JPH0759600B2 - ヒト・プロテインｓに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
ヒト・プロテインｓに対するモノクローナル抗体Info
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- JPH0759600B2 JPH0759600B2 JP61296766A JP29676686A JPH0759600B2 JP H0759600 B2 JPH0759600 B2 JP H0759600B2 JP 61296766 A JP61296766 A JP 61296766A JP 29676686 A JP29676686 A JP 29676686A JP H0759600 B2 JPH0759600 B2 JP H0759600B2
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- human
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Description
【発明の詳細な説明】 a.産業上の利用分野 本発明はヒト・プロティンＳを特異的に認識し結合する
モノクローナル抗体に関する。
モノクローナル抗体に関する。
b.従来技術 プロティンＳはプロティンＣと同様にビタミンＫ依存性
蛋白で、1977年Di Scipioらによりウシとヒトから分離
された［Di Scipio,R.G.,Hermodson,M.A.,Yates,S.G.an
d Davie,E.W.:Biochemistry.,16;698〜706,（1977）参
照］。
蛋白で、1977年Di Scipioらによりウシとヒトから分離
された［Di Scipio,R.G.,Hermodson,M.A.,Yates,S.G.an
d Davie,E.W.:Biochemistry.,16;698〜706,（1977）参
照］。
ヒト・プロティンＳはヒト血漿中には約10mg/l含まれ、
分子量約69,000の一本鎖の糖蛋白である。また、他のビ
タミンＫ依存性因子とのその構造はよく似ており、NH2
末端に約10個のγ−カルボキシグルタミン酸（Gla）を
有している。プロティンＳは血中では２つの形で存在す
る。その１つはフリーのプロティンＳであり、このフリ
ーのものが、活性化プロティンＣの補助因子として働
く。もう１つは、補体系の制御因子である高分子C4b結
合タンパク（以下このタンパクを“C4bp"と略称するこ
とがある）と非共有結合して存在する。このフリーと結
合（bound）しているプロティンＳの比率はほぼ1:1とさ
れている。
分子量約69,000の一本鎖の糖蛋白である。また、他のビ
タミンＫ依存性因子とのその構造はよく似ており、NH2
末端に約10個のγ−カルボキシグルタミン酸（Gla）を
有している。プロティンＳは血中では２つの形で存在す
る。その１つはフリーのプロティンＳであり、このフリ
ーのものが、活性化プロティンＣの補助因子として働
く。もう１つは、補体系の制御因子である高分子C4b結
合タンパク（以下このタンパクを“C4bp"と略称するこ
とがある）と非共有結合して存在する。このフリーと結
合（bound）しているプロティンＳの比率はほぼ1:1とさ
れている。
このヒト・プロティンＳの機能の重要性はリン脂質の陰
性荷電表面と非常に親和性強いことにある［Nelsestue
n,G.L.,Kisiel,W.and Di Scipio,R.G.:Biochemistry,1
7;2134〜2138,（1978）］。
性荷電表面と非常に親和性強いことにある［Nelsestue
n,G.L.,Kisiel,W.and Di Scipio,R.G.:Biochemistry,1
7;2134〜2138,（1978）］。
細胞が傷害されたり又は活性化を受けると、Ca2+の存在
下でプロティンＳのGla-domainはリン脂質に結合し、さ
らにこのプロティンＳにC4bpが複合体を形成して結合し
てその機能を発揮するものと考えられている［Dahlbc
k,B.:Semin.Thromb.Haemostas.,10;139〜148,（198
4）］。
下でプロティンＳのGla-domainはリン脂質に結合し、さ
らにこのプロティンＳにC4bpが複合体を形成して結合し
てその機能を発揮するものと考えられている［Dahlbc
k,B.:Semin.Thromb.Haemostas.,10;139〜148,（198
4）］。
プロティンS,プロティンＣの凝固，線溶系に関する機能
については、最近の研究からその制御機構に関して極め
て重要な働きをしていることが解明され、その生理的意
