KR20110099251A - 폴리펩티드 정제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이온교환 크로마토그래피를 이용하는 다른 감마 카르복실화된 형태의 폴리펩티드의 정제에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 다른 감마-카르복시글루탐산 함량들을 갖는 폴리펩티드의 종들의 혼합물을 포함하는 샘플로부터 원하는 함량의 감마-카르복시글루탐산을 갖는 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 상기 샘플을 음이온교환 크로마토그래피 재료 상에 로딩하는 단계; (b) 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 및 아세트산 나트륨으로부터 선택된 적어도 하나의 염을 포함하는, pH 9.0 미만의 pH에서의 용액을 사용하여 상기 폴리펩티드를 용리하는 단계; 그리고 (c) 상기 용리로부터 얻어진 분획을, 분획에서의 폴리펩티드가 감마-카르복시글루탐산의 원하는 함량을 갖는 것을 선별하는 단계를 포함한다.

Description

폴리펩티드 정제{POLYPEPTIDE PURIFICATION}

본 발명은 폴리펩티드의 정제에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 이온교환 크로마토그래피를 이용하는 방법에 관련되는데, 이 방법에 의해 다른 감마 카르복실화된 형태의 폴리펩티드들이 정제될 수 있다.

γ-카르복시글루탐산(Gla)은 칼슘에 결합하는 독특한 아미노산이다. 그것은 글루탐산(Glu)의 변형된 형태이고 글루타메이트 잔기의 번역후 변형에 의해 생체내에서 생산될 수 있다. 이런 식으로 글루탐산의 카르복실화는 칼슘 결합을 가능하게 하고 응혈원(procoagulants) 및 항응혈제(anticoagulants)와 같은 단백질이 인지질에 부착하는 것을 허용한다. γ-카르복실화(감마 카르복실화)로도 알려진 이 효소 매개 반응은 보조인자로서 비타민 K를 요한다.

일부 성숙한 단백질은 이런 식으로 γ-카르복시글루탐산으로 변환된 아미노산이 풍부한 도메인을 함유한다. 이것은 GLA 도메인으로서 알려져 있다. 이 GLA 도메인은 종종 단백질에 의한 칼슘이온의 높은 친화도 결합의 원인이 된다. 이러한 GLA 도메인은 여러가지 다른 단백질에서 발견될 수 있다. 예를 들면, 응혈 인자 VII, IX 및 X 및 프로트롬빈은 모두 많은 Gla 아미노산 잔기를 포함하는 GLA 도메인을 포함한다.

본 발명자들은 다른 종들이 감마 카르복실화의 양에 있어서 다양하거나, 또는 그것들이 함유하는 감마 카르복시글루탐산 잔기의 수에 있어서 다양한 폴리펩티드의 다른 종들을 분리하거나 정제하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 본 발명은 특히 다른 감마-카르복시글루탐산 함량들을 갖는 폴리펩티드 종의 크로마토그래피 분리를 언급한다.

따라서, 본 발명은 다른 감마-카르복시글루탐산 함량들을 갖는 폴리펩티드의 종들의 혼합물을 포함하는 샘플로부터 원하는 함량의 감마-카르복시글루탐산을 갖는 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은

(a) 상기 샘플을 음이온교환 크로마토그래피 재료 상에 로딩하는 단계;

(b) 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 및 아세트산 나트륨으로부터 선택된 적어도 하나의 염을 포함하는, pH 9.0 미만의 pH에서의 용액을 사용하여 상기 폴리펩티드를 용리하는 단계;

(c) 상기 용리로부터 얻어진 분획을, 분획에서의 폴리펩티드가 감마-카르복시글루탐산의 원하는 함량을 갖는 것을 선별하는 단계를 포함한다.

바람직한 이러한 방법은 다음 단계들을 포함한다.

(a) 음이온교환 재료를 9.0 미만의 pH에서의 완충액으로 평형화시키는 단계;

(b) 상기 샘플을 음이온교환 재료 상에 로딩하는 단계;

(c) 선택적으로 음이온교환 재료를 9.0 미만의 pH에서의 완충액으로 세척하는 단계;

(d) 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 및 아세트산 나트륨으로부터 선택된 적어도 하나의 염을 포함하는, 9.0 미만의 pH에서의 용액을 사용하여 음이온교환 재료로부터 상기 폴리펩티드를 용리하는 단계; 및

(e) 상기 용리로부터 얻어진 분획을, 분획에서의 폴리펩티드가 감마-카르복시글루탐산의 원하는 함량을 갖는 것을 선별하는 단계를 포함한다.

이런 식으로 정제를 위한 적합한 폴리펩티드는 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 X, 프로트롬빈, 단백질-S, 단백질-C, 단백질 Z, 오스테오칼신, 매트릭스-gla-단백질, 성장 정지 특이적-6(Growth arrest-specific-6), 프롤린-풍부-Gla-1, 프롤린-풍부-Gla-2, 프롤린-풍부-Gla-3 및 프롤린-풍부-Gla-4를 포함한다. 바람직한 방법에서, 폴리펩티드는 인자 IX, 인자 X, 인자 VII 또는 인자 VIIa이다.

폴리펩티드가 인자 IX인 경우에, 방법은 정제되는 샘플에서 인자 IX의 #1-11-Gla 및/또는 #1-12-Gla 형태들의 비율과 비교하여 인자 IX의 #1-11-Gla 및/또는 #1-12-Gla 형태들의 비율에서의 증가를 갖는 상기 용리로부터 얻어진 분획을 선별하는 것을 포함할 수 있다.

폴리펩티드가 인자 X 또는 인자 VII인 경우에, 방법은 정제되는 샘플에서 인자 X 또는 VII의 #1-10-Gla 및/또는 #1-11-Gla 형태들의 비율과 비교하여 인자 X 또는 인자 VII의 #1-10-Gla 및/또는 #1-11-Gla 형태들의 비율에서의 증가를 갖는 상기 용리로부터 함유된 분획을 선별하는 것을 포함할 수 있다.

폴리펩티드가 인자 IX인 경우에, 방법은 정제되는 샘플에서 인자 IX의 #1-10-Gla 형태의 비율과 비교하여 인자 IX의 #1-10-Gla 형태의 비율에서의 감소를 갖는 상기 용리로부터 얻어진 분획을 선별하는 것을 포함할 수 있다.

폴리펩티드가 인자 X 또는 인자 VII인 경우에, 방법은 정제되는 샘플에서 인자 X 또는 인자 VII의 #1-9-Gla 형태의 비율과 비교하여 인자 X 또는 인자 VII의 #1-9-Gla 형태의 비율에서의 감소를 갖는 상기 용리로부터 얻어진 분획을 선별하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명 방법에서, 다음 중 어느 한가지 이상이 적용된다:

- 용리 완충액은 5.0 내지 8.5의 pH를 가질 수 있다;

- 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 또는 아세트산 나트륨은 0.1M 내지 2.0M, 바람직하게는 약 0.6 M로 용리 완충액에 존재할 수 있다.

- 이온교환 크로마토그래피는 5.0 내지 8.5의 pH에서의 평형 완충액을 이용할 수 있다.

본 발명은 또한 여기 기술된 것과 같은 방법에 의해 얻어진 폴리펩티드 조제물, 즉 폴리펩티드의 하나 이상의 종의 양이 변경된 조제물로 확장되는데, 여기서 종들은 감마 카르복실화의 정도, 또는 그것들이 함유하는 감마 카르복시글루탐산 잔기의 수에 있어서 다르다.

도 1A는 확인된 서브도메인을 갖는 사람 인자 IX의 1차 구조를 나타낸다. GLA 도메인은 아미노산 1-46에서 발견되고, EGF1 도메인은 아미노산 47-83에서 발견되고, EGF2 도메인은 아미노산 84-124에서 발견되고, 활성화 펩티드는 아미노산 146 내지 180에서 발견되고 프로테아제 도메인은 아미노산 181 내지 415에서 발견된다. 잠재적으로 감마-카르복실화에 종속되는 Gla 도메인에서의 12개의 아미노산은 "γ"로서 표지되고 아미노산 7, 8, 15, 17, 20, 21, 26, 27, 30, 33, 36 및 40에서 위치된다.
도 1B는 사람 인자 VII, 인자 IX 및 인자 X 폴리펩티드의 아미노산 서열의 부분의 정렬을 나타낸다. 이들 정렬은 이들 폴리펩티드의 각각의 GLA 도메인으로부터 유도되고 *로서 Gla 잔기의 위치를 나타낸다.
도 2는 실시예 2에서 기술된 바와 같은 rhFIX의 샘플의 음이온교환 크로마토그래피로부터 얻어진 크로마토그램을 나타낸다. 도 3은 도 2의 확대된 세부 부분을 나타낸다.
도 4는 실시예 2의 음이온교환 크로마토그래피 분리 전과 후의 Gla 종의 분포의 분석을 나타낸다. 전 = 실시예 2에서 "적용"으로서 사용된 rhFIX의 샘플에서 Gla 종의 분포. 이 샘플은 rhFIX의 95% 이상 순수한 샘플을 수득하기 위해 이뮤노어피니티 캡쳐에 의해 정제되었다. 후 = 실시예 2에서 얻어진 분획 C12-D3의 푸울에서 Gla 종의 분포.
도 5는 실시예 3에서 기술된 바와 같은 rhFIX의 샘플의 음이온교환 크로마토그래피로부터 얻어진 크로마토그램을 나타낸다. 도 6은 도 5의 확대된 세부 부분을 나타낸다.
도 7은 실시예 4에서 기술된 바와 같은 FVII의 샘플의 음이온교환 크로마토그래피로부터 얻어진 크로마토그램을 나타낸다. 도 8은 도 7의 확대된 세부 부분을 나타낸다.
도 9는 실시예 5에서 기술된 바와 같은 rhFIX의 샘플의 음이온교환 크로마토그래피로부터 얻어진 크로마토그램을 나타낸다. 도 10은 도 9의 확대된 세부 부분을 나타낸다.
도 11은 실시예 6에서 기술된 바와 같은 rhFIX의 샘플의 음이온교환 크로마토그래피로부터 얻어진 크로마토그램을 나타낸다. 도 12는 도 11의 확대된 세부 부분을 나타낸다.
도 13은 실시예 7에서 기술된 바와 같은 FX의 샘플의 음이온교환 크로마토그래피로부터 얻어진 크로마토그램을 나타낸다

본 발명은 다른 감마 카르복실화의 수준들을 갖는 폴리펩티드 종들이 다른 활성 수준들을 갖는다는 것과 이러한 다른 종들은 이온교환 크로마토그래피를 사용하여 정제 또는 분리될 수 있다는 발견으로부터 유도된다. 더 활성인 폴리펩티드 종의 비율을 증가시킴으로써, 및/또는 샘플에서 덜 활성이거나 불활성인 폴리펩티드 종의 비율을 감소시킴으로써, 이것은 증가된 특이적 활성을 갖는 정제된 조제물의 생산을 가져올 수 있다.

"폴리펩티드"는 가장 광범위한 의미로 두개 이상의 서브유닛 아미노산의 화합물, 아미노산 유사체, 또는 다른 펩티도미메틱(peptidomimetics)을 언급하는 것으로 여기서 사용된다. 용어 "폴리펩티드"는 따라서 짧은 펩티드 서열 및 또한 더 긴 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 여기서 사용된 바, 용어 "아미노산"은 천연 및/또는 비천연 아미노산, 아니면 글리신을 포함하는 합성 아미노산, 및 둘다, D 또는 L 광학 이성질체, 및 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱을 말한다. "성숙한" 단백질은 카르복실화, 글리코실화 또는 표적화 서열과 같은 폴리펩티드 영역의 절단과 같은 번역후 프로세싱(post-translational processing)을 시킨 폴리펩티드이다. 성숙한 단백질의 형태인 본 발명의 폴리펩티드는 따라서 감마 카르복실화되었을 수도 있고 Gla로 변환된 번역된 서열로 하나 이상의 Glu를 가졌을 수도 있다.

