CN102239175A

CN102239175A - 多肽的纯化

Info

Publication number: CN102239175A
Application number: CN2009801490787A
Authority: CN
Inventors: J·R·布杰克
Original assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Current assignee: Novo Nordisk Health Care AG; Novo Nordisk AS
Priority date: 2008-12-02
Filing date: 2009-12-01
Publication date: 2011-11-09
Also published as: KR101821143B1; MX2011005474A; AU2009324204A1; JP2012510500A; ES2576109T3; EP2373677A1; JP5788803B2; KR20110099251A; WO2010063717A1; EP2373677B1; AU2009324204B2; CA2742246A1; RU2544860C2; BRPI0922716A2; US20110287518A1; RU2011125656A

Abstract

本发明涉及使用离子交换色谱纯化不同的γ羧基化形式的多肽。具体地，本发明提供了从包含具有不同含量的γ羧基谷氨酸的多肽种类的混合物的样品中纯化具有想要的含量的γ羧基谷氨酸的所述多肽的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将所述样品装载至阴离子交换色谱材料之上；(b)使用pH小于9.0的包含至少一种选自乙酸铵、氯化铵和乙酸钠的盐的溶液来洗脱所述多肽；和(c)选择从所述洗脱获得的级分，其中所述级分中的多肽具有想要的含量的γ羧基谷氨酸。

Description

多肽的纯化

技术领域

本发明涉及多肽的纯化。特别地，本发明涉及使用离子交换色谱的方法，通过该方法可以纯化不同的γ羧基化形式的多肽。

背景技术

γ-羧基谷氨酸(Gla)是与钙结合的独特的氨基酸。其是谷氨酸(Glu，glutamic acid)的修饰的形式，并且可以在体内通过谷氨酸残基的翻译后修饰而产生。按照这种方式进行谷氨酸的羧基化能够实现与钙的结合并且允许蛋白例如前凝血剂和抗凝剂与磷脂结合。这种酶介导的反应被称作γ-羧基化(伽马羧基化)，其需要维生素K作为辅因子。

一些成熟蛋白含有富含已经通过这种方式被转化为γ羧基谷氨酸的氨基酸的结构域。其被称作GLA结构域。这种GLA结构域通常负责钙离子与蛋白的高亲和性结合。此类GLA结构域可以存在于多种不同的蛋白中。例如，凝血因子VII、IX和X以及凝血酶原都包含含有多个Gla氨基酸残基的GLA结构域。

发明内容

本发明人发现可以分离或纯化不同种类的多肽，其中所述的不同种类的区别在于γ羧基化的量，或它们所包含的γ羧基谷氨酸残基的数目。本发明尤其解决了具有不同含量的γ羧基谷氨酸的多肽种类的色谱分离。

因此，本发明提供了从包含具有不同含量的γ羧基谷氨酸的多肽种类的混合物的样品中纯化具有想要的含量的γ羧基谷氨酸的所述多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将所述样品装载至阴离子交换色谱材料之上；

(b)使用pH小于9.0的包含至少一种选自乙酸铵、氯化铵和乙酸钠的盐的溶液来洗脱所述多肽；

(c)选择从所述洗脱获得的级分，其中所述级分中的多肽具有想要的含量的γ羧基谷氨酸。

优选方法包括以下步骤：

(a)以pH小于9.0的缓冲液平衡阴离子交换材料；

(b)将所述样品装载至所述阴离子交换材料之上；

(c)任选地以pH小于9.0的缓冲液洗涤所述阴离子交换材料；

(d)使用pH小于9.0的包含至少一种选自乙酸铵、氯化铵和乙酸钠的盐的溶液从阴离子交换材料洗脱所述多肽；和

(e)选择从所述洗脱获得的级分，其中所述级分中的多肽具有想要的含量的γ羧基谷氨酸。

适合以这种方式纯化的多肽包括因子IX、因子VII、因子VIIa、因子X、凝血酶原、蛋白-S、蛋白-C、蛋白Z、骨钙蛋白、基质(Matrix)-gla-蛋白、生长抑制特异性-6、富含脯氨酸的Gla-1、富含脯氨酸的Gla-2、富含脯氨酸的Gla-3和富含脯氨酸的Gla-4。在优选方法中，所述多肽是因子IX、因子X、因子VII或因子VIIa。

当所述多肽是因子IX时，该方法可以包括：选择从所述洗脱获得的级分，其中相较于被纯化的样品中#1-11-Gla和/或#1-12-Gla形式的因子IX的比例，所述级分中#1-11-Gla和/或#1-12-Gla形式的因子IX的比例有所增加。

当所述多肽是因子X或因子VII时，所述方法可以包括：选择从所述洗脱获得的级分，其中相较于被纯化的样品中#1-10-Gla和/或#1-11-Gla形式的因子X或因子VII的比例，所述级分中#1-10-Gla和/或#1-11-Gla形式的因子X或因子VII的比例有所增加。

当所述多肽是因子IX时，该方法可以包括：选择从所述洗脱获得的级分，其中相较于被纯化的样品中#1-10-Gla形式的因子IX的比例，所述级分中#1-10-Gla形式的因子IX的比例有所降低。

当所述多肽是因子X或因子VII时，所述方法可以包括：选择从所述洗脱获得的级分，其中相较于被纯化的样品中#1-9-Gla形式的因子X或因子VII的比例，所述级分中#1-9-Gla形式的因子X或因子VII的比例有所降低。

在本发明的方法中，可以应用下列一项或多项：

—洗脱缓冲液的pH可以是5.0-8.5；

—乙酸铵、氯化铵或乙酸钠可以以0.1M-2.0M、优选约0.6M的浓度存在于洗脱缓冲液中；

—离子交换色谱可以使用pH为5.0-8.5的平衡缓冲液。本发明还延伸至通过如本文描述的方法获得的多肽制剂，即其中一种或多种种类的多肽的量被改变的制剂，其中所述种类的区别在于γ羧基化的程度或它们包含的γ羧基谷氨酸残基的数目。

附图说明

图1A显示了人类因子IX的初级结构，其中标示出了亚结构域。GLA结构域位于氨基酸1-46，EGF1结构域位于氨基酸47-83，EGF2结构域位于氨基酸84-124，活化肽位于氨基酸146-180，蛋白酶结构域位于氨基酸181-415。Gla结构域中的潜在会经历γ羧基化的12个氨基酸被标示为“γ”，其位置为氨基酸7、8、15、17、20、21、26、27、30、33、36和40。

图1B显示了人类因子VII、因子IX和因子X多肽的氨基酸序列的一部分的比对。这些比对来自这些多肽中的每一个的GLA结构域，其中以*显示了Gla残基的位置。

图2显示了从如实施例2描述的rhFIX的样品的阴离子交换色谱获得的色谱图。图3显示了图2的局部放大。

图4显示了在实施例2的阴离子交换色谱分离之前和之后的Gla种类的分布的分析。之前＝用作实施例2中的“加样”的rhFIX的样品中Gla种类的分布。该样品已经过免疫亲和捕捉的纯化，以产生纯度大于95％的rhFIX的样品。

图5显示了从如实施例3描述的rhFIX的样品的阴离子交换色谱获得的色谱图。图6显示了图5的局部放大。

图7显示了从如实施例4描述的FVII的样品的阴离子交换色谱获得的色谱图。图8显示了图7的局部放大。

图9显示了从如实施例5描述的rhFIX的样品的阴离子交换色谱获得的色谱图。图10显示了图9的局部放大。

图11显示了从如实施例6描述的rhFIX的样品的阴离子交换色谱获得的色谱图。图12显示了图11的局部放大。

图13显示了从如实施例7描述的FX的样品的阴离子交换色谱获得的色谱图。

具体实施方式

本发明源于以下发现：具有不同水平的γ羧基化的多肽种类可以具有不同水平的活性，并且可以使用离子交换色谱来纯化或分离这样的不同种类。通过增加样品中活性更高的多肽种类的比例和/或通过降低活性较低或无活性的多肽种类的比例，结果可以产生具有增强的比活性的纯化的制剂。