義についても血栓症との関わりで注目されている。プロ
ティンＳの先天性欠乏は血栓症の原因となり得ることが
報告されている［Comp,P.C.,Nixon,R.R.,Cooper,M.R.an
d Esmon,C.T.:J.Clin.Invest.74;2082〜2088,（198
4）］。
については、最近の研究からその制御機構に関して極め
て重要な働きをしていることが解明され、その生理的意
義についても血栓症との関わりで注目されている。プロ
ティンＳの先天性欠乏は血栓症の原因となり得ることが
報告されている［Comp,P.C.,Nixon,R.R.,Cooper,M.R.an
d Esmon,C.T.:J.Clin.Invest.74;2082〜2088,（198
4）］。
したがって、プロティンＳの作用機構を明らかにし、ま
た、プロティンＳの血中における抗原量，活性量を測定
し、その動向を把握することができれば、基礎医学，臨
床医学の領域において非常に重要な意味を持つと考えら
れる。
た、プロティンＳの血中における抗原量，活性量を測定
し、その動向を把握することができれば、基礎医学，臨
床医学の領域において非常に重要な意味を持つと考えら
れる。
一方モノクローナル抗体は単一の抗原決定基に対して特
異的であり、かつ同一の特異性を有する抗体を安定的に
産生できるという利点から抗原蛋白質の機能及び構造の
解析あるいは免疫測定（EIA,RIA）に近年、一般的に広
く利用されるようになって来た。特に抗原蛋白質の機能
解析，分子解析には抗原蛋白の機能に関与する部位、ま
たは特殊な構造部位を認識する抗体を見出すことが有力
な手段となり得る。
異的であり、かつ同一の特異性を有する抗体を安定的に
産生できるという利点から抗原蛋白質の機能及び構造の
解析あるいは免疫測定（EIA,RIA）に近年、一般的に広
く利用されるようになって来た。特に抗原蛋白質の機能
解析，分子解析には抗原蛋白の機能に関与する部位、ま
たは特殊な構造部位を認識する抗体を見出すことが有力
な手段となり得る。
そこで本発明者らは、プロティンＳが補体系の制御因子
であるC4b結合タンパク（C4bp）と複合体を形成するこ
とに着目し、フリーのプロティンＳとプロティンＳとC4
bpの複合体とを選択的に認識するモノクローナル抗体に
ついて研究を進めた結果、本発明に到達した。
であるC4b結合タンパク（C4bp）と複合体を形成するこ
とに着目し、フリーのプロティンＳとプロティンＳとC4
bpの複合体とを選択的に認識するモノクローナル抗体に
ついて研究を進めた結果、本発明に到達した。
c.発明の構成 すなわち、本発明はプロティンＳに対して特異的に結合
するモノクローナル抗体である。
するモノクローナル抗体である。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
細胞はケーラーとミルシュタインの方法［Ｋhler ＆
Milstein;Nature:256,495-497（1975）］としてそれ自
体知られた方法によって得られる。すなわち、ヒト・プ
ロティンＳでマウスを免疫した後、このマウスの脾臓細
胞をマウスミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブ
リドーマ細胞はマイクロタイタープレートに固定された
ヒト・プロティンＳと反応する抗体に対し、系統的に検
査し、選択される。
細胞はケーラーとミルシュタインの方法［Ｋhler ＆
Milstein;Nature:256,495-497（1975）］としてそれ自
体知られた方法によって得られる。すなわち、ヒト・プ
ロティンＳでマウスを免疫した後、このマウスの脾臓細
胞をマウスミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブ
リドーマ細胞はマイクロタイタープレートに固定された
ヒト・プロティンＳと反応する抗体に対し、系統的に検
査し、選択される。
本発明のモノクローナル抗体はかかる新規なハイブリド
ーマ細胞が産生する産生物から得られ、ヒト・プロティ
ンＳに対し、特異的に作用する。
ーマ細胞が産生する産生物から得られ、ヒト・プロティ
ンＳに対し、特異的に作用する。
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト・プロティンＳに
対し高度に特異的に結合する性質を有するため、ヒト・
プロティンＳの分離・精製に利用する場合、非常に有利
である。すなわち、不溶性担体に本発明におけるモノク
ローナル抗体の１種類を固定化し、ヒト血漿または、他
のヒト・プロティンＳ含有混合物、あるいはそれらの粗
抽出物、粗精製物および溶液からヒト・プロティンＳを
吸着，分離し、適当な緩衝液（例えば20mM Tris-HCl,0.
