CN101098883A - 减少含有目的维生素k依赖性蛋白质的组合物中的蛋白质污染物的含量 - Google Patents

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CN101098883A CNA2005800464861A CN200580046486A CN101098883A CN 101098883 A CN101098883 A CN 101098883A CN A2005800464861 A CNA2005800464861 A CN A2005800464861A CN 200580046486 A CN200580046486 A CN 200580046486A CN 101098883 A CN101098883 A CN 101098883A
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Abstract

本发明涉及具有非常低的，或者可以忽略的蛋白质污染物含量的维生素K依赖性蛋白质组合物。本发明还涉及可应用于制备这样的维生素K依赖性蛋白质组合物的方法。这样的方法可以单独或相继组合使用，以减少蛋白质污染物的相对含量。本发明特别涉及凝血因子的组合物的制备，所述凝血因子选自凝血因子X多肽(FX/FXa)、凝血因子IX多肽(FIX/FIXa)、凝血因子VII多肽(FVII/FVIIa)和抗凝蛋白C，特别是凝血因子VII多肽。

Description

减少含有目的维生素K依赖性蛋白质的组合物中的蛋白质污染物的含量
发明领域
本发明涉及具有非常低的，或者可以忽略的蛋白质污染物含量的维生素K依赖性蛋白质组合物。本发明还涉及可应用于制备这样的维生素K依赖性蛋白质组合物的方法。这样的方法可以单独或相继组合使用，以减少蛋白质污染物的相对含量。本发明特别涉及凝血因子的组合物的制备，所述凝血因子选自凝血因子X多肽(FX/FXa)、凝血因子IX多肽(FIX/FIXa)、凝血因子VII多肽(FVII/FVIIa)和抗凝蛋白C，特别是凝血因子VII多肽。
发明背景
在从微生物或细胞系的培养来生产重组蛋白的过程中，最后的生产步骤是回收和任选地浓缩目的产物。其中已经生长了细胞并且含有分泌的蛋白质和特别是细胞溶解产物(包含细胞内的目的蛋白)的培养基，除了其他污染物(例如培养基成分、核酸等)以外，或多或少还含有由细胞产生的其他蛋白质。为了获得纯化的蛋白质产物，因而需要将目的蛋白与含有该目的蛋白的粗制材料中的其他蛋白质和多肽以及其他杂质分离开。
除去包含具有与目的多肽相同的性质的结构域的蛋白质污染物通常是困难的。
维生素K依赖性蛋白质通过在它们的分子氨基末端部分中所共有的共同结构特征而与其他蛋白质相区别。这些蛋白质的N-末端，也称为Gla-结构域，富含稀有氨基酸γ-羧基谷氨酸，该氨基酸在由γ-谷氨酰羧化酶催化的维生素K依赖性反应中从谷氨酸合成。由于存在大约2-12个Gla残基，Gla-结构域的特征是能够结合二价阳离子例如Ca2+。一旦结合金属离子，这些蛋白质发生能够通过多种技术(例如圆二色性和荧光发射)测量的构象变化。
含Gla的蛋白质的金属诱导的构象变化的发现(Nelsestuen等人，J.Biol.Chem.1976；251，6886-6893)以及构象特异性多克隆抗体的鉴定(Furie等人，J.Biol.Chem.1978；253，8980-8987)为引入构象特异性免疫亲和层析打开了通道。这些抗体在Ca2+离子存在的情况下能够识别并结合Gla-结构域，但是一旦用Ca2+螯合剂(例如EDTA或柠檬酸盐)除去Ca2+离子后就会释放出该蛋白质。
在20世纪80年代，利用含Gla的蛋白质发生金属诱导的构象变化的独特性质而开发了构象特异性拟亲和层析(pseudoaffinitychromatography)。拟亲和层析由于没有固定化的亲和配体参与而不同于常规的亲和层析，而且它在常规的层析基质上进行(Yan S.B.，J.Mol.Recog.1996；9，211-218)。通过除去二价金属离子能够将Gla蛋白质吸附至阴离子交换材料上。随后，通过加入Ca2+至洗脱缓冲液中来进行洗脱。
在1986年，Bjrn和Thim报导了利用凝血因子VII的Gla-结构域的Ca2+结合特性在阴离子交换材料上对重组凝血因子VII进行纯化(BjrnS.和ThimL.，Research Dislosure，1986，26960-26962.)。吸附在没有Ca2+缓冲液中进行，并且用低离子强度的含Ca2+缓冲液和在温和条件下可以洗脱出凝血因子VII。
Yan等人已经用相同原理纯化了重组人蛋白C(Yan S.B.等人，Bio/technology.1990；8，655-661)。
虽然Gla-结构域的存在为分离含Gla的蛋白质与其他蛋白质提供了有利条件，但是本发明的发明人观察到，含Gla的蛋白质的类似特性和行为使得难以将它们彼此分离。针对一种Gla蛋白质的几种构象特异性抗体显示出与其他Gla蛋白质的交叉反应性(FurieB.和FurieB.，J.Biol.Chem.1979；254，9766-9771；Church等人，J.Biol.Chem.1988；263，6259-6267)。
Brown等人(BroWn等人，J.Biol.Chem.2000；275，19795-19802)已经报导了对于Gla残基特异的单克隆抗体。这些抗体可以识别所有经测试的Gla蛋白质：凝血因子VII、凝血因子IX、凝血因子II、蛋白C、蛋白S、GAS-6、骨基质Gla蛋白质、芋螺抑制肽G。
具有GLA-结构域的蛋白质包括但不限于下列蛋白质：GAS-6、蛋白S、凝血因子II(凝血酶原)、凝血酶、凝血因子X/Xa、凝血因子IX/IXa、蛋白C、凝血因子VII/VIIa、蛋白Z、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白1、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白2、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白3、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白4、基质Gla蛋白和骨钙蛋白。
US5,633,350描述了用于将维生素K依赖性蛋白质与非维生素K依赖性的伴随蛋白质分离的方法。
对于将目的维生素K依赖性蛋白质(例如含Gla结构域的目的多肽)与蛋白质污染物有效分离的需要在涉及细胞培养中产生的此类多肽的纯化时是一个特别有关的议题，因为宿主细胞(其可能不是人细胞系)可以产生大量的蛋白质污染物，在使用所述多肽时这些蛋白质污染物可以引起不希望的免疫反应。
因此，本发明的一个目标是提供用于减少或甚至去除含有目的维生素K依赖性蛋白质的组合物中的蛋白质污染物含量的合适方法。本发明的另一个目标是，提供具有非常低的或甚至可以忽略的蛋白质污染物含量的含有目的维生素K依赖性蛋白质的组合物。
发明描述
本发明涉及用于减少或甚至消除含有目的维生素K依赖性蛋白质的组合物中的蛋白质污染物含量的多种方法。
目的维生素K依赖性蛋白质
本发明在广的方面涉及目的维生素K依赖性蛋白质的纯化，和涉及含有此类蛋白质的特别的经纯化的组合物。术语“目的”在此用作特殊种类(维生素K依赖性蛋白质)的指示，所述的特殊种类与以最纯的形式获得有关，例如为了在治疗方面使用维生素K依赖性蛋白质。
在此描述的方法原则上可以应用于纯化任何维生素K依赖性蛋白质，包括但不限于GAS-6、蛋白S、凝血因子II(凝血酶原)、凝血酶、凝血因子X/Xa、凝血因子IX/IXa、蛋白C、凝血因子VII/VIIa、蛋白Z、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白1、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白2、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白3、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白4、基质Gla蛋白和骨钙蛋白，特别地，选自凝血因子VII多肽、凝血因子IX多肽、凝血因子X多肽和激活的蛋白C的维生素K依赖性凝血因子。在一个特别的实施方案中，所述方法用于纯化在细胞培养条件下(特别是在非人细胞培养中)产生的重组目的维生素K依赖性蛋白质。
在一个特别的实施方案中，目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子IX多肽，例如FIX或FIXa。
在另一个特别的实施方案中，目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽，例如凝血因子VII相关的多肽，或凝血因子VII衍生物，或凝血因子VII缀合物，特别是人凝血因子VII多肽，尤其是人野生型凝血因子VII或野生型人凝血因子VIIa。
如在此使用的，术语“凝血因子VII多肽”和“FVII多肽”表示包含野生型人凝血因子VIIa(即，具有在美国专利号4,784,950中公开的氨基酸序列的多肽)的氨基酸序列1-406的任何蛋白质、它的变体，以及凝血因子VII相关的多肽、凝血因子VII衍生物和凝血因子VII缀合物。这包括相对于野生型人凝血因子VIIa显示出基本相同或提高的生物活性的凝血因子VII变体、凝血因子VII相关的多肽、凝血因子VII衍生物和凝血因子VII缀合物。
术语“凝血因子VII”或“FVII”旨在包括其未切割(酶原)的形式的凝血因子VII多肽，以及已经经蛋白水解加工而产生它们各自的生物活性形式的那些，其可称为凝血因子VIIa。通常，凝血因子VII在残基152和153之间进行切割而产生凝血因子VIIa。凝血因子VII的此类变体可以显示出相对于人凝血因子VII来说不同的特性，包括稳定性、磷脂结合、改变的特异性活性等等。
如在此使用的，“野生型人凝血因子VIIa”是具有在美国专利号4,784,950中公开的氨基酸序列的多肽。
如在此使用的，“凝血因子VII相关的多肽”涵盖了这样的多肽，包括变体(或类似物)，其中凝血因子VIIa生物活性相对于野生型凝血因子VIIa的活性来说已经实质上进行了修饰，例如减少。这些多肽包括但不限于这样的凝血因子VII或凝血因子VIIa，其中已经引入了修饰或破坏该多肽的生物活性的特定的氨基酸序列改变。
如在此使用的，术语“凝血因子VII衍生物”意指相对于野生型凝血因子VII来说显示出基本相同或提高的生物活性的凝血因子VII多肽，其中亲本肽的一个或多个氨基酸已经采用遗传和/或化学和/或酶促的方法进行了修饰，例如通过烷基化、糖基化、PEG化、糖PEG化、酰化、酯形成或酰胺形成等等。这包括但不限于PEG化的人凝血因子VIIa、半胱氨酸-PEG化的人凝血因子VIIa及其变体。凝血因子VII衍生物的非限制性实例包括在WO03/31464和美国专利申请US20040043446、US20040063911、US20040142856、US20040137557和US20040132640(Neose Technologies，Inc.)中公开的糖PEG化的凝血因子VII衍生物；在WO01/04287、美国专利申请20030165996、WO01/58935、WO03/93465(Maxygen ApS)和WO02/02764、美国专利申请20030211094(University of Minnesota)中公开的凝血因子VII缀合物。
术语“提高的生物活性”指i)与重组野生型人凝血因子VIIa相比具有基本相同或增加的蛋白水解活性的凝血因子VII多肽，或ii)与重组野生型人凝血因子VIIa相比具有基本相同或增加的TF结合活性的凝血因子VII多肽，或iii)与重组野生型人凝血因子VIIa相比具有基本相同或延长的在血浆中的半衰期的凝血因子VII多肽。术语“PEG化的人凝血因子VIIa”表示具有缀合至人凝血因子VIIa多肽的PEG分子的人凝血因子VIIa。应该理解，PEG分子可以连接至凝血因子VIIa多肽的任何部分，包括凝血因子VIIa多肽的任何氨基酸残基或糖部分。术语“半胱氨酸-PEG化的人凝血因子VIIa”表示具有PEG分子的凝血因子VIIa，所述PEG分子缀合至引入人凝血因子VIIa中的半胱氨酸的巯基上。
与重组野生型人凝血因子VIIa相比具有基本相同或增加的蛋白水解活性的凝血因子VII变体的非限制性实例包括S52A-凝血因子VIIa、S60A-凝血因子VIIa(Lino等人，Arch.Biochem.Biophys.352：182-192，1998)；在美国专利号5,580,560中公开的显示出增加的蛋白水解稳定性的凝血因子VIIa变体；已经在残基290和291之间或在残基315和316之间经蛋白水解切割的凝血因子VIIa(Mollerup等人，Biotechnol.Bioeng.48：501-505，1995)；凝血因子VIIa的氧化形式(Kornfelt等人，Arch.Biochem.Biophys.363：43-54，1999)；在PCT/DK02/00189(相应于WO02/077218)中公开的凝血因子VII变体；和在WO02/38162中公开的显示出增加的蛋白水解稳定性的凝血因子VII变体(Scripps Research Institute)；在WO99/20767、美国专利US6017882和US6747003、美国专利申请20030100506(University of Minnesota)和WO00/66753、美国专利申请US20010018414、US2004220106和US200131005、美国专利US6762286和US6693075(University of Minnesota)中公开的凝血因子VII变体，其具有经修饰的Gla-结构域并显示出增加的膜结合；以及在WO01/58935、美国专利US6806063、美国专利申请20030096338(Maxygen ApS)、WO03/93465(Maxygen ApS)和WO04/029091(Maxygen ApS)中公开的凝血因子VII变体。
与野生型凝血因子VIIa相比较具有增加的生物活性的凝血因子VII变体的非限制性实例包括在WO01/83725、WO02/22776、WO02/077218、PCT/DK02/00635(相应于WO03/027147)、丹麦专利申请PA200201423(相应于WO04/029090)、丹麦专利申请PA200101627(相应于WO03/027147)、WO02/38162(Scripps ResearchInstitute)中公开的凝血因子VII变体；以及在JP2001061479(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)中公开的具有增加的活性的凝血因子VIIa变体。
凝血因子VII的变体的实例包括但不限于P10Q-FVII，K32E-FVII，
P10Q/K32E-FVII，L305V-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，
