiendo del grado de modificacion postraduccional por gamma-carboxilacion que ha sufrido la molecula. Esto significa que una muestra de Factor IX humano puede comprender especies de Factor IX que estan totalmente gamma-descarboxiladas, es decir que tienen la totalidad de los 12 residuos gamma-carboxiglutamato posibles (#1- 12 Gla).
Ello puede comprender tambien una o mas especies de Factor IX que tienen 11 de los 12 residuos gamma- carboxiglutamato posibles. De estas, la situacion mas probable es aquella en la que los 11 residuos Glu mas proximos al termino N del polipeptido estan convertidos en Gla, pero el residuo Glu 12°, en la posicion 40 como se
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muestra en la Figura 1, se mantiene como Glu. Asf pues, en esta situacion, unicamente los residuos Glu 1 a 11 se han convertido en Gla (#1-11 Gla).
Ello puede comprender tambien una o mas especies de Factor IX que tienen 10 de los 12 residuos gamma- carboxiglutamato posibles. De estos, la mas probable es la situacion en la que los 10 residuos Glu mas proximos al termino N del polipeptido estan convertidos en Gla, pero los residuos Glu 11° y 12°, en la posiciones 36 y 40, como se muestra en la Figura 1, se mantienen como Glu. Asf, en esta situacion, unicamente los residuos Glu 1 a 10 se han convertido en Gla (#1-10 Gla).
Ello puede comprender tambien una o mas especies de Factor IX que tienen 9 de los 12 posibles residuos gamma- carboxiglutamato tales como #1-9 Gla. Ello puede comprender tambien una o mas especies de Factor IX que tienen menos de 9, tal como 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o ninguno de los 12 residuos gamma-carboxiglutamato posibles.
La presente invencion proporciona metodos para la purificacion de una especie de polipeptido de este tipo. En particular, una especie de un polipeptido puede purificarse en relacion con otras especies de dicho polipeptido en la muestra. Asf, un metodo de la invencion puede conducir a un metodo en la proporcion relativa de una especie de interes en la muestra del polipeptido. Esto puede conseguirse por separacion de una o mas especies diferentes del polipeptido de la muestra, y aumento consiguiente de la proporcion del polipeptido como un todo que se forma a partir de la especie de interes. Esto puede lograrse por separacion espedfica de una o mas especies particulares de la muestra, por la separacion de una o mas especies que no son la especie de interes de la muestra, o por separacion de una fraccion de la muestra en la cual la proporcion de la especie de interes es menor que la de la muestra original. Cualquiera de estos enfoques puede conducir a un aumento global en la proporcion de la especie de interes. Los metodos de la invencion pueden conducir por tanto a un aumento o disminucion en la proporcion de una especie particular de polipeptido en una muestra que comprende una mixtura de especies diferentes de dicho polipeptido.
Un aumento en la proporcion de una especie de polipeptido puede ser un aumento de hasta 5%, hasta 10%, hasta 20%, hasta 30%, o mas en la proporcion de dicha especie en la muestra del polipeptido como un todo. Una disminucion en la proporcion de una especie de polipeptido puede ser una disminucion de hasta 5%, hasta 10%, hasta 20%, hasta 30%, hasta 50%, hasta 70%, hasta 90% o mas en la proporcion de dicha especie en la muestra del polipeptido como un todo. Una disminucion en la proporcion de una especie de polipeptido puede ser una disminucion de hasta 5%, hasta 10%, hasta 20%, hasta 30%, hasta 50%, hasta 70%, hasta 90% o mas en la cantidad de dicha especie que esta presente comparada con la cantidad presente en la muestra original. Una disminucion en la proporcion de una especie de polipeptido puede ser la separacion completa o sustancial de dicha especie de la muestra. Por ejemplo, un metodo de la invencion puede purificar una muestra de un polipeptido por separacion de la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de polipeptido detectable de una especie particular de la muestra. La cantidad de una especie de este tipo que queda en la muestra puede ser menor que 10%, menor que 5%, menor que 2%, o menor que 1% de la cantidad presente en la muestra original.
El proposito de los metodos de la invencion es por tanto hacer posible que las proporciones relativas de las diferentes especies en una muestra del polipeptido se alteren. Especies diferentes pueden tener propiedades diferentes o actividades diferentes. Por cambio de la cantidad o proporcion de dicha especie en una muestra del polipeptido, pueden alterarse las propiedades o la actividad de la muestra como un todo. Por ejemplo, donde diferentes especies de un polipeptido tienen niveles de actividad diferentes, por alteracion de las proporciones de las diferentes especies a fin de aumentar la proporcion de especies que tienen niveles mas altos de actividad y/o por disminucion de las proporciones de especies que tienen actividad menor o nula, puede aumentarse la actividad espedfica de la muestra, v.g. la actividad media por molecula de polipeptido o el porcentaje de la actividad maxima posible para dicha cantidad de polipeptido.
Por ejemplo, se ha encontrado que el Factor humano IX producido por medios recombinantes (rhFIX) exhibe una actividad espedfica de aproximadamente 50%. El fraccionamiento de una muestra de este tipo demostro que la misma contema especies individuales de rhFIX con predominio de #1-8-, #1-9-, #1-10-, #1-11- y #1-12-Gla. Se ha encontrado que #1-11- y #1-12-Gla son totalmente activas en un ensayo de coagulacion y en un ensayo de actividad de dos etapas. Las especies #1-8-, #1-9- y #1-10-Gla exhibfan actividad reducida a aproximadamente 2-5%), 1422% y 27-36% dependiendo del ensayo utilizado.
Por tanto, puede verse que diferentes especies de rhFIX, que vanan solo en su grado de gamma-carboxilacion, exhiben niveles de actividad diferentes. Podna esperarse que una muestra con una proporcion mayor de #1-11- y/o #1-12-Gla exhibiera una actividad espedfica mayor que una muestra que tenga una proporcion menor de dichas especies. Podna esperarse que una muestra con una proporcion mayor de #1-8- y/o #1-9- y/o #1-10-Gla exhibiera una menor actividad espedfica que una muestra que tenga una proporcion menor de dichas especies.
Asf, la actividad espedfica global de una muestra de Factor IX puede verse alterada por alteracion de las proporciones de dicha especie en la muestra. En este caso, puede predecirse que la actividad espedfica global de una muestra de Factor IX puede aumentarse por uno cualquiera o mas de lo siguiente:
• aumento de la proporcion de #1-12-Gla en la muestra;
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aumento de la proporcion de #1-11 -Gla en la muestra; disminucion de la proporcion de #1-10-Gla en la muestra; disminucion de la proporcion de #1-9-Gla en la muestra; disminucion de la proporcion de #1-8-Gla en la muestra; disminucion de la proporcion de #1-7-Gla en la muestra; disminucion de la proporcion de #1-6-Gla en la muestra; disminucion de la proporcion de #1-5-Gla en la muestra; disminucion de la proporcion de #1-4-Gla en la muestra; disminucion de la proporcion de #1-3-Gla en la muestra; disminucion de la proporcion de #1-2-Gla en la muestra; y disminucion de la proporcion de #1-1-Gla en la muestra.
Uno cualquiera o mas de estos cambios pueden seleccionarse cuando se purifica una muestra de Factor IX conforme a la presente invencion.
Una muestra preferida de Factor IX comprendera unicamente #1-11 -Gla y #1-12-Gla y carecera total o sustancialmente de especies que tengan grados menores de gamma-carboxilacion que este, tales como las especies #1-10-, #1 -9- y #1 -8-Gla.