“多肽”在本文中以其最宽的含义使用，其是指两个或更多个亚单元氨基酸、氨基酸类似物或其它拟肽(peptidomimetics)的化合物。因此，术语“多肽”包括短的肽序列并且也包括较长的多肽和蛋白。如本文使用的术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体以及氨基酸类似物和拟肽。“成熟的”蛋白是已经经历翻译后加工例如羧基化、糖基化或前肽区域(例如靶向序列)的切割的多肽。因此，成熟蛋白形式的本发明的多肽可以已经经历γ羧基化，并且在其翻译的序列中可以具有一个或多个被转化为Gla的Glu残基。

本文描述的方法可用于纯化任意多肽，所述多肽是γ羧基化的或者可以是γ羧基化的。

用于本发明的方法的多肽可以是包含一个或多个γ羧基谷氨酸残基的多肽。可以通过研究该多肽的氨基酸序列并确定是否存在Gla来鉴定此类多肽。

多种包含γ羧基谷氨酸的多肽是已知的。多种血液凝块和调节蛋白中包含Gla残基，所述蛋白包括凝血酶原、因子VII(包括因子VIIa)、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。这些蛋白可以在GLA结构域中包含10-12个γ羧基谷氨酸残基，它们位于成熟蛋白的N-末端的前40个残基内。骨蛋白例如骨钙蛋白和基质Gla蛋白和其它的哺乳动物维生素K依赖性蛋白，例如生长抑制特异性-6(Gas6)、蛋白Z、富含脯氨酸的Gla-1(PRGP1)、富含脯氨酸的Gla-2(PRGP2)、富含脯氨酸的Gla-3(PRGP3)和富含脯氨酸的Gla-4(PRGP4)也包含多个Gla残基。发现在非哺乳动物蛋白例如芋螺肽(conopeptide)芋螺抑制肽G和芋螺抑制肽T中也存在γ羧基谷氨酸残基。任意这些多肽都可以根据本发明进行纯化。

用于本发明的方法的多肽可以是这样的多肽，即所述多肽可以经过翻译后修饰以包括一个或多个γ羧基谷氨酸残基。例如，可以通过多肽中谷氨酸残基的γ羧基化而产生此类残基。因此，多肽的氨基酸序列可以包含一个或多个谷氨酸(Glu)残基。可以通过这种方式进行翻译后修饰的多肽可以是天然存在的多肽。此类多肽可以源自任意合适的生物。例如，所述多肽可以是天然存在的哺乳动物多肽，例如啮齿类、灵长类、猫、狗、绵羊、牛、猪或其它哺乳动物多肽。优选地，所述多肽是小鼠、大鼠或人类多肽。最优选地，所述多肽是人类多肽。所述多肽可以源自非哺乳动物物种。例如，一些芋螺毒素可以包含γ羧基谷氨酸(glutamate)。因此，所述多肽可以是天然存在的来自软体动物例如腹足动物的多肽。所述腹足动物可以是蜗牛，例如芋螺(cone snail)。能以这种方式进行翻译后修饰的多肽可以是天然存在的多肽的变体，例如上文所讨论的已知的γ羧基化的蛋白中的一种的变体，人工产生的多肽，例如合成的多肽或重组产生的突变体或变体蛋白。

所述多肽可以是具有GLA结构域的多肽。GLA结构域是包含多个谷氨酸(Glu)残基的翻译后修饰以形成γ羧基谷氨酸(Gla)的蛋白结构域。这些Gla残基一般位于多肽的单一的区域或结构域内。这通常位于多肽或成熟蛋白的N-末端。

例如，图1A显示了人类因子IX蛋白的初级结构。该蛋白包括位于氨基酸1-46的GLA结构域。该结构域包括12个氨基酸残基，它们可以从谷氨酸被修饰为Gla。这些氨基酸位于位置7、8、15、17、20、21、26、27、30、33、36和40。因此其能够包含最多12个Gla残基。因此，根据本发明进行纯化的多肽可以是因子IX。图1B显示了基于人类因子VII、IX和X蛋白的Gla结构域的比对。在每个序列中，可以从谷氨酸被修饰为Gla的氨基酸残基的位置被标记为*。因此，根据本发明进行纯化的多肽可以是因子VII或因子X。

用于本发明的多肽可以包含来自已知的γ羧基化蛋白的GLA结构域，例如来自因子IX、因子VI或因子X的GLA结构域，或来自如上文讨论的任意其它已知的γ羧基化蛋白例如来自另一种凝血因子的GLA结构域。

用于本发明的方法的多肽可以是包含或能够包含一个或多个γ羧基谷氨酸残基的多肽。例如，所述多肽可以包含或能够包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个Gla残基。优选地，所述多肽包含或能够包含1个以上的Gla残基，例如1个以上，2个以上，5个以上或9个以上Gla残基。所述多肽可以包含或能够包含最多10个、最多12个、最多15个或最多20个Gla残基。如下文所讨论，本发明的方法允许纯化具有不同水平的γ羧基化的多肽的不同分子种类。此处所称的数目是可以存在于该多肽中的Gla残基的总数目。也就是说，如果该多肽是完全γ羧基化的，这些数目表示存在的Gla残基的数目。例如，当γ羧基化发生于GLA结构域中时，这些数目是指该GLA结构域中可能发生γ羧基化的位点的总数目，例如翻译的多肽中的Glu残基的总数目，或可以通过酶例如γ-谷氨酰羧化酶产生的Gla残基的最大数目。也可以存在相同多肽的其它种类，其中存在比该最大数目少的γ羧基谷氨酸残基。

因此，多肽可以在其翻译的氨基酸序列的N-末端40个残基中包含多个Glu残基。例如，表达的多肽的氨基酸序列可以在最接近多肽的N末端的40个氨基酸中或者在最接近成熟蛋白的N末端的40个氨基酸中包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个Glu残基。

可以使用酶来实现γ羧基化。已知此类γ-谷氨酰羧化酶在体内参与很多多肽的γ羧基化。γ-谷氨酰羧化酶是内质酶，其催化多种维生素K依赖性凝血因子的GLA结构域中的Glu通过翻译后修饰被转化为Gla。因此可以通过测定它们是否被γ-谷氨酰羧化酶γ羧基化来鉴定用于本发明的多肽。

相信γ-谷氨酰羧化酶通过待羧基化的谷氨酸残基的氨基末端一侧的序列模体而与其底物蛋白结合。然后该酶可以使该区域中的多个谷氨酸残基(例如，GLA结构域中的所有谷氨酸残基)羧基化，然后释放所述底物。因此，用于本发明的多肽可以包含被γ-谷氨酰羧化酶或其它能够进行γ羧基化的酶识别的模体或位点。这种识别位点可以位于多肽的N-末端区域，例如，最接近所翻译的多肽的N末端或最接近将成为成熟蛋白的N末端的蛋白的18、19、20、21、22、23、24、25、30、35或40个氨基酸内。这种识别位点可以位于待羧基化的谷氨酸残基的氨基末端一侧。例如，在很多天然存在的γ羧基化蛋白中，γ-谷氨酰羧化酶识别前肽区域中的位点并与其结合。然后在翻译后加工过程中从多肽的其余部分切除该区域。因此，成熟蛋白中可以不含γ-谷氨酰羧化酶识别位点。