L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，
V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，
V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，
V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，
V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，
E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII，和
S336G-FVII，L305V/K337A-FVII，L305V/V158D-FVII，
L305V/E296V-FVII，L305V/M298Q-FVII，L305V/V158T-FVII，
L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，
L305V/K337A/E296V-FVII，L305V/K337A/V158D-FVII，
L305V/V158D/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V-FVII，
L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，
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F374Y/V158D-FVII，F374Y/E296V-FVII，F374Y/M298Q-FVII，
F374Y/V158T-FVII，F374Y/S314E-FVII，F374Y/L305V-FVII，
F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D-FVII，
F374Y/L305V/E296V-FVII，F374Y/L305V/M298Q-FVII，
F374Y/L305V/V158T-FVII，F374Y/L305V/S314E-FVII，
F374Y/K337A/S314E-FVII，F374Y/K337A/V158T-FVII，
F374Y/K337A/M298Q-FVII，F374Y/K337A/E296V-FVII，
F374Y/K337A/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E-FVII，
F374Y/V158D/M298Q-FVII，F374Y/V158D/E296V-FVII，
F374Y/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q-FVII，
F374Y/V158T/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E-FVII，
F374Y/S314E/M298Q-FVII，F374Y/E296V/M298Q-FVII，
F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII，
F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII，
F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII，
F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII，
F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，
F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII，
F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII，
F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII，F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII，
F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII，
F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII，F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII，
F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII，
F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII，
F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII，
F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII，
F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII，
F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII，
F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII，
F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，
F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII，
F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，
F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，
F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，
F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII，
F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，
F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，
F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII，
F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，
F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII，
F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII，
F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，
F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII，
F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII，
F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII，
F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII，
F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，
F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII，
F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，
F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII，
F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII，
F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，
F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，
F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII，
F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII，
F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FYII，
F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，
F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，
F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，
F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，S52A-凝血因子VII，S60A-凝血因子VII；R152E-凝血因子VII，S344A-凝血因子VII，T106N-FVII，K143N/N145T-FVII，V253N-FVII，R290N/A292T-FVII，G291N-FVII，R315N/V317T-FVII，K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；以及在233Thr至240Asn的氨基酸序列中具有置换、添加或缺失的FVII；在304Arg至329Cys的氨基酸序列中具有置换、添加或缺失的FVII；和在153Ile至223Arg的氨基酸序列中具有置换、添加或缺失的FVII。
因此，凝血因子VII多肽中的置换变体包括但不限于在位置P10、K32、L305、M306、D309、L305、L305、F374、V158、M298、V158、E296、K337、M298、M298、S336、S314、K316、K316、F374、S52、S60、R152、S344、T106、K143、N145、V253、R290、A292、G291、R315、V317处的置换，以及在从T233至N240或从R304至C329；或从I153至R223的氨基酸序列中的置换、添加或缺失，或它们的组合，特别是变体例如P10Q、K32E、L305V、M306D、D309S、L305I、L305T、F374P、V158T、M298Q、V158D、E296V、K337A、M298Q、M298K、S336G、S314E、K316H、K316Q、F374Y、S52A、S60A、R152E、S344A、T106N、K143N、N145T、V253N、R290N、A292T、G291N、R315N、V317T，以及从T233至N240，或从R304至C329，或从I153至R223的氨基酸序列中的置换、添加或缺失，或它们的组合。
与术语“凝血因子X多肽”和“凝血因子IX多肽”相关的表述“多肽”旨在包括分别包含野生型人凝血因子X和凝血因子IX的氨基酸序列的任何蛋白质，以及它们各自的“类似物”、“变体”、“相关多肽”、“衍生物”和“缀合物”，其中表述“变体”、“相关多肽”、“衍生物”和“缀合物”如对于凝血因子VII时的定义一样，并作必要的更改。
组合物
当在这此使用时，表述“组合物”旨在表示液体组合物，例如含水的液体组合物，即包含少于5％的非水溶剂的组合物。
术语“第一组合物”指在根据本发明的处理例如纯化步骤之前的包含目的维生素K依赖性蛋白质的组合物。
该术语用于区分“第一组合物”和“第二组合物”，所述的第二组合物指相同的组合物，但是在某种处理，例如纯化步骤之后的组合物。
目的维生素K依赖性蛋白质极其通常地是在细胞培养条件下产生的重组蛋白，即目的维生素K依赖性蛋白质可直接作为细胞培养物上清液的组分而获得，或在一个或多个先前的过程步骤后从细胞培养物上清液获得。在实施本发明中，所述细胞是真核生物细胞，例如已建立的真核生物细胞系，包括但不限于CHO(例如ATCC CCL61)、COS-1(例如ATCC CRL1650)、幼仓鼠肾(BHK)和HEK293(例如ATCC CRL1573；Graham等人，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)细胞系。优选的BHK细胞系是tk-ts13 BHK细胞系(Waechter和Baserga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：1106-1110，1982)，下文中称为BHK570细胞。BHK570细胞系可从美国典型培养物保藏中心，12301 ParklawnDr.，RockVille，MD20852，在ATCC登记号CRL10314下获得。tk- ts13BHK细胞系还可以从ATCC在登记号CRL1632下获得。优选的CHO细胞系是可从ATCC在登记号CC161下获得的CHO K1细胞系。
其他合适的细胞系包括但不限于Rat Hep I(大鼠肝瘤；ATCC CRL1600)，Rat Hep II(大鼠肝瘤；ATCC CRL1548)，TCMK(ATCC CCL139)，人肺(ATCC HB8065)，NCTC1469(ATCC CCL9.1)；DUKX细胞(CHO细胞系)(Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220，1980)(DUKX细胞也称为DXB11细胞)，和DG44(CHO细胞系)(Cell，33：405，1983，和Somatic Cell and MolecularGenetics12：555，1986)。同样可以使用的是3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤和骨髓瘤与其他细胞的融合细胞。在一些实施方案中，细胞可以是突变细胞或重组细胞，例如表达与它们所源自的细胞类型相比在性质或数量上不同的酶谱的细胞，其中所述酶催化蛋白质的翻译后修饰(例如，糖基化酶如糖基转移酶和/或糖苷酶，或者加工酶，例如前肽)。合适的昆虫细胞系还包括但不限于鳞翅目昆虫细胞系，例如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(见，例如US5,077,214)。