Este enfoque puede aplicarse a composiciones existentes de HFIX. Por ejemplo, como se explica en esta memoria, se encontro que el hFIX utilizado en el Ejemplo 2 tiene 45,6% de #1-12-Gla, 36.0% de #1-11 -Gla, 13,6% de #1-10- Gla, 3,3% de #1-9-Gla y 1,6% de #1-8-Gla. rhFIX esta disponible comercialmente de Wyeth bajo la marca Benefix®. Benefix® tiene un contenido de #1-10-, #1-11-, y #1-12-Gla de aprox. 8-10%, 25-31% y 60-67%, respectivamente. Puede verse que los metodos descritos en esta memoria se pueden utilizar para aumentar la proporcion de #1-11- Gla y/o #1-12-Gla en tales composiciones. Los metodos descritos en esta memoria pueden utilizarse para disminuir la proporcion de especies menos gamma-carboxiladas tales como #1-10-Gla, #1-9-Gla y #1-8-Gla en tales formulaciones. Podna esperarse que esto mejorara la actividad espedfica del hFIX en una formulacion de este tupo.
Puede utilizarse un enfoque similar en relacion con otros polipeptidos que contienen Gla. Por ejemplo, Factor VII y Factor X pueden incluir hasta 11 residuos Gla. Como se muestra en el Ejemplo 4, los metodos de la presente invencion pueden utilizarse para alterar las proporciones de, por ejemplo, #1-9-, #1-10-, o #1-11-Factor VII. Los metodos descritos en esta memoria pueden utilizarse por tanto para alterar las proporciones de diferentes especies de Factor VII dependiendo de su contenido de Gla. Por ejemplo, los metodos descritos en esta memoria pueden utilizarse para aumentar la proporcion de #1-10-Gla y/o #1-11 -Gla en tales composiciones. Los metodos descritos en esta memoria pueden utilizarse para reducir la proporcion de especies menos gamma-carboxiladas, por ejemplo #1- 9-Gla e inferiores, en tales composiciones.
Analogamente, el Ejemplo 7 muestra que una formulacion que comprende especies multiples de Factor X puede procesarse conforme a un metodo de la invencion a fin de alterar las proporciones de diferentes especies de Factor X que contienen Gla. Por seleccion de fracciones adecuadas durante la cromatograffa de intercambio de aniones, pueden seleccionarse muestras que comprenden proporciones diferentes de distintas especies de Gla. Por ejemplo, puede verse por el Ejemplo 7 que los metodos descritos en esta memoria pueden utilizarse para aumentar la proporcion de #1-10-Gla y/o #1-11-Gla en tales composiciones. Los metodos descritos en esta memoria pueden utilizarse para reducir la proporcion de especies menos gamma-carboxiladas tales como #1-9-Gla e inferiores.
La invencion proporciona por tanto metodos que permiten que una especie de un polipeptido se purifique de otras especies del mismo polipeptido, en donde las especies difieren en la proporcion en que las mismas estan gamma- carboxiladas, o en el numero de residuos Gla en su secuencia de aminoacidos.
Los metodos de la invencion utilizan cromatograffa de intercambio de aniones. La invencion se refiere en particular a metodos en los que un polipeptido de interes esta unido a un material de intercambio de aniones y la elucion del polipeptido del material de intercambio de aniones se realiza utilizando un tampon que comprende acetato de amonio, cloruro de amonio o acetato de sodio.
Un material de intercambio de aniones es un material de intercambio de anion que esta cargado positivamente. El mismo tiene por tanto aniones libres que pueden intercambiarse por aniones en una solucion acuosa pasada sobre o a traves del material de intercambio de aniones. La carga puede proporcionarse por fijacion de uno o mas ligandos
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cargados a la fase solida, o puede tratarse de una propiedad inherente de la fase solida. La fase solida puede ser, por ejemplo, una columna de purificacion, parffculas o cuentas, una membrana o un filtro. En general, puede utilizarse una resina de intercambio de anion para la purificacion de polipeptidos con un pi menor que aproximadamente 7. Materiales de intercambio de anion disponibles comercialmente que pueden utilizarse como se describe en esta memoria incluyen, por ejemplo, Sepharose Q Fast Flow, Macroprep 25Q, Poros HQ50, Source 30Q, Source 15Q, MiniQ, MonoQ, preferiblemente MiniQ, MonoQ, CaptoQ, Q Sepharose HP, Toyopearl QAE 550C, Unosphere Q, DE-AE Sepharose FF, Fratoprep DTEAE y Q HyperD20.
Un material de intercambio de anion puede utilizar un grupo de intercambio de anion fuerte tal como una amina cuaternaria. Un material de intercambio de anion puede utilizar un grupo de intercambio de anion debil tal como Dietilaminoetil (DEAE). Un material de intercambio de anion adecuado puede ser seleccionado por el especialista experto dependiendo, por ejemplo, del polipeptido particular a purificar.
El material de intercambio de anion puede seleccionarse dependiendo del polipeptido espedfico a purificar y las condiciones empleadas tales como pH, tampon, fuerza ionica, etc.
Un proceso de purificacion convencional por cromatograffa de intercambio de anion comprende usualmente uno o mas pasos seleccionados de: equilibracion del material de intercambio de anion, aplicacion o carga de una muestra, uno o mas pasos de lavado, elucion y regeneracion del material de intercambio ionico. Metodos estandar para la cromatograffa de intercambio de aniones pueden encontrarse, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences.
La resina de intercambio de anion se equilibra preferiblemente antes de la carga del polipeptido de interes. El proposito de este paso de equilibracion es ajustar las condiciones en el material de intercambio de anion para asemejarse mas estrechamente a las utilizadas en los pasos subsiguientes del metodo. A fin de evitar los cambios en la composicion de la fase movil durante la cromatograffa, el material de intercambio de aniones debeffa equilibrarse al pH y la composicion ionica (v.g., conductividad, composicion del tampon) del tampon de partida. Por ejemplo, la fuerza ionica (v.g., conductividad, pH) del tampon de equilibracion puede seleccionarse de modo que sea lo mas similar posible a la fuerza ionica de los tampones a utilizar en los pasos posteriores del metodo, tales como el tampon utilizado para cargar el polipeptido y/o el o los tampones de lavado.
El material de intercambio de anion puede equilibrarse por tanto utilizando un tampon que este basado estrechamente en los tampones o formulaciones a utilizar en los pasos subsiguientes. Por ejemplo, puede utilizarse el mismo tampon para equilibracion del material de intercambio de anion y para la carga de la muestra. Puede utilizarse el mismo tampon para equilibracion del material de intercambio de anion y para lavado del material de intercambio de anion despues que se ha cargado la muestra. El tampon de equilibracion puede tener el mismo pH que la formulacion de carga y/o el tampon de lavado. El tampon de equilibracion puede tener la misma conductividad que la formulacion de carga y/o el tampon de lavado. El tampon de equilibracion puede utilizar la misma sustancia tampon que la formulacion de carga y/o el tampon de lavado. El tampon de equilibracion puede tener la misma concentracion de la sustancia tampon que la formulacion de carga y/o el tampon de lavado. El tampon de equilibracion puede comprender componentes adicionales presentes tambien en la formulacion de carga y/o el tampon de lavado, tales como detergentes.
El pH del tampon de equilibracion puede determinarse dependiendo del polipeptido particular a purificar. Por ejemplo, para cierto numero de polipeptidos tales como Factor IX, un pH de 9,0 o mayor no es optimo, dado que pueden observarse autoactivacion y/o degradacion del polipeptido a estos valores de pH.
Un tampon de equilibracion para uso en la presente invencion puede formularse a, por ejemplo, un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,5, tal como desde pH 5,0 a pH 8,5. El pH de un tampon de equilibracion puede ser mayor que aproximadamente 5,0, mayor que aproximadamente 5,5, mayor que aproximadamente 6,0, mayor que aproximadamente 6,5, mayor que aproximadamente 7,0, mayor que aproximadamente 7,5 o mayor que aproximadamente 8,0. El pH del tampon de equilibracion puede ser menor que aproximadamente 8,5, menor que aproximadamente 8,0, menor que aproximadamente 7,5, menor que aproximadamente 7,0, menor que aproximadamente 6,5, menor que aproximadamente 6,0 o menor que aproximadamente 5,5. Puede combinarse cualquier combinacion de tales puntos finales. Por ejemplo, el pH del tampon de equilibracion puede ser mayor que aproximadamente 7,0 y menor que aproximadamente 8,5. El pH puede ser, por ejemplo, aproximadamente pH 7,0,
7,5, 8,0 u 8,5.