在凝血酶原和因子IX中，参与识别γ-谷氨酰羧化酶的位点是由残基-18、-17、-15、-15和-10确定的。类似的识别位点存在于其它γ羧基化蛋白中。位置-16处的苯丙氨酸和位置-10处的丙氨酸在羧基化酶底物的前肽中是高度保守的，如同脂肪族残基，例如位置-17和-15处的异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸。位置-16处的亮氨酸、缬氨酸或赖氨酸也可以支持羧基化。用于本发明的多肽可以包含来自已知的γ羧基化蛋白的γ羧基化识别位点，例如来自因子IX、因子X、因子VII的γ羧基化识别位点，或来自如上文讨论的任意其它已知的γ羧基化蛋白的γ羧基化识别位点。例如，来自任意此类蛋白的前肽区(其包含γ羧基化识别位点)可以存在于翻译的多肽的N末端，以允许通过γ-谷氨酰羧化酶进行多肽的合适的翻译后加工。

能够被γ羧基化的多肽优选满足以下标准之一或二者：

(1)该多肽包含γ羧基化识别位点；和

(2)在γ羧基化识别位点的40个残基内存在谷氨酸残基。

相信γ-谷氨酰羧化酶在糙面内质网中是有活性的。对于被该酶γ羧基化的多肽，多肽优选穿过表达γ-谷氨酰羧化酶的细胞的糙面内质网。因此，多肽可以包含允许将新合成的多肽运输通过糙面内质网的序列。能够将多肽靶向内质网的信号序列是熟知的。此类信号序列经常存在于多肽的氨基末端，长度可以是16-30个氨基酸，并且可以包含4-12个疏水性残基。此类信号肽一般通过信号肽酶从多肽分子上被切除，所以不存在于成熟蛋白中。

为了进行多肽的γ羧基化，优选在细胞内表达多肽。可以通过在此类细胞中的表达来合成用于本发明的多肽。优选地，表达多肽的细胞包括允许进行多肽的γ羧基化的必要的细胞机制(cellular machinery)。例如，细胞可以表达γ-谷氨酰羧化酶。优选地，用于合成蛋白的细胞具有与糙面内质网结合的γ-谷氨酰羧化酶。可以在存在酶的辅因子例如维生素K的情况下培养细胞。优选地，用于合成蛋白的细胞包含细胞内的维生素K。

可以通过在此类细胞中表达并测定是否发生γ羧基化来鉴定能够被γ羧基化的多肽。例如，可以在如本文描述的细胞中表达多肽，并通过例如使用如上文描述的信号肽将其靶向此类细胞的糙面内质网。通过在此类细胞中表达多肽并测定所表达的和翻译后加工的多肽是否包含Gla残基，可以鉴定能够被γ羧基化的多肽。

本发明的方法包括从具有不同程度的γ羧基化的多肽的其它种类中纯化一种或多种多肽种类。当某多肽可以在不止一个位点被γ羧基化时，可以存在该多肽的不同种类，其中存在不同数目的γ羧基谷氨酸氨基酸残基，或者其中在该多肽分子的不同的可能位置处存在γ羧基谷氨酸残基。

例如，一些种类的多肽可以被完全γ羧基化。即，γ羧基化可以将该多肽内所有可能的残基(例如GLA结构域中的所有Glu残基)处的谷氨酸都转化为γ羧基谷氨酸。其它种类的多肽可以是部分γ羧基化的。即，γ羧基化可以将该多肽内的一些但非所有可能的残基(例如GLA结构域内的一些但非所有Glu残基)处的谷氨酸转化为γ羧基谷氨酸。

可以鉴定多种不同的部分γ脱羧基化的种类。可以按照多种方式对这些种类进行分类。例如，可以通过“多肽中哪个残基被γ脱羧基化”或通过“存在于多肽中的γ羧基谷氨酸的氨基酸总数目”来确定γ脱羧基化的水平。后者的分类的意思可以是，基于它们包含的γ羧基谷氨酸残基的总数目，一起考虑多肽的多个结构上不同的分子种类。例如，这样的多肽种类：其中除了一个γ羧基谷氨酸残基之外的所有可能的γ羧基谷氨酸残基都存在，则该多肽可以包含多肽的多个不同亚类，其中在可能被γ羧基化的不同位置处保留了谷氨酸。

由于γ谷氨酰羧化酶的作用机理，γ羧基化一般起始于最接近γ羧基化识别位点的Glu残基，并且向远离多肽的N末端的方向进行。当多肽未被完全γ羧基化时，这一般是由于：在最远端的Glu残基被转化之前，γ羧基化被阻断，或者酶从多肽中被释放出来。在部分γ羧基化的多肽中，一般是距离γ羧基化结合位点最远或者距离蛋白的N末端最远的Glu残基未被γ羧基化。

例如，如图1所示，人类因子IX包括最多12个γ羧基谷氨酸残基。存在的实际Gla残基数在不同的多肽分子中是不同的，这取决于该分子通过γ羧基化所进行的翻译后修饰的程度。这意味着人类因子IX的样品可以包含完全γ脱羧基化的因子IX的种类，即，具有所有12个可能的γ羧基谷氨酸残基(#1-12Gla)。

其还可以包含一个或多个种类的因子IX，其具有可能的12个γ羧基谷氨酸残基中的11个。在这些之中，最可能的情形是：最接近多肽的N末端的11个Glu残基被转化为Gla，但是在如图1所示的位置40处的第12个Glu残基仍然保持为Glu。因此，在这种情况下，只有Glu残基1-11被转化为Gla(#1-11Gla)。

其还可以包含一个或多个种类的因子IX，其具有可能的12个γ羧基谷氨酸残基中的10个。在这些之中，最可能的情形是：最接近多肽的N末端的10个Glu残基被转化为Gla，但是在如图1所示的位置36和40处的第11个和第12个Glu残基仍然保持为Glu。因此，在这种情况下，只有Glu残基1-10被转化为Gla(#1-10Gla)。

其还可以包含一个或多个种类的因子IX，其具有可能的12个γ羧基谷氨酸残基中的9个，例如#1-9Gla。其还可以包含一个或多个种类的因子IX，其具有可能的12个γ羧基谷氨酸残基中的小于9个，例如8、7、6、5、4、3、2、1个，或一个都没有。

本发明提供了用于纯化此种多肽种类的方法。特别地，可以相对于样品中的多肽的其它种类纯化多肽的某个种类。因此，本发明的方法可以引起感兴趣的种类在多肽样品中的相对比例增大。这可以通过从该样品中除掉多肽的一个或多个不同种类，由此增加从感兴趣的种类形成的多肽(作为一个整体)的比例来实现。这可以通过从样品中特异性除掉一个或多个特定种类来实现，通过从样品中除掉一个或多个不是感兴趣的种类的种类来实现，或通过除掉感兴趣的种类在其中所占比例小于在原始样品中的比例的样品级分来实现。这些方法中的任意项可以引起感兴趣的种类的比例的总体上的增加。因此，本发明的方法可以引起包含多肽的不同种类的混合物的样品中特定的多肽种类的比例的增加或降低。

多肽种类的比例的增加可以是：作为一个整体该种类在多肽样品中的比例增加至多5％，至多10％，至多20％，至多30％或更高。多肽种类的比例的降低可以是：作为一个整体该种类在多肽样品中的比例降低至多5％，至多10％，至多20％，至多30％，至多50％，至多70％，至多90％或更高。多肽种类的比例的降低可以是：相对于存在于原始样品中的量而言，存在的该种类的量下降至多5％，至多10％，至多20％，至多30％，至多50％，至多70％，至多90％或更高。多肽种类的比例的降低可以是从样品中基本上或完全除掉该种类。例如，本发明的方法可以通过从样品中除掉所有的或基本上所有的可检测的特定种类的多肽而纯化多肽样品。样品中剩余的该种类的量可以低于原始样品中存在的量的10％，低于5％，低于2％或低于1％。

因此，本发明的方法的目的是允许改变多肽样品中不同种类的相对比例。不同的种类可以具有不同性质或不同活性。通过改变多肽样品中此种类的量或比例，作为一个整体的样品的性质或活性可以被改变。例如，当不同种类的多肽具有不同水平的活性时，通过改变不同种类的比例以增加具有较高水平活性的种类的比例，和/或通过降低具有较低活性或无活性的种类的比例，可以增加该样品的比活性，例如每个多肽分子的平均活性，或那些量的多肽具有的最大可能活性的百分率。