여기에 기술된 방법은 감마 카르복실화되거나 될 수 있는 어떤 폴리펩티드의 정제를 위해서도 사용될 수 있다.

본 발명 방법에서 사용을 위한 폴리펩티드는 하나 이상의 감마 카르복시글루탐산 잔기를 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 조사하고 Gla가 존재하는지를 결정함으로써 확인될 수 있다.

감마-카르복시글루탐산을 포함하는 수많은 폴리펩티드가 공지되어 있다. 프로트롬빈, 인자 VII (인자 VIIa를 포함함), 인자 IX, 인자 X, 단백질 C 및 단백질 S를 포함하는 수많은 혈액 응고 및 조절 단백질은 Gla 잔기를 포함한다. 이들 단백질은 성숙한 단백질의 N-말단의 처음 40개 잔기 내에 위치된 GLA 도메인에서 10 내지 12개의 감마 카르복시글루탐산 잔기를 함유할 수 있다. 오스테오칼신 및 매트릭스 Gla 단백질 및 다른 포유동물 비타민 K 의존 단백질, 예를 들면 성장 정지-특이적-6 (Gas6), 단백질 Z, 프롤린-풍부-Gla-1 (PRGP1), 프롤린-풍부-Gla-2 (PRGP2), 프롤린-풍부-Gla-3 (PRGP3) 및 프롤린-풍부-Gla-4 (PRGP4)는 또한 다수의 Gla 잔기를 포함한다. 감마 카르복시글루탐산 잔기는 또한 코노펩티드(conopeptides) Conantokin G 및 Conantokin T와 같은 비포유동물 단백질에서 발견되었다. 이들 단백질의 어떤 것도 본 발명에 따라 정제될 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용을 위한 폴리펩티드는 하나 이상의 감마 카르복시글루탐산 잔기를 포함하도록 번역후 변형될 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들면, 이러한 잔기는 폴리펩티드에서 글루탐산 잔기의 감마 카르복실화에 의해 생산될 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열은 따라서 하나 이상의 글루탐산(Glu) 잔기를 포함한다. 이런 식으로 번역후 변형될 수 있는 폴리펩티드는 자연 발생 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 어떤 적합한 유기체로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드는 설치류, 영장류, 고양이, 개, 양, 소, 돼지 또는 기타 포유동물 폴리펩티드와 같은 자연 발생 포유동물 폴리펩티드일 수 있다. 바람직하게는 폴리펩티드는 마우스, 래트 또는 사람 폴리펩티드이다. 가장 바람직하게는 폴리펩티드는 사람 폴리펩티드이다. 폴리펩티드는 비포유동물 종으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들면, 일부 코노톡신(conotoxins)은 감마 카르복시글루타메이트를 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 복족류와 같은 연체동물로부터의 자연 발생 폴리펩티드일 수 있다. 복족류는 나사조개(cone snail)와 같은 달팽이일 수 있다. 이런 식으로 번역후 변형될 수 있는 폴리펩티드는 상기 논의된 공지의 감마 카르복실화된 단백질 중 하나의 변이체와 같은 자연 발생 폴리펩티드의 변이체, 합성 폴리펩티드와 같은 인공적으로 발생된 폴리펩티드 또는 재조합 생산된 돌연변이 또는 변이체 단백질일 수 있다.

폴리펩티드는 GLA 도메인을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. GLA 도메인은 감마 카르복시글루타메이트(Gla)를 형성하기 위해 다수의 글루타메이트(Glu) 잔기의 번역후 변형물을 함유하는 단백질 도메인이다. 이들 Gla 잔기는 일반적으로 폴리펩티드의 단일 영역 또는 도메인에 위치된다. 이것은 종종 폴리펩티드의 N-말단 또는 성숙한 단백질의 N-말단에 위치된다.

예를 들면, 도 1A는 사람 인자 IX 단백질의 1차 구조를 나타낸다. 이 단백질은 아미노산 1 내지 46에서 GLA 도메인을 포함한다. 이 도메인은 글루타메이트로부터 Gla로 변형될 수 있는 12개의 아미노산 잔기를 포함한다. 이것들은 위치 7, 8, 15, 17, 20, 21, 26, 27, 30, 33, 36 및 40에서 위치된다. 그러므로 그것은 12개 까지의 Gla 잔기를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 정제되는 폴리펩티드는 따라서 인자 IX일 수 있다. 도 1B는 사람 인자 VII, IX 및 X 단백질의 Gla 도메인에 기초한 정렬을 나타낸다. 각 서열에서 글루타메이트로부터 Gla로 변형될 수 있는 아미노산 잔기의 위치는 *로서 확인된다. 본 발명에 따라 정제되는 폴리펩티드는 그러므로 인자 VII 또는 인자 X일 수 있다.

본 발명에서 사용을 위한 폴리펩티드는 인자 IX, 인자 VI 또는 인자 X로부터, 또는 또 다른 혈액 응고 인자로부터와 같은 상기 논의된 다른 공지의 감마 카르복실화 단백질의 어떤 것으로부터의 GLA 도메인과 같은, 공지의 감마 카르복실화 단백질로부터의 GLA 도메인을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용을 위한 폴리펩티드는 하나 이상의 감마 카르복시글루탐산 잔기를 포함하거나 포함할 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 그 이상의 Gla 잔기를 포함하거나 포함할 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 1보다 많은, 2보다 많은, 5보다 많은 또는 9보다 많은 Gla 잔기와 같은 1보다 많은 Gla 잔기를 포함하거나 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 10개 까지, 12개 까지, 15개 까지 또는 20개 까지의 Gla 잔기를 포함하거나 포함할 수 있다. 이하에서 더 논의되는 바와 같이, 본 발명의 방법은 다른 수준들의 감마 카르복실화가 일어난 다른 분자 종들의 폴리펩티드의 정제를 허용한다. 여기서 언급된 수들은 그 폴리펩티드에 존재할 수 있는 Gla 잔기의 총수이다. 즉, 폴리펩티드가 충분히 감마 카르복실화된다면, 이들 수는 존재하는 Gla 잔기의 수를 가리킨다. 예를 들면, 감마 카르복실화가 GLA 도메인에서 일어나는 경우에, 이들 수는 번역된 폴리펩티드에서 Glu 잔기의 총수와 같은 그 GLA 도메인에서 감마 카르복실화를 위한 가능한 부위의 총수 또는 γ-글루타밀 카르복실라제와 같은 효소의 작용에 의해 생산될 수 있는 Gla 잔기의 최대수를 말한다. 이 최대수보다 더 적은 감마 카르복시글루탐산 잔기가 존재하는 같은 폴리펩티드의 추가의 종들이 또한 존재할 수 있다.

폴리펩티드는 그러므로 그것의 번역된 아미노산 서열의 N-말단 40개 잔기에서 다수의 Glu 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들면, 발현된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 폴리펩티드의 N 말단에 가장 가까운 40개의 아미노산에서, 또는 성숙한 단백질의 N 말단에 가장 가까운 40개 아미노산에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 그 이상의 Glu 잔기를 포함할 수 있다.

감마 카르복실화는 효소를 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 γ-글루타밀 카르복실라제 효소는 생체내에서 많은 폴리펩티드의 감마 카르복실화에 수반되는 것으로 알려져 있다. γ-글루타밀 카르복실라제는 수많은 비타민 K 의존 응고 인자의 GLA 도메인에서 Glu의 Gla로의 번역후 변형을 촉매작용하는 내부원형질의 효소이다. 본 발명에서 사용을 위한 폴리펩티드는 따라서 그것들이 γ-글루타밀 카르복실라제에 의해 감마 카르복실화되는지를 결정함으로써 확인될 수 있다.

γ-글루타밀 카르복실라제 효소는 카르복실화되는 글루타메이트 잔기의 아미노 말단 측에서 서열 모티프를 통해 그것의 기질 단백질에 결합하는 것으로 생각된다. 효소는 다음에 그 영역에서 다수의 글루타메이트 잔기, 예를 들면, 기질을 방출하기 전에 GLA 도메인에서 모든 글루타메이트 잔기를 카르복실화할 수 있다. 본 발명에서 사용을 위한 폴리펩티드는 그러므로 γ-글루타밀 카르복실라제에 의해서 또는 감마 카르복실화를 할 수 있는 또 다른 효소에 의해서 인식되는 모티프 또는 부위를 포함한다. 이 인식 부위는 폴리펩티드의 N-말단 영역에서, 예를 들면, 번역되는 바와 같은 폴리펩티드의 N 말단 영역에 가장 가까운 또는 성숙한 단백질의 N 말단 영역이 될 것에 가장 가까운 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35 또는 40개 아미노산 내에서 위치될 수 있다. 인식 부위는 카르복실화될 글루타메이트 잔기의 아미노 말단 측에 위치될 수 있다. 예를 들면, 많은 자연 발생 감마 카르복실화된 단백질에서, γ-글루타밀 카르복실라제 효소는 폴리펩티드 영역에서의 부위를 인식하고 거기에 결합한다. 그 영역은 이어서 번역후 프로세싱의 동안에 폴리펩티드의 나머지로부터 절단된다. 감마 카르복실라제 인식 부위는 그러므로 성숙한 단백질에서 없을 수 있다.

프로트롬빈 및 인자 IX에서, γ-글루타밀 카르복실라제 효소의 인식에 수반된 부위는 잔기 -18, -17, -15, -15 및 -10에 의해 규정된다. 유사한 인식 부위가 다른 감마 카르복실화된 단백질에서 발견된다. 위치 -16에서 페닐알라닌과 위치 -10에서 알라닌은 위치 -17 및 -15에서 이소류신, 류신 및 발린과 같은 지방족 잔기가 그러한 것과 같이 카르복실라제 기질의 프로펩티드 내에서 잘 보존된다. 위치 -16에서 류신, 발린 또는 리신은 또한 카르복실화를 지지한다. 본 발명에서 사용을 위한 폴리펩티드는 인자 IX, 인자 X, 인자 VII, 또는 상기 논의된 다른 공지의 감마 카르복실화된 단백질의 어떤 것으로부터의 감마 카르복실화 인식 부위와 같은, 공지의 감마 카르복실화된 단백질로부터의 감마 카르복실화 인식 부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, 감마 카르복실화 인식 부위를 포함하는 어떤 이러한 단백질로부터의 프로펩티드 영역은 γ-글루타밀 카르복실라제에 의한 폴리펩티드의 적합한 번역후 프로세싱을 허용하는 번역된 폴리펩티드의 N 말단에서 존재할 수 있다.

감마 카르복실화될 수 있는 폴리펩티드는 바람직하게는 다음 평가기준의 한가지 또는 둘다를 충족한다:

(1) 폴리펩티드는 감마 카르복실화 인식 부위를 포함하고, 그리고

(2) 감마 카르복실화 인식 부위의 40개 잔기 내에 글루탐산 잔기가 있다.

γ-글루타밀 카르복실라제 효소는 조면 소포체(rough endoplasmic reticulum)에서 활성인 것으로 생각된다. 이 효소에 의해 감마 카르복실화되는 폴리펩티드에 대해, 폴리펩티드는 바람직하게는 γ-글루타밀 카르복실라제 효소를 발현하는 세포의 조면 소포체를 통과한다. 폴리펩티드는 따라서 조면 소포체를 통해 새롭게 합성된 폴리펩티드의 트래피킹을 허용하는 서열을 포함할 수 있다. 소포체에 폴리펩티드를 표적화할 수 있는 신호 서열은 잘 공지되어 있다. 이러한 신호 서열은 폴리펩티드의 아미노 말단에서 종종 발견되고, 종종 길이가 16 내지 30개 아미노산이며 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 신호 펩티드는 일반적으로 신호 펩티다제에 의해 폴리펩티드 분자로부터 절단되고 따라서 성숙한 단백질에서 존재하지 않는다.