Estos valores de pH pueden ser adecuados para la equilibracion de materiales de intercambio de anion para la purificacion de polipeptidos como se describen en esta memoria, tales como Factor IX, Factor VII o Factor X.
Componentes adecuados para un tampon de equilibracion pueden incluir una sustancia tampon, v.g., Tris, fosfato, MES, Hepes o carbonato. Para un metodo de cromatograffa de intercambio de anion, es preferible un ion de tamponamiento positivo tal como Tris. Una sustancia tampon de este tipo puede utilizarse para mantener el tampon de equilibracion a pH como se ha definido arriba. En una realizacion, se utilizan la misma sustancia tampon y concentracion de sustancia tampon a todo lo largo del procedimiento de cromatograffa de intercambio anionico. Por ejemplo, el tampon de equilibracion, el o los tampones de lavado y el tampon de elucion pueden comprender todos
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ellos la misma sustancia tampon a la misma concentracion de sustancia tampon. La concentracion de sustancia tampon debena ser suficiente para mantener la capacidad de tamponamiento y el pH constante durante el procedimiento de intercambio anionico. Por ejemplo, la sustancia tampon y la concentracion de sustancia tampon pueden seleccionarse para mantener un pH y capacidad de tamponamiento estables durante la aplicacion de la muestra y durante la elucion. Una concentracion de sustancia tampon adecuada puede estar comprendida, por ejemplo, entre 5 mM y 50 mM, tal como entre 20 mM y 40 mM. Una concentracion de sustancia tampon adecuada puede ser, por ejemplo, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM o 25 mM.
Un tampon de equilibracion puede comprender uno o mas componentes adicionales. Un tampon de equilibracion puede comprender un aditivo tal como etilenglicol, etanol, urea o un detergente utilizado para aumentar la solubilidad de una protema. Un detergente utilizado en cromatograffa de intercambio anionico debena ser neutro o tener la misma carga que el material de intercambio anionico. Detergentes no ionicos tales como Tween 80, Tween 20 o Triton X100 pueden utilizarse en una concentracion de, por ejemplo, menor que 1%, menor que 0,5%, menor que 0,1%, o menor que 0,01%. Puede utilizarse una sal no-tampon, tal como NaCl para ajustar la fuerza ionica del tampon.
Una muestra que comprende el polipeptido de interes se carga en el material de intercambio anionico. Esto se consigue por exposicion de la muestra al material de intercambio anionico en condiciones apropiadas (tales como conductividad y/o pH) de tal modo que el polipeptido esta inmovilizado en o sobre el material de intercambio anionico. Esta inmovilizacion o fijacion se consigue por interacciones ionicas entre el polipeptido y grupos cargados del material de intercambio anionico. Dicha fijacion ocurre generalmente cuando la fuerza ionica de la fase movil en contacto con el material de intercambio anionico se reduce hasta el punto de que los grupos ionicos del polipeptido de interes comienzan a servir como los contraiones para los grupos cargados en el material de intercambio anionico.
La muestra a purificar en un metodo de la invencion puede ser cualquier muestra que comprenda un polipeptido como se describe anteriormente. Preferiblemente, la muestra comprende mas de una especie diferente del mismo polipeptido en la que las especies vanan en el grado y/o la localizacion de su gamma-carboxilacion.
Como se ha mencionado arriba, el polipeptido de interes puede obtenerse utilizando cualesquiera procedimientos de rutina. Por ejemplo, el polipeptido puede obtenerse a partir de una fuente in vivo, por ejemplo a partir de un animal, o puede producirse in vitro, por ejemplo, en un tejido o celula. El polipeptido de interes puede producirse recombinantemente, por ejemplo por induccion de la expresion del polipeptido en una celula. Por ejemplo, el polipeptido de interes puede producirse en una celula hospedadora que ha sido transformada o transfectada con un polinucleotido que codifica, y es susceptible de expresar, el polipeptido. Una celula hospedadora de este tipo puede cultivarse en condiciones que permiten la expresion del polipeptido. El polipeptido puede recuperarse luego del medio de cultivo o de las propias celulas hospedadoras.
Preferiblemente, el polipeptido se purifica antes de ser aplicado a la resina de intercambio anionico. Por ejemplo, el polipeptido puede someterse a uno o mas pasos de purificacion tales como precipitacion, inmunoprecipitacion, enfoque isoelectrico, filtracion, centrifugacion o cromatograffa tal como otra cromatograffa de intercambio anionico.
Dicha purificacion puede utilizarse para eliminar, parcial o totalmente, uno o mas contaminantes de la muestra y aumentar con ello el grado de pureza del polipeptido de interes. El contaminante puede ser cualquier molecula que no sea el polipeptido de interes. Por ejemplo, el contaminante puede ser un polipeptido diferente, un acido nucleico o una endotoxina. El contaminante puede ser una variante del polipeptido de interes, tal como un polipeptido truncado o extendido, una forma desamidada del polipeptido, un polipeptido plegado incorrectamente o una forma del polipeptido que tenga glicosilacion no deseada. El contaminante puede ser una molecula que podna interferir con la cromatograffa de intercambio ionico.
Preferiblemente, el polipeptido de interes tiene una pureza de al menos 75%, mas preferiblemente al menos 80%, al menos 90% o mas. Muy preferiblemente, el polipeptido tiene una pureza de al menos 90%, tal como al menos 95%, al menos 97% o al menos 99%. La pureza debe entenderse que se refiere a la proporcion del peso seco total que esta constituida por el polipeptido de interes. La muestra puede comprender menos de 25% en peso de contaminantes como se ha descrito arriba, tal como menos de 25% en peso de protemas distintas del polipeptido de interes, mas preferiblemente menos de 20%, menos de 10%, menos de 5%, menos de 3% o menos de 1%. La muestra puede ser una muestra pura o sustancialmente pura del polipeptido de interes. La muestra puede ser una muestra aislada o sustancialmente aislada del polipeptido de interes.
Una muestra de polipeptido de este tipo puede aplicarse al material de intercambio anionico en una forma obtenida directamente por smtesis de polipeptidos, tal como en la forma de una muestra del medio de cultivo de celulas que producen recombinantemente el polipeptido o una muestra de celulas lisadas que expresan el polipeptido. Una muestra de polipeptido puede aplicarse al material de intercambio anionico en una forma purificada o parcialmente purificada como se describe en esta memoria. Una muestra como se describe en esta memoria puede formularse ulteriormente antes de la aplicacion al material de intercambio anionico. Por ejemplo, cuando el polipeptido (o polipeptido purificado) se proporciona en forma solida, el mismo puede formularse en una composicion lfquida para aplicacion al material de intercambio anionico. Por ejemplo, la misma puede formularse en agua, un tampon u otro disolvente. Preferiblemente, la composicion lfquida es acuosa. Cuando el polipeptido o polipeptido purificado se
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proporciona en una forma Ifquida o acuosa, o cuando una muestra de polipeptido solido se ha formulado en una forma Ifquida como se describe arriba, la formulacion de la muestra puede ajustarse antes de aplicar la misma al material de intercambio anionico.