通常地，在第一(例如未纯化的)组合物中的蛋白质污染物总含量为至少200ppm，例如至少300ppm，例如至少400ppm，或至少500ppm。
同样通常地，在第一(例如未纯化的)组合物中的蛋白S污染物总含量为至少200ppm，例如至少300ppm，例如至少400ppm，或至少500ppm。
典型的蛋白质污染物
当在这此使用时，术语“蛋白质污染物”等等意指构成相对于目的维生素K依赖性蛋白质来说的杂质的蛋白质或多肽组分。因而，目的维生素K依赖性蛋白质显然将不会被视为蛋白质污染物，尽管“维生素K依赖性蛋白质”本身和“蛋白质污染物”的定义分别地部分重叠。在一个实施方案中，蛋白质污染物是维生素K依赖性蛋白质(但不是目的维生素K依赖性蛋白质)。
由于维生素K依赖性蛋白质通常在细胞培养中产生，因而特别的一组蛋白质污染物是宿主细胞蛋白质。“宿主细胞蛋白质”是由表达目的维生素K依赖性蛋白质的宿主细胞产生的蛋白质，并且通常认为是杂质。如果将人细胞系用于产生目的维生素K依赖性蛋白质则宿主细胞蛋白质可以是人蛋白质，或者如果将非人细胞系用于产生目的蛋白则宿主细胞蛋白质可以是非人蛋白质。因而，在本发明的一个方面，蛋白质污染物是宿主细胞蛋白质，例如维生素K依赖性蛋白质。
一类特别相关的宿主细胞蛋白质是含有Gla-结构域的蛋白质，例如GAS-6、蛋白S、凝血因子II(凝血酶原)、凝血酶、凝血因子X/Xa、凝血因子IX/IXa、蛋白C、凝血因子VII/VIIa、蛋白Z、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白1、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白2、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白3、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白4、基质Gla蛋白和骨钙蛋白。在这些蛋白质中Gla残基的数目是2-12个。由于Gla残基的合成需要维生素K，所以含有Gla残基的蛋白质也称为维生素K依赖性蛋白质。
在本文中，一种特别的相关宿主细胞蛋白质是蛋白S。在一个特别的实施方案中，蛋白S是仓鼠蛋白S。因而，在这里定义的方法和组合物特别着眼于蛋白S含量的减少。
蛋白质污染物含量的减少
本发明的一个关键方面是能够从含有目的维生素K依赖性蛋白质(特别是凝血因子VII多肽)的组合物中去除蛋白质污染物(特别是蛋白S)的方法。
因此，本发明涉及用于减少含有目的维生素K依赖性蛋白质的组合物中一种或多种蛋白质污染物含量的方法，所述方法至少包括下列步骤：(i)使该组合物与能够结合一种或多种蛋白质污染物和/或目的维生素K依赖性蛋白质的固相材料接触，和(ii)收集因而产生的含有目的维生素K依赖性蛋白质的组合物，由此蛋白质污染物水平减少至少5倍，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
在最重要的实施方案中，在因而产生的含有目的维生素K依赖性蛋白质的第二(例如纯化的)组合物中蛋白质污染物总含量降低至至多100ppm。
如上面提及的，目的维生素K依赖性蛋白质通常是选自凝血因子VII多肽、凝血因子IX多肽、凝血因子X多肽和激活的蛋白C的维生素K依赖性凝血因子。在一个更特别的实施方案中，目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子IX多肽。在另一个更特别的实施方案中，目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。在另一个特别的实施方案中，目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子X多肽。
在一个特别的实施方案中，占优势量的蛋白质污染物是含有Gla-结构域的多肽，特别是蛋白S；并且目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。在一个实施方案中，蛋白质污染物是仓鼠蛋白S。在另一个实施方案中，蛋白质污染物是蛋白S，并且目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子IX多肽。在一个实施方案中，蛋白质污染物是仓鼠蛋白S。
在一个实施方案中，本发明涉及用于将含有2-16个Gla残基的目的维生素K依赖性蛋白质与含有2-16个Gla残基的其他维生素K依赖性蛋白质污染物分离的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于将具有抗凝血作用的蛋白质例如蛋白S和蛋白C与具有凝血作用的蛋白质分离的方法。在一个方面，目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子，并且具有抗凝血作用的蛋白质污染物是蛋白S。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于将非人蛋白质污染物与人维生素K依赖性蛋白质分离的方法。在本发明的一个方面，所述非人蛋白质污染物也是维生素K依赖性蛋白质。在另外一个方面，所述非人蛋白质污染物是仓鼠蛋白质。
这就是说，本发明的方法使得可能产生减少至少10倍，或至少25倍，或至少50倍，例如减少至少100倍，或至少250倍，或至少500倍，或至少750倍，或至少1000倍，或至少2000倍的蛋白质污染物水平，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
特别地，在因而产生的第二(例如纯化的)组合物例如经处理的细胞培养物上清液中的蛋白质污染物总含量为至多100ppm，例如至多90ppm，或至多80ppm，或至多70ppm，或至多60ppm，或至多50ppm，或至多40ppm，或至多30ppm，或至多20ppm，或至多10ppm，或至多5ppm；或者在因而产生的第二(例如纯化的)组合物例如经处理的细胞培养物上清液中的蛋白S污染物总含量为至多100ppm，例如至多90ppm，或至多80ppm，或至多70ppm，或至多60ppm，或至多50ppm，或至多40ppm，或至多30ppm，或至多20ppm，或至多10ppm，或至多5ppm，或至多1ppm。
通常的细胞培养物上清液可能具有显著量的蛋白质污染物(特别是蛋白S)，因此，在(例如未纯化的)细胞培养物上清液中的蛋白质污染物总含量通常为至少500ppm，例如至少750ppm，或至少1000ppm，或至少2000ppm；或者在(例如未纯化的)细胞培养物上清液中的蛋白S污染物总含量为至少500ppm，例如至少750ppm，或至少1000ppm，或至少2000ppm。
因此，在上述的一个方面中涉及用于减少含有凝血因子VII多肽的组合物中一种或多种蛋白S污染物含量的方法，所述方法至少包括下列步骤：(i)使该组合物与能够结合蛋白S污染物和/或凝血因子VII多肽的固相材料接触，和(ii)收集因而产生的含有凝血因子VII多肽的组合物，由此蛋白S污染物水平减少至少2倍，例如5倍，所述蛋白S污染物水平表示为相对于凝血因子VII多肽的百万分率。
在此可用的固相材料是通常用于色谱和亲和捕获方法和程序的那些固相材料以及它们的特别的变化形式，这将是明显的。
在上述的一个主要变化形式中，所述固相材料结合与目的维生素K依赖性蛋白质相比较相对更大数量的蛋白质污染物。在一个方面，目的维生素K依赖性蛋白质不结合至固相并流过色谱柱，而蛋白质污染物结合至固相，导致目的维生素K依赖性蛋白质与蛋白质污染物的分离。特别地，固相材料例如通过强的亲和力或者通过共价结合所述污染物，如通过与所述污染物的巯基部分形成二硫键，来特异性地结合所述污染物中的至少一种。
在一个实施方案中，固相材料是离子交换树脂，例如阴离子交换树脂。通常使用的阴离子交换树脂包括Q-树脂、季胺和DEAE(二乙氨基乙烷，DiEthylAminoEthane)树脂。阴离子交换树脂是可商业获得的，例如Mono Q(Amersham Biosciences)、Source15Q或30Q(Amersham Biosciences)、Poros 20HQ或50HQ(PerseptiveBiosystems)、Toyopearl Q650S(Toso Haas)等。
从阴离子交换树脂上的洗脱可以通过增加洗脱缓冲液的电导率，例如增加洗脱缓冲液中的盐浓度，或者通过降低洗脱缓冲液的pH来进行。在本发明的一个特别的实施方案中，洗脱通过增加CaCl2浓度来进行。在另一个特别的实施方案中，洗脱通过增加MgCl2浓度来进行。洗脱可以逐步进行或通过使用梯度洗脱来进行。
最广泛使用的阳离子交换树脂含有羧甲基(CM)或磺丙基(SP)。此类阳离子交换剂的实例包括但不限于Toyopearl CM-650或Toyopearl SP-650(Toso Haas)，Source15S或30S，CM或SPSepharose Fast Flow(Amersham Biosciences)Obelix(AmershamBiosciences)。
在另一个实施方案中，固相材料是用疏水性配体例如乙基、丁基、苯基或己基取代的基质。这种类型的色谱法称为疏水作用层析(HIC)并且利用了蛋白质的疏水特性。通过蛋白质上的非极性区域和固定在固体支持物上的疏水性配体之间的疏水相互作用来促进吸附。在含水的流动相中的高盐浓度的情况下达到吸附，并通过降低盐浓度来促进洗脱。在一个特别的实施方案中，材料是用丁基或苯基配体取代的基质。
在本发明的进一步方面，固相材料携带有亲和配体。在一个实施方案中，固相材料携带有针对所述蛋白质污染物中至少一种蛋白质污染物的单克隆抗体，特别是针对蛋白S的单克隆抗体。这将在“实验”部分中举例说明。在另一方面，固相材料携带有固定化的三嗪配体，例如在WO97/10887(例如在第5页的第21行至第13页的第6行中描述的三嗪配体)或US6,117,996(例如第4-21段)中描述的三嗪配体，所述文献的内容在此以其全文进行引用作为参考。
蛋白S在血浆中游离地或与C4bp相复合地存在。B链含有与蛋白S的相互作用位点。因而，使用含有B链的C4bp种类对于本发明来说是重要的。在本发明的一个实施方案中，将整个C4bp分子用于固定至固体基质。在另一个实施方案中，将能够结合蛋白S的B链或B链序列用于固定至固体基质。
在另一个变化形式中，固相材料携带有固定化的蛋白C。在另一个变化形式中，固相材料携带有固定化的三嗪配体。在另一个变化形式中，固相材料携带有C4结合蛋白。蛋白S以比其他维生素K依赖性蛋白质大得多的亲和力结合蛋白C和C4bp。因此，可以通过使蛋白S结合至固定化的蛋白C或C4bp来减少蛋白S的含量。备选地，可以将选择出的负责结合蛋白S的蛋白C和C4bp的序列用于固定至固相。
C4b-结合蛋白(C4bp)参与了补体系统的调节。它是含有7条相同的α链和单条β链的多亚基蛋白。α链和β链的分子量分别为70kD和45kD。两种亚基都属于主要由长度为大约60个氨基酸残基的串联排列的短共有重复序列(SCR)组成的蛋白质的超家族。
在另一个实施方案中，固相材料通过共价捕获而结合所述污染物中的至少一种。蛋白S具有一个游离的半胱氨酸部分，而凝血因子VII没有。该游离的半胱氨酸部分然后可以通过硫醇-二硫化物交换而选择性地连接至激活的巯基化的物质或基质，形成混合的二硫化物。因此，通过例如共价层析、大小排阻层析或膜处理应当可以减少蛋白S。应该理解，这种实施方案的变化形式是其中不涉及固相材料的实施方案，即其中二硫化物的形成(例如通过形成二聚物)使得能够通过其他方法，例如通过大小排阻层析或膜处理来使蛋白质污染物与目的维生素K依赖性蛋白质分离。
在一个特别的实施方案中，目的维生素K依赖性蛋白质是细胞培养物上清液的组分，参见“实验”部分。
在上面进一步定义的方法的另一个实施方案中，固相材料结合与蛋白质污染物相比较相对更大数量的目的维生素K依赖性蛋白质。更特别地，固相材料特异性地结合目的维生素K依赖性蛋白质。
在一个变化形式中，固相材料携带有针对目的维生素K依赖性蛋白质或其类似物的单克隆抗体。
在另一个变化形式中，固相材料携带有所述目的维生素K依赖性蛋白质的抑制剂，例如苄脒-或胍-类型的抑制剂，例如包含-C(＝N-Z1-R1)-NH-Z2-R2基序的那些抑制剂，其中
Z1和Z2独立地选自-O-、-S-、-NRH-和单键，其中RH选自氢、C1-4-烷基、芳基和芳基甲基，并且R1和R2独立地选自氢、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-链烯基、任选取代的芳基、任选取代的杂环基，或者
Z2和R2是如上定义的，并且-C＝N-Z1-R1形成杂环的一部分，或者
Z1和R1是如上定义的，并且-C-NH-Z2-R2形成杂环的一部分，或者
-C(＝N-Z1-R1)-NH-Z2-R2形成其中-Z1-R1-R2-Z2-是双游离基(biradical)的杂环。
在另外的变化形式中，固相材料携带有能够与所述目的维生素K依赖性蛋白质形成螯合物的金属(其中随后的洗脱可以通过改变pH或用缓冲质如咪唑来进行)，或者携带有固定化的组织因子(促凝血酶原激酶)(在这种情况下发现，凝血因子VII多肽以比蛋白质污染物如蛋白S大得多的亲和力结合组织因子，因此通过例如使凝血因子VII多肽结合固定化的组织因子可以减少例如蛋白S的含量(也参见US6,573,056))，或者携带有固定化的肝素(参见“实验”部分)，或者携带有磷脂酰丝氨酸(磷脂酰丝氨酸只在不存在钙时才结合含有Gla-结构域的蛋白质如维生素K依赖性蛋白质的Gla-结构域；在钙存在的情况下，磷脂酰丝氨酸结合EGF-结构域(凝血因子VII具有2个EGF-环，而蛋白S具有4个EGF-环)，从而，由于对磷脂酰丝氨酸的不同亲和力，尤其是当存在钙时，可以分离凝血因子VII与蛋白质污染物如蛋白S)。
在另一个实施方案中，固相材料是羟磷灰石。
在上面进一步定义的方法的另一个实施方案中，固相材料是色谱材料。合适的固相材料的实例是，例如选自阴离子交换材料、阳离子交换材料、羟磷灰石、疏水性固相材料等的那些，参考“实验”部分。
本发明的多个特殊方面将在下面描述。
使用对于蛋白质污染物的单克隆抗体的免疫亲和法
根据本发明的这个方面，所述蛋白质污染物中的至少一种被携带有单克隆抗体的固相材料结合。因而，组合物可以简单地与所述固相材料接触并随后与固相材料分离，从而获得至少更少污染的组合物。
单克隆抗体与固相材料的偶联可以通过置于固相材料上的反应基团来进行。最普遍使用的基质是经溴化氰(CNBr)或N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)活化的支持物(WilchekM等人，Reactive&FunctionalPolymers.1999，41，263-268)。关于经CNBr和NHS活化的支持物，偶联通过抗体中的伯胺基团发生，导致与CNBr-基团的异脲键和与NHS-基团的酰胺键。