5M NaCl,pH7.4）で洗浄後、溶液をカオトロピックイオ
ンを含む溶液例えば3M Na SCN pH7.0）に置き換えてヒ
ト・プロティンＳを溶出することができる。
対し高度に特異的に結合する性質を有するため、ヒト・
プロティンＳの分離・精製に利用する場合、非常に有利
である。すなわち、不溶性担体に本発明におけるモノク
ローナル抗体の１種類を固定化し、ヒト血漿または、他
のヒト・プロティンＳ含有混合物、あるいはそれらの粗
抽出物、粗精製物および溶液からヒト・プロティンＳを
吸着，分離し、適当な緩衝液（例えば20mM Tris-HCl,0.
5M NaCl,pH7.4）で洗浄後、溶液をカオトロピックイオ
ンを含む溶液例えば3M Na SCN pH7.0）に置き換えてヒ
ト・プロティンＳを溶出することができる。
次に本発明におけるモノクローナル抗体を製造する具体
的方法について詳細に説明する。
的方法について詳細に説明する。
A.抗原の単離・精製； 抗原に用いるヒト・プロティンＳは、Bajajらの方法［B
ajaj SP,Rapaport SI,Maki SL,Brown SF:Prep.Biochem.
13,191,（1983）］によりヒト・血漿から単離・精製さ
れる。
ajaj SP,Rapaport SI,Maki SL,Brown SF:Prep.Biochem.
13,191,（1983）］によりヒト・血漿から単離・精製さ
れる。
B.ヒト・プロティンＳによるマウスの免疫； 雌Balb/Cマウスを用いることができるが他の系（Strai
n）のマウスを使用してもよい。その際、免疫計画、及
びヒト・プロティンＳの濃度は十分な量の抗原刺戟を受
けた、リンパ球が形成されるよう選ばれるべきである。
例えばマウスに50μｇのヒト・プロティンＳを２週間間
隔で腹腔に３回免疫の後、さらに30μｇを静脈に投与す
る。最終免疫の数日後に融合の為に脾臓細胞をとり出
す。
n）のマウスを使用してもよい。その際、免疫計画、及
びヒト・プロティンＳの濃度は十分な量の抗原刺戟を受
けた、リンパ球が形成されるよう選ばれるべきである。
例えばマウスに50μｇのヒト・プロティンＳを２週間間
隔で腹腔に３回免疫の後、さらに30μｇを静脈に投与す
る。最終免疫の数日後に融合の為に脾臓細胞をとり出
す。
C.細胞融合； 上記の如く免疫したマウスの脾臓を無菌的に取り出し、
そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの脾臓細胞を
適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により、細胞融合させる。脾臓細胞対、骨髄腫
細胞の好ましい比率は約20:1〜約2:1の範囲である。約1
08個の脾臓細胞について0.5〜1.5mlの融合媒体の使用が
適当である。
そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの脾臓細胞を
適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により、細胞融合させる。脾臓細胞対、骨髄腫
細胞の好ましい比率は約20:1〜約2:1の範囲である。約1
08個の脾臓細胞について0.5〜1.5mlの融合媒体の使用が
適当である。
細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は、良く知られてい
るが、本発明では、P3-X63-Ag8-U1細胞（P3-U1）［Yelt
on,D.E.et al.Current.Topics in Microbiology and Im
munology,81,1（1978）参照］を用いた。
るが、本発明では、P3-X63-Ag8-U1細胞（P3-U1）［Yelt
on,D.E.et al.Current.Topics in Microbiology and Im
munology,81,1（1978）参照］を用いた。
好ましい融合促進剤としては、例えば、平均分子量1000
〜4000のポリエチレングリコールを有利に使用できる
が、この分野で知られている他の融合促進剤を使用する
こともできる。本発明においては、平均分子量1540のポ
リエチレングリコールを用いた。
〜4000のポリエチレングリコールを有利に使用できる
が、この分野で知られている他の融合促進剤を使用する
こともできる。本発明においては、平均分子量1540のポ
リエチレングリコールを用いた。
D.融合した細胞の選択； 別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未融
合の脾臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞および融合し
たハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのに十分な時間（約１週間）培養する。培地
は、薬物抵抗性（例えば８−アザグアニン抵抗性）で未