Por ejemplo, la conductividad y/o el pH de la muestra o muestra formulada pueden ajustarse utilizando metodos de rutina. El pH de la muestra puede ajustarse de modo que sea el mismo que, o sustancialmente el mismo que, el de los tampones utilizados para equilibracion del material de intercambio anionico y/o lavado del material de intercambio anionico. La conductividad de la muestra puede ajustarse de modo que sea la misma que, o sustancialmente la misma que, la de los tampones utilizados para equilibracion del material de intercambio anionico y/o lavado del material de intercambio anionico. La muestra puede formularse con una sustancia tampon, tal como cualquiera de las sustancias tampon expuestas anteriormente en relacion con la composicion del tampon de equilibracion. La muestra puede formularse en el mismo tampon utilizado para equilibracion del material de intercambio anionico y/o lavado del material de intercambio anionico. La muestra puede formularse en la misma sustancia tampon y/o la misma concentracion de sustancia tampon y/o el mismo pH y/o la misma conductividad que el tampon utilizado para equilibracion del material de intercambio anionico y/o lavado del material de intercambio anionico. En una realizacion, se formula un polipeptido de interes para aplicacion a un material de intercambio anionico por adicion del mismo a un tampon identico al tampon de equilibracion que este siendo utilizado.
El polipeptido se carga luego en el material de intercambio ionico por paso de la formulacion relevante del polipeptido sobre o a traves del material de intercambio anionico en condiciones que permiten la fijacion del polipeptido al material de intercambio anionico. Tales metodos son rutinarios en la tecnica.
Una vez que el polipeptido de interes se carga en la columna de intercambio anionico, la columna puede someterse a uno o mas lavados. El lavado se realiza haciendo pasar una solucion apropiada a traves de o sobre el material de intercambio anionico. El proposito de tales lavados puede incluir la separacion de cualquier polipeptido u otros componentes que no se fijan al material de intercambio anionico; la separacion de cualquier polipeptido u otros componentes que se fijan solo debilmente al material de intercambio anionico; la separacion de impurezas que se fijan al material de intercambio anionico con menor afinidad que el polipeptido de interes.
En una realizacion, despues de la carga del polipeptido sobre el material de intercambio anionico, el material de intercambio anionico se lava con un tampon a fin de eliminar cualquier polipeptido no fijado, contaminantes o impurezas. Por ejemplo, el tampon de lavado puede ser identico, o sustancialmente identico, al tampon en el cual se formulo el polipeptido para carga sobre el material de intercambio anionico. El tampon de lavado puede ser identico, o sustancialmente identico al tampon de equilibracion. Por ejemplo, puede realizarse un lavado utilizando el mismo tampon que el tampon de equilibracion o el mismo tampon utilizado para formular el polipeptido. Puede realizarse un lavado utilizando un tampon que tiene el mismo o sustancialmente el mismo pH y/o la misma o sustancialmente la misma conductividad que el tampon de equilibracion o el tampon utilizado para formular el polipeptido. Puede realizarse un lavado utilizando un tampon que comprende la misma sustancia tampon a la misma o sustancialmente la misma concentracion que la utilizada en el tampon de equilibracion o para la formulacion del polipeptido.
Pueden realizarse otros lavados alternativa o adicionalmente utilizando tampones que son diferentes del tampon de equilibracion. Por ejemplo, puede ser posible eliminar contaminantes del material de intercambio anionico que se fijan al material de intercambio anionico menos fuertemente que el polipeptido de interes. Tales contaminantes se liberaran del material de intercambio anionico mas facilmente que el polipeptido de interes. Por ejemplo, el material de intercambio anionico puede lavarse con un tampon que tiene una conductividad o fuerza ionica mayor que el tampon de equilibracion y/o la formulacion en la cual se cargo el polipeptido. Por aumento de la fuerza ionica del tampon, puede conseguirse la elucion de componentes del material de intercambio anionico. Preferiblemente, el tampon de lavado se selecciona, o se utiliza en un volumen suficientemente pequeno tal que sustancialmente no se eluye cantidad alguna del polipeptido de interes del material de intercambio anionico.
Los tampones para lavado pueden ser seleccionados por un especialista experto dependiendo de la naturaleza de la muestra particular y el polipeptido de interes. Por ejemplo, pueden seleccionarse tampones que tengan un pH o conductividad particulares para permitir la separacion de polipeptidos o impurezas particulares que se fijaran a la resina menos fuertemente que el polipeptido de interes. Tales tampones pueden seleccionarse y optimizarse su uso por experimentos de rutina simples, por ejemplo por monitorizacion de la composicion de la solucion separada de la columna.
El pH de un tampon de lavado puede determinarse dependiendo del polipeptido particular a purificar. Por ejemplo, para cierto numero de polipeptidos, tales como Factor IX, un pH de 9,0 o mayor no es optimo, dado que puede observarse autoactivacion y/o degradacion del polipeptido a estos valores de pH.
Un tampon de lavado adecuado para uso en la presente invencion puede formularse a, por ejemplo, un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,5, tal como desde pH 5,0 a pH 8,5. El pH de un tampon de lavado puede ser mayor que aproximadamente 5,0, mayor que aproximadamente 5,5, mayor que aproximadamente 6,0, mayor que aproximadamente 6,5, mayor que aproximadamente 7,0, mayor que aproximadamente 7,5 o mayor que aproximadamente 8,0. El pH del tampon de lavado puede ser menor que aproximadamente 8,5, menor que aproximadamente 8,0, menor que aproximadamente 7,5, menor que aproximadamente 7,0, menor que
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aproximadamente 6,5, menor que aproximadamente 6,0 o menor que aproximadamente 5,5. Cualquier combinacion de tales puntos finales puede combinarse. Por ejemplo, el pH del tampon de lavado puede ser mayor que aproximadamente 7,0 y menor que aproximadamente 8,5. El pH puede ser, por ejemplo, aproximadamente pH 7,0,
7.5, 8,0 u 8,5.
Estos valores de pH pueden ser adecuados para el lavado de materiales de intercambio anionico para la purificacion de polipeptidos como se describen en esta memoria, tales como Factor IX, Factor VII o Factor X.
Componentes adecuados para un tampon de lavado pueden incluir una sustancia tampon, v.g. Tris, fosfato, MES, Hepes o carbonato. Para un metodo de cromatograffa de intercambio anionico, se prefiere un ion de tamponamiento positivo tal como Tris. Puede utilizarse una sustancia tampon de este tipo para mantener el tampon de lavado a un pH como se define anteriormente. Una concentracion adecuada de sustancia tampon puede ser, por ejemplo, entre 5 mM y 50 mM, tal como entre 10 mM y 40 mM. Una concentracion de sustancia tampon adecuada puede ser, por ejemplo, entre 5 mM y 50 mM, tal como entre 10 mM y 40 mM. Una concentracion de sustancia tampon adecuada puede ser, por ejemplo, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM o 25 mM.
Un tampon de lavado puede comprender uno o mas componentes adicionales. Un tampon de lavado puede comprender un aditivo tal como etilenglicol, etanol, urea o un detergente utilizado para aumentar la solubilidad de una protema. Un detergente utilizado en cromatograffa de intercambio anionico debena ser neutro o tener la misma carga que el material de intercambio anionico. Detergentes no ionicos tales como Tween 80, Tween 20 o Triton X100 pueden utilizarse en una concentracion de, por ejemplo, menor que 1%, menor que 0,5%, menor que 0,1% o menor que 0,01%. Una sal no tamponizante, tal como NaCl puede utilizarse para ajustar la fuerza ionica del tampon.
La elucion de una molecula de un material de intercambio anionico significa separacion de la molecula del material de intercambio anionico. Esto se consigue generalmente por alteracion de la fuerza ionica del tampon que rodea el material de intercambio anionico de tal manera que el tampon compite con la molecula por los grupos cargados del material de intercambio anionico. La fuerza de fijacion de la molecula para el material de intercambio anionico disminuye por tanto y se desprende la misma. La elucion de un material de intercambio anionico puede conseguirse tambien en algunos casos por utilizacion de una molecula que altera la conformacion del polipeptido de interes, reduciendo asf la fuerza de fijacion y causando la liberacion del polipeptido del material de intercambio anionico.