폴리펩티드의 감마 카르복실화가 일어나기 위해, 폴리펩티드는 바람직하게는 세포에서 발현된다. 본 발명에서 사용을 위한 폴리펩티드는 이러한 세포에서 발현에 의해 합성될 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드가 발현되는 세포는 폴리펩티드의 감마 카르복실화를 허용하기 위해 필요한 세포 기계를 포함한다. 예를 들면, 세포는 γ-글루타밀 카르복실라제를 발현할 수 있다. 바람직하게는 단백질이 합성되는 세포는 조면 소포체와 연관된 감마 카르복실라제 효소를 갖는다. 세포는 비타민 K와 같은 효소 보조인자의 존재하에 배양될 수 있다. 바람직하게는 단백질이 합성되는 세포는 세포내 비타민 K를 포함한다.

감마 카르복실화될 수 있는 폴리펩티드는 이러한 세포에서 그것들을 발현하고 감마 카르복실화가 일어나는지를 결정함으로써 확인될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드는 여기서 기술된 바와 같은 세포에서 발현될 수 있고 예를 들면 상기한 바와 같은 신호 펩티드를 사용함으로써 이러한 세포의 조면 소포체에 표적화될 수 있다. 이러한 세포에서 폴리펩티드를 발현하고 발현된 번역후 프로세싱된 폴리펩티드가 Gla 잔기를 포함하는지를 결정함으로써, 감마 카르복실화될 수 있는 폴리펩티드가 확인될 수 있다.

본 발명의 방법은 폴리펩티드의 하나 이상의 종들을 다른 정도의 감마 카르복실화를 갖는 그 폴리펩티드의 다른 종들로부터 정제하는 것을 수반한다. 이때 폴리펩티드가 하나 이상의 부위에서 감마 카르복실화될 수 있는 경우에, 다른 수의 감마 카르복시글루타메이트 아미노산 잔기들이 존재하거나, 또는 감마 카르복시글루타메이트 잔기가 폴리펩티드 분자 내의 다른 가능한 위치들에서 존재하는 그 폴리펩티드의 다른 종들이 존재할 수 있다.

예를 들면, 폴리펩티드의 어떤 종들은 충분히 감마 카르복실화될 수 있다. 즉, 감마 카르복실화는 가능한 폴리펩티드에서 모든 잔기에서, 예를 들면 GLA 도메인의 모든 Glu 잔기에서 글루타메이트를 감마 카르복시글루타메이트로 변환시킬 수 있었다. 폴리펩티드의 다른 종들은 부분적으로 감마 카르복실화될 수 있다. 즉, 감마 카르복실화는 가능한 폴리펩티드에서 모두는 아닌 일부 잔기에서, 예를 들면 GLA 도메인의 Glu 잔기의 모두는 아닌 일부에서 글루타메이트를 감마 카르복시글루타메이트로 변환시킬 수 있었다.

다양한 다른 부분적으로 감마 탈카르복실화된 종들이 확인될 수 있다. 이것들은 여러가지 방식으로 분류될 수 있다. 예를 들면, 감마 탈카르복실화의 수준은 감마 탈카르복실화되는 폴리펩티드에서의 잔기들에 의해 정의되거나, 또는 폴리펩티드에 존재하는 감마 카르복시글루타메이트 아미노산의 총수에 의해 정의될 수 있다. 후자의 분류는 수많은 구조적으로 다른 폴리펩티드 분자종들이 그것들이 함유하는 감마 카르복시글루탐산 잔기의 총수에 기초하여 함께 고려된다. 예를 들면, 가능한 감마 카르복시글루타메이트 잔기의 하나를 제외한 모두가 존재하는 폴리펩티드의 종은 글루타메이트가 감마 카르복실화되었을 수 있는 다른 위치들에서 보유되는 폴리펩티드의 다수의 다른 아종들을 함유할 수도 있다.

γ-글루타밀 카르복실라제의 작용 메카니즘 때문에, 감마 카르복실화는 일반적으로 감마 카르복실화 인식 부위에 가장 가까운 Glu 잔기에서 시작하고 폴리펩티드의 N 말단으로부터 멀리 진행한다. 폴리펩티드가 충분히 감마 카르복실화되어 있지 않은 경우에, 이것은 일반적으로 멀리 있는 Glu 잔기가 변환되기 전에 감마 카르복실화가 중지되거나, 또는 효소가 폴리펩티드로부터 방출되기 때문이다. 그것은 일반적으로, 부분적으로 감마 카르복실화된 폴리펩티드에서 감마 카르복실화되어 있지 않은, 감마 카르복실화 결합 부위로부터 멀리 있거나 또는 단백질의 N 말단으로부터 멀리 있는 Glu 잔기이다.

예를 들면, 도 1에서 나타낸 바와 같이, 사람 인자 IX는 12개까지의 감마 카르복시글루타메이트 잔기를 포함한다. 존재하는 Gla 잔기의 실제 수는 분자가 당한 감마 카르복실화에 의한 번역후 변형의 정도에 따라 다른 폴리펩티드 분자들에서 다양할 것이다. 이것은 사람 인자 IX의 샘플이 충분히 감마 탈카르복실화되어 있는, 즉 모두 12개의 가능한 감마 카르복시글루타메이트 잔기(#1-12Gla)를 갖는 인자 IX의 종들을 포함할 수 있다는 것을 의미한다.

그것은 또한 가능한 12개의 감마 카르복시글루타메이트 잔기 중 11개를 갖는 인자 IX의 하나 이상의 종들을 포함할 수 있다. 이것들 중, 가장 있음직한 것은 폴리펩티드의 N 말단에 가장 가까운 11개의 Glu 잔기가 Gla로 변환되어 있으나, 도 1에 나타낸 바와 같이 위치 40에서 12번째 Glu 잔기는 Glu로서 남아있는 상황이다. 따라서, 이 상황에서, 단지 Glu 잔기 1 내지 11이 Gla (#1-11Gla)로 변환되었다.

그것은 또한 가능한 12개의 감마 카르복시글루타메이트 잔기 중 10개를 갖는 인자 IX의 하나 이상의 종들을 포함할 수 있다. 이것들 중, 가장 있음직한 것은 폴리펩티드의 N 말단에 가장 가까운 10개의 Glu 잔기가 Gla로 변환되어 있으나, 도 1에 나타낸 것과 같이 위치 36 및 40에서 11번째 및 12번째 Glu 잔기는 Glu로서 남아있는 상황이다. 따라서, 이 상황에서, 단지 Glu 잔기 1 내지 10이 Gla (#1-10Gla)로 변환되었다.

그것은 또한 #1-9Gla와 같은 가능한 12개의 감마 카르복시글루타메이트 잔기 중 9개를 갖는 인자 IX의 하나 이상의 종들을 포함할 수 있다. 그것은 또한 가능한 12개의 감마 카르복시글루타메이트 잔기 중 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개와 같은 9개 미만을 갖는 인자 IX의 하나 이상의 종들을 포함할 수 있다.

본 발명은 이러한 폴리펩티드 종의 정제 방법을 제공한다. 특히, 폴리펩티드의 종은 샘플에서 그 폴리펩티드의 다른 종들에 관하여 정제될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 폴리펩티드의 샘플에서 관심있는 종의 상대적인 비율에 있어서 증가를 이끌 수도 있다. 이것은 샘플로부터 폴리펩티드의 하나 이상의 다른 종들을 제거하고, 따라서 관심있는 종으로부터 형성되는 폴리펩티드 비율을 전체적으로 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 이것은 샘플로부터 관심있는 종이 아닌 하나 이상의 종들의 제거에 의해서, 또는 관심있는 종의 비율이 원래의 샘플에서 보다 낮은 샘플의 분획을 제거함으로써, 샘플로부터 하나 이상의 특정한 종의 특이적 제거를 통해서 달성될 수 있다. 이들 접근방법 중 어떤 것은 관심있는 종의 비율의 전체적인 증가를 가져올 수 있다. 본 발명의 방법은 따라서 그 폴리펩티드의 다른 종들의 혼합물을 포함하는 샘플에서 폴리펩티드의 특정 종들의 비율에 있어서 증가 또는 감소를 가져올 수 있다.

폴리펩티드 종의 비율의 증가는 폴리펩티드의 샘플에서 그 종의 비율에 있어서 전체적으로 5%까지, 10%까지, 20%까지, 30%까지 또는 그 이상의 증가일 수 있다. 폴리펩티드 종의 비율의 감소는 폴리펩티드의 샘플에서 그 종의 비율에 있어서 전체적으로 5%까지, 10%까지, 20%까지, 30%까지, 50%까지, 70%까지, 90%까지 또는 그 이상의 감소일 수 있다. 폴리펩티드 종의 비율의 감소는 원래의 샘플에서 존재하는 양과 비교하여 존재하는 종의 양에 있어서 5%까지, 10%까지, 20%까지, 30%까지, 50%까지, 70%까지, 90%까지 또는 그 이상의 감소일 수 있다. 폴리펩티드 종의 비율의 감소는 샘플로부터 그 종의 완전한 또는 실질적인 제거일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 샘플로부터 특정 종의 모든, 또는 실질적으로 모든, 검출가능한 폴리펩티드를 제거함으로써 폴리펩티드의 샘플을 정제할 수 있다. 샘플에 남아있는 이러한 종의 양은 원래의 샘플에서 존재하는 양의 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만일 수 있다.

본 발명 방법의 목적은 따라서 폴리펩티드 샘플 중의 다른 종들의 상대적인 비율이 변경되는 것을 허용하는 것이다. 다른 종들은 다른 성질 또는 다른 활성을 가질 수 있다. 폴리펩티드 샘플 중의 이러한 종들의 양 또는 비율을 변화시킴으로써, 전체적으로 샘플의 성질 또는 활성이 변경될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 다른 종들이 다른 활성 수준들을 갖는 경우에, 높은 수준의 활성을 갖는 종의 비율을 증가시키기 위해 다른 종들의 비율을 변경시킴으로써 및/또는 낮은 활성을 갖거나 활성이 없는 종들의 비율을 감소시킴으로써, 샘플의 특이적 활성, 예를 들면 폴리펩티드 분자 당 평균 활성 또는 폴리펩티드의 그 양에 대한 최대 가능한 활성의 백분률이 증가될 수 있다.

예를 들면, 재조합에 의해 생산된 사람 인자 IX (rhFIX)는 대략 50%의 특이적 활성을 나타내는 것으로 발견되었다. 이러한 샘플의 분별은 그것이 개개의 rhFIX 종들을 함유하였고 #1-8-, #1-9-, #1-10- #1-11- 및 #1-12-Gla가 우세한 것으로 나타났다. #1-11- 및 #1-12-Gla는 혈전 분석(clot assay)에서 및 2-단계 활성 분석에서 충분히 활성인 것으로 발견되었다. #1-8-, #1-9- 및 #1-10-Gla 종은 사용된 분석법에 따라 대략 2-5%, 14-22% 및 27-36%로 감소된 활성을 나타내었다.

그러므로 감마 카르복실화도에서만 다양한 rhFIX의 다른 종들은 다른 활성 수준들을 나타낸다는 것을 알 수 있다. 높은 비율의 #1-11- 및/또는 #1-12-Gla를 갖는 샘플은 더 낮은 비율의 이들 종을 갖는 샘플보다 더 높은 특이적 활성을 나타내는 것으로 기대될 것이다. 더 높은 비율의 #1-8- 및/또는 #1-9- 및/또는 #1-10-Gla를 갖는 샘플은 더 낮은 비율의 이들 종을 갖는 샘플보다 더 낮은 특이적 활성을 나타내는 것으로 기대될 것이다.