将抗体溶液溶解或透析入合适的偶联缓冲液(例如0.2M NaHCO3、0.5M NaCl pH8.3)中，不能使用具有伯胺基团的缓冲液。偶联的pH取决于抗体和活化的支持物，但是通常可以使用pH6-9。为了在使用前保持活化的支持物的稳定性，将其用10-15介质体积的冰冷的1mM HCl洗涤。在洗涤后立即将经洗涤的支持物转移至抗体溶液中，并轻轻混合，和调节至所希望的pH水平。在轻轻旋转下，让偶联混合物于室温下放置数小时或在4℃下放置过夜。偶联完成后，支持物上任何未反应的基团通过在室温下置于例如Tris、乙醇胺或甘氨酸缓冲液pH8-9中数小时来进行封闭。在封闭后，用例如封闭缓冲液和乙酸盐缓冲液pH3-4，采用使高和低pH相互交替的方法，来洗涤支持物。
一个特别的实施方案涉及用于减少含有目的维生素K依赖性蛋白质的第一组合物(例如细胞培养物上清液)中一种或多种蛋白质污染物含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使第一(例如未纯化的)组合物与携带有针对所述蛋白质污染物中至少一种蛋白质污染物的单克隆抗体的固相材料接触，和(ii)将因而产生的第二组合物与所述固相材料分离，从而获得其中蛋白质污染物水平减少至少5倍的组合物，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
因此，发现直接使用细胞培养物上清液，即没有任何先前的纯化步骤，是非常有利的。这可能是由于这样的事实：如果在实施本方法之前对细胞培养物上清液进行处理，那么目的维生素K依赖性蛋白质可能至少部分地切割蛋白质污染物，由此产生更复杂的蛋白质污染物的混合物。因而，在存在这种复杂的混合物时，可能更加难以减少蛋白质污染物的含量。
这就是说，应该理解，本发明还提供了一种备选方法，其中应用了相同的步骤，但是含有目的维生素K依赖性蛋白质的液体组合物不必是直接从细胞培养获得的细胞培养物上清液的组分。
蛋白质污染物通常是宿主细胞蛋白质，因此，通常产生单克隆抗体以针对选自宿主细胞蛋白质的蛋白质污染物，例如含有Gla-结构域的蛋白质污染物，特别是选自GAS-6、蛋白S、凝血因子II(凝血酶原)、凝血因子X/Xa、凝血因子IX/IXa、蛋白C、凝血因子VIIa、蛋白Z、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白1、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白2、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白3、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白4、基质Gia蛋白和骨钙蛋白的蛋白质污染物，更特别地是蛋白S。
如上面提到的，目的维生素K依赖性蛋白质通常是选自凝血因子VII多肽、凝血因子IX多肽、凝血因子X多肽和激活的蛋白C的维生素K依赖性凝血因子。在一个更特别的实施方案中，目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子IX多肽。在另一个更特别的实施方案中，目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
在一个实施方案中，占优势量的蛋白质污染物是含有Gla-结构域的多肽，特别是蛋白S，并且目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
这就是说，该方法使得可能产生减少至少10倍，或至少25倍，或至少50倍，例如减少至少100倍，或至少250倍，或至少500倍，或至少750倍，或至少1000倍，或至少2000倍的蛋白质污染物水平，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
特别地，在第二(纯化的)组合物中的蛋白质污染物总含量为至多100ppm，例如至多90ppm，或至多80ppm，或至多70ppm，或至多60ppm，或至多50ppm，或至多40ppm，或至多30ppm，或至多20ppm，或至多10ppm，或至多5ppm；或者在第二(纯化的)组合物中的蛋白S污染物总含量为至多100ppm，例如至多90ppm，或至多80ppm，或至多70ppm，或至多60ppm，或至多50ppm，或至多40ppm，或至多30ppm，或至多20ppm，或至多10ppm，或至多5ppm。
通常的细胞培养物上清液可能具有显著量的蛋白质污染物(特别是蛋白S)，因此，在细胞培养物上清液(例如未纯化的细胞培养物上清液)中的蛋白质污染物总含量通常为至少500ppm，例如至少750ppm，或至少1000ppm，或至少2000ppm；或者在未纯化的细胞培养物上清液中的蛋白S污染物总含量为至少500ppm，例如至少750ppm，或至少1000ppm，或至少2000ppm。
本发明的这一方面的一个特别的实施方案涉及用于减少含有凝血因子VII多肽的细胞培养物上清液中蛋白S污染物含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使第一组合物例如细胞培养物上清液与携带有针对蛋白S污染物的单克隆抗体的固相材料接触，和(ii)将因而产生的第二组合物与所述固相材料分离，从而获得其中蛋白S污染物水平减少至少50倍的组合物，所述蛋白S污染物水平表示为相对于目的凝血因子VII多肽的百万分率。
固定化的蛋白C
根据本发明的这个方面，所述蛋白质污染物中的至少一种被携带有固定化的蛋白C的固相材料结合。因而，组合物可以简单地与所述固相材料接触并随后与固相材料分离，从而获得至少更少污染的组合物。
更特别地，本发明提供了用于减少含有目的维生素K依赖性蛋白质的组合物中蛋白质污染物含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使第一组合物与携带有固定化的蛋白C的固相材料接触，和(ii)将因而产生的第二组合物与所述固相材料分离，从而获得其中蛋白质污染物水平减少至少5倍的组合物，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率，例如用于减少含有凝血因子VII多肽的组合物中蛋白S含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使第一组合物与携带有固定化的蛋白C的固相材料接触，和(ii)将因而产生的第二组合物与所述固相材料分离，从而获得其中蛋白质污染物水平减少至少10倍的组合物，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
应该理解，上述用于减少蛋白质污染物含量的方法可以单独或组合使用，例如相组合地使用。单独的色谱法步骤可以以任何合适的顺序实施。基于初步的研究，认为下面的组合提供了蛋白质污染物含量的极好的全面减少：
·阳离子交换层析→使用针对蛋白质污染物的单克隆抗体的免疫亲和法→阴离子交换层析
·阳离子交换层析→疏水作用层析→阴离子交换层析
·阳离子交换层析→疏水作用层析→使用针对蛋白质污染物的单克隆抗体的免疫亲和法→阴离子交换层析
·阴离子交换层析→使用针对目的蛋白的单克隆抗体的免疫亲和法→使用污染物单克隆抗体的免疫亲和法→阴离子交换层析→疏水作用层析
·阴离子交换层析→疏水作用层析→阳离子交换层析
·阴离子交换层析→疏水作用层析→使用针对蛋白质污染物的单克隆抗体的免疫亲和法→阳离子交换层析
·阴离子交换层析→使用针对目的蛋白的单克隆抗体的免疫亲和法→阴离子交换层析→疏水作用层析
·阳离子交换层析→羟磷灰石→阴离子交换层析
·阳离子交换层析→羟磷灰石→使用针对蛋白质污染物的单克隆抗体的免疫亲和法→阴离子交换层析
·使用针对目的蛋白的单克隆抗体的免疫亲和法→疏水作用层析→阴离子交换层析→使用针对蛋白质污染物的单克隆抗体的免疫亲和法→阴离子交换层析
·使用针对目的蛋白的单克隆抗体的免疫亲和法→阴离子交换层析→疏水作用层析→使用针对蛋白质污染物的单克隆抗体的免疫亲和法→阴离子交换层析
·羟磷灰石→疏水作用层析→阳离子交换层析→阴离子交换层析
·羟磷灰石→使用针对蛋白质污染物的单克隆抗体的免疫亲和法→阳离子交换层析→阴离子交换层析
·使用针对蛋白质污染物的单克隆抗体的免疫亲和法→疏水作用层析→阴离子交换层析
·使用针对蛋白质污染物的单克隆抗体的免疫亲和法→疏水作用层析→凝胶过滤→阴离子交换层析
·使用针对蛋白质污染物的单克隆抗体的免疫亲和法→阳离子交换层析→疏水作用层析→阴离子交换层析
·使用针对目的蛋白的单克隆抗体的免疫亲和法→阴离子交换层析→疏水作用层析→阳离子交换层析。
在一个特别的实施方案中，使用针对目的蛋白的单克隆抗体的免疫亲和法被用作纯化过程的第一个步骤。因此，发现直接使用细胞培养物上清液，即没有任何先前的纯化步骤，是非常有利的。应该理解，在上面描述的多步方法的每一步骤中，蛋白质污染物的减少通常为至少2倍，例如至少5倍。
含有目的维生素K依赖性蛋白质的新的组合物
据信本发明的方法产生了维生素K依赖性蛋白质(特别是凝血因子VII多肽)的组合物，其本身就是新的。
因此，本发明的进一步方面涉及含有在细胞培养条件下产生的目的维生素K依赖性蛋白质的组合物，其中蛋白质污染物的总含量基于目的维生素K依赖性蛋白质含量为至多100ppm。在其大多数实施方案中，蛋白质污染物的含量为0.01-100ppm，例如0.01～50ppm，例如0.05-25ppm，或0.05-20ppm，或0.05-15ppm，或0.05-10ppm，或0.05-5ppm。
本发明的一个备选方面涉及含有从无血清的非人细胞培养中获得的凝血因子VII多肽的组合物，其中蛋白S污染物的总含量基于凝血因子VII多肽含量为至多100ppm。在其大多数实施方案中，蛋白质污染物的含量为0.01-100ppm，例如0.01～50ppm，例如0.05-25ppm，或0.05-20ppm，或0.05-15ppm，或0.05-10ppm，或0.05-5ppm。
在上述的方面中，目的维生素K依赖性蛋白质通常是选自凝血因子VII多肽、凝血因子IX多肽、凝血因子X多肽和激活的蛋白C的维生素K依赖性凝血因子。在一个更特别的实施方案中，目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子IX多肽。在另一个更特别的实施方案中，目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
上述的一个更特别的实施方案涉及含有在细胞培养条件下产生的凝血因子VII多肽的组合物，其中蛋白S污染物的总含量基于凝血因子VII多肽含量为至多100ppm。
本发明通过下面的实施方案来进一步举例说明。
1.用于减少含有目的维生素K依赖性蛋白质的组合物中一种或多种蛋白质污染物含量的方法，所述方法至少包括下列步骤：(i)使第一组合物与能够结合一种或多种蛋白质污染物和/或目的维生素K依赖性蛋白质的固相材料接触，和(ii)收集因而产生的含有目的维生素K依赖性蛋白质的第二组合物，由此从所述第一组合物到所述因而产生的第二组合物，蛋白质污染物水平减少至少2倍，例如至少5倍，例如至少10倍，例如至少20倍，例如至少50倍，例如至少100倍，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
2.根据实施方案1的方法，其中在因而产生的含有目的维生素K依赖性蛋白质的第二组合物中蛋白质污染物的总含量为至多100ppm。
3.根据实施方案1-2中任一项的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是选自凝血因子VII多肽、凝血因子IX多肽、凝血因子X多肽和激活的蛋白C的维生素K依赖性凝血因子。
4.根据实施方案1-3的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子IX多肽。
5.根据实施方案1-3的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽，例如野生型人凝血因子VIIa。
6.根据实施方案5的方法，其中凝血因子VII多肽包含选自P10Q和K32E的氨基酸置换。
7.根据实施方案1-6中任一项的方法，其中占优势量的蛋白质污染物是含有Gla-结构域的多肽，特别是蛋白S，并且其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
8.根据实施方案1-7中任一项的方法，其中蛋白质污染物水平减少至少10倍，或至少25倍，或至少50倍，例如减少至少100倍，或至少250倍，或至少500倍，或至少750倍，或至少1000倍，或至少2000倍，或至少5000倍，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
9.根据实施方案1-8中任一项的方法，其中在因而产生的含有目的维生素K依赖性蛋白质的第二组合物中蛋白质污染物的总含量为至多100ppm，例如至多50ppm，例如至多10ppm，例如至多5ppm，例如至多2ppm，例如至多1ppm。
10.根据实施方案1-9中任一项的方法，其中在第一组合物中蛋白质污染物的总含量为至少500ppm。
11.根据实施方案1-10中任一项的方法，其中在第一组合物中蛋白S污染物的总含量为至少500ppm。
12.用于减少含有凝血因子VII多肽的组合物中一种或多种蛋白S污染物含量的方法，所述方法至少包括下列步骤：(i)使第一组合物与能够结合蛋白S污染物和/或凝血因子VII多肽的固相材料接触，和(ii)收集因而产生的含有凝血因子VII多肽的第二组合物，由此蛋白S污染物水平减少至少2倍，例如5倍，所述蛋白S污染物水平表示为相对于凝血因子VII多肽的百万分率。
13.根据实施方案1-11和12中任一项的方法，其中所述固相材料结合与目的维生素K依赖性蛋白质相比较相对更大数量的蛋白质污染物。
14.根据实施方案13的方法，其中所述固相材料例如通过强的亲和力或者通过共价结合所述污染物，如通过与所述污染物的巯基部分形成二硫键，来特异性地结合所述污染物中的至少一种。
15.根据实施方案13和14中任一项的方法，其中所述固相材料携带有针对所述蛋白质污染物中至少一种蛋白质污染物的单克隆抗体。
16.根据实施方案15的方法，其中含有目的维生素K依赖性蛋白质的组合物是细胞培养物上清液的组分。
17.根据实施方案14的方法，其中所述固相材料携带有固定化的蛋白C。
18.根据实施方案1-11和12中任一项的方法，其中与蛋白质污染物相比较，所述固相材料结合相对更大量的目的维生素K依赖性蛋白质。
19.根据实施方案18的方法，其中所述固相材料特异性地结合目的维生素K依赖性蛋白质。
20.根据实施方案18和19中任一项的方法，其中所述固相材料携带有针对目的维生素K依赖性蛋白质或其类似物的单克隆抗体。
21.根据实施方案18和19中任一项的方法，其中所述固相材料是对目的维生素K依赖性蛋白质或其类似物具有亲和力的三嗪配体。
22.根据实施方案18和19中任一项的方法，其中所述固相材料携带有所述目的维生素K依赖性蛋白质的抑制剂，或携带有能够与所述目的维生素K依赖性蛋白质形成螯合物的金属，或携带有固定化的组织因子(促凝血酶原激酶)，或携带有固定化的肝素。