融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、（例えばHA
T培地）が使用される。この選択培地中では、未融合の
骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の脾臓細胞は非腫瘍
性細胞なので、ある一定期間後（１週間後）死滅する。
これらに対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の腫瘍
性と、親脾細胞の性質を合わせ持つため、選択培地中で
生存できる。
合の脾臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞および融合し
たハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのに十分な時間（約１週間）培養する。培地
は、薬物抵抗性（例えば８−アザグアニン抵抗性）で未
融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、（例えばHA
T培地）が使用される。この選択培地中では、未融合の
骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の脾臓細胞は非腫瘍
性細胞なので、ある一定期間後（１週間後）死滅する。
これらに対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の腫瘍
性と、親脾細胞の性質を合わせ持つため、選択培地中で
生存できる。
E.各容器中のヒト・プロティンＳに対する抗体の確認； かくして、ハイブリドーマ細胞が検出された後、その培
養上清を採取し、ヒト・プロティンＳに対する抗体につ
いて酵素免疫定量法（Enzyme Linked Immunosorbent As
say）によりスクリーニングする。
養上清を採取し、ヒト・プロティンＳに対する抗体につ
いて酵素免疫定量法（Enzyme Linked Immunosorbent As
say）によりスクリーニングする。
F.目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞のクローン
化； 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限界希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なった方法で産生される。その第１の方法によれ
ば、ハイブリドーマ細胞を一定時間、適当な培地で培養
することにより、その培養上清からそのハイブリドーマ
細胞の産生するモノクローナル抗体を得ることができ
る。第２の方法によれば、ハイブリドーマ細胞は同質遺
伝子、又は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射する
ことができる。一定時間後の宿主動物の血液中および腹
水中より、そのハイブリドーマ細胞の産生するモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。
化； 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限界希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なった方法で産生される。その第１の方法によれ
ば、ハイブリドーマ細胞を一定時間、適当な培地で培養
することにより、その培養上清からそのハイブリドーマ
細胞の産生するモノクローナル抗体を得ることができ
る。第２の方法によれば、ハイブリドーマ細胞は同質遺
伝子、又は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射する
ことができる。一定時間後の宿主動物の血液中および腹
水中より、そのハイブリドーマ細胞の産生するモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。
G.ヒト・プロティンＳ含有混合物からのヒト・プロティ
ンＳの分離； 前記ヒト・プロティンＳに対するモノクローナル抗体を
不溶性担体に固定化又は結合させて吸着体を得る。その
際使用される不溶性担体としては、モノクローナル抗体
を用いた測定試薬又は測定用キツトの基材として一般的
に使用されるものであればよい。例えば材質としてセフ
ァローズ，ポリアクリルアミド，セルロース，デキスト
ラン，またはマレイン酸ポリマー或いはこれらの混合物
が好ましく用いられる。これら不活性担体の形態として
は、粉末状，粒状，ペレット状，ビーズ状，繊維状など
種々の形態であることができる。また一般に血漿、また
はその分画成分の測定や分離に用いられる多数の凹状の
くぼみを有するプレート（ウエル）を用いることが有利
である。
ンＳの分離； 前記ヒト・プロティンＳに対するモノクローナル抗体を
不溶性担体に固定化又は結合させて吸着体を得る。その