例如，已经发现重组产生的人类因子IX(rhFIX)显示出约50％的比活性。此样品的分级分离(fractionization)显示：其包含具有主要是#1-8-、#1-9-、#1-10-#1-11-和#1-12-Gla的各个rhFIX种类。已经发现：#1-11-和#1-12-Gla在凝固测验和两阶段活性测验中是完全有活性的。#1-8-、#1-9-和#1-10-Gla种类显示出活性下降至约2-5％、14-22％和27-36％，这取决于所用的测验。

因此可以看出，不同种类的rhFIX(其区别仅在于它们γ羧基化程度的不同)显示出不同水平的活性。预期具有较高比例的#1-11-和/或#1-12-Gla的样品将显示出比具有较低比例的这些种类的样品更高的比活性。预期具有较高比例的#1-8-和/或#1-9-和/或#1-10-Gla的样品将显示出比具有较低比例的这些种类的样品更低的比活性。

因此，可以通过改变样品中这些种类的比例来改变因子IX样品的总体比活性。在这种情况下，可以预测：可以通过下列一项或多项来增加因子IX的样品的总体比活性：

—增加样品中#1-12-Gla的比例；

—增加样品中#1-11-Gla的比例；

—降低样品中#1-10-Gla的比例；

—降低样品中#1-9-Gla的比例；

—降低样品中#1-8-Gla的比例；

—降低样品中#1-7-Gla的比例；

—降低样品中#1-6-Gla的比例；

—降低样品中#1-5-Gla的比例；

—降低样品中#1-4-Gla的比例；

—降低样品中#1-3-Gla的比例；

—降低样品中#1-2-Gla的比例；和

—降低样品中#1-1-Gla的比例。

当根据本发明纯化因子IX的样品时，可以选择这些变化中的任一项或多项。

优选的因子IX样品将仅包含#1-11-Gla和#1-12-Gla，并且将不含或基本上不含具有比这低的γ羧基化程度的种类，例如#1-10-、#1-9-和#1-8-Gla种类。

该方法可适用于现有的hFIX的成分。例如，如本文所解释，发现用于实施例2的hFIX具有45.6％#1-12-Gla、36.0％#1-11-Gla、13.6％#1-10-Gla、3.3％#1-9-Gla和1.6％#1-8-Gla。rhFIX可以通过商业渠道从Wyeth获得，其商标是BenefixBenefix

中#1-10-、#1-11-和#1-12-Gla的含量分别是约8-10％、25-31％和60-67％。可以看出本文描述的方法可用于增加此类成分中#1-11-Gla和/或#1-12-Gla的比例。本文描述的方法可用于降低此类制剂中γ羧基化程度较低的种类例如#1-10-Gla、#1-9-Gla和#1-8-Gla的比例。预期这将会改善此类制剂中hFIX的比活性。

类似的方法可用于其它的含有Gla的多肽。例如，因子VII和因子X可以包括至多11个Gla残基。如图4所示，本发明的方法可用于改变例如#1-9-、#1-10-或#1-11-因子VII的比例。因此，本文描述的方法可用于改变因子VII的不同种类的比例(基于它们的Gla含量)。例如，本文描述的方法可用于增加此类成分中#1-10-Gla和/或#1-11-Gla的比例。本文描述的方法可用于降低此类成分中的γ羧基化程度较低的种类例如#1-9-Gla和更低的种类的比例。

类似地，实施例7显示了可以根据本发明的方法处理包含因子X的多个种类的制剂，以改变因子X的包含Gla的不同种类的比例。通过在阴离子交换色谱中选择合适的级分，可以选择包含不同比例的不同Gla种类的样品。例如，从实施例7中可以看出，本文描述的方法可用于增加此类成分中#1-10-Gla和/或#1-11-Gla的比例。本文描述的方法可用于降低γ羧基化程度较低的种类例如#1-9-Gla和更低的种类的比例。

因此，本发明提供了允许从相同多肽的其它种类中纯化多肽种类的方法，其中所述种类的区别在于其γ羧基化程度不同，或者它们的氨基酸序列中Gla残基的数目不同。

本发明的方法使用阴离子交换色谱。本发明特别涉及这样的方法：其中感兴趣的多肽结合至阴离子交换材料，并且使用包含乙酸铵、氯化铵或乙酸钠的缓冲液从阴离子交换材料中洗脱多肽。

阴离子交换材料是带正电的离子交换材料。因此，其具有可以与穿过或通过该阴离子交换材料的水溶液中的阴离子进行交换的游离阴离子。可以通过将一个或多个带电的配体结合至固相来提供电荷，或者，电荷可以是固相的固有性质。所述固相可以是例如，纯化柱、颗粒或珠子、膜或滤器。一般而言，阴离子交换树脂可用于纯化具有小于约7的pI的多肽。可用于本文的商业上可获得的阴离子交换材料包括，例如，Q Sepharose FastFlow、Macroprep 25Q、Poros HQ50、Source 30Q、Source 15Q、Mini Q、Mono Q，优选Mini Q、Mono Q、Capto Q、Q Sepharose HP、Toyopearl QAE550C、Unosphere Q、DEAE Sepharose FF、Fratoprep DEAE和Q HyperD 20。

阴离子交换材料可以使用强的阴离子交换基团，例如季胺。阴离子交换材料可以使用弱的阴离子交换基团，例如二乙氨基乙基(DEAE)。技术人员可以根据例如待纯化的特定多肽来选择合适的阴离子交换材料。

可以根据待纯化的特定多肽和所用的条件例如pH、缓冲液、离子强度等来选择阴离子交换材料。

常规的阴离子交换色谱纯化过程通常由选自下列的一个或多个步骤组成：阴离子交换材料的平衡、加样或装载样品、一个或多个洗涤步骤、洗脱和离子交换材料的再生。用于离子交换色谱的标准方法可以见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences。

优选在装载感兴趣的多肽之前平衡阴离子交换树脂。该平衡步骤的目的是将阴离子交换材料的状况调整至更加接近用于该方法的随后步骤的状况。为了避免色谱过程中流动相的成分的改变，应该将阴离子交换材料平衡至起始缓冲液的pH和离子组成(例如，导电性、缓冲液组成)。例如，可以将平衡缓冲液的离子强度(例如导电性、pH)选择为尽可能类似于用于该方法的后续步骤的缓冲液的离子强度，例如用于装载多肽的缓冲液和/或洗涤缓冲液的离子强度。

因此，可以使用接近于后续步骤中使用的缓冲液或制剂的缓冲液来平衡阴离子交换材料。例如，对于阴离子交换材料的平衡和样品的装载，可以使用相同的缓冲液。对于阴离子交换材料的平衡和样品装载后阴离子交换材料的洗涤，可以使用相同的缓冲液。平衡缓冲液的pH可以与装载制剂和/或洗涤缓冲液相同。平衡缓冲液的导电性可以与装载制剂和/或洗涤缓冲液相同。平衡缓冲液使用的缓冲物质可以与装载制剂和/或洗涤缓冲液相同。平衡缓冲液的缓冲物质的浓度可以与装载制剂和/或洗涤缓冲液相同。平衡缓冲液可以含有同样也存在于装载制剂和/或洗涤缓冲液中的另外的成分，例如洗涤剂。

可以根据待纯化的特定多肽来确定平衡缓冲液的pH。例如，对于多种多肽例如因子IX而言，9.0或更高的pH不是最佳的，因为在这些pH值时可以观察到这些多肽的自动活化和/或降解。