23.根据实施方案22的方法，其中所述目的维生素K依赖性蛋白质的抑制剂是苄脒-或胍-类型的抑制剂，例如包含-C(＝N-Z1-R1)-NH-Z2-R2基序的那些抑制剂，其中
Z1和Z2独立地选自-O-、-S-、-NRH-和单键，其中RH选自氢、C1-4-烷基、芳基和芳基甲基，并且R1和R2独立地选自氢、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-链烯基、任选取代的芳基、任选取代的杂环基，或者
Z2和R2是如上定义的，并且-C＝N-Z1-R1形成杂环的一部分，或者
Z1和R1是如上定义的，并且-C-NH-Z2-R2形成杂环的一部分，或者
-C(＝N-Z1-R1)-NH-Z2-R2形成其中-Z1-R1-R2-Z2-是双游离基的杂环。
24.根据实施方案1-11和12中任一项的方法，其中所述固相材料是色谱材料。
25.根据实施方案1-11和12中任一项的方法，其中所述固相材料结合至膜上。
26.根据实施方案22-23的方法，其中所述固相材料是阴离子交换材料。
27.根据实施方案26的方法，其中从阴离子交换的洗脱通过增加钙盐例如CaCl2的浓度来进行。
28.根据实施方案26的方法，其中从阴离子交换的洗脱通过增加镁盐例如MgCl2的浓度来进行。
29.根据实施方案24的方法，其中所述固相材料是阳离子交换材料。
30.根据实施方案24的方法，其中所述固相材料是羟磷灰石。
31.根据实施方案24的方法，其中所述固相材料是疏水性固相材料。
32.用于减少含有目的维生素K依赖性蛋白质的组合物(特别是细胞培养物上清液)中一种或多种蛋白质污染物含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使第一组合物与携带有针对所述蛋白质污染物中至少一种蛋白质污染物的单克隆抗体的固相材料接触，和(ii)将因而产生的第二组合物与所述固相材料分离，从而获得其中蛋白质污染物水平减少至少5倍的组合物，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
33.根据实施方案32的方法，其中所述单克隆抗体针对选自宿主细胞蛋白质的蛋白质污染物，例如含有Gla-结构域的蛋白质污染物，特别是选自GAS-6、蛋白S、凝血因子II(凝血酶原)、凝血酶、凝血因子X/Xa、凝血因子IX/IXa、蛋白C、凝血因子VII/VIIa、蛋白Z、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白1、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白2、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白3、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白4、基质Gla蛋白和骨钙蛋白的蛋白质污染物，更特别地是蛋白S。
34.根据实施方案27-28中任一项的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是选自凝血因子VII多肽、凝血因子IX多肽、凝血因子X多肽和激活的蛋白C的维生素K依赖性凝血因子。
35.根据实施方案29的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子IX多肽。
36.根据实施方案29的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
37.根据实施方案32-36中任一项的方法，其中占优势量的蛋白质污染物是含有Gla-结构域的多肽，特别是蛋白S，并且其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
38.根据实施方案32-37中任一项的方法，其中占优势量的蛋白质污染物是仓鼠蛋白S。
39.根据实施方案32-38中任一项的方法，其中蛋白质污染物水平减少至少10倍，或至少25倍，或至少50倍，例如减少至少100倍，或至少250倍，或至少500倍，或至少750倍，或至少1000倍，或至少2000倍，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
40.根据实施方案32-39中任一项的方法，其中在因而产生的第二组合物中蛋白质污染物的总含量为至多100ppm。
41.根据实施方案32-40中任一项的方法，其中在因而产生的第二组合物中蛋白S污染物的总含量为至多100ppm。
42.根据实施方案32-41中任一项的方法，其中在第一组合物中蛋白质污染物的总含量为至少500ppm。
43.根据实施方案32-42中任一项的方法，其中在第一组合物中蛋白S污染物的总含量为至少500ppm。
44.用于减少含有凝血因子VII多肽的组合物例如细胞培养物上清液中蛋白S污染物含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使第一组合物例如细胞培养物上清液与携带有针对蛋白S污染物的单克隆抗体的固相材料接触，和(ii)将因而产生的第二组合物与所述固相材料分离，从而获得其中蛋白S污染物水平减少至少50倍的组合物，所述蛋白S污染物水平表示为相对于目的凝血因子VII多肽的百万分率。
45.用于减少含有目的维生素K依赖性蛋白质的组合物中蛋白质污染物含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使第一组合物与携带有固定化的蛋白C的固相材料接触，和(ii)将因而产生的第二组合物与所述固相材料分离，从而获得其中蛋白质污染物水平减少至少5倍的组合物，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
46.根据实施方案45的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是选自凝血因子VII多肽、凝血因子IX多肽、凝血因子X多肽和激活的蛋白C的维生素K依赖性凝血因子。
47.根据实施方案46的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子IX多肽。
48.根据实施方案46的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
49.根据实施方案45-48中任一项的方法，其中占优势量的蛋白质污染物是含有Gla-结构域的多肽，特别是蛋白S，并且其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
50.根据实施方案45-49中任一项的方法，其中蛋白质污染物水平减少至少10倍，或至少25倍，或至少50倍，例如减少至少100倍，或至少250倍，或至少500倍，或至少750倍，或至少1000倍，或至少2000倍，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
51.根据实施方案45-50中任一项的方法，其中在所述因而产生的第二组合物中蛋白质污染物的总含量为至多100ppm。
52.根据实施方案45-51中任一项的方法，其中在所述因而产生的第二组合物中蛋白S污染物的总含量为至多100ppm。
53.根据实施方案45-52中任一项的方法，其中在所述第一组合物中蛋白质污染物的总含量为至少500ppm。
54.根据实施方案45-53中任一项的方法，其中在所述第一组合物中蛋白S污染物的总含量为至少500ppm。
55.用于减少含有凝血因子VII多肽的组合物中蛋白S含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使第一组合物与携带有固定化的蛋白C的固相材料接触，和(ii)将因而产生的第二组合物与所述固相材料分离，从而获得其中蛋白质污染物水平减少至少10倍的组合物，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
56.用于减少含有目的维生素K依赖性蛋白质的细胞培养物上清液中一种或多种蛋白质污染物含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使细胞培养物上清液与携带有针对目的维生素K依赖性蛋白质或其类似物的单克隆抗体的固相材料接触，(ii)任选地，洗涤所述固相材料，和(iii)从所述固相材料中洗脱目的维生素K依赖性蛋白质，从而获得其中蛋白质污染物水平减少至少5倍的因而产生的组合物，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
57.根据实施方案56的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是选自凝血因子VII多肽、凝血因子IX多肽、凝血因子X多肽和激活的蛋白C的维生素K依赖性凝血因子。
58.根据实施方案57的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子IX多肽。
59.根据实施方案57的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
60.根据实施方案56-59中任一项的方法，其中占优势量的蛋白质污染物是含有Gla-结构域的多肽，特别是蛋白S，并且其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
61.根据实施方案56-60中任一项的方法，其中蛋白质污染物水平减少至少10倍，或至少25倍，或至少50倍，例如减少至少100倍，或至少250倍，或至少500倍，或至少750倍，或至少1000倍，或至少2000倍，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
62.根据实施方案56-61中任一项的方法，其中在所述因而产生的组合物中蛋白质污染物的总含量为至多100ppm。
63.根据实施方案56-62中任一项的方法，其中在所述因而产生的组合物中蛋白S污染物的总含量为至多100ppm。
64.根据实施方案56-63中任一项的方法，其中在细胞培养物上清液中蛋白质污染物的总含量为至少500ppm。
65.根据实施方案56-64中任一项的方法，其中在细胞培养物上清液中蛋白S污染物的总含量为至少500ppm。
66.用于减少含有凝血因子VII多肽的细胞培养物上清液中蛋白质污染物含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使细胞培养物上清液与携带有针对凝血因子VII多肽或其类似物的单克隆抗体的固相材料接触，(ii)任选地，洗涤所述固相材料，和(iii)从所述固相材料中洗脱凝血因子VII多肽，从而获得其中蛋白质污染物水平减少至少100倍的因而产生的组合物，所述蛋白质污染物水平表示为相对于凝血因子VII多肽的百万分率。
67.用于减少含有凝血因子VII多肽的细胞培养物上清液中蛋白S含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使细胞培养物上清液与携带有针对凝血因子VII多肽或其类似物的单克隆抗体的固相材料接触，(ii)任选地，洗涤所述固相材料，和(iii)从所述固相材料中洗脱凝血因子VII多肽，从而获得其中蛋白S水平减少至少100倍的因而产生的组合物，所述蛋白S水平表示为相对于凝血因子VII多肽的百万分率。
68.含有在细胞培养条件下产生的目的维生素K依赖性蛋白质的组合物，其中蛋白质污染物的总含量基于目的维生素K依赖性蛋白质含量为至多100ppm。
69.根据实施方案68的组合物，其中蛋白质污染物的含量为0.01-100ppm，例如0.01-50ppm，例如0.05-25ppm，或0.05-20ppm，或0.05-15ppm，或0.05-10ppm，或0.05-5ppm。
70.含有从无血清的非人细胞培养中获得的凝血因子VII多肽的组合物，其中蛋白S污染物的总含量基于凝血因子VII多肽含量为至多100ppm。
71.含有从无血清的非人细胞培养中获得的凝血因子IX多肽的组合物，其中蛋白S污染物的总含量基于凝血因子IX多肽含量为至多100ppm。
72.根据实施方案67-71中任一项的组合物，其中蛋白S污染物的含量为0.01-100ppm，例如0.01-50ppm，例如0.05-25ppm，或0.05-20ppm，或0.05-15ppm，或0.05-10ppm，或0.05-5ppm。
73.根据实施方案67-72中任一项的组合物，其中目的维生素K依赖性蛋白质是选自凝血因子VII多肽、凝血因子IX多肽、凝血因子X多肽和激活的蛋白C的维生素K依赖性凝血因子。
74.根据实施方案73的组合物，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子IX多肽。
75.根据实施方案73的组合物，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
76.含有在细胞培养条件下产生的凝血因子VII多肽的组合物，其中蛋白S污染物的总含量基于凝血因子VII多肽含量为至多100ppm，例如0.01-100ppm。
实验
抗仓鼠蛋白S的单克隆抗体
使用用从SF-凝血因子VIIa产品中分离的仓鼠蛋白S汇集物免疫的RBF小鼠，并通过使用将FoxNy骨髓瘤作为RBF脾细胞的融合配对物的融合技术，而形成了这些抗体。所述单克隆抗体识别在凝血酶切割位点之外以及在C4BP结合区域之外的任何表位。此外，所述单克隆抗体可以是不依赖于Ca2+的，也可以是依赖于Ca2+的。所述单克隆抗体可以是任何Ig类型。
不依赖于Ca2+的抗仓鼠蛋白S的单克隆抗体旨在用于检测在从CHO细胞产生的任何药物中的仓鼠蛋白S污染。此外，打算使用依赖于Ca2+的抗仓鼠蛋白S的单克隆抗体来从由CHO细胞产生的药物的产品中分离和纯化仓鼠蛋白S，并且特别是用于减少(例如消除)维生素K依赖性蛋白质组合物中的蛋白S含量。
用从SF-凝血因子VIIa产品(批次HW3-029汇集物，含有＜1％的凝血因子VIIa)中分离的仓鼠蛋白S免疫RBF小鼠。在6周后，使用FoxNy骨髓瘤进行两次融合。分离出数个杂交瘤，并在不同的Ca2+浓度(从无Ca2+存在到35mM Ca2+的Ca2+浓度)下检测它们与蛋白S的结合能力。四种单克隆抗体(ProS-1 F18、ProS-1 F22、ProS-2 F32和ProS-2 F46)由于它们不依赖于Ca2+而被选择出来，并将它们分型为IgG1或IgG2a同种型。使用这四种不依赖于Ca2+的抗体中的两种(ProS-1 F18和ProS-2 F32)来实施夹心ELISA测定法以确定以Ca2+依赖性方式的仓鼠蛋白S污染，因为这两种抗体显示出良好的协作。这四种不依赖于Ca2+的单克隆抗体的相对亲和力是相当低的。此外，我们已经显示，对凝血因子VIIa不存在交叉反应性。在用于人蛋白S检测的ELISA中使用一种单克隆抗体，ProS-1 F22。F22根本不识别人蛋白S。最可能的是，这些单克隆抗体的情况都是这样。此外，我们已经产生了三种依赖于Ca2+的抗体，ProS-2 F15、ProS-2 F35和ProS-2 F44，它们在存在20mM柠檬酸盐，即不存在Ca2+时，都不结合任何蛋白S。这三种抗体对蛋白S的结合能力随着Ca2+浓度(2.5mM至35mM的Ca2+)而变化，但都显著不同于不存在Ca2+的时候。冷冻这三种抗体直到进一步通知。