際使用される不溶性担体としては、モノクローナル抗体
を用いた測定試薬又は測定用キツトの基材として一般的
に使用されるものであればよい。例えば材質としてセフ
ァローズ，ポリアクリルアミド，セルロース，デキスト
ラン，またはマレイン酸ポリマー或いはこれらの混合物
が好ましく用いられる。これら不活性担体の形態として
は、粉末状，粒状，ペレット状，ビーズ状，繊維状など
種々の形態であることができる。また一般に血漿、また
はその分画成分の測定や分離に用いられる多数の凹状の
くぼみを有するプレート（ウエル）を用いることが有利
である。
前記吸着体を用い、これにヒト・プロティンＳ含有混合
物を接触せしめると、該吸着体に固定したモノクローナ
ル抗体とヒト・プロティンＳとが結合して、結果的にヒ
ト・プロティンＳが該吸着体に結合する。かくすること
によりヒト・プロティンＳを分離，除去することが可能
である。
物を接触せしめると、該吸着体に固定したモノクローナ
ル抗体とヒト・プロティンＳとが結合して、結果的にヒ
ト・プロティンＳが該吸着体に結合する。かくすること
によりヒト・プロティンＳを分離，除去することが可能
である。
又前記の如くしてヒト・プロティンＳを吸着体に結合さ
せ、出来れば残余の混合物を洗滌して除去し、次いで吸
着体に結合したヒト・プロティンＳをカオトロピックイ
オン（SCN-）等を含む適当な溶液と接触又は洗滌する
と、ヒト・プロティンＳは吸着体から離脱し、これを単
離することによって、ヒト・プロティンＳを単離するこ
とができる。
せ、出来れば残余の混合物を洗滌して除去し、次いで吸
着体に結合したヒト・プロティンＳをカオトロピックイ
オン（SCN-）等を含む適当な溶液と接触又は洗滌する
と、ヒト・プロティンＳは吸着体から離脱し、これを単
離することによって、ヒト・プロティンＳを単離するこ
とができる。
かくして前記本発明の分離法によれば、ヒト・プロティ
ンＳを含有する混合物からのヒト・プロティンＳの除
去、該混合物からのヒト・プロティンＳの分離及び精
製、該混合物中のヒト・プロティンＳの含有量の測定な
どが極めて簡単な操作で達成される。
ンＳを含有する混合物からのヒト・プロティンＳの除
去、該混合物からのヒト・プロティンＳの分離及び精
製、該混合物中のヒト・プロティンＳの含有量の測定な
どが極めて簡単な操作で達成される。
以下実施例を上げ本発明を詳細に説明する。以下実施例
ではプロティンＳをPSと略称することがある。
ではプロティンＳをPSと略称することがある。
実施例１ 精製したヒト・PSを雌のBalb/Cマウス（４周齢）２匹に
対して14日間隔で４回免疫した。初回の免疫はPBSに溶
解した。50μｇのヒト・PSを等量のフロイントの完全ア
ジュバント（Complete Freund′s adjuvant）と混合
し、そのエマルジョンを、腹腔内に投与した（0.5mg/he
ad）、２回目,3回目は、同じく50μｇのヒト・PSをフロ
イントの不完全アジュバント（Freund′s incomplete a
djuvant）と混合し、同じく腹腔内に投与した。最終免
疫は30μｇのヒト・PSをPBS溶液のまま、マウス尾静脈
から追加投与した。最終免疫の３日後に免疫したマウス
の脾臓細胞を細胞融合に用いた。
対して14日間隔で４回免疫した。初回の免疫はPBSに溶
解した。50μｇのヒト・PSを等量のフロイントの完全ア
ジュバント（Complete Freund′s adjuvant）と混合
し、そのエマルジョンを、腹腔内に投与した（0.5mg/he
ad）、２回目,3回目は、同じく50μｇのヒト・PSをフロ
イントの不完全アジュバント（Freund′s incomplete a
djuvant）と混合し、同じく腹腔内に投与した。最終免
疫は30μｇのヒト・PSをPBS溶液のまま、マウス尾静脈
から追加投与した。最終免疫の３日後に免疫したマウス
の脾臓細胞を細胞融合に用いた。
免疫したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（P3U1）を約2:1〜約15:1の割合で混合し、50％ポリエ
チレングリコール1540（和光純薬（製）を融合促進剤と
してＫhlerとMilsteinの方法に従い細胞融合を行っ
た。融合後の細胞は、１×106cells/mlの細胞濃度とな
るように10％FCS・‐RPMI-1640培地に懸濁し、96wells
マイクロプレート（Coster）に１ウエル当り100μｌず
つ分注した。
（P3U1）を約2:1〜約15:1の割合で混合し、50％ポリエ
チレングリコール1540（和光純薬（製）を融合促進剤と
してＫhlerとMilsteinの方法に従い細胞融合を行っ
た。融合後の細胞は、１×106cells/mlの細胞濃度とな
るように10％FCS・‐RPMI-1640培地に懸濁し、96wells
マイクロプレート（Coster）に１ウエル当り100μｌず
つ分注した。
融合細胞は、CO2インキュベーター（５％CO2,37℃）中