用于本发明的平衡缓冲液可以配制为例如pH为约5.0至约8.5，例如pH5.0至pH8.5。平衡缓冲液的pH可以是大于约5.0，大于约5.5，大于约6.0，大于约6.5，大于约7.0，大于约7.5或大于约8.0。平衡缓冲液的pH可以是小于约8.5，小于约8.0，小于约7.5，小于约7.0，小于约6.5，小于约6.0或小于约5.5。可以组合这些端点的任意组合。例如，平衡缓冲液的pH可以是大于约7.0和小于约8.5。pH可以是例如约pH7.0、7.5、8.0或8.5。

这些pH值可以适用于用来纯化如本文描述的多肽例如因子IX、因子VII或因子X的阴离子交换材料的平衡。

用于平衡缓冲液的合适的组分可以包括缓冲物质，例如Tris、磷酸盐、MES、Hepes或碳酸盐。对于阴离子交换色谱方法，优选阳性缓冲离子例如Tris。此类缓冲物质可用于将平衡缓冲液维持在如上所述的pH。在一个实施方式中，在整个阴离子交换色谱程序过程中使用相同的缓冲物质和缓冲物质浓度。例如，平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液可以都包含相同缓冲物质浓度的相同的缓冲物质。缓冲物质的浓度应该足以在阴离子交换程序中维持缓冲液能力和恒定的pH。例如，可以将缓冲物质和缓冲物质浓度选择为在加样和洗脱过程中维持稳定的pH和缓冲能力。合适的缓冲物质浓度可以是例如5mM-50mM，例如10mM-40mM。合适的缓冲物质浓度可以是例如5mM、10mM、15mM、20mM或25mM。

平衡缓冲液可以包含一种或多种另外的成分。平衡缓冲液可以包含添加剂，例如乙二醇、乙醇、脲或用于增强蛋白的溶解性的洗涤剂。用于阴离子交换色谱的洗涤剂应该是中性的或与阴离子交换材料具有相同的电荷。可以以例如小于1％、小于0.5％、小于0.1％或小于0.01％的浓度使用非离子型洗涤剂例如Tween 80、Tween 20或Triton X100。可以使用非缓冲盐例如NaCl来调节缓冲液的离子强度。

将包含感兴趣的多肽的样品装载至阴离子交换材料之上。这是通过在合适的条件(例如导电性和/或pH)下将样品暴露于阴离子交换材料从而将多肽固定在阴离子交换材料中或固定在阴离子交换材料上来实现的。这种固定或结合是通过多肽与阴离子交换材料的带电基团之间的离子相互作用来实现的。一般地，当与阴离子交换材料接触的流动相的离子强度降低至感兴趣的多肽的离子基团开始作为阴离子交换材料上的带电基团的反荷离子的那个点时，发生此类结合。

根据本发明的方法纯化的样品可以是包含如上所述的多肽的任意样品。优选地，所述样品包含同一多肽的多于一种的不同种类，其中所述种类的差别在于它们的γ羧基化的程度和/或位置。

如上所述，可以使用任意常规程序获得感兴趣的多肽。例如，可以从体内来源例如从动物获得多肽，或者，可以在体外例如在组织或细胞中产生多肽。可以重组产生感兴趣的多肽，例如，通过诱导多肽在细胞中的表达。例如，可以在经过编码多肽的多核苷酸转化或转染并能够表达该多肽的宿主细胞中产生感兴趣的多肽。可以在允许多肽表达的条件下培养此类宿主细胞。然后，可以从培养基或者从宿主细胞自身中回收所述多肽。

优选地，在施加到阴离子交换树脂之前对多肽进行纯化。例如，可以使多肽经历一个或多个纯化步骤，例如沉淀、免疫沉淀、等电点聚焦、过滤、离心或色谱，例如其它的阴离子交换色谱。

此类纯化可用于从样品中部分地或完全地除掉一种或多种污染物，从而增加感兴趣的多肽的纯度。所述污染物可以是除了感兴趣的多肽以外的任意分子。例如，所述污染物可以是不同的多肽、核酸或内毒素。所述污染物可以是感兴趣的多肽的变体，例如截短的或延伸的多肽，多肽的脱酰胺化形式，非正确折叠的多肽或具有不想要的糖基化的多肽形式。所述污染物可以是可能干扰离子交换色谱的分子。

优选地，感兴趣的多肽是至少75％纯的，更优选至少80％纯的，至少90％纯的或者纯度更高。最优选地，所述多肽是至少90％纯的，例如至少95％，至少97％或至少99％纯的。纯度意指由感兴趣的多肽组成的总干重的比例。样品可以包含低于25％wt的如上所述的污染物，例如低于25％wt的除了感兴趣的多肽之外的蛋白，更优选低于20％，低于10％，低于5％，低于3％或低于1％。样品可以是纯的或基本上纯的感兴趣的多肽的样品。样品可以是分离的或基本上分离的感兴趣的多肽的样品。

施加到阴离子交换材料上的此类多肽样品的形式可以是从多肽合成中直接获得的形式，例如来自重组产生该多肽的细胞的培养基的样品的形式，或表达该多肽的裂解的细胞的样品的形式。施加到阴离子交换材料上的多肽样品的形式可以是如本文描述的纯化的或部分纯化的形式。可以在施加到阴离子交换材料之前进一步配制如本文描述的样品。例如，当以固体形式提供多肽(或纯化的多肽)时，可以将其配制于液体成分中以施加至阴离子交换材料。例如，可以将其配制于水、缓冲液或另一种溶剂中。优选地，所述液体成分是含水的。当以液体或水性形式提供多肽或纯化的多肽时，或者当固体多肽样品已经配制为如上所述的液体形式时，可以在施加到阴离子交换材料之前调节样品的配制。

例如，可以使用常规方法调节样品或配制的样品的导电性和/或pH。可以将样品的pH调节为等于或基本上等于用于平衡阴离子交换材料和/或洗涤阴离子交换材料的缓冲液的pH。可以将样品的导电性调节为等于或基本上等于用于平衡阴离子交换材料和/或洗涤阴离子交换材料的缓冲液的导电性。可以使用缓冲物质配制样品，例如如上文中针对平衡缓冲液的组成而讨论的任意缓冲物质。可以在用于平衡阴离子交换材料和/或洗涤阴离子交换材料的相同缓冲液中配制样品。可以在与用于平衡阴离子交换材料和/或洗涤阴离子交换材料的缓冲液相同的缓冲物质中和/或相同的缓冲物质浓度下和/或相同的pH下和/或相同的导电性下配制样品。在一个实施方式中，就用以施加到阴离子交换材料的感兴趣的多肽而言，通过将其加入到与所用的平衡缓冲液相同的缓冲液中来配制。

然后，通过在允许多肽与阴离子交换材料结合的条件下将多肽的相关制剂通过或穿过阴离子交换材料而将所述多肽装载至离子交换材料之上。此类方法是本领域中的常规操作。

一旦将感兴趣的多肽装载至阴离子交换柱上之后，可以使该柱经历一次或多次洗涤。通过将合适的溶液穿过或通过阴离子交换材料来进行洗涤。此类洗涤的目的可以包括：除掉未与阴离子交换材料结合的任意多肽或其它成分；除掉仅与阴离子交换材料较弱结合的任意多肽或其它成分；除掉与阴离子交换材料结合的杂质，所述杂质与阴离子交换材料的亲和性小于感兴趣的多肽与阴离子交换材料的亲和性。

在一个实施方式中，将多肽装载至阴离子交换材料上之后，以缓冲液洗涤阴离子交换材料以除掉任何未结合的多肽、污染物或杂质。例如，所述洗涤缓冲液可以与配制用于装载至阴离子交换材料上的多肽的缓冲液相同或基本上相同。所述洗涤缓冲液可以与平衡缓冲液相同或基本上相同。例如，可以使用与平衡缓冲液相同的缓冲液或与用于配制多肽的缓冲液相同的缓冲液来进行洗涤。可以使用与平衡缓冲液或用于配制多肽的缓冲液具有相同或基本上相同的pH和/或相同或基本上相同的导电性的缓冲液来进行洗涤。可以使用包含与用于平衡缓冲液中的或用于配制多肽的缓冲物质相同并且浓度与其相同或基本上相同的缓冲物质的缓冲液来进行洗涤。