따라서, 인자 IX의 샘플의 전체적인 특이적 활성은 샘플 내의 이러한 종의 비율을 변경시킴으로써 변경될 수 있다. 이 경우에, 인자 IX의 샘플의 전체적인 특이적 활성은 다음 중 어느 것이든 한가지 이상에 의해 증가시킬 수 있음을 예상할 수 있다.

- 샘플에서 #1-12-Gla의 비율을 증가시킨다;

- 샘플에서 #1-11-Gla의 비율을 증가시킨다;

- 샘플에서 #1-10-Gla의 비율을 감소시킨다;

- 샘플에서 #1-9-Gla의 비율을 감소시킨다;

- 샘플에서 #1-8-Gla의 비율을 감소시킨다;

- 샘플에서 #1-7-Gla의 비율을 감소시킨다;

- 샘플에서 #1-6-Gla의 비율을 감소시킨다;

- 샘플에서 #1-5-Gla의 비율을 감소시킨다;

- 샘플에서 #1-4-Gla의 비율을 감소시킨다;

- 샘플에서 #1-3-Gla의 비율을 감소시킨다;

- 샘플에서 #1-2-Gla의 비율을 감소시킨다; 그리고

- 샘플에서 #1-1-Gla의 비율을 감소시킨다.

본 발명에 따라 인자 IX의 샘플을 정제할 때 이들 변화 중 어느 것이든 한가지 이상을 선별할 수 있다.

인자 IX의 바람직한 샘플은 단지 #1-11-Gla 및 #1-12-Gla를 포함할 것이고, #1-10-, #1-9- 및 #1-8-Gla 종과 같은, 이보다 더 적은 감마 카르복실화도를 갖는 종을 결핍하거나 실질적으로 결핍할 것이다.

이 접근방법은 hFIX의 현존하는 조성물들에 적용될 수 있다. 예를 들면, 여기서 설명한 바와 같이, 실시예 2에서 사용된 hFIX는 45.6% #1-12-Gla, 36.0% #1-11-Gla, 13.6% #1-10-Gla, 3.3% #1-9-Gla 및 1.6% #1-8-Gla를 갖는 것으로 발견되었다. rhFIX는 상표 Benefix® 하에 Wyeth로부터 상업적으로 이용가능하다. Benefix®는 각각 대략 8-10%, 25-31% 및 60-67%의 #1-10-, #1-11- 및 #1-12-Gla 함량을 갖는다. 여기서 기술된 방법은 이러한 조성물에서 #1-11-Gla 및/또는 #1-12-Gla의 비율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 여기서 기술된 방법은 이러한 조제물에서 #1-10-Gla, #1-9-Gla 및 #1-8-Gla와 같은 덜 감마 카르복실화된 종의 비율을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 이것은 이러한 조제물에서 hFIX의 특이적 활성을 개선하는 것으로 기대될 것이다.

유사한 접근 방법이 다른 Gla-함유 폴리펩티드와 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 인자 VII 및 인자 X는 11개까지의 Gla 잔기를 포함할 수 있다. 실시예 4에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법은, 예를 들면, #1-9-, #1-10-, 또는 #1-11- 인자 VII의 비율을 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 여기에 기술된 것과 같은 방법은 따라서 인자 VII의 다른 종들의 비율을 그것들의 Gla 함량에 따라 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 여기 기술된 방법은 이러한 조성물에서 #1-10-Gla 및/또는 #1-11-Gla의 비율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 여기 기술된 방법은 이러한 조성물에서 덜 감마 카르복실화된 종, 예를 들면 #1-9-Gla 및 그 이하의 것의 비율을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

유사하게, 실시예 7은 인자 X의 다수의 종을 포함하는 조제물이, 인자 X의 다른 Gla-함유 종의 비율을 변경시키기 위해 본 발명의 방법에 따라 프로세싱될 수 있음을 나타낸다. 음이온 교환 크로마토그래피의 동안에 적합한 분획을 선별함으로써, 다른 비율의 다른 Gla 종들을 포함하는 샘플들이 선별될 수 있다. 예를 들면, 여기 기술된 방법은 이러한 조성물에서 #1-10-Gla 및/또는 #1-11-Gla의 비율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다는 것을 실시예 7로부터 알 수 있다. 여기 기술된 방법은 #1-9-Gla 및 그 이하의 것과 같은 덜 감마 카르복실화된 종의 비율을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 따라서 폴리펩티드의 종으로 하여금 같은 폴리펩티드의 다른 종들로부터 정제되도록 허용하는 방법을 제공하는데, 여기서 종들은 그것들이 감마 카르복실화되는 정도에 있어서, 또는 그것들의 아미노산 서열에서 Gla 잔기의 수에 있어서 다르다.

본 발명의 방법은 음이온교환 크로마토그래피를 사용한다. 본 발명은 구체적으로 관심있는 폴리펩티드를 음이온교환 재료에 결합시키고 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 또는 아세트산 나트륨을 포함하는 완충액을 사용하여 음이온교환 재료로부터 폴리펩티드의 용리를 수행하는 방법에 관련된다.

음이온교환 재료는 양으로 하전된 이온교환 재료이다. 그러므로 그것은 음이온교환 재료 위로 또는 그것을 통해서 통과하는 수용액 중의 음이온과 교환할 수 있는 유리 음이온을 갖는다. 전하는 고체상(solid phase)에 하나 이상의 하전된 리간드를 부착함으로써 제공될 수도 있고, 또는 그것은 고체상의 고유의 성질일 수도 있다. 고체상은, 예를 들면, 정제 컬럼, 입자 또는 비드, 멤브레인 또는 필터일 수 있다. 일반적으로 음이온교환 수지는 약 7 미만의 pI를 갖는 폴리펩티드의 정제에 사용된다. 여기서 기술된 바과 같이 사용될 수 있는 상업적으로 이용가능한 음이온교환 재료는, 예를 들면, Q Sepharose Fast Flow, Macroprep 25Q, Poros HQ50, Source 30Q, Source 15Q, Mini Q, Mono Q, 바람직하게는 Mini Q, Mono Q, Capto Q, Q Sepharose HP, Toyopearl QAE 550C, Unosphere Q, DEAE Sepharose FF, Fratoprep DEAE 및 Q HyperD 20을 포함한다.

음이온교환 재료는 4차 아민과 같은 강한 음이온 교환기를 이용할 수 있다. 음이온교환 재료는 디에틸아미노에틸(DEAE)과 같은 약한 음이온교환 기를 이용할 수도 있다. 적합한 음이온교환 재료는 예를 들면, 정제할 구체적인 폴리펩티드에 따라 당업자에 의해 선별될 수 있다.

음이온교환 재료는 정제할 특정 폴리펩티드와, pH, 완충액, 이온 강도 등과 같은 사용되는 조건에 따라 선별될 수 있다.

종래의 음이온교환 크로마토그래피 정제 방법은 보통 음이온교환 재료의 평형화, 샘플의 적용 또는 로딩, 하나 이상의 세정단계, 이온교환 재료의 용리 및 재생으로부터 선택되는 하나 이상의 단계들로 구성된다. 이온교환 크로마토그래피를 위한 표준 방법은 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences에서 발견된다.

음이온교환 수지는 바람직하게는 관심있는 폴리펩티드를 로딩하기에 앞서 평형화시킨다. 이 평형화 단계의 목적은 방법의 후속 단계들에서 사용되는 것들에 더 가깝게 닮도록 음이온교환 재료에서 조건을 조절하는 것이다. 크로마토그래피의 동안에 이동상의 조성에 있어서 변화를 회피하기 위해, 음이온교환 재료는 출발 완충액의 pH 및 이온 조성(예를 들면, 전도도, 완충액 조성)으로 평형화되어야 한다. 예를 들면, 평형 완충액의 이온 강도(예를 들면, 전도도, pH)는 폴리펩티드 및/또는 세척 완충액(들)에 로딩하기 위해 사용된 완충액과 같은, 방법의 나중 단계들에서 사용될 완충액의 이온 강도에 가능한 한 유사하도록 선별될 수 있다.

음이온교환 재료는 따라서 후속 단계에서 사용되는 완충액 또는 조제물에 밀접하게 기초한 완충액을 사용하여 평형화시킬 수 있다. 예를 들면, 음이온교환 재료의 평형화를 위해서와 샘플을 로딩하기 위해서 같은 완충액을 사용할 수 있다. 같은 완충액이 음이온교환 재료의 평형화를 위해서 및 샘플이 로딩된 후 음이온교환 재료를 세척하기 위해서 사용될 수 있다. 평형 완충액은 로딩 조제물 및/또는 세척 완충액과 같은 pH를 가질 수 있다. 평형 완충액은 로딩 조제물 및/또는 세척 완충액과 같은 전도도를 가질 수 있다. 평형 완충액은 로딩 조제물 및/또는 세척 완충액과 같은 완충 물질을 가질 수 있다. 평형 완충액은 로딩 조제물 및/또는 세척 완충액과 같은 완충 물질 농도를 가질 수 있다. 평형 완충액은 로딩 조제물 및/또는 세척 완충액, 예를 들면 세제에서 또한 존재하는 추가의 성분들을 포함할 수 있다.

평형 완충액의 pH는 정제할 구체적인 폴리펩티드에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 인자 IX와 같은 수많은 폴리펩티드에 대해, 9.0 이상의 pH는 최적이 아닌데, 폴리펩티드의 자동활성화 및/또는 분해가 이들 pH 값에서 관찰될 수 있기 때문이다.

본 발명에서 사용하기 위한 평형 완충액은 예를 들면, pH 5.0 내지 pH 8.5와 같은 약 5.0 내지 약 8.5의 pH에서 조제될 수 있다. 평형 완충액의 pH는 약 5.0보다 크거나, 약 5.5보다 크거나, 약 6.0보다 크거나, 약 6.5보다 크거나, 약 7.0보다 크거나, 약 7.5보다 크거나 또는 약 8.0보다 크다. 평형 완충액의 pH는 약 8.5 미만, 약 8.0 미만, 약 7.5 미만, 약 7.0 미만, 약 6.5 미만, 약 6.0 미만 또는 약 5.5 미만이다. 이러한 종말점의 어떤 조합도 조합될 수 있다. 예를 들면 평형 완충액의 pH는 약 7.0보다 크고 약 8.5미만이다. pH는, 예를 들면, 약 pH 7.0, 7.5, 8.0 또는 8.5이다.

이들 pH 값들이 인자 IX, 인자 VII 또는 인자 X와 같은, 여기 기술된 바와 같은 폴리펩티드의 정제를 위한 음이온교환 재료의 평형화를 위해 적합하다.

평형 완충액을 위한 적합한 성분들은 완충 물질, 예를 들면, Tris, 인산염, MES, Hepes 또는 탄산염을 포함할 수 있다. 음이온교환 크로마토그래피 방법을 위해, Tris와 같은, 양의 완충 이온이 바람직하다. 이러한 완충 물질은 평형 완충액을위에서 규정된 바와 같은 pH에서 유지하기 위해 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 같은 완충 물질 및 완충 물질 농도가 음이온교환 크로마토그래피 과정을 통해 사용된다. 예를 들면, 평형 완충액, 세척 완충액(들) 및 용리 완충액은 모두 같은 완충 물질 농도에서 같은 완충 물질을 포함할 수 있다. 완충 물질 농도는 음이온교환 크로마토그래피 과정의 동안에 완충 용량 및 일정한 pH를 유지하기에 충분해야 한다. 예를 들면, 완충 물질 및 완충 물질 농도는 샘플의 적용 동안에 및 용리의 동안에 안정한 pH 및 완충 용량을 유지하기 위해 선별될 수 있다. 적합한 완충 물질 농도는, 예를 들면, 10 mM 내지 40mM과 같은 5mM 내지 50mM일 수 있다. 적합한 완충 물질 농도는, 예를 들면, 5mM, 10mM, 15mM, 20mM 또는 25mM일 수 있다.