で培養し、ヒポキサンチン，アミノプテリン；チミジン
を含む培地（HAT培地）で培地交換を行い、HAT培地中で
増殖させて、脾臓細胞と、骨髄腫細胞から成るハイブリ
ドーマのスクリーニングを行った。
で培養し、ヒポキサンチン，アミノプテリン；チミジン
を含む培地（HAT培地）で培地交換を行い、HAT培地中で
増殖させて、脾臓細胞と、骨髄腫細胞から成るハイブリ
ドーマのスクリーニングを行った。
ハイブリドーマの培養上清中の抗体は抗原ヒト・PSをコ
ーティングしたマイクロタイタープレートを用いELISA
法により検出した。第２抗体には、アルカリホスファタ
ーゼ標識ウサギ抗マウスIg G抗体を用い、抗原PSに対す
る結合性を調べた。融合細胞をまいた合計494のウエル
のうち、487ののウエルにコロニーの形成が認められ、
このうち抗原PSに対して結合性を示す抗体産生陽性ウエ
ルは94ウエルであった。
ーティングしたマイクロタイタープレートを用いELISA
法により検出した。第２抗体には、アルカリホスファタ
ーゼ標識ウサギ抗マウスIg G抗体を用い、抗原PSに対す
る結合性を調べた。融合細胞をまいた合計494のウエル
のうち、487ののウエルにコロニーの形成が認められ、
このうち抗原PSに対して結合性を示す抗体産生陽性ウエ
ルは94ウエルであった。
これらの抗体産生陽性ウエルのうち４つのウエルについ
て限界希釈法によるクローニングを２回繰り返して行な
い、６個のクローンを得た。得られたクローンは、90％
FCS-10％DMSO中に懸濁させ液体窒素中に保存した。
て限界希釈法によるクローニングを２回繰り返して行な
い、６個のクローンを得た。得られたクローンは、90％
FCS-10％DMSO中に懸濁させ液体窒素中に保存した。
各クローンの産生するモノクローナル抗体をクローンを
Balb/Cマウス腹腔内で増殖させ、その腹水からプロティ
ンＡ−Sepharose4Bカラムを用いて精製した。
Balb/Cマウス腹腔内で増殖させ、その腹水からプロティ
ンＡ−Sepharose4Bカラムを用いて精製した。
実施例２（精製したモノクローナル抗体の性質） マウス腹水から精製した各クローンのIgGについてクラ
ス及びヒト・プロティンＳ（PS）に対する結合性を調べ
た。
ス及びヒト・プロティンＳ（PS）に対する結合性を調べ
た。
マウスモノクローナル抗体のクラスは、各クラス特異性
の抗マウス抗血清を用いて、オクタロニー法により決定
した。
の抗マウス抗血清を用いて、オクタロニー法により決定
した。
この結果を下記表２に示した。
ヒト・プロティンＳに対する結合性は、マイクロタイタ
ープレートに固相化したヒト・プロティンＳと適当な濃
度になるように希釈したモノクローナル抗体とを反応さ
せ、アルカリ性フォスファクターゼ標識化したヤギ抗マ
ウスIgGで検出することにより評価した。
ープレートに固相化したヒト・プロティンＳと適当な濃
度になるように希釈したモノクローナル抗体とを反応さ
せ、アルカリ性フォスファクターゼ標識化したヤギ抗マ
ウスIgGで検出することにより評価した。
その結果６種類のモノクローナル抗体のヒト・プロティ
ンＳに対する結合の強さは、2B9F122B9C10＞3C3G8＞3
C4G4＞2B9G3＞＞2E12C7であることが判明した。
ンＳに対する結合の強さは、2B9F122B9C10＞3C3G8＞3
C4G4＞2B9G3＞＞2E12C7であることが判明した。
この結果を添付図１に示した。
実施例３［ヒトC4b結合タンパクとプロティンＳ複合体
（C4bp-PS複合体）に対する反応性］ 精製した前記６種類のモノクローナル抗体を10μg/mlの
濃度でマイクロタイタプレートにコーティングし、１％
BSAでBlocking後、適当な濃度になるように希釈したヒ
ト健常人血漿を加え、血漿中のC4bp−プロティンＳ複合
体とモノクローナル抗体とを反応させた。次に、アルカ
リ性フォスファターゼ標識化した抗C4bp抗体を加え、６
種類のモノクローナル抗体のC4bp−プロティンＳ複合体
に対する結合性を検出し、調べた。
（C4bp-PS複合体）に対する反応性］ 精製した前記６種類のモノクローナル抗体を10μg/mlの
濃度でマイクロタイタプレートにコーティングし、１％
BSAでBlocking後、適当な濃度になるように希釈したヒ
ト健常人血漿を加え、血漿中のC4bp−プロティンＳ複合
体とモノクローナル抗体とを反応させた。次に、アルカ
リ性フォスファターゼ標識化した抗C4bp抗体を加え、６
種類のモノクローナル抗体のC4bp−プロティンＳ複合体
に対する結合性を検出し、調べた。
その結果、モノクローナル抗体2E12C7は、フリーのプロ
ティンＳに対しては非常に結合性が弱いが、C4bp−プロ
ティンＳ複合体に対しては、高度に特異的に結合性を示
すことが判明した。
ティンＳに対しては非常に結合性が弱いが、C4bp−プロ
ティンＳ複合体に対しては、高度に特異的に結合性を示
すことが判明した。
この結果を図２に示した。
このような各種抗体を免疫学的測定手段（EIA,RIA）に