El pH del tampon de elucion puede determinarse dependiendo del polipeptido particular a purificar. Por ejemplo, para cierto numero de polipeptidos tales como Factor IX, no es optimo un pH de 9,0 o mayor, dado que puede observarse autoactivacion y/o degradacion del polipeptido a estos valores de pH.
Un tampon de elucion adecuado para uso en la presente invencion puede formularse a, por ejemplo, un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,5, tal como desde pH 5,0 a pH 8,5. El pH de un tampon de elucion puede ser mayor que aproximadamente 5,0, mayor que aproximadamente 5,5, mayor que aproximadamente 6,0, mayor que aproximadamente 6,5, mayor que aproximadamente 7,0, mayor que aproximadamente 7,5 o mayor que aproximadamente 8,0. El pH del tampon de elucion puede ser menor que aproximadamente 8,5, menor que aproximadamente 8,0, menor que aproximadamente 7,5, menor que aproximadamente 7,0, menor que aproximadamente 6,5, menor que aproximadamente 6,0 o menor que aproximadamente 5,5. Cualquier combinacion de tales puntos finales puede combinarse. Por ejemplo, el pH del tampon de elucion puede ser mayor que aproximadamente 7,0 y menor que aproximadamente 8,5. El pH puede ser, por ejemplo, aproximadamente pH 7,0,
7.5, 8,0 u 8,5.
Estos valores de pH pueden ser adecuados para la elucion de materiales de intercambio anionico para la purificacion de polipeptidos como se describen en esta memoria, tales como Factor IX, Factor VII o Factor X.
Componentes adecuados para un tampon de elucion pueden incluir una sustancia tampon, v.g., Tris, fosfato, MES, Hepes o carbonato. Para un metodo de cromatograffa de intercambio anionico, se prefiere un ion de tamponamiento positivo tal como Tris. Puede utilizarse una sustancia tampon de este tipo para mantener el tampon de elucion a un pH como se ha definido arriba. Una concentracion de sustancia tampon adecuada puede ser, por ejemplo, entre 5 mM y 50 mM, tal como entre 10 mM y 40 mM. Una concentracion de sustancia tampon adecuada puede ser, por ejemplo, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM o 25 mM.
Un tampon de elucion puede comprender uno o mas componentes adicionales. Un tampon de elucion puede comprender un aditivo tal como etilenglicol, urea o un detergente utilizado para aumentar la solubilidad de una protema. Un detergente utilizado en cromatograffa de intercambio anionico debena ser neutro o tener la misma carga que el material de intercambio anionico. Detergentes no ionicos tales como Tween 80, Tween 20 o Triton X100 pueden utilizarse en una concentracion de, por ejemplo, menor que 1%, menor que 0,5%, menor que 0,1% o menor que 0,01%. Una sal no tamponizante, tal como NaCl, puede utilizarse para ajustar la fuerza ionica del tampon.
Para uso de acuerdo con la presente invencion, el tampon de elucion comprendera preferiblemente una o mas sales caotropicas, tales como una o mas sales seleccionadas de acetato de amonio, cloruro de amonio y acetato de sodio. La sal caotropica tal como acetato de amonio, cloruro de amonio y/o acetato de sodio puede estar presente en el
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tampon de elucion a una concentracion de al menos 0,1 M, al menos 0,2 M, al menos 0,5 M, al menos 1,0 M o al menos 1,5 M. La sal caotropica tal como acetato de amonio, cloruro de amonio y/o acetato de sodio puede estar presente en una concentracion de hasta 2,0 M, hasta 1,9 M, hasta 1,5 M o hasta 1,0 M. Uno cualquiera de estos puntos finales inferiores puede combinarse con uno cualquiera de estos puntos finales superiores para formar un intervalo de concentracion adecuado. La sal caotropica tal como acetato de amonio, cloruro de amonio y/o acetato de sodio puede estar presente a cualquier concentracion hasta aproximadamente 2,0 M. Por ejemplo, la sal caotropica tal como acetato de amonio, cloruro de amonio y/o acetato de sodio puede estar presente en una concentracion de hasta aproximadamente 0,1, aproximadamente 0,2, aproximadamente 0,3, aproximadamente 0,4, aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,6, aproximadamente 0,7, aproximadamente 0,8, aproximadamente 0,9, aproximadamente 1,0, aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,3, aproximadamente 1,4, aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,6, aproximadamente 1,7, aproximadamente 1,8, aproximadamente 1,9 o aproximadamente 2,0 M, muy preferiblemente en una concentracion de aproximadamente 0,6 M.
En una realizacion, el tampon de elucion tiene la misma composicion que un tampon de lavado y/o el tampon de equilibracion, excepto que el tampon de elucion comprende adicionalmente sal caotropica. Una sal caotropica preferida es una o mas de acetato de amonio, cloruro de amonio y/o acetato de sodio como se ha descrito arriba. Asf, el tampon de elucion puede tener cualquier composicion descrita en esta memoria para un tampon de lavado o tampon de equilibracion, pero puede comprender adicionalmente acetato de amonio, cloruro de amonio y/o acetato de sodio.
En una realizacion, el tampon de equilibracion y el tampon de lavado son identicos y el tampon de elucion difiere de ellos unicamente en que el tampon de elucion comprende tambien acetato de amonio, cloruro de amonio o acetato de sodio.
La elucion puede realizarse utilizando un gradiente isocratico o lineal de la sal caotropica, tal como un gradiente isocratico o lineal de acetato de amonio, cloruro de amonio o acetato de sodio. La elucion puede realizarse utilizando un cambio gradual en la concentracion de la sal caotropica en el tampon. La adicion puede realizarse por cualquier combinacion de estos enfoques de elucion. Por ejemplo, la elucion isocratica a una concentracion dada de sal caotropica puede ir seguida por un aumento de la concentracion de la sal sea en la forma de un gradiente o en uno o mas pasos.
En cualquier metodo de elucion de este tipo, los diferentes componentes se liberaran del material de intercambio anionico en tiempos diferentes, dependiendo de la fuerza de su union. Los componentes que se fijan menos fuertemente tenderan a liberarse antes o a una conductividad menor del tampon tal como una concentracion menor de sal. Los componentes que se fijan mas fuertemente tenderan a quedar retenidos en el material de intercambio anionico durante mas tiempo o hasta una concentracion mayor de sal. El eluyente que ha pasado a traves de o por el material de intercambio anionico puede monitorizarse para identificar cuando se eluyen los componentes particulares. El eluyente puede acumularse en diferentes momentos y cada acumulacion analizarse para determinar que componentes estan presentes en cualesquiera acumulaciones. Pueden seleccionarse luego acumulaciones particulares que tengan la formulacion deseada, por ejemplo concentraciones mayores de especies polipeptfdicas particulares o concentraciones menores de otras especies de polipeptidos.
La elucion isocratica como se describe en esta memoria utiliza una concentracion fija o constante de la sal. Se utiliza un tampon de elucion que comprende dicha concentracion de la sal, tal como cualquiera de las concentraciones expuestas anteriormente. El tampon de elucion se hace pasar a traves de o por el material de intercambio anionico, y el eluyente se monitoriza para identificar en que momento ocurre la elucion. Utilizando elucion isocratica, los componentes que tienen menor afinidad de fijacion para el material de intercambio anionico se liberaran mas pronto, cuando se ha utilizado un volumen menor de tampon de elucion, que los componentes que tienen una mayor afinidad de fijacion, los cuales pueden requerir mayores volumenes de tampon de elucion para pasar a traves de o por el material de intercambio anionico. Por seleccion de acumulaciones o lotes particulares de eluyente obtenidos en diferentes momentos, pueden obtenerse muestras que tienen composiciones diferentes de especies polipeptfdicas.
La elucion en gradiente puede conseguirse por aumento de la concentracion de la sal en el tampon hasta una concentracion final maxima, tal como una concentracion como la expuesta anteriormente en esta memoria. Por ejemplo, un gradiente lineal puede utilizar desde 0% a 100% de la concentracion final de la sal caotropica. Este gradiente puede aplicarse al material de intercambio anionico a lo largo de un periodo de tiempo, tal como mas de 10, 20, 30, 40, 50, 70, 100, 150 o mas volumenes de columna. Utilizando dicha elucion en gradiente, los componentes que tienen menor afinidad de fijacion para el material de intercambio anionico se liberaran mas pronto, a una concentracion de sal menor, que los componentes que tienen una afinidad de fijacion mayor, los cuales pueden requerir una concentracion mayor de sal para que tenga lugar la elucion. Por seleccion de acumulaciones o lotes particulares de eluyente obtenidos en diferentes momentos, pueden obtenerse muestras que tienen diferentes composiciones de especies polipeptfdicas.
En lugar de utilizar un gradiente gradual para aumentar la concentracion de la sal caotropica, puede utilizarse un aumento escalonado. Es decir, la concentracion de la sal puede aumentarse hasta una concentracion final maxima en uno o mas pasos discretos. Esto puede utilizarse para reflejar los efectos de una reaccion en gradiente, en donde
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los diferentes componentes se liberan a concentraciones diferentes y por tanto en pasos diferentes. La elucion escalonada puede combinarse alternativamente con la elucion isocratica. Por ejemplo, un aumento escalonado en concentracion de sal puede mantenerse para cierto numero de volumenes de columna del tampon de elucion, de tal modo que puede tener lugar una elucion isocratica a dicha concentracion, eluyendose los diferentes componentes a medida que se utilizan volumenes crecientes del tampon. Pueden utilizarse tambien pasos adicionales subsiguientes en concentracion de sal.
En las realizaciones en que el tampon de elucion difiere del tampon de lavado unicamente en la presencia de una sal tal como acetato de amonio, cloruro de amonio o acetato de sodio en el tampon de elucion, puede obtenerse un tampon de elucion para elucion isocratica por adicion de una cantidad de la sal al tampon de lavado, puede realizarse elucion en gradiente por adicion gradual de la sal a la solucion de tampon de lavado y puede conseguirse una elucion escalonada por adicion de cantidades de la sal al tampon de lavado a fin de aumentar la concentracion de la sal en el tampon en pasos discretos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Analisis de actividad de diferentes especies de FIX gamma-carboxiladas
Se produjo Factor IX (FIX) humano recombinante en celulas de ovario de hamster chino (CHO). Se midio la actividad espedfica del FIX, encontrandose un valor de aproximadamente 50%.
Se fraccionaron especies individuales de FIX con predominio de #1-8-, #1-9-, #1-10-, #1-11- y #1-12-Gla.
Se utilizo un ensayo de coagulacion para medir el tiempo dependiente de la actividad de FIX hasta la formacion del coagulo de fibrina. Un activador de contacto (acido elagico en el reactivo APTT) para estimular la produccion de FXIIa y se cebo luego por re-calcificacion y adicion de fosfolfpidos. Las actividades se midieron contra BeneFIX y plasma humano acumulado normal, que se calibro contra un estandar WHO de FIX humano.
Se utilizo un kit de ensayo disponible comercialmente conocido como 'Hyphen BioMed Chromogenic Factor IX kit' (Aniara)' para evaluar el nivel de actividad de rhFIX. En este ensayo, el Factor XIa activa el Factor IX a Factor IXa, que junto con el Factor VIII:C activado, fosfolfpidos y Ca2+, activa el Factor X a Factor Xa. La cantidad de Factor Xa generada se midio a 405 nm por la cantidad de pNA liberada del sustrato cromogenico espedfico SXA-11 del Factor Xa.
Se encontro que las especies #1-11- y #1-12-Gla eran plenamente activas en los ensayos de actividad y de coagulacion y de la etapa 2. Las especies #1-8-, #1-9- y #1-10-Gla disminrnan en actividad hasta aproximadamente 2-5%, 14-22% y 27-36%, respectivamente, dependiendo del ensayo utilizado.
Ejemplo 2: Purificacion y analisis de diferentes especies de FIX gamma-carboxiladas
Se utilizo cromatograffa de intercambio anionico para la separacion de diferentes formas gamma-carboxiladas para Factor IX humano recombinante (rhFIX). El metodo utilizo una columna SOURCE 15Q (GE Healthcare) con un volumen de lecho de 6 ml, un caudal de 3 ml/min y una temperatura de 4°C.
La muestra cargada a la columna ("muestra de carga") era de rhFIX. Se cargo un total de aproximadamente 13 mg. La muestra de carga se ajusto a pH 8,0 utilizando NaOH 0,1 M.
Los tampones utilizados eran como sigue:
Tampon de equilibracion: Tris/NaOH 20 mM, pH 8,0, 0,01% Tween 80.
Tampon de elucion: Tris/HCl 20 mM, acetato de amonio 1,5 M, pH 8,0, 0,01% Tween 80.
CIP: NaOH 1M.
El procedimiento de cromatograffa de intercambio anionico era como sigue:
Paso
Tampon CV %-tampon de elucion
Equilibracion
Tampon de equilibracion 10 0%
Aplicacion
Lavado
Tampon de equilibracion 5 0%
Elucion
Tampon de elucion 5 20 % (isocratica)
Paso
Tampon CV %-tampon de elucion
Elucion
Tampon de elucion 20 20-40% (gradiente)
Elucion
Tampon de elucion 5 65% (isocratica)
Elucion
Tampon de elucion 5 100% (isocratica)
CIP1
NaOH 5 0%
CIP2
Tampon de elucion 10 100% (isocratica)
Reequilibracion
Tampon de equilibracion 20 0%
El resultado de esta cromatograffa de intercambio anionico se muestran en las Figuras 2 y 3.
Se selecciono una acumulacion de la fraccion C12-D3, que produda 9,6 mg/74%. El contenido de Gla de esta acumulacion se comparo con el de la muestra original utilizada para cargar la muestra anterior.
Se realizaron analisis del contenido de Gla de fracciones individuales utilizando un sistema HPLC Agilent. Los 5 analisis del contenido de Gla basados en el metodo HPLC estaban correlacionados con los analisis de contenido de Gla obtenidos utilizando analisis de secuenciacion N-terminal e hidrolisis de aminoacidos basicos. La HPLC utilizo una columna MiniQ PC3.2/3 (GE Healthcare cat. No. 17:0686-01) a un caudal de 0,18 ml/min. Los tampones utilizados en este sistema eran:
A-Tampon: Tris/NaOH 20 mM, pH 9,0
10 B-Tampon: Tris/HCl 20 mM, pH 9,0, acetato de amonio 1,5 M
Las senales medidas en este sistema eran UV280 y la senal de fluorescencia (ex: 280 nm / em: 340 nm).
El procedimiento HPLC fue como sigue:
0 - 5 min.
0 - 30 % B
5 - 55 min.
30 - 55 % B
55 - 65 min.
55 - 100 % B
Una comparacion de la distribucion de Gla antes y despues de la separacion utilizando cromatograffa de intercambio anionico como se ha descrito arriba se muestra en la Figura 4. Estos resultados pueden presentarse tambien como 15 sigue:
%-#Gla
Antes Despues BeneFIX®, incl. para comparacion
%-#1-8
1,6 0 0
%-#1-9
3,3 0 3
%-#1-10
13,6 6,7 10
%-#1-11
36,0 40,7 27
%-#1-12
45,6 52,6 60
La purificacion utilizando cromatograffa de intercambio anionico como se ha indicado arriba condujo asf a la separacion de la totalidad de #1-8- y #1-9-Gla detectables de la muestra FIX original. Habfa tambien una disminucion en la presencia de #1-10-Gla y un aumento consiguiente en las proporciones de #1-11- y #1-12-Gla.
En el conjunto purificado final, la actividad espedfica aumentaba tambien a aprox. 110% comparada con Benefix 20 (ensayo de actividad en dos etapas, calculos de los datos no presentados).