可替代地或另外，可以使用不同于平衡缓冲液的缓冲液来进行其它的洗涤。例如，可以从阴离子交换材料中除掉与阴离子交换材料结合但其结合弱于感兴趣的多肽的污染物。此类污染物从阴离子交换材料中的释放比感兴趣的多肽容易。例如，可以使用导电性或离子强度大于平衡缓冲液和/或装载多肽的制剂的缓冲液来洗涤阴离子交换材料。通过增加缓冲液的离子强度，可以实现从阴离子交换材料中洗脱成分。优选地，将洗涤缓冲液选择为达到基本上没有感兴趣的多肽从阴离子交换材料中被洗脱，或者以足够小的体积来使用洗涤缓冲液，以达到基本上没有感兴趣的多肽从阴离子交换材料中被洗脱。

技术人员可以根据特定样品和感兴趣的多肽的性质来选择用于洗涤的缓冲液。例如，可以选择具有特定pH或导电性的缓冲液以允许除掉那些与树脂的结合弱于感兴趣的多肽的特定多肽或杂质。可以通过简单的常规实验来选择此类缓冲液并优化其使用，例如，通过监测从柱中除掉的溶液的成分。

可以根据待纯化的特定多肽来确定洗涤缓冲液的pH。例如，对于多种多肽例如因子IX而言，等于或大于9.0的pH不是最佳的，因为在这些pH值时可以观察到多肽的自动活化和/或降解。

适用于本发明的洗涤缓冲液可以配制为例如pH为约5.0至约8.5，例如pH5.0至pH8.5。洗涤缓冲液的pH可以是大于约5.0，大于约5.5，大于约6.0，大于约6.5，大于约7.0，大于约7.5或大于约8.0。洗涤缓冲液的pH可以是低于约8.5，低于约8.0，低于约7.5，低于约7.0，低于约6.5，低于约6.0或低于约5.5。可以组合这些端点的任意组合。例如，洗涤缓冲液的pH可以是大于约7.0和低于约8.5。pH可以是例如约pH7.0、7.5、8.0或8.5。

这些pH值可以适合于用来洗涤用于纯化如本文描述的多肽例如因子IX、因子VII或因子X的阴离子交换材料。

用于洗涤缓冲液的合适的成分可以包括缓冲物质，例如Tris、磷酸盐、MES、Hepes或碳酸盐。对于阴离子交换色谱法，优选阳性缓冲离子例如Tris。此类缓冲物质可用于将洗涤缓冲液维持在如上所述的pH。合适的缓冲物质浓度可以是例如5mM-50mM，例如10mM-40mM。合适的缓冲物质浓度可以是例如5mM、10mM、15mM、20mM或25mM。

洗涤缓冲液可以包含一种或多种另外的成分。洗涤缓冲液可以包含添加剂，例如乙二醇、乙醇、脲或用于增强蛋白的溶解性的洗涤剂。用于阴离子交换色谱的洗涤剂应该是中性的或与阴离子交换材料具有相同的电荷。可以以例如小于1％、小于0.5％、小于0.1％或小于0.01％的浓度使用非离子型洗涤剂例如Tween 80、Tween 20或Triton X100。可以使用非缓冲盐例如NaCl来调节缓冲液的离子强度。

从阴离子交换材料中洗脱分子意思是从阴离子交换材料中除掉该分子。这一般是通过改变阴离子交换材料周围的缓冲液的离子强度，从而缓冲液与分子竞争与阴离子交换材料的带电基团的结合来实现的。因此，所述分子与阴离子交换材料的结合强度降低，它们就分开了。在一些情况下，还可以通过使用改变感兴趣的多肽的构象的分子、从而降低结合强度并引起多肽从阴离子交换材料中释放来实现从阴离子交换材料的洗脱。

可以根据待纯化的特定多肽来确定洗脱缓冲液的pH。例如，对于多种多肽例如因子IX而言，等于或大于9.0的pH不是最佳的，因为在这些pH值时可以观察到多肽的自动活化和/或降解。

适用于本发明的洗脱缓冲液可以配制为例如pH为约5.0至约8.5，例如pH5.0至pH8.5。洗脱缓冲液的pH可以是大于约5.0，大于约5.5，大于约6.0，大于约6.5，大于约7.0，大于约7.5或大于约8.0。洗脱缓冲液的pH可以是低于约8.5，低于约8.0，低于约7.5，低于约7.0，低于约6.5，低于约6.0或低于约5.5。可以组合这些端点的任意组合。例如，洗脱缓冲液的pH可以是大于约7.0和低于约8.5。pH可以是例如约pH7.0、7.5、8.0或8.5。

这些pH值可以适用于用来洗脱用于纯化如本文描述的多肽例如因子IX、因子VII或因子X的阴离子交换材料。

用于洗脱缓冲液的合适的成分可以包括缓冲物质，例如Tris、磷酸盐、MES、Hepes或碳酸盐。对于阴离子交换色谱法，优选阳性缓冲离子例如Tris。此类缓冲物质可用于将洗脱缓冲液维持在如上所述的pH。合适的缓冲物质浓度可以是例如5mM-50mM，例如10mM-40mM。合适的缓冲物质浓度可以是例如5mM、10mM、15mM、20mM或25mM。

洗脱缓冲液可以包含一种或多种另外的成分。洗脱缓冲液可以包含添加剂，例如乙二醇、乙醇、脲或用于增强蛋白的溶解性的洗涤剂。用于阴离子交换色谱的洗涤剂应该是中性的或与阴离子交换材料具有相同的电荷。可以以例如小于1％、小于0.5％、小于0.1％或小于0.01％的浓度使用非离子型洗涤剂例如Tween 80、Tween 20或Triton X100。可以使用非缓冲盐例如NaCl来调节缓冲液的离子强度。

为了用于本发明，洗脱缓冲液优选包含一种或多种离液盐，例如一种或多种选自乙酸铵、氯化铵和乙酸钠的盐。洗脱缓冲液中存在的离液盐例如乙酸铵、氯化铵和/或乙酸钠的浓度可以是至少0.1M，至少0.2M，至少0.5M，至少1.0M或至少1.5M。离液盐例如乙酸铵、氯化铵和/或乙酸钠的存在的浓度可以是至多2.0M，至多1.9M，至多1.5M或至多1.0M。这些下限值中的任一项可以与这些上限值中的任一项组合以形成合适的浓度范围。离液盐例如乙酸铵、氯化铵和/或乙酸钠的存在的浓度可以是至多约2.0M的任意浓度。例如，离液盐例如乙酸铵、氯化铵和/或乙酸钠的存在的浓度可以是至多约0.1，约0.2，约0.3，约0.4，约0.5，约0.6，约0.7，约0.8，约0.9，约1.0，约1.1，约1.2，约1.3，约1.4，约1.5，约1.6，约1.7，约1.8，约1.9或约2.0M，最优选的浓度是约0.6M。

在一个实施方式中，洗脱缓冲液的组成与洗涤缓冲液和/或平衡缓冲液相同，只不过洗脱缓冲液另外含有离液盐。优选的离液盐是乙酸铵、氯化铵和/或乙酸钠中的一种或多种。因此，洗脱缓冲液可以具有本文描述的用于洗涤缓冲液或平衡缓冲液的任意成分，但是可以另外包含乙酸铵、氯化铵和/或乙酸钠。

在一个实施方式中，平衡缓冲液和洗涤缓冲液是相同的，并且洗脱缓冲液与它们的区别仅在于洗脱缓冲液还包含乙酸铵、氯化铵或乙酸钠。

可以使用离液盐的等度或线性梯度来进行洗脱，例如乙酸铵、氯化铵或乙酸钠的等度或线性梯度。可以通过逐步改变缓冲液中的离液盐的浓度来进行洗脱。可以通过这些洗脱方法的任意组合来进行洗脱。例如，可以以给定浓度的离液盐进行等度洗脱，然后以梯度或一个或多个步骤的形式通过浓度渐增的盐进行洗脱。

在任意此类洗脱方法中，将会在不同的时间从阴离子交换材料中释放不同的成分，这取决于它们的结合强度。结合较弱的成分倾向于较早释放，或者在较低缓冲液导电性例如较低盐浓度时被释放。结合较强的成分倾向于在阴离子交换材料上保留较长时间或者在较高盐浓度下保持。可以监测穿过或通过阴离子交换材料的洗脱液以鉴定特定成分何时被洗脱。可以在不同的时间点汇集洗脱液，并且分析每个汇集物以确定在哪些汇集物中存在哪些成分。然后可以选择具有想要的制剂的特定汇集物，例如具有浓度增高的特定多肽种类或浓度降低的其它多肽种类的特定汇集物。

如本文描述的等度洗脱使用固定的或稳定的浓度的盐。使用的洗脱缓冲液包含该浓度的盐，例如如上文讨论的任意浓度。洗脱缓冲液穿过或通过阴离子交换材料，监测洗脱液以鉴定何时发生洗脱。使用等度洗脱，当使用较小体积的洗脱缓冲液时，与阴离子交换材料的结合亲和性较低的成分的释放将会早于具有较高结合亲和性的成分，后者需要更大体积的洗脱缓冲液以穿过或通过阴离子交换材料。通过选择在不同的时间段获得的特定的汇集物或洗脱液的批次，可以获得具有多肽种类的不同成分的样品。

可以通过增加缓冲液中的盐浓度直至最终的最大浓度，例如上文讨论的浓度，来进行梯度洗脱。例如，线性梯度可以使用0％-100％的最终浓度的离液盐。可以在一段时间内将该梯度应用于阴离子交换材料，例如超过10、20、30、40、50、70、100、150或更多个柱体积。使用此类梯度洗脱，与阴离子交换材料的结合亲和性较低的成分将会在较低浓度的盐较早释放，而具有较高结合亲和性的成分将会晚于前者的释放，它们需要更高浓度的盐以发生洗脱。通过选择在不同的时间段获得的特定的汇集物或洗脱物的批次，可以获得具有多肽种类的不同成分的样品。

除了使用逐级(gradual)的梯度来增加离液盐的浓度以外，还可以使用逐步(stepwise)的增加。即，盐的浓度可以在一个或多个不连续的阶段中增加至最终的最大浓度。这可以用于反映梯度洗脱的效应，其中在不同的浓度、从而在不同的阶段中释放不同的成分。逐步洗脱可以替代性地与等度洗脱组合。例如，可以将盐浓度的逐步增加维持多个柱体积的缓冲液，从而允许发生在该浓度的等度洗脱，随着所用的缓冲液体积的增加而洗脱不同的成分。也可以使用盐浓度中的后续的另外的步骤。

在一个实施方式中，当洗脱缓冲液与洗涤缓冲液的差别仅在于在洗脱缓冲液中存在例如乙酸铵、氯化铵或乙酸钠的盐时，可以通过向洗涤缓冲液中添加一定数量的盐来获得用于等度洗脱的洗脱缓冲液，可以通过逐渐向洗涤缓冲液中添加盐来实现梯度洗脱，可以通过向洗涤缓冲液中添加一定数量的盐以在不连续的阶段中增加缓冲液中的盐浓度来实现逐步洗脱。

实施例

实施例1：FIX的不同的γ羧基化种类的活性分析

在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生重组人类因子IX(FIX)。经测定FIX的比活性是约50％。

分级主要是#1-8-、#1-9-、#1-10-、#1-11-和#1-12-Gla的各个FIX种类。

使用凝结测验来测定FIX活性依赖性的形成纤维蛋白凝块所需时间。使用接触激活剂(APTT试剂中的鞣花酸)来刺激FXIIa的产生，其进一步通过重新钙化和添加的磷脂被触发。测定针对BeneFIX和正常汇集的人类血浆的活性，并且就WHO人类FIX标准物进行校正。

使用商售的名称为‘Hyphen BioMed Chromogenic Factor IX kit(Aniara)’的测定试剂盒来测定rhFIX的活性水平。在该测验中，因子XIa将因子IX激活为因子IXa，因子IXa与激活的因子VIII:C、磷脂和Ca²⁺一起将因子X激活为因子Xa。通过在405nm处从因子Xa特异性发色底物SXa-11中释放的pNA的量来测定所产生的因子Xa的量。

发现#1-11-和#1-12-Gla种类在凝固和两步活性测定中完全具有活性。#1-8-、#1-9-和#1-10-Gla种类的活性分别下降至约2-5％、14-22％和27-36％，这取决于所用的测验。

实施例2：FIX的不同的γ羧基化的种类的纯化和分析

使用阴离子交换色谱来分离不同γ羧基化形式的重组人类因子IX(rhFIX)。该方法使用SOURCE 15Q柱(GE Healthcare)，其柱床体积是6ml，流速是3ml/分钟，温度是4℃。

装载至柱上的样品(“装载样品”)是rhFIX。总共装载约13mg。使用0.1M NaOH将装载样品调节至pH 8.0。

使用的缓冲液如下：

平衡缓冲液：20mM Tris/NaOH、pH 8.0、0.01％Tween80。

洗脱缓冲液：20mM Tris/HCl、1.5M乙酸铵、pH 8.0、0.01％Tween80。

CIP：1M NaOH

阴离子交换色谱程序如下：

该阴离子交换色谱的结果显示于图2和3。

选择级分C12-D3的汇集物，产量9.6mg/74％。将该汇集物的Gla含量与用于上文所述的装载样品的原始样品中的含量进行比较。

使用Agilent HPLC系统进行各个级分的Gla含量分析。基于HPLC方法的Gla含量分析与使用N末端测序和氨基酸碱性水解分析获得的Gla含量分析相对应。HPLC使用MiniQ PC3.2/3柱(GE Healthcare目录号17-0686-01)，流速为0.18ml/分钟。用于该系统的缓冲液是：

A-缓冲液：20mM Tris/NaOH、pH 9.0

B-缓冲液：20mM Tris/HCl、pH 9.0、1.5M乙酸铵

该系统测定的信号是UV280和荧光信号(激发：280nm/发射：340nm)。

HPLC程序如下：

0-5分钟 0-30％B

5-55分钟 30-55％B

55-65分钟 55-100％B

使用如上所述的阴离子交换色谱分离之前和之后的Gla分布的比较显示于图4。这些结果也表示如下。

因此，使用如上所述的阴离子交换色谱进行的纯化从原始FIX样品中除掉了所有的可检测的#1-8-和#1-9-Gla。#1-10-Gla的存在量也发生了下降，从而使#1-11-和#1-12-Gla的比例增加。

在最终的纯化的汇集物中，相比于Benefix，比活性也增加至约110％(两步活性测定，未显示数据计算)。

实施例3：FIX的不同的γ羧基化的种类的纯化和分析

使用阴离子交换色谱来分离不同γ羧基化形式的重组人类FIX。该方法使用SOURCE 30Q柱(GE Healthcare)，其柱床体积是6ml，流速是2ml/分钟，温度是4℃。

装载至柱上的样品(“装载样品”)是FIX。总共装载约2.5mg。使用0.1M NaOH将装载样品调节至pH 8.0。

使用的缓冲液如下：

平衡缓冲液：20mM Tris/NaOH、pH 8.0、0.01％Tween80。

洗脱缓冲液：20mM Tris/HCl、1.5M乙酸铵、pH 8.0、0.01％Tween80。

CIP：1M NaOH

阴离子交换色谱程序如下：

该阴离子交换色谱的结果显示于图5和6。

选择级分C12-D3的汇集物，产生约1.75mg/70％。将该汇集物的Gla含量与用于上文所述的装载样品的原始样品中的含量进行比较。使用如实施例2中描述的Agilent HPLC系统进行各个级分的Gla含量分析。

使用如上所述的阴离子交换色谱分离之前和之后的Gla分布的比较显示于下表。

因此，使用如上所述的阴离子交换色谱进行的纯化从原始FIX样品中除掉了所有的可检测的#1-8-和#1-9-Gla。#1-10-Gla的存在量也发生了下降，从而#1-11-和#1-12-Gla的比例增加。

实施例4：FVII的不同的γ羧基化的种类的纯化和分析

使用阴离子交换色谱来分离不同γ羧基化形式的重组人类因子VIIa(FVII)。该方法使用SOURCE 15Q柱(GE Healthcare)，其柱床体积是1.7ml，流速是0.75ml/分钟，温度是4℃。

装载至柱上的样品(“装载样品”)是在CHO细胞中产生的FVII。总共装载约1.8mg。向装载样品中加入50mM EDTA(来自1M的贮液)并使用0.1M NaOH将装载样品调节至pH 8.0。

使用的缓冲液如下：

平衡缓冲液：20mM Tris/NaOH、pH 8.0。

洗脱缓冲液：20mM Tris/HCl、1.5M乙酸铵、pH 8.0。

CIP：1M NaOH

阴离子交换色谱程序如下：

该阴离子交换色谱的结果显示于图7和8。

使用如实施例2中描述的Agilent HPLC系统进行各个级分(22至27)的Gla含量分析。

使用如上所述的阴离子交换色谱分离的FVII Gla种类的分布的比较显示于下表中。

^*注意：FVII总共仅包含10个Gla残基。

使用如上所示的阴离子交换色谱进行的纯化实现了FVIIa Gla种类的清楚的分离。因此，可以通过实验员优选的方式制备FVII Gla种类的成分。

实施例5：FIX的不同的γ羧基化的种类的纯化和分析

使用阴离子交换色谱来分离不同γ羧基化形式的重组人类FIX。该方法使用SOURCE 15Q柱(GE Healthcare)，其柱床体积是1.7ml，流速是0.75ml/分钟，温度是4℃。

装载至柱上的样品(“装载样品”)是FIX。总共装载约2mg。使用0.1MNaOH将装载样品调节至pH 8.5。

使用的缓冲液如下：

平衡缓冲液：20mM Tris/NaOH、pH 8.5。

洗脱缓冲液：20mM Tris/NaOH、1.0M氯化铵、pH 8.5。

CIP：1M NaOH

阴离子交换色谱程序如下：

该阴离子交换色谱的结果显示于图9和10。

使用如实施例2描述的Agilent HPLC系统进行各个级分(E7至F12)的Gla含量分析。

使用如上所述的阴离子交换色谱分离的FIX Gla种类的分布的比较显示于下表。

使用如上所示的阴离子交换色谱进行的纯化实现了FIX Gla种类的清楚的分离。因此，可以通过实验员优选的方式制备FIX Gla种类的成分。

实施例6：FIX的不同的γ羧基化的种类的纯化和分析

装载至柱上的样品(“装载样品”)是FIX。总共装载约2mg。使用0.1MNaOH将装载样品调节至pH 8.0。

使用的缓冲液如下：

平衡缓冲液：20mM Tris/NaOH、pH 8.0。

洗脱缓冲液：20mM Tris/HCl、1.0M乙酸钠、pH 8.0。

CIP：1M NaOH

阴离子交换色谱程序如下：

该阴离子交换色谱的结果显示于图11和12。

使用如实施例2描述的Agilent HPLC系统进行各个级分(E5至E1)的Gla含量分析。

使用如上所示的阴离子交换色谱进行的纯化实现了FIX Gla种类的一些分离。因此，可以通过实验员优选的方式制备FIX Gla种类的成分。

实施例7：FX的不同的γ羧基化的种类的纯化和分析

使用阴离子交换色谱来分离不同γ羧基化形式的重组人类FX构建体，在所述构建体中FX活化肽被替换为纤维蛋白肽A活化肽(DFLAEGGGVR)和添加到C末端的HPC4标签(DQVDPRLIDGK)。该方法使用SOURCE15Q柱(GE Healthcare)，其柱床体积是1.7ml，流速是0.75ml/分钟，温度是4℃。

装载至柱上的样品(“装载样品”)是所述FX构建体。总共装载约2.5mg。使用0.1M NaOH将装载样品调节至pH 8.0。

使用的缓冲液如下：

平衡缓冲液：20mM Tris、pH 8.0。

洗脱缓冲液：20mM Tris/HCl、1.5M乙酸铵、pH 8.0。

CIP：1M NaOH

阴离子交换色谱程序如下：

该阴离子交换色谱的结果显示于图13。

使用如实施例2描述的Agilent HPLC系统进行各个级分的Gla含量分析。

基于级分分析，使用如上所述的阴离子交换色谱分离之前和之后的FX Gla种类的分布的比较显示于下表。

因此，制备了具有增加的数量的Gla#10和Gla#11的FX构建体的成分。

Claims

1.从包含具有不同含量的γ羧基谷氨酸的多肽种类的混合物的样品中纯化具有想要的含量的γ羧基谷氨酸的所述多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将所述样品装载至阴离子交换色谱材料之上；

2.根据权利要求1的方法，包括以下步骤：

(a)以pH小于9.0的缓冲液平衡阴离子交换材料；

(b)将所述样品装载至所述阴离子交换材料之上；

(c)任选地以pH小于9.0的缓冲液洗涤所述阴离子交换材料；

3.根据权利要求1或2的方法，其中待纯化的多肽选自因子IX、因子VII、因子VIIa、因子X、凝血酶原、蛋白-S、蛋白-C、蛋白Z、骨钙蛋白、基质-gla-蛋白、生长抑制特异性-6、富含脯氨酸的Gla-1、富含脯氨酸的Gla-2、富含脯氨酸的Gla-3和富含脯氨酸的Gla-4。

4.根据权利要求3的方法，其中所述多肽是因子IX。

5.根据权利要求4的方法，其中所述方法包括：选择从所述洗脱获得的级分，其中相较于被纯化的样品中#1-11-Gla和/或#1-12-Gla形式的因子IX的比例，所述级分中#1-11-Gla和/或#1-12-Gla形式的因子IX的比例有所增加。

6.根据权利要求4的方法，其中所述方法包括：选择从所述洗脱获得的级分，其中相较于被纯化的样品中#1-10-Gla形式的因子IX的比例，所述级分中#1-10-Gla形式的因子IX的比例有所降低。

7.根据权利要求3的方法，其中所述多肽是因子VII或因子VIIa。

8.根据权利要求7的方法，其中所述方法包括：选择从所述洗脱获得的级分，其中相较于被纯化的样品中#1-10-Gla和/或#1-11-Gla形式的因子VII或因子VIIa的比例，所述级分中#1-10-Gla和/或#1-11-Gla形式的因子VII或因子VIIa的比例有所增加。

9.根据权利要求7的方法，其中所述方法包括：选择从所述洗脱获得的级分，其中相较于被纯化的样品中#1-9-Gla形式的因子VII或因子VIIa的比例，所述级分中#1-9-Gla形式的因子VII或因子VIIa的比例有所降低。

10.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述洗脱缓冲液的pH是5.0-8.5。

11.根据前述权利要求任一项的方法，其中乙酸铵、氯化铵或乙酸钠以0.1M-2.0M的浓度存在于洗脱缓冲液中。

12.根据权利要求11的方法，其中乙酸铵、氯化铵或乙酸钠以约0.6M的浓度存在于洗脱缓冲液中。

13.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述离子交换色谱使用pH为5.0-8.5的平衡缓冲液。

14.通过如前述权利要求任一项的方法获得的多肽制剂。