仓鼠蛋白S含量的测定，使用单克隆抗体的ELISA
仓鼠蛋白S的相对含量用夹心ELISA来测定，该ELISA使用两种不同的单克隆抗体。所述抗体用来自CHO细胞的纯化的蛋白S在小鼠中产生。
将96孔Nunc maxisorb微量滴定板用抗体ProS-2-F32包被，该抗体的功能是捕获抗原。
包被过程如下：将100μl含有大约5μg/ml ProS-2-F32(将1.93mg/ml的储液在0.1M Na2HCO3pH9.8中作1∶386稀释)的溶液施加于96孔Nunc微量滴定板的每个孔中，将平板密封器加在该平板的顶部，并将平板在1和9℃之间孵育过夜。
第2天，在初步孵育后弃去溶液，并如下对每个孔进行封闭：加350μl封闭缓冲液(磷酸缓冲盐水(PBS)，0.010M磷酸盐和0.15M NaCl，0.1％吐温20pH7.2)至每个孔中，并且将平板密封器加至平板上并在室温下孵育平板1小时，其中将室温定义为18至25℃。在封闭-孵育期完成后，弃去溶液，并使用350μl洗涤缓冲液(0.010M磷酸盐和0.15M NaCl、0.05％吐温20pH7.2)将每个孔洗涤独立的3次。
将校准品和样品在含有柠檬酸盐的Tris缓冲液(0.010M Tris；0.15M NaCl、0.050M柠檬酸盐、0.1％v/v吐温20，pH8.6)中适当稀释，对照在具有载体蛋白的Tris缓冲液(0.010M Tris、0.15M NaCl、0.1％v/v吐温20、1％BSA，pH8.0)中稀释。将100μl的校准品、对照和样品中的每一种施加于Nunc平板中，加上平板密封器，并在1和9℃之间将平板孵育过夜。
第3天。将孔清空并如上使用PBS洗涤缓冲液洗涤平板3次，并加入经生物素标记的抗体ProS-1-F18以用于检测抗原-抗体复合物。将经生物素标记的ProS-1-F18抗体溶液在TBS(0.010M Tris；0.15M NaCl、0.1％吐温20pH8.6)中作1∶1000稀释并将100μl加入至每个孔，加上平板密封器，并将该平板在室温下孵育1小时。弃去溶液，并如上用350μl PBS洗涤缓冲液洗涤平板3次。
加入100μl在TBS(0.010M Tris；0.15M NaCl、0.1％吐温20pH8.6)中作1∶10000稀释的辣根过氧化物酶抗生物素蛋白D溶液，加上平板密封器，并在室温下孵育平板1小时。用PBS、洗涤缓冲液洗涤平板3次，并最后加入100μl TMB底物。在室温下于暗处孵育平板10分钟，加入100μl 2M磷酸以终止反应，并在450nm处测量吸光度(用620nm作为参照)。
仓鼠蛋白S含量的测定，使用多克隆抗体的ELISA
仓鼠蛋白S的含量在基于多克隆抗体的夹心ELISA中测定。
用一抗包被：将96孔Nunc maxisorb微量培养板用多克隆抗体Rb-α-Hu蛋白S(Dakocytomation code nr.A0384)包被。将具有4.1mg/ml的蛋白质浓度的抗体溶液在包被缓冲液(碳酸氢盐缓冲液，pH9.6；3.03g Na2CO3；5.98g NaHCO3；加水至1L)中稀释至5.0μg/ml(相当于1∶820的稀释度)。将100μl加入每个孔中，用作空白的孔A1和A2除外。在4℃下将平板孵育过夜。
第二天上午，弃去溶液，并用洗涤缓冲液(吐温/PBS)洗涤平板3次(350μl)。随后用稀释缓冲液(BSA/吐温/PBS)封闭该平板(孔A1和A2除外)。加上平板密封器，让该平板在室温下封闭1小时，之后用洗涤缓冲液(洗涤缓冲液(PBS/吐温，pH7.4)；16.0g NaCl；0.40g KH2PO4；2.30g Na2HPO4；0.40g KCl；1ml吐温20；加水至2L)洗涤平板3次(350μl)。
样品、对照和标准品：将浓度为1120μg/ml的蛋白S标准品在稀释缓冲液(稀释缓冲液(BSA/吐温/PBS)：0.5g牛血清白蛋白(Sigma，A-7030)；加洗涤缓冲液至100ml)中稀释至浓度为25ng/ml(1∶44800)。这种标准品通过2-倍步骤在稀释缓冲液中进一步稀释至0.78ng/ml的最低标准。阳性对照由在稀释缓冲液中稀释至2.5ng/ml的浓度的人蛋白S(American Diagnostica，代码443)组成。通过仅将稀释缓冲液加入一对孔中而加入了配对对照(conjugatecontrol)。样品在稀释缓冲液中稀释，目标是1至10ng/ml的浓度，这对应于标准曲线的线性部分。标准品、对照和样品都一式两份地置于平板上，并加上平板密封器在4℃下孵育过夜。
用缀合有HRP的二抗进行孵育：将孔清空，并如上使用吐温/PBS洗涤缓冲液洗涤平板3次。将Rb-α-人蛋白S、HRP(Dakocytomation代码nr.P0419)在稀释缓冲液中稀释1000倍，并将100μl加入至除A1+A2外的每个孔中。在摇动器上，让平板在室温下孵育1小时，然后用洗涤缓冲液将其洗涤3次(350μl)。
检测：将100μl底物溶液加入至所有的孔中。在即将使用前，底物溶液由在12ml超纯水和5μl30％H2O2中的4个OPD药片(每片2mg)(Dakocytomation代码S2045)来构成。让反应进行15分钟，随后通过每孔加入50μl 2.5M的H2SO4来终止。平板在微量培养板读取器中于492nm下进行读取。
A.使用抗蛋白S的单克隆抗体的免疫亲和法
实施例1
蛋白S的减少在的Amersham HiTrap NHS活化的柱(1ml柱体积(CV))上进行，所述柱偶联有针对仓鼠蛋白S而在小鼠中进行培育的单克隆抗体(MAb)(0.4mg MAb/ml填满的柱)。该柱用10CV的10mM Na2HPO4，150mM NaCl pH7.5平衡，并且上样物是100CV的电导率为14mS/cm的溶液，其含有1.49mg/ml的凝血因子VIIa以及大于300ppm的蛋白S含量(钙用柠檬酸盐螯合)，随后用10CV的10mM Na2HPO4，150mM NaCl pH7.5进行洗涤。整个步骤在60CV/h的流速和5℃的温度下进行。小痕量的蛋白S和凝血因子VIIa用20mMNa2HPO4，2M NaCl pH7.2洗脱(通过SDS-PAGE/银染色确认)，随后用50mM柠檬酸盐pH3.0洗脱出结合的蛋白S，并用50mM甘氨酸pH2.0解吸小部分的凝血因子VIIa(＜1％的上样量)。用10CV的Na2HPO4，150mM NaCl pH7.5再次平衡该柱。在走过液(run-through)中通过ELISA测量出，蛋白S水平低于30ppm，即减少至少10倍。
实施例2
蛋白S的减少在偶联有单克隆抗体(MAb)(0.4mg MAb/ml填满的柱)的Amersham HiTrap NHS活化的柱(1ml柱体积(CV))上进行，所述单克隆抗体是针对仓鼠蛋白S而在小鼠中进行培育的。该柱用10CV的15mM Tris，150mM NaCl pH7.5平衡，并且上样物是108CV的蛋白S含量大于150ppm的、电导率为12mS/cm的溶液(存在10mM钙)，随后用10CV的15mM Tris，150mM NaCl pH7.5进行洗涤。在5℃的温度下，上样和洗涤在24CV/h的流速下进行，该程序的其余部分在60CV/hr的流速下进行。该柱用15CV的50mM柠檬酸盐pH3.0进行清洁，然后用10CV的15mM Tris，150mM NaClpH7.5再次平衡，最后用12CV的50mM甘氨酸pH2.0进行清洁，并用10CV的15mM Tris，150mM NaCl pH7.5使其再次平衡。在走过液中通过ELISA测量出，蛋白S水平低于15ppm，即减少至少10倍。
实施例3
蛋白S的减少在来自GE Healthcare的CNBr-活化的Sepharose4FF介质上进行，所述介质固定有针对仓鼠蛋白S而在小鼠中培育的单克隆抗体(MAb)(0.8mg蛋白S的MAb/ml介质)。该柱用10CV的75mM Tris，30mM柠檬酸三钠pH7.5平衡，并且上样物是32CV的蛋白S含量为665ng/ml≈485ng/mg rFVIIa的溶液，之后用20CV的75mM Tris，30mM柠檬酸三钠pH7.5进行洗涤。用10CV的50mM甘氨酸pH2.0再生该柱，并用8CV的75mM Tris，30mM柠檬酸三钠pH7.5再次平衡。在走过级分(run-through fraction)中通过ELISA测量出，蛋白S水平为2.6ng/ml≈3ng/mg rFVIIa，即减少至少160倍。上样和洗涤在7.2CV/h的流速下进行，该程序的其余部分在40CV/h的流速下进行。温度是5℃。
实施例4
作为填满的柱床的备选方案，蛋白S的减少在Sartorius经环氧活化的膜装置(膜体积＝2.1ml)上进行，所述膜装置固定有针对仓鼠蛋白S而在小鼠中培育的单克隆抗体(MAb)(1mg蛋白S的MAb/个膜装置)。该膜用10MV(膜体积)的75mM Tris，30mM柠檬酸三钠pH7.5平衡，并且上样物是14MV的蛋白S含量为683ng/ml≈502ng/mg rFVIIa的溶液，之后用8MV的75mM Tris，30mM柠檬酸三钠pH7.5进行洗涤。用10MV的50mM甘氨酸pH2.0再生该膜，并用8MV的75mM Tris，30mM柠檬酸三钠pH7.5再次平衡。在走过级分中通过ELISA测量出，蛋白S水平为9.1ng/ml≈8ng/mg rFVIIa，即减少至少62倍。该膜方法在143MV/h的流速和5℃的温度下进行。
实施例5：FIX溶液的纯化
蛋白S的减少在Amersham NHS活化的Sepharose FF柱(0.9ml柱体积(CV))上进行，所述柱偶联有针对仓鼠蛋白S而在小鼠中进行培育的单克隆抗体(MAb)(0.8mg MAb/ml填满的柱)。该柱用10CV的15mM Tris，150mM NaCl，pH7.5平衡。如包装插页所描述的，将BeneFIX(1000IE；批号LE07D002AF)悬浮于10mL水中。将5mL的含有大约2mg FIX的该溶液上样至柱上。通过单克隆ELISA测量出蛋白S的含量为230ng/mL，总共约1150ng蛋白S。用10CV的平衡缓冲液洗涤该柱，并用15mM Tris，2M NaCl，pH7.5洗脱。发现FIX存在于洗涤和洗脱级分中。通过单克隆ELISA测量出，在洗涤和洗脱级分中蛋白S的含量分别为26和52ng。
B.阴离子交换层析
实施例6-在pH8.6下实施阴离子交换层析
阴离子交换层析在填充有Amersham Q-Sepharose FF的并用5CV的10mM甘氨酰甘氨酸，175mM NaCl，pH8.6平衡的柱(内径1cm×长度1.3cm＝1.0ml柱体积(CV))上进行。上样物是35ml的含有大于300ppm的蛋白S含量的溶液。用7CV的10mM甘氨酰甘氨酸，175mM NaCl和4CV的10mM甘氨酰甘氨酸，50mM NaCl洗涤该柱。洗脱用0mM CaCl2至15mM CaCl2的20CV线性梯度来进行，所述线性梯度用含有50mM NaCl的甘氨酰甘氨酸进行缓冲。纯化在40CV/h的流速和5℃的温度下进行。汇集物中含有低于30ppm的蛋白S水平，即减少至少10倍。
实施例7-在pH8.6下实施阴离子交换层析以通过使用NaCl洗脱 来纯化FIX溶液
阴离子交换层析在填充有Amersham Q-Sepharose FF的并用10CV的10mM Tris，175mM NaCl，pH8.6平衡的柱(内径0.5cm×长度5cm＝1.0ml柱体积(CV))上进行。如包装插页所描述的，将BeneFIX(1000IE；批号LE07D051AD)悬浮于10mL水中。将3mL的含有大约1.2mg FIX的该溶液上样至柱上。通过多克隆ELISA测量出蛋白S的含量为280ng/mL，在上样溶液中总共为840ng。用7CV的平衡缓冲液洗涤该柱，然后用3CV的15mM Tris，50mM NaCl，pH8.6洗涤。随后用这种洗涤缓冲液并同时在5CV等度洗脱步骤(isocraticsteps)中增加CaCl2的含量(3-5-7-9mM)来洗涤该柱，之后用10CV的15mM Tris，50mM NaCl，15mM CaCl2进行洗涤。FIX的洗脱通过10mM Tris，1M NaCl来进行。在用含有15mM CaCl2的缓冲液获得的最后的洗涤级分中，SDS-PAGE显示出弱的条带。
通过多克隆ELISA测量出，洗脱级分中蛋白S的量为小于1.5ng/mL或小于7.5ng。
实施例8-在pH8.0下实施阴离子交换层析以纯化含有氨基酸置换 P10Q和K32E的FVII-多肽
阴离子交换层析在填充有AmershamQ-Sepharose FF的并用10CV的10mM Tris，50mM NaCl，pH8平衡的柱(内径1cm×长度3.2cm＝2.5ml柱体积(CV))上进行。向150mL含有具有P10Q、K32E突变的FVII变体的培养物上清液加入2.2mL 0.5M EDTA溶液。通过加入260mL WFI(注射用水)来调节电导率。通过ELISA测量出蛋白S的含量为284ng/mL或总共为97微克。用10CV的10mM Tris，175mM NaCl，pH8洗涤该柱，随后用平衡缓冲液洗涤。洗脱通过10mM Tris，50mM NaCl，35mM CaCl2，pH8来进行。通过多克隆ELISA测量出，在洗脱汇集物中蛋白S的含量为18μg。纯化在24CV/h的流速和室温下进行。
实施例9-使用MgCl2梯度洗脱在pH6.0下实施阴离子交换层析
阴离子交换层析在填充有Amersham Q-Sepharose FF的并用10CV的10mM组氨酸，175mM NaCl，pH6平衡的柱(内径1cm×长度3.2cm＝2.5ml柱体积(CV))上进行。将8mL含有1.6mg/mL FVII多肽的溶液上样至柱上。通过ELISA测量出蛋白S的含量为360ng/mL或总共为2900ng。用10CV的平衡缓冲液洗涤该柱，随后用5CV的洗涤缓冲液10mM组氨酸，50mM NaCl，pH6进行洗涤。洗脱通过从洗涤缓冲液到10mM组氨酸，50mM MgCl2，pH6的梯度来进行。通过多克隆ELISA测量出，在洗脱汇集物中蛋白S的含量为790ng。纯化在24CV/h的流速和5℃下进行。
实施例10-在pH9.0下实施阴离子交换层析
阴离子交换层析在填充有Amersham Source30Q的并用10CV的10mM Tris，2mM CaCl2平衡的柱(内径0.5cm×长度5.5cm＝1.0ml柱体积(CV))上于pH9.0下进行。上样物是8ml的含有1mg/ml FVII并且蛋白S含量大于10ppm的溶液。用5CV的10mM Tris，2mM CaCl2洗涤该柱。洗脱用0mM NaCl至600mM NaCl的50CV线性梯度来进行，所述线性梯度用含有2mM CaCl2的Tris进行缓冲。用蛋白S的ELISA来评估收集的级分中的蛋白S水平。蛋白S在含有＞99％FVII的主峰的前沿洗脱。纯化在60CV/h的流速和5℃的温度下进行。