15
EJEMPLO 3: Purificacion y analisis de diferentes especies de FIX gamma-carboxiladas
Se utilizo cromatograffa de intercambio anionico para la separacion de diferentes formas gamma-carboxiladas para FIX humano recombinante. El metodo utilizo una columna SOURCE 30Q (GE Healthcare) con un volumen de lecho de 6 ml, un caudal de 2 ml/min y una temperatura de 4°C.
5 La muestra cargada a la columna ("muestra de carga") era de FIX. Se cargaron un total de aprox. 2,5 mg. La muestra de carga se ajusto a pH 8,0 utilizando NaOH 0,1 M.
Los tampones utilizados eran como sigue:
Tampon de equilibracion: Tris/NaOH 20 mM, pH 8,0, 0,01% Tween 80.
Tampon de elucion: Tris/HCl 20 mM, acetato de amonio 1,5 M, pH 8,0, 0,01% Tween 80.
10 CIP: NaOH 1M.
El procedimiento de cromatograffa de intercambio anionico era como sigue:
Paso
Tampon CV %-tampon de elucion
Equilibracion
Tampon de equilibracion 10 0%
Aplicacion
Lavado
Tampon de equilibracion 5 0%
Elucion
Tampon de elucion 5 25 % (isocratica)
Elucion
Tampon de elucion 20 25-45% (gradiente)
Elucion
Tampon de elucion 5 100% (isocratica)
CIP1
NaOH 5 0%
CIP2
Tampon de elucion 10 100% (isocratica)
Reequilibracion
Tampon de equilibracion 20 0%
El resultado de esta cromatograffa de intercambio anionico se muestra en las Figuras 5 y 6.
Se selecciono un conjunto de la fraccion C12-D13, que produjo aproximadamente 1,75 mg/70%. El contenido de Gla de este conjunto se comparo con el de la muestra original utilizada para la muestra de carga arriba indicada. Los 15 analisis del contenido de Gla de fracciones individuales se realizaron utilizando un sistema HPLC Agilent como se describe en el Ejemplo 2.
Una comparacion de la distribucion de Gla antes y despues de la separacion utilizando cromatograffa de intercambio anionico como se ha descrito arriba se muestra en la tabla siguiente.
%-#Gla
Antes Despues BeneFIX®, incl. para comparacion
%-#1-8
1,0 0 0
%-#1-9
3,3 0 3
%-#1-10
12,7 2,3 10
%-#1-11
32,2 25,7 27
%-#1-12
50,8 72,0 60
La purificacion utilizando cromatograffa de intercambio anionico como se muestra anteriormente condujo as^ a la separacion de la totalidad de #1-8- y #1-9-Gla detectable de la muestra FIX original. Se apreciaba tambien una disminucion en la presencia de #1-10-Gla y un aumento consiguiente en las proporciones de #1-11- y #1-12-Gla.
EJEMPLO 4: Purificacion y analisis de diferentes especies de FVII gamma-carboxiladas
5 Se utilizo cromatograffa de intercambio anionico para la separacion de diferentes formas gamma-carboxiladas para Factor Vila humano recombinante (FVII). El metodo utilizo una columna SOURCE 15Q (GE Healthcare) con un volumen de lecho de 1,7 ml, un caudal de 0,75 ml/min y una temperatura de 4°C.
La muestra cargada a la columna ("muestra de carga") era de FVII producido en celulas CHO. Se cargo un total de aproximadamente 1,8 mg. Se anadio a la muestra de carga EDTA 50 mM procedente de una solucion stock 1 M y se 10 ajusto a pH 8,0 utilizando NaOH 0,1 M.
Los tampones utilizados eran como sigue:
Tampon de equilibracion: Tris/NaOH 20 mM, pH 8,0
Tampon de elucion: Tris/HCl 20 mM, acetato de amonio 1,5 M, pH 8,0
CIP: NaOH 1M.
15 El procedimiento de cromatograffa de intercambio anionico fue como sigue:
Paso
Tampon CV %-tampon de elucion
Equilibracion
Tampon de equilibracion 5 0%
Aplicacion
Lavado
Tampon de equilibracion 5 0%
Elucion
Tampon de elucion 100 0-100 % (gradiente)
Elucion
Tampon de elucion 5 100 % (isocratica)
CIP1
NaOH 5 0%
CIP2
Tampon de elucion 10 100% (isocratica)
Reequilibracion
Tampon de equilibracion 10 0%
El resultado de esta cromatograffa de intercambio anionico se muestra en las Figuras 7 y 8.
Se realizaron analisis del contenido de Gla de fracciones individuales (22 a 27) utilizando un sistema HPLC Agilent como se describe en el Ejemplo 2.
Una comparacion de la distribucion de las especies Gla FVII separadas utilizando cromatograffa de intercambio 20 anionico como se ha descrito arriba se muestra en la Tabla siguiente:
Especie Gla* (%)
Fracciones Antes de la separacion (muestra de carga)
22
23 24 25 26 27
%-#1 -8
100,0 100,0 11,0 - - - < 1 %
%-#1 -9
- - 89,0 100,0 69,2 36,7 65
%-#1-10
- - - - 30,8 63,3 34
* Observese que FVII contiene solo 10 Gla residuos Gla en total.
La purificacion utilizando cromatograffa de intercambio anionico como se ha indicado arriba condujo a una separacion clara de especies Gla de FVIIa. As^ puede prepararse una composicion de especies Gla FVII de una manera preferida por el investigador.
EJEMPLO 5: Purificacion y analisis de diferentes especies de FIX gamma-carboxiladas
5 Se utilizo cromatograffa de intercambio anionico para la separacion de diferentes formas gamma-carboxiladas para FIX humano recombinante. El metodo utilizo una columna SOURCE 15Q (GE Healthcare) con un volumen de lecho de 1,7 ml, un caudal de 0,75 ml/min y una temperatura de 4°C.
La muestra cargada a la columna ("muestra de carga") era de FIX. Se cargaron un total de aprox. 2 mg. La muestra de carga se ajusto a pH 8,5 utilizando NaOH 0,1 M.
10 Los tampones utilizados fueron como sigue:
Tampon de equilibracion: Tris/NaOH 20 mM, pH 8,5
Tampon de elucion: Tris/NaOH 20 mM, cloruro de amonio 1,0 M, pH 8,5
CIP: NaOH 1M.
El procedimiento de cromatograffa de intercambio anionico fue como sigue:
Paso
Tampon CV %-tampon de elucion
Equilibracion
Tampon de equilibracion 5 0%
Aplicacion
Lavado
Tampon de equilibracion 5 0%
Elucion
Tampon de elucion 100 0-100% (gradiente)
Elucion
Tampon de elucion 5 100% (isocratica)
CIP1
NaOH 5 0%
CIP2
Tampon de elucion 10 100% (isocratica)
Reequilibracion
Tampon de equilibracion 10 0%
15 El resultado de esta cromatograffa de intercambio anionico se muestra en las Figuras 9 y 10.
Se realizaron analisis del contenido de Gla de fracciones individuales (E7 a F12) utilizando un sistema HPLC Agilent como se describe en el Ejemplo 2.
Una comparacion de la distribucion de las especies Gla FIX separadas utilizando cromatograffa de intercambio anionico como se describe arriba se muestra en la tabla siguiente.
Especie Gla (%)
Antes de la separacion (muestra de carga) Fracciones Benefix®
E7
E8 E9 E10 E11 E12 F12
Gla#8
1,0 - - - - - - - -
Gla#9
3,3 - - - - - - - 3
Gla#10
12,7 18,9 - - - - - - 10
Gla#11
32,2 81,1 73,7 46,3 22,6 13,4 10,4 7,1 27
Especie Gla (%)
Antes de la separacion (muestra de carga) Fracciones Benefix®
E7
E8 E9 E10 E11 E12 F12
Gla#12
50,8 - 26,3 53,7 77,4 86,6 89,6 92,9 60
La purificacion utilizando cromatograffa de intercambio anionico como se muestra anteriormente condujo a una separacion clara de las especies Gla FIX. Asf pues, puede prepararse una composicion de especies Gla FIX de una manera preferida por el investigador.