用いることにより、溶液状態（例えばヒト血漿）にある
フリーのヒト・プロティンＳ及びC4bp−プロティンＳ複
合体の測定に応用が可能と考えられる。
用いることにより、溶液状態（例えばヒト血漿）にある
フリーのヒト・プロティンＳ及びC4bp−プロティンＳ複
合体の測定に応用が可能と考えられる。
実施例４（ヒト・プロティンＳの分離方法） （１） 抗体の不溶性担体への固定化； ブロムシアン活性化セファロース4B（ファルマシア・フ
ァイン・ケミカルズ社製）の乾燥ゲル0.5gを、G3グラス
フィルター上で100mlの1mM HClを用いて膨潤，洗浄し、
更にカップリングバックファー（0.5M NaClを含む0.1M
NaHCO3 pH8.3）で洗浄した。カップリングバッファーを
吸引除去した後、直ちにゲルをモノクローナル抗体（6H
2）のカップリングバッファー溶液（3mg/ml）2ml中に加
えて懸濁させ、４℃で一夜ゆるやかに振とうした。次に
ゲルを1Mエタノールアミン−HCl（pH8.0,2ml）中に移
し、室温で２時間振とうして残存する活性基をブロック
した。ブロッキング後、抗体結合セファロースゲルをグ
ラスフィルター上で、0.5M NaClを含む0.1M酢酸バッフ
ァーpH4.0,と0.5M NaClを含む0.1Mホウ酸バッファーpH
8.0を交互に用いて洗浄した。濾液の280nmにおける吸光
度が0.01以下になったところで、1mMベンザミジンを含
む0.05M Tris/HCl pH7.4で平衡化し、カラムに充てんし
た。このようにして調製した抗ヒトPSモノクローナル抗
体（2B9C10）結合セファロース4Bカラムを用いてアフィ
ニティクロアトを行った。
ァイン・ケミカルズ社製）の乾燥ゲル0.5gを、G3グラス
フィルター上で100mlの1mM HClを用いて膨潤，洗浄し、
更にカップリングバックファー（0.5M NaClを含む0.1M
NaHCO3 pH8.3）で洗浄した。カップリングバッファーを
吸引除去した後、直ちにゲルをモノクローナル抗体（6H
2）のカップリングバッファー溶液（3mg/ml）2ml中に加
えて懸濁させ、４℃で一夜ゆるやかに振とうした。次に
ゲルを1Mエタノールアミン−HCl（pH8.0,2ml）中に移
し、室温で２時間振とうして残存する活性基をブロック
した。ブロッキング後、抗体結合セファロースゲルをグ
ラスフィルター上で、0.5M NaClを含む0.1M酢酸バッフ
ァーpH4.0,と0.5M NaClを含む0.1Mホウ酸バッファーpH
8.0を交互に用いて洗浄した。濾液の280nmにおける吸光
度が0.01以下になったところで、1mMベンザミジンを含
む0.05M Tris/HCl pH7.4で平衡化し、カラムに充てんし
た。このようにして調製した抗ヒトPSモノクローナル抗
体（2B9C10）結合セファロース4Bカラムを用いてアフィ
ニティクロアトを行った。
（２） プロティンＳの抗体結合セファロース4Bへの吸
着，溶出； 血漿100mlに1M BaCl2溶液8mlを加え４℃で１時間撹拌し
た。沈澱を遠心分離して集め5mM BaCl2,5mMベンザミジ
ンを含む0.1M NaClで洗浄した後、15mlの5mMベンザミジ
ンを含む0.2M EDTA pH7.4で沈澱物を溶解し、バリウム
吸着分画を得た。このバリウム吸着分画を1mMベンザミ
ジンを含む0.05M Tris/HCl pH7.4に透析し、1mMベンザ
ミジンを含む0.05M Tris/HCl pH7.4で平衡化した抗体2B
9C10結合カラムにかけた。1mMベンザミジンおよび1M Na
Clを含む0.05M Tris/HCl pH7.4で洗浄し、3M NaSCN pH
7.0溶液で溶出したところ、PSを含むシングルピークが
得られた。回収率は約75.4％であった。
着，溶出； 血漿100mlに1M BaCl2溶液8mlを加え４℃で１時間撹拌し
た。沈澱を遠心分離して集め5mM BaCl2,5mMベンザミジ
ンを含む0.1M NaClで洗浄した後、15mlの5mMベンザミジ
ンを含む0.2M EDTA pH7.4で沈澱物を溶解し、バリウム
吸着分画を得た。このバリウム吸着分画を1mMベンザミ
ジンを含む0.05M Tris/HCl pH7.4に透析し、1mMベンザ
ミジンを含む0.05M Tris/HCl pH7.4で平衡化した抗体2B
9C10結合カラムにかけた。1mMベンザミジンおよび1M Na
Clを含む0.05M Tris/HCl pH7.4で洗浄し、3M NaSCN pH
7.0溶液で溶出したところ、PSを含むシングルピークが
得られた。回収率は約75.4％であった。
添付図１は、本発明のモノクローナル抗体のヒト・プロ
ティンＳに対する結合性の強さを示したものであり、図
２は本発明モノクローナル抗体のC4bp−プロティンＳ複
合体に対する結合性の強さを示したものである。
ティンＳに対する結合性の強さを示したものであり、図
２は本発明モノクローナル抗体のC4bp−プロティンＳ複