평형 완충액은 하나 이상의 추가의 성분들을 포함할 수 있다. 평형 완충액은 에틸렌글리콜, 에탄올, 우레아, 또는 단백질의 용해도를 증가시키기 위해 사용되는 세제와 같은 첨가제를 포함할 수 있다. 음이온교환 크로마토그래피에서 사용되는 세제는 중성이거나 또는 음이온교환 재료와 같은 전하이어야 한다. Tween 80, Tween 20 또는 Triton X100과 같은 비이온성 세제가 예를 들어서, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 농도로 사용될 수 있다. NaCl과 같은 비완충 염이 완충액의 이온 강도를 조절하기 위해 사용될 수도 있다.

관심있는 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 음이온교환 재료 위에 로딩한다. 이것은 폴리펩티드가 음이온교환 재료에 또는 위에 고정화되도록 하는 적당한 조건(전도도 및/또는 pH와 같은 것) 하에 음이온교환 재료에 샘플을 노출시킴으로써 달성된다. 이 고정화 또는 결합은 폴리펩티드와 음이온교환 재료의 하전된 기 사이의 이온 상호작용에 의해 달성된다. 이러한 결합은 일반적으로 음이온교환 재료와 접촉하여 있는 이동상의 이온 강도가, 관심있는 폴리펩티드의 이온성 기가 음이온교환 재료 상의 하전된 기에 대한 반대 이온으로서 역할을 하기 시작하는 점으로 감소될 때 일어난다.

본 발명의 방법으로 정제되는 샘플은 상기한 바와 같이 폴리펩티드를 포함하는 어떤 샘플도 될 수 있다. 바람직하게는 샘플은 감마 카르복실화의 정도 및/또는 위치에 있어서 다양한 같은 폴리펩티드의 하나 이상의 다른 종들을 포함한다.

상기한 바와 같이, 관심있는 폴리펩티드는 어떤 경로의 과정도 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드는 동물로부터와 같은 생체내 공급원으로부터 얻어질 수도 있고, 또는 시험관 내에서, 예를 들면, 조직 또는 세포에서 생산될 수도 있다. 관심있는 폴리펩티드는 예를 들면 세포에서 폴리펩티드의 발현을 유도함으로써 재조합에 의해 생산될 수 있다. 예를 들면, 관심있는 폴리펩티드는 폴리펩티드를 코딩하고 발현할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주 세포에서 생산될 수 있다. 이러한 숙주 세포는 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 배양될 수 있다. 폴리펩티드는 그 다음 배지로부터 또는 숙주 세포 자체로부터 회수될 수 있다.

바람직하게는 폴리펩티드는 음이온교환 수지에 적용되기 전에 정제된다. 예를 들면, 폴리펩티드는 침전, 면역침전, 등전점 전기영동, 여과, 원심분리 또는 다른 음이온교환 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피와 같은 하나 이상의 정제 단계를 받게 한다.

이러한 정제는 샘플로부터 한가지 이상의 오염물질을 부분적으로 또는 전적으로 제거하고 이로써 관심있는 폴리펩티드의 순도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 오염물질은 관심있는 폴리펩티드가 아닌 어떤 분자도 될 수 있다. 예를 들면, 오염물질은 다른 폴리펩티드, 핵산 또는 내독소일 수 있다. 오염물질은 절단된 또는 연장된 폴리펩티드, 탈아미드화된 형태의 폴리펩티드, 올바르지 않게 접힌 폴리펩티드 또는 원하지 않는 글리코실화를 갖는 폴리펩티드의 형태와 같은 관심있는 폴리펩티드의 변이체일 수 있다. 오염물질은 이온교환 크로마토그래피를 방해할 수도 있는 분자일 수 있다.

바람직하게는 관심있는 폴리펩티드는 적어도 적어도 75% 순수, 더 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 이상 순수하다. 가장 바람직하게는 폴리펩티드는 적어도 90% 순수하며, 예를 들면 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 순수하다. 순도는 관심있는 폴리펩티드로 이루어진 전체 건조 중량의 비율을 말하는 것으로 의도된다. 샘플은 상기한 바와 같이 25중량% 미만의 오염물질, 예를 들어서, 25중량% 미만의 관심있는 폴리펩티드이외의 단백질, 더 바람직하게는 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 3% 미만 또는 1% 미만이다. 샘플은 관심있는 폴리펩티드의 순수한 또는 실질적으로 순수한 샘플일 수 있다. 샘플은 관심있는 폴리펩티드의 분리된 또는 실질적으로 분리된 샘플일 수 있다.

이러한 폴리펩티드의 샘플은 폴리펩티드를 재조합 생산하는 세포의 배지로부터의 샘플 또는 폴리펩티드를 발현한 용해된 세포의 샘플의 형태와 같은 폴리펩티드 합성으로부터 직접 얻어진 형태로 음이온 교환 재료에 적용된다. 폴리펩티드의 샘플은 여기서 기술된 바와 같이 정제된 또는 부분적으로 정제된 형태로 음이온교환 재료에 적용될 수 있다. 여기서 기술된 바와 같은 샘플은 음이온 교환 재료에 적용되기 전에 더욱 조제될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드 (또는 정제된 폴리펩티드)가 고체 형태로 제공되는 경우에, 음이온교환 재료에 적용을 위해 액체 조성물로 조제될 수 있다. 예를 들면, 그것은 물, 완충액 또는 또다른 용매로 조제될 수 있다. 바람직하게는, 액체 조성물은 수성이다. 폴리펩티드 또는 정제된 폴리펩티드가 액체 또는 수성 형태로 제공되는 경우에, 또는 고체 폴리펩티드 샘플이 상기한 바와 같이 액체 형태로 조제된 경우에, 샘플의 조제물은 음이온교환 재료에 적용되기 전에 조절될 수 있다.

예를 들면, 샘플 또는 조제된 샘플의 전도도 및/또는 pH는 일상적인 방법을 사용하여 조절될 수 있다. 샘플의 pH는 음이온교환 재료의 평형화 및/또는 음이온교환 재료의 세척에 사용된 완충액의 pH와 갖거나, 실질적으로 같도록 조절될 수 있다. 샘플의 전도도는 음이온교환 재료의 평형화 및/또는 음이온교환 재료의 세척에 사용된 완충액의 전도도와 갖거나, 실질적으로 같도록 조절될 수 있다. 샘플은 평형 완충액의 조성과 관련하여 상기 논의된 완충 물질의 어떤 것과도 같은 완충 물질과 함께 조제될 수 있다. 샘플은 음이온교환 재료의 평형화 및/또는 음이온교환 재료의 세척에 사용된 같은 완충액에서 조제될 수 있다. 샘플은 음이온교환 재료의 평형화 및/또는 음이온교환 재료의 세척에 사용된 완충액과 같은 완충 물질 및/또는 같은 완충 물질 농도 및/또는 같은 pH 및/또는 같은 전도도에서 조제될 수 있다. 한 구체예에서, 관심있는 폴리펩티드는 그것을 사용되는 평형 완충액과 동일한 완충액에 첨가함으로써 음이온교환 재료에 적용을 위해 조제된다.

폴리펩티드는 그 다음 음이온교환 재료에 폴리펩티드의 결합을 허용하는 조건 하에서 폴리펩티드의 관련 조제물을 음이온교환 재료 위로 또는 그것을 통해서 통과시킴으로써 음이온교환 재료에 로딩된다. 이러한 방법은 본 분야에서 일상적인 것이다.

일단 관심있는 폴리펩티드가 음이온교환 컬럼에 로딩되면, 컬럼을 1회 이상 세척을 받게 한다. 세척은 적당한 용액을 음이온교환 재료를 통과시킴으로써 달성된다. 이러한 세척의 목적은 음이온교환 재료에 결합되지 않은 어떤 폴리펩티드나 또는 다른 성분들을 제거하고, 음이온교환 재료에 단지 약하게 결합된 어떤 폴리펩티드나 또는 다른 성분들을 제거하고, 관심있는 폴리펩티드보다 더 낮은 친화도로 음이온교환 재료에 결합하는 불순물들을 제거하기 위한 것이다.

한 구체예에서, 음이온교환 재료 위에 폴리펩티드의 로딩 후, 음이온교환 재료를, 어떤 미결합 폴리펩티드, 오염물질 또는 불순물을 제거하기 위해 완충액으로 세척한다. 예를 들면, 세척 완충액은 폴리펩티드를 음이온교환 재료에 로딩하기 위해 조제한 완충액과 동일하거나, 실질적으로 동일할 수 있다. 세척 완충액은 평형 완충액과 동일하거나, 실질적으로 동일할 수 있다. 예를 들면, 세척은 평형 완충액과 같은 완충액 또는 폴리펩티드를 조제하기 위해 사용된 같은 완충액을 사용하여 수행될 수 있다. 세척은 평형 완충액 또는 폴리펩티드를 조제하기 위해 사용된 완충액과 같거나 또는 실질적으로 같은 pH 및/또는 같거나 또는 실질적으로 같은 전도도를 사용하여 수행될 수 있다. 세척은 평형 완충액 또는 폴리펩티드의 조제에 사용된 것과 같거나 실질적으로 같은 농도에서 같은 완충 물질을 포함하는 완충액을 사용하여 수행될 수 있다.

다른 세척은 대안으로 또는 추가로 평형 완충액과 다른 완충액을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 관심있는 폴리펩티드보다 덜 강하게 음이온교환 재료에 결합하는 음이온교환 재료로부터 오염물질을 제거하는 것이 가능할 수 있다. 이러한 오염물질은 관심있는 폴리펩티드보다 더 쉽게 음이온교환 재료로부터 방출될 것이다. 예를 들면, 음이온교환 재료는 평형 완충액 및/또는 폴리펩티드가 로딩된 조제물보다 더 큰 전도도 또는 이온 강도를 갖는 완충액으로 세척될 수 있다. 완충액의 이온 강도를 증가시킴으로써, 음이온교환 재료로부터의 성분들의 용리는 달성될 수 있다. 바람직하게는 세척 완충액은 관심있는 폴리펩티드가 음이온교환 재료로부터 실질적으로 용리되지 않도록 선별되거나 또는 충분히 작은 부피로 사용된다.

세척을 위한 완충액은 특정 샘플 및 관심있는 폴리펩티드의 성질에 따라 당업자에 의해 선별될 수 있다. 예를 들면, 관심있는 폴리펩티드보다 덜 강하게 수지에 결합하게 되는 특정 폴리펩티드 또는 불순물의 제거를 허용하는 특정 pH 또는 전도도를 갖는 완충액이 선별될 수 있다. 이러한 완충액을 선별하고 그것의 사용을 간단한 일상적인 실험에 의해, 예를 들면 컬럼으로부터 제거된 용액의 조성을 모니터링함으로써 최적화시킨다.

세척 완충액의 pH는 정제할 특정 폴리펩티드에 따라 결정된다. 예를 들면, 인자 IX와 같은 수많은 폴리펩티드에 대해서, 9.0 또는 그 이상의 pH는 최적이 아닌데, 폴리펩티드의 자동활성화 및/또는 분해가 이들 pH 값에서 관찰될 수 있기 때문이다.

본 발명에서 사용을 위해 적합한 세척 완충액은 pH 5.0 내지 pH 8.5와 같은 약 5.0 내지 약 8.5의 pH에서 조제될 수 있다. 세척 완충액의 pH는 약 5.0보다 크거나, 약 5.5보다 크거나, 약 6.0보다 크거나, 약 6.5보다 크거나, 약 7.0보다 크거나, 약 7.5보다 크거나 또는 약 8.0보다 크다. 세척 완충액의 pH는 약 8.5 미만, 약 8.0 미만, 약 7.5 미만, 약 7.0 미만, 약 6.5 미만, 약 6.0 미만 또는 약 5.5 미만이다. 이러한 종말점의 어떤 조합도 조합될 수 있다. 예를 들면 세척 완충액의 pH는 약 7.0보다 크고 약 8.5미만일 수 있다. pH는, 예를 들면, 약 pH 7.0, 7.5, 8.0 또는 8.5일 수 있다.

이들 pH 값들이 인자 IX, 인자 VII 또는 인자 X와 같은, 여기 기술된 바와 같은 폴리펩티드의 정제를 위한 음이온교환 재료의 세척을 위해 적합하다.

세척 완충액을 위한 적합한 성분들은 완충 물질, 예를 들면, Tris, 인산염, MES, Hepes 또는 탄산염을 포함할 수 있다. 음이온교환 크로마토그래피 방법을 위해, Tris와 같은, 양의 완충 이온이 바람직하다. 이러한 완충 물질은 세척 완충액을 위에서 규정된 바와 같은 pH에서 유지하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 완충 물질 농도는, 예를 들면, 10 mM 내지 40mM과 같은 5mM 내지 50mM일 수 있다. 적합한 완충 물질 농도는, 예를 들면, 5mM, 10mM, 15mM, 20mM 또는 25mM일 수 있다.

세척 완충액은 하나 이상의 추가의 성분들을 포함할 수 있다. 세척 완충액은 에틸렌글리콜, 에탄올, 우레아, 또는 단백질의 용해도를 증가시키기 위해 사용되는 세제와 같은 첨가제를 포함할 수 있다. 음이온교환 크로마토그래피에서 사용되는 세제는 중성이거나 또는 음이온교환 재료와 같은 전하이어야 한다. Tween 80, Tween 20 또는 Triton X100과 같은 비이온성 세제가 예를 들어서, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 농도로 사용될 수 있다. NaCl과 같은 비완충 염이 완충액의 이온 강도를 조절하기 위해 사용될 수도 있다.

음이온교환 재료로부터 분자를 용리하는 것은 음이온교환 재료로부터 분자를 제거하는 것을 의미한다. 이것은 일반적으로 음이온교환 재료를 둘러싸는 완충액의 이온 강도를 변경시켜서 완충액이 음이온교환 재료의 하전된 기에 대해 분자와 경쟁하도록 함으로써 달성된다. 음이온교환 재료에 대한 분자의 결합 강도는 따라서 감소하고 그것은 탈착한다. 음이온교환 재료로부터의 용리는 또한 관심있는 폴리펩티드의 입체구조를 변경시키는 분자를 사용하고, 따라서 결합 강도를 감소시키고 폴리펩티드로 하여금 음이온교환 재료로부터 방출되도록 야기함으로써 달성될 수 있다.

용리 완충액의 pH는 정제할 특정 폴리펩티드에 따라 결정된다. 예를 들면, 인자 IX와 같은 수많은 폴리펩티드에 대해서, 9.0 또는 그 이상의 pH는 최적이 아닌데, 폴리펩티드의 자동활성화 및/또는 분해가 이들 pH 값에서 관찰될 수 있기 때문이다.

본 발명에서 사용을 위해 적합한 용리 완충액은 pH 5.0 내지 pH 8.5와 같은 약 5.0 내지 약 8.5의 pH에서 조제될 수 있다. 용리 완충액의 pH는 약 5.0보다 크거나, 약 5.5보다 크거나, 약 6.0보다 크거나, 약 6.5보다 크거나, 약 7.0보다 크거나, 약 7.5보다 크거나 또는 약 8.0보다 크다. 용리 완충액의 pH는 약 8.5 미만, 약 8.0 미만, 약 7.5 미만, 약 7.0 미만, 약 6.5 미만, 약 6.0 미만 또는 약 5.5 미만이다. 이러한 종말점의 어떤 조합도 조합될 수 있다. 예를 들면 용리 완충액의 pH는 약 7.0보다 크고 약 8.5미만일 수 있다. pH는, 예를 들면, 약 pH 7.0, 7.5, 8.0 또는 8.5일 수 있다.

이들 pH 값들이 인자 IX, 인자 VII 또는 인자 X와 같은, 여기 기술된 바와 같은 폴리펩티드의 정제를 위한 음이온교환 재료의 용리을 위해 적합하다.

용리 완충액을 위한 적합한 성분들은 완충 물질, 예를 들면, Tris, 인산염, MES, Hepes 또는 탄산염을 포함할 수 있다. 음이온교환 크로마토그래피 방법을 위해, Tris와 같은, 양의 완충 이온이 바람직하다. 이러한 완충 물질은 용리 완충액을 위에서 규정된 바와 같은 pH에서 유지하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 완충 물질 농도는, 예를 들면, 10 mM 내지 40mM과 같은 5mM 내지 50mM일 수 있다. 적합한 완충 물질 농도는, 예를 들면, 5mM, 10mM, 15mM, 20mM 또는 25mM일 수 있다.

용리 완충액은 하나 이상의 추가의 성분들을 포함할 수 있다. 용리 완충액은 에틸렌글리콜, 에탄올, 우레아, 또는 단백질의 용해도를 증가시키기 위해 사용되는 세제와 같은 첨가제를 포함할 수 있다. 음이온교환 크로마토그래피에서 사용되는 세제는 중성이거나 또는 음이온교환 재료와 같은 전하이어야 한다. Tween 80, Tween 20 또는 Triton X100과 같은 비이온성 세제가 예를 들어서, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 농도로 사용될 수 있다. NaCl과 같은 비완충 염이 완충액의 이온 강도를 조절하기 위해 사용될 수도 있다.

본 발명에 따르는 사용을 위해, 용리 완충액은 바람직하게는 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 및 아세트산 나트륨으로부터 선택된 한가지 이상의 염과 같은 한가지 이상의 카오트로픽 염(chaotropic salts)을 포함할 것이다. 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 및/또는 아세트산 나트륨과 같은 카오트로픽 염은 적어도 0.1M, 적어도 0.2M, 적어도 0.5M, 적어도 1.0M 또는 적어도 1.5 M의 농도로 용리 완충액에 존재할 수 있다. 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 및/또는 아세트산 나트륨와 같은 카오트로픽 염은 2.0M 까지, 1.9M 까지, 1.5M 까지 또는 1.0M 까지의 농도로 존재할 수 있다. 이들 하부 종말점의 어느 하나를 이들 상부 종말점의 어느 하나와 조합하여 적합한 농도 범위를 형성할 수 있다. 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 및/또는 아세트산 나트륨과 같은 카오트로픽 염은 약 2.0M 까지의 어떤 농도로도 존재할 수 있다. 예를 들면, 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 및/또는 아세트산 나트륨과 같은 카오트로픽 염은 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9 또는 약 2.0 M 까지의 농도로, 가장 바람직하게는 약 0.6 M의 농도로 존재할 수 있다.

한 구체예에서 용리 완충액은 용리 완충액이 카오트로픽 염을 추가로 포함하는 것을 제외하고는 세척 완충액 및/또는 평형 완충액과 같은 조성을 갖는다. 바람직한 카오트로픽 염은 상기한 바와 같이 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 및/또는 아세트산 나트륨 중 한가지 이상이다. 따라서, 용리 완충액은 세척 완충액 또는 평형 완충액에 대해 여기서 기술된 어떤 조성도 가질 수 있으나, 추가로 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 및/또는 아세트산 나트륨을 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 평형 완충액과 세척 완충액은 동일하고 용리 완충액은 그것들과 단지 용리 완충액이 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 또는 아세트산 나트륨을 또한 포함한다는 점에서 다르다.

용리는 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 또는 아세트산 나트륨의 등용매(isocratic) 또는 선형 기울기와 같은 카오트로픽 염의 등용매 또는 선형 기울기를 사용하여 수행될 수 있다. 용리는 완충액 중의 카오트로픽 염의 농도에 있어서 단계별 변화를 사용하여 수행될 수 있다. 용리는 이들 용리 방법들의 어떤 조합에 의해서도 달성될 수 있다. 예를 들면, 카오트로픽 염의 주어진 농도에서 등용매 용리 후 기울기 형태나 아니면 하나 이상의 단계들로 염의 농도가 증가한다.

어떤 이러한 용리 방법으로도, 다른 성분들이 그것들의 결합의 강도에 따라 다른 때에 음이온교환 재료로부터 방출될 것이다. 덜 강하게 결합하는 성분들은 더 조기에 또는 더 낮은 염 농도와 같은 더 낮은 완충액 전도도에서 방출되는 경향이 있게 된다. 더 강하게 결합하는 성분들은 음이온교환 재료 상에 더 오래 또는 더 높은 염 농도에서 보유되는 경향이 있게 된다. 음이온교환 재료를 가로질러 또는 통해서 통과한 용출물을 모니터링하여 특정 성분들이 용리되는 때를 확인할 수 있다. 용출물은 다른 시점에서 모으고 각 푸울을 분석하여 어느 성분들이 어느 푸울에 존재하는지를 결정한다. 그 다음 원하는 조제물, 예를 들면 특정 폴리펩티드 종의 증가된 농도 또는 다른 폴리펩티드 종의 감소된 농도를 갖는 특정한 푸울을 선별할 수 있다.

여기서 기술된 바와 같은 등용매 용리는 고정된 또는 일정한 농도의 염을 사용한다. 상기 논의된 농도 중 어떤 농도와 같은 염의 농도를 포함하는 용리 완충액을 사용한다. 용리 완충액은 음이온교환 재료를 가로지르거나 통해서 통과하고 용출물을 모니터링하여 용리가 일어나는 때를 확인한다. 등용매 용리를 사용하여, 음이온교환 재료에 대해 더 낮은 결합 친화도를 갖는 성분들은, 더 작은 부피의 용리 완충액을 사용했을 때, 음이온교환 재료를 가로지르거나 통해서 통과하는 더 큰 부피의 용리 완충액을 요하는 더 높은 결합 친화도를 갖는 성분들보다 조기에 방출될 것이다. 다른 시간 기간에 얻어진 용출물의 특정 푸울 또는 배치를 선별함으로써, 폴리펩티드 종의 다른 조성들을 갖는 샘플이 얻어질 수 있다.

기울기 용리는 완충액 중의 염의 농도를 상기 논의된 바와 같은 농도와 같은 최종 최대 농도까지 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들면 선형 기울기는 카오트로픽 염의 최종 농도의 0% 내지 100%를 사용할 수 있다. 이 기울기는 10, 20, 30, 40, 50, 70, 100, 150 또는 그 이상의 컬럼 부피에 걸쳐서와 같은 시간 기간에 걸쳐 음이온교환 재료에 적용될 수 있다. 이러한 기울기 용리를 사용하여, 음이온교환 재료에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 성분들은 용리가 일어나기 위해 더 높은 농도의 염을 요하는 더 높은 결합 친화도를 갖는 성분들보다 더 낮은 농도의 염에서 조기에 방출될 것이다. 다른 시간 기간에서 얻어진 용출물의 특정 푸울 또는 배치를 선별함으로써, 폴리펩티드 종의 다른 조성들을 갖는 샘플들이 얻어질 수 있다.