EJEMPLO 6: Purificacion y analisis de diferentes especies de FIX gamma-carboxiladas
5 Se utilizo cromatograffa de intercambio anionico para la separacion de diferentes formas gamma-carboxiladas para FIX humana recombinante. El metodo utilizo una columna SOURCE 15Q (GE Healthcare) con un volumen de lecho de 1,7 ml, un caudal de 0,75 ml/min y una temperatura de 4°C.
La muestra cargada a la columna ("muestra de carga") era de FIX. Se cargo un total de aprox. 2 mg. La muestra de carga se ajusto a pH 8,0 utilizando NaOH 0,1 M.
10 Los tampones utilizados fueron los siguientes:
Tampon de equilibracion: Tris/NaOH 20 mM, pH 8,0
Tampon de elucion: Tris/HCl 20 mM, acetato de sodio 1,0 M, pH 8,0
CIP: NaOH 1 M.
El procedimiento de la cromatograffa de intercambio anionico fue como sigue:
Paso
Tampon CV %-tampon de elucion
Equilibracion
Tampon de equilibracion 10 0%
Aplicacion
Lavado
Tampon de equilibracion 5 0%
Elucion
Tampon de elucion 5 10% (isocratica)
Elucion
Tampon de elucion 40 10-60% (gradiente)
Elucion
Tampon de elucion 5 100% (isocratica)
CIP1
NaOH 5 0%
CIP2
Tampon de elucion 10 100% (isocratica)
Reequilibracion
Tampon de equilibracion 10 0%
15 El resultado de esta cromatograffa de intercambio anionico se muestra en las Figuras 11 y 12.
Los analisis del contenido de Gla de las fracciones individuales (E5 a E1) se realizaron utilizando un sistema HPLC Agilent como se describe en el Ejemplo 2.
Una comparacion de la distribucion de las especies Gla FIX separadas utilizando cromatograffa de intercambio anionico como se describe arriba se muestra en la tabla siguiente.
Especie Gla (%)
Antes de la separacion (Aplicacion) Fracciones Benefix®
D5
D4 D3 D2 D1 E1
Gla#8
1,1 - - - - - - -
Gla#9
2,7 16,5 3,1 - - - - 3
Gla#10
12,5 49,8 27,8 6,0 5,1 4,4 5,0 10
Gla#11
26,1 12,2 42,4 26,8 18,5 19,1 18,7 27
Gla#12
57,5 21,5 26,8 67,2 76,4 76,5 76,4 60
La purificacion utilizando cromatograffa de intercambio anionico como se muestra arriba condujo a cierta separacion de las especies Gla FIX. Asf pues, puede prepararse una composicion de especies Gla FIX de una manera preferida por el investigador.
EJEMPLO 7: Purificacion y analisis de diferentes especies de FX gamma-carboxiladas
5 Se utilizo cromatograffa de intercambio anionico para la separacion de diferentes formas gamma-carboxiladas de un constructo de FX humano recombinante en el cual el peptido de activacion de FX ha sido cambiado por un peptido de activacion del fibrinopeptido A (DFLAEGGVR) y se ha anadido una etiqueta HPC4 al termino C (DQVDPRLIDGK). El metodo utilizaba una columna SOURCE 15Q (GE Healthcare) con un volumen de lecho de 1,7 ml, un caudal de 0,75 ml/min y una temperatura de 4°C.
10 La muestra cargada a la columna ("muestra de carga") era de dicho constructo FX. Se cargo un total de aproximadamente 2,5 mg. La muestra de carga se ajusto a pH 8,0 utilizando NaOH 0,1 M.
Los tampones utilizados fueron los siguientes:
Tampon de equilibracion: Tris 20 mM, pH 8,0
Tampon de elucion: Tris/HCl 20 mM, acetato de amonio 1,5 M, pH 8,0 15 CIP: NaOH 1 M.
El procedimiento de cromatograffa de intercambio anionico fue como sigue:
Paso
Tampon CV %-tampon de elucion
Equilibracion
Tampon de equilibracion 5 0%
Aplicacion
Lavado
Tampon de equilibracion 5 0%
Elucion
Tampon de elucion 100 0-100% (gradiente)
Elucion
Tampon de elucion 5 100% (isocratica)
CIP1
NaOH 5 0%
CIP2
Tampon de elucion 10 100% (isocratica)
Reequilibracion
Tampon de equilibracion 10 0%
El resultado de esta cromatograffa de intercambio anionico se muestra en la Figura 13.
Se realizaron analisis del contenido de Gla de fracciones individuales utilizando un sistema HPLC Agilent como se describe en el ejemplo 2.
Basandose en el analisis de las fracciones, se muestra en la tabla siguiente una comparacion de la distribucion de las especies Gla FX separadas antes y despues de la utilizacion de la cromatograffa de intercambio anionico como se ha descrito arriba.
Especie Gla (%)
Antes de la separacion (muestra de carga) Despues de la separacion pdFX
Gla#8 y menores
3 - -
Gla#9
30 - -
Gla#10
42 59 40
Gla#11
25 41 43
De este modo, se preparo una composicion del constructo FX con una cantidad incrementada de Gla #10 y Gla #11.
5

Claims (5)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para purificacion de un polipeptido que tiene un contenido deseado de acido gamma- carboxiglutamico a partir de una muestra que comprende una mixtura de especies de dicho polipeptido que tienen contenidos diferentes de acido gamma-carboxiglutamico, comprendiendo dicho metodo los pasos de:
    a) cargar dicha muestra sobre un material de cromatograffa de intercambio anionico;
    (b) eluir dicho polipeptido utilizando una solucion con un pH comprendido entre 5,0 y 8,5 que comprende al menos una sal seleccionada del grupo constituido por acetato de amonio, cloruro de amonio y acetato de sodio; y
    (c) seleccionar una fraccion obtenida por dicha elucion, que tiene un aumento en la proporcion de formas #1-10-Gla y/o #1-11 -Gla de Factor VII o Factor Vila comparada con la proporcion de formas #1-10-Gla y/o #1-11 -Gla de Factor VII o Factor Vila en la muestra que se purifica.
  2. 2. Un metodo para purificacion de un polipeptido que tiene un contenido deseado de acido gamma- carboxiglutamico a partir de una muestra que comprende una mixtura de especies de dicho polipeptido que tienen contenidos diferentes de acido gamma-carboxiglutamico, comprendiendo dicho metodo los pasos de:
    a) cargar dicha muestra sobre un material de cromatograffa de intercambio anionico;
    (b) eluir dicho polipeptido utilizando una solucion con un pH comprendido entre 5,0 y 8,5 que comprende al menos una sal seleccionada del grupo constituido por acetato de amonio, cloruro de amonio y acetato de sodio; y
    (c) seleccionar una fraccion obtenida por dicha elucion, que tiene un aumento en la proporcion de formas #1-11 -Gla y/o #1-12-Gla de Factor IX comparada con la proporcion de formas #1-11 -Gla y/o #1-12-Gla de Factor IX en la muestra que se purifica.
  3. 3. Un metodo conforme a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual esta presente acetato de amonio, cloruro de amonio o acetato de sodio en el tampon de elucion en una concentracion comprendida entre 0,1 M y 2,0 M.
  4. 4. Un metodo conforme a la reivindicacion 3, en el cual esta presente acetato de amonio, cloruro de amonio o acetato de sodio en el tampon de elucion en una concentracion aproximada 0,6 M.
  5. 5. Un metodo conforme a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual dicha cromatograffa de intercambio anionico utiliza un tampon de equilibracion a un pH comprendido entre 5,0 y 8,5.
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