C.疏水作用层析
实施例11-实施疏水作用层析
疏水作用层析在填充有Toso Haas TSK-Gel phenyl 5PW的并用10CV的10mM柠檬酸盐，1.7M NH4-乙酸盐平衡的柱(内径2.6cm×长度8.5cm＝45.1ml柱体积(CV))上于pH6.0下进行。上样物是215ml的含有大约700μg/ml FVII并且蛋白S含量大于200ppm的溶液。将1.7M NH4-乙酸盐加入至上样溶液中。用5CV的10mM柠檬酸盐，1.7M NH4-乙酸盐洗涤该柱。洗脱用1.7M NH4-乙酸盐至0M NH4-酸盐的20CV线性梯度来进行，所述线性梯度用柠檬酸盐进行缓冲。汇集物含有低于100ppm的蛋白S水平，即减少至少2倍。纯化在20CV/h的流速和5℃的温度下进行。
实施例12-在存在Ca2+时实施HIC
疏水作用层析(HIC)在填充有Toyopearl MD-G丁基树脂的柱(内径1cm×长度7cm＝5.5ml)上进行。该柱用10CV的35mM CaCl2，1.5M NaCl，10mM组氨酸，pH6.0平衡。平衡后，将42ml含有0.1mg/ml FVIIa的溶液上样至柱上。上样后，用10CV的平衡缓冲液洗涤该柱。用20mM EDTA，50mM组氨酸，pH6.0洗脱结合的FVII(a)。收集含有FVII(a)的汇集物，其具有减少的蛋白S含量。
D-1.使用Ca2+-依赖性抗-FVIIa单克隆抗体的免疫亲和法
实施例13-在pH6下进行免疫亲和捕获
通过加入钙至10mM Ca2+的浓度和通过加入组氨酸缓冲液至10mM的浓度来稳定一份1500ml的CHO K1培养物上清液，用HCl调节至pH6.0，并通过大约45微米的死端式过滤器进行过滤。将经稳定的培养物上清液上样至填充有固定在Pharmacia Sepharose 4B上的Ca2+-依赖性抗-FVIIa单克隆抗体的柱(内径1.6cm×长度10cm＝20mlCV)上。在上样之前，用5CV的10mM CaCl2，10mM组氨酸，pH6.0平衡该柱。在上样之后，用10CV的2M NaCl，10mM CaCl2，10mM组氨酸，pH6.0洗涤该柱。用10CV的30mM EDTA，50mM组氨酸，pH6.0洗脱结合的FVII(a)。从主峰前沿上大约0.1AU(280nm)至后沿上大约0.1AU(280nm)，收集含有FVII(a)的汇集物。在整个纯化过程中使用12CV/h的流速和5℃的温度。蛋白S水平通过基于多克隆抗huPS的蛋白S ELISA来测定。
D-2.使用固定化配体的亲和纯化
实施例14-使用固定化的苄脒类似物的FVII类似物的亲和纯化
将1mL柱体积(CV)的经NHS活化的HiTrap(GE Healthcare)与苄脒类似物(式1或式2)偶联。用5CV的50mM HEPES，100mM NaCl，5mM CaCl2，0.01％吐温80，pH7.5平衡该柱。该柱用0.5CV的含有FVII类似物和20mg/L蛋白S的pH7.5溶液进行上样。在上样后，用6CV的平衡缓冲液洗涤柱。用5CV的50mM HAc，100mM NaCl，5mM CaCl2，0.01％吐温80，pH4.4以及4CV的50mM Gly-HCl，100mM NaCl，5mM CaCl2，0.01％吐温80，pH3.0进行洗脱。洗脱后立刻将洗出液的pH调节至pH6。流速为每小时30CV，并且在室温下进行过柱。大多数蛋白S不结合树脂，并在流过液(flow-through)和洗涤下来的液体中观察到。对于FVII则观察到相反的情形，其中大多数结合树脂，并且随着pH降低而洗脱下来。分别使用固定有式1或式2化合物的柱，通过单克隆ELISA测量出，洗脱级分中的蛋白S含量是大约150ng和180ng。
式1：
Figure A20058004648600551
式2：
实施例15-使用固定化的三嗪配体的蛋白S的亲和纯化(流过模式 (flow through mode))
纯化在填充有ACL 5/5(ProMetic)的并用10CV的20mM Tris，100mM NaCl，5mM CaCl2，pH8.5平衡的柱(内径1cm×长度6.2cm＝5mL柱体积(CV))上进行。上样物是43mL含有大于40000ppm的蛋白S的溶液。用2CV的20mM Tris，100mM NaCl，5mM CaCl2，pH8.5洗涤该柱。洗脱用从20mM Tris，100mM NaCl，5mM CaCl2，pH8.5到20mM Tris，1M NaCl，5mM CaCl2，pH8.5的40CV线性梯度来进行。收集含有FVII的汇集物，得到含有低于7000ppm蛋白S的蛋白S水平的洗出液。
E.阳离子交换层析
实施例16-来自Amersham目录号11-0010的ObelixCIE阳离子交 换剂
将培养基上样至阳离子交换树脂上。用30mM NaAc pH7.0平衡该柱。在室温下流速为48CV/H。上样后，用平衡缓冲液洗涤树脂，然后用5-10柱体积的1M NaAc pH7洗涤。再次使用10柱体积的平衡缓冲液。用30mM NaAc，2M NaCl，pH6.3或者更高pH的Tris缓冲液和NaCl来洗脱产物。基于UV收集汇集物并立即冷却。蛋白S在洗涤步骤中洗脱。在使用后，柱用1M NaOH进行清洁。
备选地，向施加物中加入NaAc至1M pH7，并用相同的缓冲液洗涤。平衡缓冲液是1M NaAc pH7.0。在施加后，用平衡缓冲液洗出未结合的材料。用10cv的30mM NaAc pH6.3进行洗涤，并且通过30mM NaAc，2M NaCl pH6.3或更高pH的Tris缓冲液和NaCl来洗脱产品。基于UV收集汇集物。蛋白S在洗涤步骤中洗脱。
树脂也可以以下面的方式使用：用30mM NaAc pH6.0平衡并施加产物(电导率低于10mS/cm)。用平衡缓冲液洗出未结合的材料，并通过增加NaCl梯度来进行洗脱。室温下流速为30cv/h。基于UV收集汇集物。蛋白S在产物的前面洗脱。
实施例17-SP-Sepharose HP，Amersham目录号17-1087
用50mM Mes，50mM NaCl，2.5mM CaCl2，pH5.75平衡柱。将施加物调节至电导率低于10mS/cm。用平衡缓冲液洗涤出未结合的材料，然后通过增加NaCl浓度来洗脱产物。流速是每小时48柱体积，并且纯化在冷室中进行。
蛋白S洗脱在走过级分中。在使用后，柱用1M NaOH进行清洁。
实施例18-Toyopearl SP650M
含有大约25mg/l FVII和25mg/l蛋白S的混合物中蛋白S的减少在1ml(内径0.5cm×柱床高5cm)Toyopearl SP 650M(TosohBioscience)柱上进行。用10柱体积(CV)的10mM组氨酸缓冲液(pH6)平衡该柱，并将0.5ml含有FVII和蛋白S的混合物上样至柱上。用1CV的10mM组氨酸缓冲液(pH6)洗涤/洗脱该柱，随后用在10mM组氨酸缓冲液(pH6)中的0-1M NaCl进行梯度洗涤/洗脱。整个纯化步骤在室温下以48CV/h的流速进行。蛋白S洗脱在流过液中，和FVII在梯度洗脱过程中洗脱。蛋白S和FVII的分离通过采用银染色的标准、非变性SDS-PAGE分析并通过上样FVII标准品的平行纯化试验来鉴定和确认。用3CV的0.1M NaOH，然后通过10CV的1.5MNaCl+25mM组氨酸缓冲液(pH6)来平衡该柱。
实施例19-CM Sepharose FF
含有大约25mg/l FVII和25mg/l蛋白S的混合物中蛋白S的减少在1ml(内径0.5cm×柱床高5cm)CM Sepharose FF(GE HealthCare)柱上进行。用10柱体积(CV)的40mM组氨酸缓冲液(pH6)平衡该柱，并将0.5ml含有FVII和蛋白S的混合物上样至柱上。用1CV的40mM组氨酸缓冲液(pH6)洗涤/洗脱柱，随后用在40mM组氨酸缓冲液(pH6)中的0-0.35M NaCl进行梯度洗涤/洗脱。整个纯化步骤在室温下48CV/h的流速进行。蛋白S洗脱在流过液中，和FVII在梯度洗脱过程中洗脱。蛋白S和FVII的分离通过采用银染色的标准、非变性SDS-PAGE分析来鉴定和确认。用3CV的0.1M NaOH，然后通过10CV的1.5M NaCl+25mM组氨酸缓冲液(pH6)来平衡该柱。
实施例20-CM Sepharose FF
含有大约25mg/l FVII和25mg/l蛋白S的混合物中蛋白S的减少在1ml(内径0.5cm×柱床高5cm)CM Sepharose FF(GE HealthCare)柱上进行。用10柱体积(CV)的10mM组氨酸缓冲液(pH6)平衡该柱，并将0.5ml含有FVII和蛋白S的混合物上样至柱上。用1CV的10mM组氨酸缓冲液(pH6)洗涤/洗脱柱，随后用在10mM组氨酸缓冲液(pH6)中的0-0.35M NaCl进行梯度洗涤/洗脱。整个纯化步骤在室温下48CV/h的流速进行。蛋白S洗脱在流过液中，和FVII在梯度洗脱过程中洗脱。蛋白S和FVII的分离通过采用银染色的标准、非变性SDS-PAGE分析来鉴定和确认。用3CV的0.1M NaOH，然后通过10CV的1.5M NaCl+25mM组氨酸缓冲液(pH6)来平衡该柱。
实施例21-Toyopearl SP 650M
含有大约25mg/l FVII和25mg/l蛋白S的混合物中蛋白S的减少在1ml(内径0.5cm×柱床高5cm)Toyopearl SP650M(TosohBioscience)柱上进行。用10柱体积(CV)的10mM组氨酸缓冲液(pH6)平衡该柱，并将0.5ml含有FVII和蛋白S的混合物上样至柱上。用1CV的10mM组氨酸缓冲液(pH6)洗涤/洗脱柱，随后用在10mM组氨酸缓冲液(pH6)中的0-0.35M NaCl进行梯度洗涤/洗脱。整个纯化步骤在室温下以48CV/h的流速进行。蛋白S洗脱在流过液中，和FVII在梯度洗脱过程中洗脱。蛋白S和FVII的分离通过采用银染色的标准、非变性SDS-PAGE分析来鉴定和确认。用3CV的0.1M NaOH，然后通过10CV的1.5M NaCl+25mM组氨酸缓冲液(pH6)来平衡该柱。
实施例22-Capto MMC
将层析介质填充在直径1.6cm、柱床高10cm的柱中。纯化在约5℃下以每小时20柱体积的流速进行。将柱在150mM NaCl，5mM CaCl2和20mM组氨酸(pH6.0)中平衡。向含有FVII的培养物上清液中分别加入CaCl2和组氨酸至5和10mM的浓度，调节至pH6.0，并上样至柱上。具体的柱负荷是约1.3mg FVII/mL填满的柱床。上样后，用平衡缓冲液，接着用0.8M NaCl、10mM CaCl2、20mM组氨酸(pH6.6)，随后用平衡缓冲液，然后用0.5M NaCl、25mM组氨酸(pH5.8)洗涤柱。用0.5M NaCl、25mM组氨酸(pH6.8)从柱中洗脱FVII。发现蛋白S富集于上样过程中的流过液中以及用0.8M NaCl、10mMCaCl2、20mM组氨酸(pH6.6)进行洗涤的洗涤级分中。
F.使用羟磷灰石材料的层析
实施例23-羟磷灰石柱，BioRad目录号157-0085I型80um
调节施加物的pH，然后直接施加于先前平衡了的树脂上。流速是每小时42柱体积，在4-20℃下进行。用平衡缓冲液(水)洗涤直至基线，然后通过逐渐增加K2HPO4/KH2PO4缓冲液的梯度至400mM(pH6.2)来洗脱产物。基于UV收集汇集物并立即冷却。
蛋白S在产物之后洗脱。在使用后，柱用1M NaOH进行清洁。
G.肝素亲和层析
实施例24-Toyopearl Heparin 650M
含有大约25mg/l FVII和25mg/l蛋白S的混合物中蛋白S的减少在1ml(内径0.5cm×柱床高5cm)Toyopearl Heparin 650M(TosohBioscience)柱上进行。用10柱体积(CV)的10mM组氨酸缓冲液(pH6)平衡该柱，并将0.5ml含有FVII和蛋白S的混合物上样至柱上。用1CV的10mM组氨酸缓冲液(pH6)洗涤/洗脱柱，随后用在10mM组氨酸缓冲液(pH6)中的0-0.35M NaCl进行梯度洗涤/洗脱。整个纯化步骤在室温下以48CV/h的流速进行。在梯度洗脱过程中，蛋白S在FVII之前洗脱。蛋白S和FVII的分离通过采用银染色的标准、非变性SDS-PAGE分析来鉴定和确认。用3CV的0.1M NaOH，然后通过10CV的1.5M NaCl+25mM组氨酸缓冲液(pH6)来平衡该柱。

Claims (76)

1.用于减少含有目的维生素K依赖性蛋白质的组合物中一种或多种蛋白质污染物含量的方法，所述方法至少包括下列步骤：(i)使第一组合物与能够结合一种或多种蛋白质污染物和/或目的维生素K依赖性蛋白质的固相材料接触，和(ii)收集因而产生的含有目的维生素K依赖性蛋白质的第二组合物，由此从所述第一组合物到所述因而产生的第二组合物，蛋白质污染物水平减少至少2倍，例如至少5倍，例如至少10倍，例如至少20倍，例如至少50倍，例如至少100倍，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
2.根据权利要求1的方法，其中在因而产生的含有目的维生素K依赖性蛋白质的第二组合物中蛋白质污染物的总含量为至多100ppm。
3.根据权利要求1-2中任一项的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是选自凝血因子VII多肽、凝血因子IX多肽、凝血因子X多肽和激活的蛋白C的维生素K依赖性凝血因子。
4.根据权利要求1-3的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子IX多肽。
5.根据权利要求1-3的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽，例如野生型人凝血因子VIIa。
6.根据权利要求5的方法，其中凝血因子VII多肽包含选自P10Q和K32E的氨基酸置换。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中占优势量的蛋白质污染物是含有Gla-结构域的多肽，特别是蛋白S，并且其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中蛋白质污染物水平减少至少10倍，或至少25倍，或至少50倍，例如减少至少100倍，或至少250倍，或至少500倍，或至少750倍，或至少1000倍，或至少2000倍，或至少5000倍，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中在因而产生的含有目的维生素K依赖性蛋白质的第二组合物中蛋白质污染物的总含量为至多100ppm，例如至多50ppm，例如至多10ppm，例如至多5ppm，例如至多2ppm，例如至多1ppm。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中在第一组合物中蛋白质污染物的总含量为至少500ppm。
11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中在第一组合物中蛋白S污染物的总含量为至少500ppm。
12.用于减少含有凝血因子VII多肽的组合物中一种或多种蛋白S污染物含量的方法，所述方法至少包括下列步骤：(i)使第一组合物与能够结合蛋白S污染物和/或凝血因子VII多肽的固相材料接触，和(ii)收集因而产生的含有凝血因子VII多肽的第二组合物，由此蛋白S污染物水平减少至少2倍，例如5倍，所述蛋白S污染物水平表示为相对于凝血因子VII多肽的百万分率。
13.根据权利要求1-11和12中任一项的方法，其中所述固相材料结合与目的维生素K依赖性蛋白质相比较相对更大数量的蛋白质污染物。
14.根据权利要求13的方法，其中所述固相材料例如通过强的亲和力或者通过共价结合所述污染物，如通过与所述污染物的巯基部分形成二硫键，来特异性地结合所述污染物中的至少一种。
15.根据权利要求13和14中任一项的方法，其中所述固相材料携带有针对所述蛋白质污染物中至少一种蛋白质污染物的单克隆抗体。
16.根据权利要求15的方法，其中含有目的维生素K依赖性蛋白质的组合物是细胞培养物上清液的组分。
17.根据权利要求14的方法，其中所述固相材料携带有固定化的蛋白C。
18.根据权利要求1-11和12中任一项的方法，其中与蛋白质污染物相比较，所述固相材料结合相对更大量的目的维生素K依赖性蛋白质。
19.根据权利要求18的方法，其中所述固相材料特异性地结合目的维生素K依赖性蛋白质。
20.根据权利要求18和19中任一项的方法，其中所述固相材料携带有针对目的维生素K依赖性蛋白质或其类似物的单克隆抗体。
21.根据权利要求18和19中任一项的方法，其中所述固相材料是对目的维生素K依赖性蛋白质或其类似物具有亲和力的三嗪配体。
22.根据权利要求18和19中任一项的方法，其中所述固相材料携带有所述目的维生素K依赖性蛋白质的抑制剂，或携带有能够与所述目的维生素K依赖性蛋白质形成螯合物的金属，或携带有固定化的组织因子(促凝血酶原激酶)，或携带有固定化的肝素。
23.根据权利要求22的方法，其中所述目的维生素K依赖性蛋白质的抑制剂是苄脒-或胍-类型的抑制剂，例如包含-C(＝N-Z1-R1)-NH-Z2-R2基序的那些抑制剂，其中
Z1和Z2独立地选自-O-、-S-、-NRH-和单键，其中RH选自氢、C1-4-烷基、芳基和芳基甲基，并且R1和R2独立地选自氢、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-链烯基、任选取代的芳基、任选取代的杂环基，或者
Z2和R2是如上定义的，并且-C＝N-Z1-R1形成杂环的一部分，或者
Z1和R1是如上定义的，并且-C-NH-Z2-R2形成杂环的一部分，或者
-C(＝N-Z1-R1)-NH-Z2-R2形成其中-Z1-R1-R2-Z2-是双游离基的杂环。
24.根据权利要求1-11和12中任一项的方法，其中所述固相材料是色谱材料。
25.根据权利要求1-11和12中任一项的方法，其中所述固相材料结合至膜上。
26.根据权利要求22-23的方法，其中所述固相材料是阴离子交换材料。
27.根据权利要求26的方法，其中从阴离子交换的洗脱通过增加钙盐例如CaCl2的浓度来进行。
28.根据权利要求26的方法，其中从阴离子交换的洗脱通过增加镁盐例如MgCl2的浓度来进行。
29.根据权利要求24的方法，其中所述固相材料是阳离子交换材料。
30.根据权利要求24的方法，其中所述固相材料是羟磷灰石。
31.根据权利要求24的方法，其中所述固相材料是疏水性固相材料。
32.用于减少含有目的维生素K依赖性蛋白质的组合物(特别是细胞培养物上清液)中一种或多种蛋白质污染物含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使第一组合物与携带有针对所述蛋白质污染物中至少一种蛋白质污染物的单克隆抗体的固相材料接触，和(ii)将因而产生的第二组合物与所述固相材料分离，从而获得其中蛋白质污染物水平减少至少5倍的组合物，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
33.根据权利要求32的方法，其中所述单克隆抗体针对选自宿主细胞蛋白质的蛋白质污染物，例如含有Gla-结构域的蛋白质污染物，特别是选自GAS-6、蛋白S、凝血因子II(凝血酶原)、凝血酶、凝血因子X/Xa、凝血因子IX/IXa、蛋白C、凝血因子VII/VIIa、蛋白Z、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白1、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白2、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白3、跨膜γ-羧基谷氨酸蛋白4、基质Gla蛋白和骨钙蛋白的蛋白质污染物，更特别地是蛋白S。
34.根据权利要求27-28中任一项的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是选自凝血因子VII多肽、凝血因子IX多肽、凝血因子X多肽和激活的蛋白C的维生素K依赖性凝血因子。
35.根据权利要求29的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子IX多肽。
36.根据权利要求29的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
37.根据权利要求32-36中任一项的方法，其中占优势量的蛋白质污染物是含有Gla-结构域的多肽，特别是蛋白S，并且其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
38.根据权利要求32-37中任一项的方法，其中占优势量的蛋白质污染物是仓鼠蛋白S。
39.根据权利要求32-38中任一项的方法，其中蛋白质污染物水平减少至少10倍，或至少25倍，或至少50倍，例如减少至少100倍，或至少250倍，或至少500倍，或至少750倍，或至少1000倍，或至少2000倍，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
40.根据权利要求32-39中任一项的方法，其中在因而产生的第二组合物中蛋白质污染物的总含量为至多100ppm。
41.根据权利要求32-40中任一项的方法，其中在因而产生的第二组合物中蛋白S污染物的总含量为至多100ppm。
42.根据权利要求32-41中任一项的方法，其中在第一组合物中蛋白质污染物的总含量为至少500ppm。
43.根据权利要求32-42中任一项的方法，其中在第一组合物中蛋白S污染物的总含量为至少500ppm。
44.用于减少含有凝血因子VII多肽的组合物例如细胞培养物上清液中蛋白S污染物含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使第一组合物例如细胞培养物上清液与携带有针对蛋白S污染物的单克隆抗体的固相材料接触，和(ii)将因而产生的第二组合物与所述固相材料分离，从而获得其中蛋白S污染物水平减少至少50倍的组合物，所述蛋白S污染物水平表示为相对于目的凝血因子VII多肽的百万分率。
45.用于减少含有目的维生素K依赖性蛋白质的组合物中蛋白质污染物含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使第一组合物与携带有固定化的蛋白C的固相材料接触，和(ii)将因而产生的第二组合物与所述固相材料分离，从而获得其中蛋白质污染物水平减少至少5倍的组合物，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
46.根据权利要求45的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是选自凝血因子VII多肽、凝血因子IX多肽、凝血因子X多肽和激活的蛋白C的维生素K依赖性凝血因子。
47.根据权利要求46的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子IX多肽。
48.根据权利要求46的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
49.根据权利要求45-48中任一项的方法，其中占优势量的蛋白质污染物是含有Gla-结构域的多肽，特别是蛋白S，并且其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
50.根据权利要求45-49中任一项的方法，其中蛋白质污染物水平减少至少10倍，或至少25倍，或至少50倍，例如减少至少100倍，或至少250倍，或至少500倍，或至少750倍，或至少1000倍，或至少2000倍，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
51.根据权利要求45-50中任一项的方法，其中在所述因而产生的第二组合物中蛋白质污染物的总含量为至多100ppm。
52.根据权利要求45-51中任一项的方法，其中在所述因而产生的第二组合物中蛋白S污染物的总含量为至多100ppm。
53.根据权利要求45-52中任一项的方法，其中在所述第一组合物中蛋白质污染物的总含量为至少500ppm。
54.根据权利要求45-53中任一项的方法，其中在所述第一组合物中蛋白S污染物的总含量为至少500ppm。
55.用于减少含有凝血因子VII多肽的组合物中蛋白S含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使第一组合物与携带有固定化的蛋白C的固相材料接触，和(ii)将因而产生的第二组合物与所述固相材料分离，从而获得其中蛋白质污染物水平减少至少10倍的组合物，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
56.用于减少含有目的维生素K依赖性蛋白质的细胞培养物上清液中一种或多种蛋白质污染物含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使细胞培养物上清液与携带有针对目的维生素K依赖性蛋白质或其类似物的单克隆抗体的固相材料接触，(ii)任选地，洗涤所述固相材料，和(iii)从所述固相材料中洗脱目的维生素K依赖性蛋白质，从而获得其中蛋白质污染物水平减少至少5倍的因而产生的组合物，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
57.根据权利要求56的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是选自凝血因子VII多肽、凝血因子IX多肽、凝血因子X多肽和激活的蛋白C的维生素K依赖性凝血因子。
58.根据权利要求57的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子IX多肽。
59.根据权利要求57的方法，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
60.根据权利要求56-59中任一项的方法，其中占优势量的蛋白质污染物是含有Gla-结构域的多肽，特别是蛋白S，并且其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
61.根据权利要求56-60中任一项的方法，其中蛋白质污染物水平减少至少10倍，或至少25倍，或至少50倍，例如减少至少100倍，或至少250倍，或至少500倍，或至少750倍，或至少1000倍，或至少2000倍，所述蛋白质污染物水平表示为相对于目的维生素K依赖性蛋白质的百万分率。
62.根据权利要求56-61中任一项的方法，其中在所述因而产生的组合物中蛋白质污染物的总含量为至多100ppm。
63.根据权利要求56-62中任一项的方法，其中在所述因而产生的组合物中蛋白S污染物的总含量为至多100ppm。
64.根据权利要求56-63中任一项的方法，其中在细胞培养物上清液中蛋白质污染物的总含量为至少500ppm。
65.根据权利要求56-64中任一项的方法，其中在细胞培养物上清液中蛋白S污染物的总含量为至少500ppm。
66.用于减少含有凝血因子VII多肽的细胞培养物上清液中蛋白质污染物含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使细胞培养物上清液与携带有针对凝血因子VII多肽或其类似物的单克隆抗体的固相材料接触，(ii)任选地，洗涤所述固相材料，和(iii)从所述固相材料中洗脱凝血因子VII多肽，从而获得其中蛋白质污染物水平减少至少100倍的因而产生的组合物，所述蛋白质污染物水平表示为相对于凝血因子VII多肽的百万分率。
67.用于减少含有凝血因子VII多肽的细胞培养物上清液中蛋白S含量的方法，所述方法包括下列步骤：(i)使细胞培养物上清液与携带有针对凝血因子VII多肽或其类似物的单克隆抗体的固相材料接触，(ii)任选地，洗涤所述固相材料，和(iii)从所述固相材料中洗脱凝血因子VII多肽，从而获得其中蛋白S水平减少至少100倍的因而产生的组合物，所述蛋白S水平表示为相对于凝血因子VII多肽的百万分率。
68.含有在细胞培养条件下产生的目的维生素K依赖性蛋白质的组合物，其中蛋白质污染物的总含量基于目的维生素K依赖性蛋白质含量为至多100ppm。
69.根据权利要求68的组合物，其中蛋白质污染物的含量为0.01-100ppm，例如0.01-50ppm，例如0.05-25ppm，或0.05-20ppm，或0.05-15ppm，或0.05-10ppm，或0.05-5ppm。
70.含有从无血清的非人细胞培养中获得的凝血因子VII多肽的组合物，其中蛋白S污染物的总含量基于凝血因子VII多肽含量为至多100ppm。
71.含有从无血清的非人细胞培养中获得的凝血因子IX多肽的组合物，其中蛋白S污染物的总含量基于凝血因子IX多肽含量为至多100ppm。
72.根据权利要求67-71中任一项的组合物，其中蛋白S污染物的含量为0.01-100ppm，例如0.01-50ppm，例如0.05-25ppm，或0.05-20ppm，或0.05-15ppm，或0.05-10ppm，或0.05-5ppm。
73.根据权利要求67-72中任一项的组合物，其中目的维生素K依赖性蛋白质是选自凝血因子VII多肽、凝血因子IX多肽、凝血因子X多肽和激活的蛋白C的维生素K依赖性凝血因子。
74.根据权利要求73的组合物，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子IX多肽。
75.根据权利要求73的组合物，其中目的维生素K依赖性蛋白质是凝血因子VII多肽。
76.含有在细胞培养条件下产生的凝血因子VII多肽的组合物，其中蛋白S污染物的总含量基于凝血因子VII多肽含量为至多100ppm，例如0.01-100ppm。
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