카오트로픽 염의 농도를 증가시키기 위해 점진적인 기울기를 사용하는 것보다는, 단계식 증가가 사용될 수 있다. 즉, 염의 농도는 하나 이상의 별도의 단계들로 최종 최대 농도로 증가시킬 수 있다. 이것은 기울기 용리의 효과를 반영하기 위해 사용될 수 있는데, 이때 다른 성분들이 다른 농도에서 및 따라서 다른 단계들에서 방출된다. 단계식 용리는 대안으로 등용매 용리와 조합될 수 있다. 예를 들면, 염 농도에 있어서 단계식 증가를 용리 완충액의 수많은 컬럼 부피에 대해 유지시켜서 그 농도에서의 등용매 용리가 일어나게 하고, 완충액의 증가하는 부피가 사용됨에 따라 다른 성분들이 용리된다. 염 농도에 있어서 후속 추가의 단계들이 또한 사용될 수 있다.

용리 완충액이 용리 완충액 중의 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 또는 아세트산 나트륨과 같은 염의 존재에 있어서만 세척 완충액과 다른 구체예에서, 등용매 용리를 위한 용리 완충액은 세척 완충액에 염의 양을 첨가함으로써 얻어질 수 있고, 기울기 용리는 세척 완충액 용액에 염을 점차적으로 첨가함으로써 달성될 수 있으며, 단계별 용리는 별도의 단계들로 완충액에서의 염의 농도를 증가시키기 위해 세척 완충액에 염의 양을 첨가함으로써 달성될 수 있다.

실시예

실시예 1: FIX의 다른 감마-카르복실화된 종의 활성의 분석.

재조합체 사람 인자 IX (FIX)를 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포에서 생산하였다. FIX의 특이적 활성은 대략 50%인 것으로 측정되었다.

#1-8-, #1-9-, #1-10-, #1-11- 및 #1-12-Gla가 우세한 개개의 FIX 종들을 분별하였다.

혈전 분석을 사용하여 섬유소 응괴 형성에 대한 FIX 활성 의존 시간을 측정하였다. 접촉 활성화제(APTT 시약 중의 엘라직산)을 사용하여 FXIIa의 생산을 자극하고 재석회화(re-calcification)에 의해 촉발하고 인지질을 첨가하였다. 활성을 BeneFIX 및 정상의 모은 사람 혈장에 대해 측정하고, 이것을 WHO 사람 FIX 표준에 대해 검정하였다.

'Hyphen BioMed Chromogenic Factor IX 키트 (Aniara)'로서 공지된 상업적으로 이용가능한 분석 키트를 사용하여 rhFIX의 활성 수준을 산정하였다. 이 분석에서, 인자 XIa는 인자 IX를 인자 IXa로 활성화시키는데, 이것은 활성화된 인자 VIII:C, 인지질 및 Ca²⁺와 함께, 인자 X를 인자 Xa로 활성화한다. 발생된 인자 Xa의 양을 인자 Xa 특이적 색소원 기질 SXa-11로부터 방출된 pNA의 양에 의해 405nm에서 측정하였다.

#1-11- 및 #1-12-Gla 종은 혈전 및 2-단계 활성 분석에서 충분히 활성인 것으로 발견되었다. #1-8-, #1-9- 및 #1-10-Gla 종은 사용된 분석법에 따라 각각 대략 2-5%, 14-22% 및 27-36%로 활성이 하락하였다.

실시예 2: FIX의 다른 감마-카르복실화된 종의 정제 및 분석.

음이온교환 크로마토그래피를 재조합체 사람 인자 IX (rhFIX)에 대해 다른 감마 카르복실화된 형태들의 분리를 위해 사용하였다. 방법은 SOURCE 15Q 컬럼(GE Healthcare)을 사용하였고 베드 부피가 6 ml, 유속이 3 ml/min 그리고 온도가 4℃이었다.

컬럼에 로딩된 샘플("로딩 샘플")은 rhFIX이었다. 전체 대략 13 mg을 로딩하였다. 로딩 샘플을 0.1 M NaOH를 사용하여 pH 8.0으로 조절하였다.

사용된 완충액은 다음과 같았다:

평형 완충액: 20 mM Tris/NaOH, pH 8.0, 0.01 % Tween80.

용리 완충액: 20 mM Tris/HCl, 1.5 M 아세트산 암모늄, pH 8.0, 0.01% Tween80.

CIP: 1 M NaOH

음이온교환 크로마토그래피 과정은 다음과 같았다:

단계 완충액 CV %-용리 완충액

평형화 평형 완충액 10 0%

적용

세척 평형 완충액 5 0%

용리 용리 완충액 5 20 % (등용매)

용리 용리 완충액 20 20-40% (기울기)

용리 용리 완충액 5 65% (등용매)

용리 용리 완충액 5 100% (등용매)

CIP1 NaOH 5 0%

CIP2 용리 완충액 10 100% (등용매)

재평형화 평형 완충액 20 0%

이 음이온 교환 크로마토그래피의 결과를 도 2 및 도 3에 나타낸다.

분획 C12-D3의 푸울을 선택하였고, 9.6 mg/74 %을 수득하였다. 이 푸울의 Gla 함량을 위의 로딩 샘플에 대해 사용된 원래의 샘플과 비교하였다.

개개 분획들의 Gla 함량 분석을 Agilent HPLC 시스템을 사용하여 수행하였다. HPLC법에 기초한 Gla 함량 분석을 N-말단 서열결정 및 아미노산 염기성 가수분해 분석을 사용하여 얻어진 Gla 함량 분석과 상관시켰다. HPLC는 MiniQ PC3.2/3 컬럼(GE Healthcare cat. no 17-0686-01)을 사용하였고 유속은 0.18 ml/min이었다. 이 시스템에서 사용된 완충액은 다음과 같았다:

A-완충액: 20 mM Tris/NaOH, pH 9.0

B-완충액: 20 mM Tris/HCl, pH 9.0, 1.5 M 아세트산 암모늄

이 시스템에서 측정된 신호는 UV280 및 형광 신호이었다(ex: 280nm / em: 340nm).

HPLC 과정은 다음과 같았다:

0 - 5 분 0 - 30 % B

5 - 55 분 30 - 55 % B

55 - 65 분 55 - 100 % B

상기한 바와 같이 음이온교환 크로마토그래피를 사용한 분리 전과 후의 Gla의 분포의 비교를 도 4에 나타내었다. 이들 결과는 또한 다음과 같이 제공될 수 있다.

%-#Gla	전	후	BeneFIX®, 비교용으로 포함
%-#1-8	1.6	0	0
%-#1-9	3.3	0	3
%-#1-10	13.6	6.7	10
%-#1-11	36.0	40.7	27
%-#1-12	45.6	52.6	60

상기한 바와 같이 음이온교환 크로마토그래피를 사용한 정제는 따라서 원래의 FIX 샘플로부터 모든 검출가능한 #1-8- 및 #1-9-Gla의 제거를 이끌었다. 또한 #1-10-Gla의 존재와 결과적인 #1-11- 및 #1-12-Gla의 비율에 있어서의 증가가 있었다.

최종 정제된 푸울에서 특이적 활성은 또한 Benefix (2-단계 활성 분석, 데이터 계산은 나타내지 않음)와 비교하여 대략 110%로 증가하였다.

실시예 3: FIX의 다른 감마-카르복실화된 종의 정제 및 분석.

음이온교환 크로마토그래피를 재조합체 사람 FIX에 대해 다른 감마 카르복실화된 형태들의 분리를 위해 사용하였다. 방법은 SOURCE 30Q 컬럼(GE Healthcare)을 사용하였고 베드 부피가 6 ml, 유속이 2 ml/min 그리고 온도가 4℃이었다.

컬럼에 로딩된 샘플("로딩 샘플")은 FIX이었다. 전체 대략 2.5 mg을 로딩하였다. 로딩 샘플을 0.1 M NaOH를 사용하여 pH 8.0으로 조절하였다.

사용된 완충액은 다음과 같았다:

평형 완충액: 20 mM Tris/NaOH, pH 8.0, 0.01 % Tween80.

용리 완충액: 20 mM Tris/HCl, 1.5 M 아세트산 암모늄, pH 8.0, 0.01 % Tween80.

CIP: 1M NaOH

음이온교환 크로마토그래피 과정은 다음과 같았다:

단계 완충액 CV %-용리 완충액

평형화 평형 완충액 10 0%

적용

세척 평형 완충액 5 0%

용리 용리 완충액 5 25 % (등용매)

용리 용리 완충액 20 25-45% (기울기)

용리 용리 완충액 5 100% (등용매)

CIP1 NaOH 5 0%

CIP2 용리 완충액 10 100% (등용매)

재평형화 평형 완충액 20 0%

이 음이온 교환 크로마토그래피의 결과를 도 5 및 도 6에 나타낸다.

분획 C12-D3의 푸울을 선택하였고, 1.75 mg/70 %을 수득하였다. 이 푸울의 Gla 함량을 위의 로딩 샘플에 대해 사용된 원래의 샘플과 비교하였다. 개개 분획들의 Gla 함량 분석을 실시예 2에 기술된 바와 같이 Agilent HPLC 시스템을 사용하여 수행하였다.

상기한 바와 같이 음이온교환 크로마토그래피를 사용한 분리 전과 후의 Gla의 분포의 비교를 이하의 표에 나타내었다.

%-#Gla	전	후	BeneFIX®, 비교용으로 포함
%-#1-8	1.6	0	0
%-#1-9	3.3	0	3
%-#1-10	12.7	2.3	10
%-#1-11	32.2	25.7	27
%-#1-12	50.8	72.0	60

상기한 바와 같이 음이온교환 크로마토그래피를 사용한 정제는 따라서 원래의 FIX 샘플로부터 모든 검출가능한 #1-8- 및 #1-9-Gla의 제거를 이끌었다. 또한 #1-10-Gla의 존재와 결과적인 #1-11- 및 #1-12-Gla의 비율에 있어서의 증가가 있었다.

실시예 4: FVII의 다른 감마-카르복실화된 종의 정제 및 분석.

음이온교환 크로마토그래피를 재조합체 사람 인자 VIIa (FVII)에 대해 다른 감마 카르복실화된 형태들의 분리를 위해 사용하였다. 방법은 SOURCE 15Q 컬럼(GE Healthcare)을 사용하였고 베드 부피가 1.7 ml, 유속이 0.75 ml/min 그리고 온도가 4℃이었다.

컬럼에 로딩된 샘플("로딩 샘플")은 CHO 세포에서 생산된 FVII이었다. 전체 대략 1.8 mg을 로딩하였다. 로딩 샘플을 1 M 스톡 용액으로부터 50 mM EDTA를 첨가하고 0.1 M NaOH를 사용하여 pH 8.0으로 조절하였다.

사용된 완충액은 다음과 같았다:

평형 완충액: 20 mM Tris/NaOH, pH 8.0

용리 완충액: 20 mM Tris/HCl, 1.5 M 아세트산 암모늄, pH 8.0

CIP: 1 M NaOH

음이온교환 크로마토그래피 과정은 다음과 같았다.

단계 완충액 CV %-용리 완충액

평형화 평형 완충액 5 0%

적용

세척 평형 완충액 5 0%

용리 용리 완충액 100 0-100 % (기울기)

용리 용리 완충액 5 100% (등용매)

CIP1 NaOH 5 0%

CIP2 용리 완충액 10 100% (등용매)

재평형화 평형 완충액 10 0%

이 음이온 교환 크로마토그래피의 결과를 도 7 및 도 8에 나타낸다.

개개 분획들(22 내지 27)의 Gla 함량 분석을 실시예 2에 기술된 바와 같이 Agilent HPLC 시스템을 사용하여 수행하였다.

상기한 바와 같이 음이온교환 크로마토그래피를 사용한 분리 전과 후의 분리된 FVII Gla 종의 분포의 비교를 이하의 표에 나타내었다.

Gla 종* (%)	분획						분리 전 (로딩 샘플)
	22	23	24	25	26	27
%-#1-8	100.0	100.0	11.0	-	-	-	< 1 %
%-#1-9	-	-	89.0	100.0	69.2	36.7	65
%-#1-10	-	-	-	-	30.8	63.3	34

* 주: FVII는 전체적으로 단지 10개의 Gla 잔기를 함유한다.

상기 나타낸 바와 같이 음이온교환 크로마토그래피를 사용하는 정제는 FVIIa Gla 종의 분명한 분리를 이끌었다. 따라서, FVII Gla 종의 조성물이 실험자에 의해 바람직한 방식으로 제조될 수 있다.

실시예 5: FIX의 다른 감마-카르복실화된 종의 정제 및 분석.

음이온교환 크로마토그래피를 재조합체 사람 인자 FIX에 대해 다른 감마 카르복실화된 형태들의 분리를 위해 사용하였다. 방법은 SOURCE 15Q 컬럼(GE Healthcare)을 사용하였고 베드 부피가 1.7 ml, 유속이 0.75 ml/min 그리고 온도가 4℃이었다.

컬럼에 로딩된 샘플("로딩 샘플")은 FIX이었다. 전체 대략 2 mg을 로딩하였다. 로딩 샘플을 0.1 M NaOH를 사용하여 pH 8.5로 조절하였다.

사용된 완충액은 다음과 같았다:

평형 완충액: 20 mM Tris/NaOH, pH 8.5

용리 완충액: 20 mM Tris/HCl, 1.0 M 아세트산 암모늄, pH 8.5

CIP: 1 M NaOH

음이온교환 크로마토그래피 과정은 다음과 같았다.

단계 완충액 CV %-용리 완충액

평형화 평형 완충액 5 0%

적용

세척 평형 완충액 5 0%

용리 용리 완충액 100 0-100 % (기울기)

용리 용리 완충액 5 100% (등용매)

CIP1 NaOH 5 0%

CIP2 용리 완충액 10 100% (등용매)

재평형화 평형 완충액 10 0%

이 음이온 교환 크로마토그래피의 결과를 도 9 및 도 10에 나타낸다.

개개 분획들(E7 내지 F12)의 Gla 함량 분석을 실시예 2에 기술된 바와 같이 Agilent HPLC 시스템을 사용하여 수행하였다.

상기한 바와 같이 음이온교환 크로마토그래피를 사용하여 분리된 FIX Gla 종의 분포의 비교를 이하의 표에 나타내었다.

Gla 종 (%)	분리 전 (로딩 샘플)	분획							Benefix®
		E7	E8	E9	E10	E11	E12	F12
Gla#8	1.0	-	-	-	-	-	-	-	-
Gla#9	3.3	-	-	-	-	-	-	-	3
Gla#10	12.7	18.9	-	-	-	-	-	-	10
Gla#11	32.2	81.1	73.7	46.3	22.6	13.4	10.4	7.1	27
Gla#12	50.8	-	26.3	53.7	77.4	86.6	89.6	92.9	60

상기 나타낸 바와 같이 음이온교환 크로마토그래피를 사용하는 정제는 FIX Gla 종의 분명한 분리를 이끌었다. 따라서, FIX Gla 종의 조성물이 실험자에 의해 바람직한 방식으로 제조될 수 있다.

실시예 6: FIX의 다른 감마-카르복실화된 종의 정제 및 분석.

음이온교환 크로마토그래피를 재조합체 사람 인자 FIX에 대해 다른 감마 카르복실화된 형태들의 분리를 위해 사용하였다. 방법은 SOURCE 15Q 컬럼(GE Healthcare)을 사용하였고 베드 부피가 1.7 ml, 유속이 0.75 ml/min 그리고 온도가 4℃이었다.

컬럼에 로딩된 샘플("로딩 샘플")은 FIX이었다. 전체 대략 2 mg을 로딩하였다. 로딩 샘플을 0.1 M NaOH를 사용하여 pH 8.0으로 조절하였다.

사용된 완충액은 다음과 같았다:

평형 완충액: 20 mM Tris/NaOH, pH 8.0

용리 완충액: 20 mM Tris/HCl, 1.0 M 아세트산 암모늄, pH 8.0

CIP: 1 M NaOH

음이온교환 크로마토그래피 과정은 다음과 같았다.

단계 완충액 CV %-용리 완충액

평형화 평형 완충액 10 0%

적용

세척 평형 완충액 5 0%

용리 용리 완충액 5 10% (등용매)

용리 용리 완충액 40 10-60 % (기울기)

용리 용리 완충액 5 100% (등용매)

CIP1 NaOH 5 0%

CIP2 용리 완충액 10 100% (등용매)

재평형화 평형 완충액 10 0%

이 음이온 교환 크로마토그래피의 결과를 도 11 및 도 12에 나타낸다.

개개 분획들(E5 내지 E1)의 Gla 함량 분석을 실시예 2에 기술된 바와 같이 Agilent HPLC 시스템을 사용하여 수행하였다.

상기한 바와 같이 음이온교환 크로마토그래피를 사용하여 분리된 FIX Gla 종의 분포의 비교를 이하의 표에 나타내었다.

Gla 종 (%)	분리 전 (적용)	분획						Benefix®
		D5	D4	D3	D2	D1	E1
Gla#8	1.1	-	-	-	-	-	-	-
Gla#9	2.7	16.5	3.1	-	-	-	-	3
Gla#10	12.5	49.8	27.8	6.0	5.1	4.4	5.0	10
Gla#11	26.1	12.2	42.4	26.8	18.5	19.1	18.7	27
Gla#12	57.5	21.5	26.8	67.2	76.4	76.5	76.4	60

상기 나타낸 바와 같이 음이온교환 크로마토그래피를 사용하는 정제는 FIX Gla 종의 분명한 분리를 이끌었다. 따라서, FIX Gla 종의 조성물이 실험자에 의해 바람직한 방식으로 제조될 수 있다.

실시예 7: FX의 다른 감마-카르복실화된 종의 정제 및 분석.

FX 활성화 펩티드가 피브리노펩티드 A 활성화 펩티드(DFLAEGGGVR)로 교환되고 HPC4 태그가 C-말단 (DQVDPRLIDGK)에 첨가된 재조합체 사람 FX 구조물에 대해 다른 감마 카르복실화된 형태들의 분리를 위해 음이온교환 크로마토그래피를 사용하였다. 사용된 방법은 SOURCE 15Q 컬럼(GE Healthcare)을 사용하였고 베드 부피가 1.7 ml, 유속이 0.75 ml/min 그리고 온도가 4℃이었다.

컬럼에 로딩된 샘플("로딩 샘플")은 상기 FX 구조물이었다. 전체 대략 2.5 mg을 로딩하였다. 로딩 샘플을 0.1 M NaOH를 사용하여 pH 8.0으로 조절하였다.

사용된 완충액은 다음과 같았다:

평형 완충액: 20 mM Tris/NaOH, pH 8.0

용리 완충액: 20 mM Tris/HCl, 1.0 M 아세트산 암모늄, pH 8.0

CIP: 1 M NaOH

음이온교환 크로마토그래피 과정은 다음과 같았다.

단계 완충액 CV %-용리 완충액

평형화 평형 완충액 5 0%

적용

세척 평형 완충액 5 0%

용리 용리 완충액 100 0-100 % (기울기)

용리 용리 완충액 5 100% (등용매)

CIP1 NaOH 5 0%

CIP2 용리 완충액 10 100% (등용매)

재평형화 평형 완충액 10 0%

이 음이온 교환 크로마토그래피의 결과를 도 13에 나타낸다.

개개 분획들의 Gla 함량 분석을 실시예 2에 기술된 바와 같이 Agilent HPLC 시스템을 사용하여 수행하였다.

분획 분석에 기초하여, 상기한 바와 같이 음이온교환 크로마토그래피를 사용하기 전과 후에 분리된 FX Gla 종의 분포의 비교를 이하의 표에 나타내었다.

Gla 종 (%)	분리 전 (로딩 샘플)	분리 후	pdFX
Gla#8 및 그 이하	3	-	-
Gla#9	30	-	-
Gla#10	42	59	40
Gla#11	25	41	43

따라서, 증가된 양의 Gla#10 및 Gla#11를 갖는 FX 구조물의 조성물이 제조되었다.

Claims (14)

1. 다른 감마-카르복시글루탐산 함량들을 갖는 폴리펩티드의 종들의 혼합물을 포함하는 샘플로부터 원하는 함량의 감마-카르복시글루탐산을 갖는 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은
   (a) 상기 샘플을 음이온교환 크로마토그래피 재료 상에 로딩하는 단계;
   (b) 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 및 아세트산 나트륨으로부터 선택된 적어도 하나의 염을 포함하는, pH 9.0 미만의 pH에서의 용액을 사용하여 상기 폴리펩티드를 용리하는 단계;
   (c) 상기 용리로부터 얻어진 분획을, 분획에서의 폴리펩티드가 감마-카르복시글루탐산의 원하는 함량을 갖는 것을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   (a) 음이온교환 재료를 9.0 미만의 pH에서의 완충액으로 평형화시키는 단계;
   (b) 상기 샘플을 음이온교환 재료 상에 로딩하는 단계;
   (c) 선택적으로 음이온교환 재료를 9.0 미만의 pH에서의 완충액으로 세척하는 단계;
   (d) 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 및 아세트산 나트륨으로부터 선택된 적어도 하나의 염을 포함하는, 9.0 미만의 pH에서의 용액을 사용하여 음이온교환 재료로부터 상기 폴리펩티드를 용리하는 단계; 및
   (e) 상기 용리로부터 얻어진 분획을, 분획에서의 폴리펩티드가 감마-카르복시글루탐산의 원하는 함량을 갖는 것을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 정제할 폴리펩티드는 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 X, 프로트롬빈, 단백질-S, 단백질-C, 단백질 Z, 오스테오칼신, 매트릭스-gla-단백질, 성장 정지 특이적-6(Growth arrest-specific-6), 프롤린-풍부-Gla-1, 프롤린-풍부-Gla-2, 프롤린-풍부-Gla-3 및 프롤린-풍부-Gla-4로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 폴리펩티드는 인자 IX인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 방법은 정제되는 샘플에서 인자 IX의 #1-11-Gla 및/또는 #1-12-Gla 형태들의 비율과 비교하여 인자 IX의 #1-11-Gla 및/또는 #1-12-Gla 형태들의 비율에서의 증가를 갖는 상기 용리로부터 얻어진 분획을 선별하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 4 항에 있어서, 상기 방법은 정제되는 샘플에서 인자 IX의 #1-10-Gla 형태의 비율과 비교하여 인자 IX의 #1-10-Gla 형태의 비율에서의 감소를 갖는 상기 용리로부터 얻어진 분획을 선별하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 3 항에 있어서, 폴리펩티드는 인자 VII 또는 인자 VIIa인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 방법은 정제되는 샘플에서 인자 VII 또는 인자 VIIa의 #1-10-Gla 및/또는 #1-11-Gla 형태들의 비율과 비교하여 인자 VII 또는 인자 VIIa의 #1-10-Gla 및/또는 #1-11-Gla 형태들의 비율에서의 증가를 갖는 상기 용리로부터 얻은 분획을 선별하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 7 항에 있어서, 상기 방법은 정제되는 샘플에서 인자 VII 또는 인자 VIIa의 #1-9-Gla 형태의 비율과 비교하여 인자 VII 또는 인자 VIIa의 #1-9-Gla 형태의 비율에서의 감소를 갖는 상기 용리로부터 얻어진 분획을 선별하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리 완충액은 5.0 내지 8.5의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 또는 아세트산 나트륨은 0.1M 내지 2.0M로 용리 완충액에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 아세트산 암모늄, 염화 암모늄 또는 아세트산 나트륨은 약 0.6 M로 용리 완충액에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온교환 크로마토그래피는 5.0 내지 8.5의 pH에서의 평형 완충액을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 얻은 폴리펩티드 조제물.

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