合体に対する結合性の強さを示したものである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 市川 弥太郎 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社中央研究所内 (56)参考文献 Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ，16［３］（1986）ｐ．227 −245
Claims (1)
- 【請求項１】フリーのヒト・プロティンＳを選択的に認
識し、ヒト・プロティンＳとヒト補体系制御因子のC4b
結合タンパクとの複合体は認識しない、ヒト・プロティ
ンＳに対するモノクローナル抗体。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61296766A JPH0759600B2 (ja) | 1986-12-15 | 1986-12-15 | ヒト・プロテインｓに対するモノクローナル抗体 |
| EP87118183A EP0271810B1 (en) | 1986-12-15 | 1987-12-08 | Immunological determination of free human protein s and c4bp-protein s complex |
| DE19873789284 DE3789284T2 (de) | 1986-12-15 | 1987-12-08 | Immunologische Bestimmung von freiem menschlichem Protein-S und c4bp-Protein-S-Komplex. |
| DK654787A DK654787A (da) | 1986-12-15 | 1987-12-14 | Fremgangsmaade til immunologisk bestemmelse af frit humant protein s og c4bp-protein s-kompleks |
| NO875215A NO172084C (no) | 1986-12-15 | 1987-12-14 | Monoklonalt antistoff, anvendelse derav samt reagenssystem for immunologisk bestemmelse av fritt protein s og c4bp-protein s kompleks |
| US07/670,383 US5187067A (en) | 1986-12-15 | 1991-03-14 | Immunological determination of free human protein S and C4bp-protein S complex |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61296766A JPH0759600B2 (ja) | 1986-12-15 | 1986-12-15 | ヒト・プロテインｓに対するモノクローナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63148994A JPS63148994A (ja) | 1988-06-21 |
| JPH0759600B2 true JPH0759600B2 (ja) | 1995-06-28 |
Family
ID=17837851
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61296766A Expired - Lifetime JPH0759600B2 (ja) | 1986-12-15 | 1986-12-15 | ヒト・プロテインｓに対するモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0759600B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2592054A1 (en) | 2004-12-23 | 2006-06-29 | Novo Nordisk Health Care Ag | Reduction of the content of protein contaminants in compositions comprising a vitamin k-dependent protein of interest |
-
1986
- 1986-12-15 JP JP61296766A patent/JPH0759600B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６［３（１９８６）ｐ．２２７−２４５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63148994A (ja) | 1988-06-21 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |