JPH08301900A - 可溶性フィブリン複合体に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

可溶性フィブリン複合体に対するモノクローナル抗体

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JPH08301900A
JPH08301900A JP12736395A JP12736395A JPH08301900A JP H08301900 A JPH08301900 A JP H08301900A JP 12736395 A JP12736395 A JP 12736395A JP 12736395 A JP12736395 A JP 12736395A JP H08301900 A JPH08301900 A JP H08301900A
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JP
Japan
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fibrin
complex
fibrinogen
human
soluble
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JP12736395A
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English (en)
Inventor
Masakatsu Hashimoto
正勝 橋本
Akiko Harada
亜紀子 原田
Yoshio Takahashi
良夫 高橋
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SHIMA KENKYUSHO KK
Original Assignee
SHIMA KENKYUSHO KK
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Abstract

(57)【要約】 [目的] 可溶性フィブリン複合体に対するモノクロー
ナル抗体を提供すること。 [構成] 血液凝固第13因子が作用していないヒトフ
ィブリンモノマー・フィブリノーゲン複合体又はヒトフ
ィブリンポリマー・フィブリノーゲン複合体を保持する
画分とは反応するが、ヒトフィブリノーゲン或いはヒト
クロスリンクフィブリン及びこれらのプラスミン分解産
物とは反応しないモノクローナル抗体で、血清中或いは
血漿中の可溶性フィブリン複合体の測定に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は可溶性ヒトフィブリン複
合体に対するモノクローナル抗体に関するものである。
【0002】更に詳細には、血液凝固第13因子が作用
していないヒトノンクロスリンクのフィブリンモノマー
・フィブリノーゲン複合体又はヒトフィブリンポリマー
・フィブリノーゲン複合体を保持する画分とは反応する
が、ヒトフィブリノーゲン及びそのプラスミン分解産
物、或いはヒトクロスリンクフィブリン及びそのプラス
ミン分解産物とは反応しないモノクローナル抗体に関す
るものであり、このモノクローナル抗体は血清中或いは
血漿中の可溶性フィブリン複合体の測定に有用である。
【0003】
【従来の技術】フィブリノーゲンにトロンビンが作用し
て不溶性のフィブリン塊形成に至る一連の止血機構の過
程で、一時的に可溶性フィブリンモノマー複合体(SF
MC)が生じる。従ってSFMCの存在はトロンビンに
よってフィブリノーゲンが活性化されていることを意味
し、凝固系の分子マーカーとしてSFMCを測定する臨
床的意義は大きい。
【0004】従来行われている測定方法は、検体中のフ
ィブリンモノマーがフィブリン被覆固定赤血球と結合し
て、(1)赤血球凝集を来す反応を利用する方法、
(2)SFMC中に隠蔽されているエピトープを露出さ
せてELISA法で測定する方法、等である。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら(1)の
方法は半定量的な方法であり、(2)の方法では検体の
前処理が必要である。
【0006】本発明者らはSFMCを、検体の前処理な
しに簡便に測定する手段を提供すべく、鋭意検討を重ね
て本発明を完成した。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明は、血液凝固第1
3因子が作用していないヒトノンクロスリンクのフィブ
リンモノマー・フィブリノーゲン複合体又はヒトフィブ
リンポリマー・フィブリノーゲン複合体を保持する画分
とは反応するが、ヒトフィブリノーゲン及びそのプラス
ミン分解産物、或いはヒトクロスリンクフィブリン及び
そのプラスミン分解産物とは反応しないことを特徴とす
る可溶性フィブリン複合体に対するモノクローナル抗体
にかかるものである。
【0008】本発明において使用される融合細胞は、可
溶性フィブリン複合体を含む抗原で免疫された動物から
得られた可溶性フィブリン複合体に対する抗体を産生し
ている細胞と、骨髄腫細胞とを融合させることによって
形成される。
【0009】抗体産生細胞及び骨髄腫細胞は、これらが
融合可能であれば、その由来動物の種類は限定されな
い。しかし、融合効率や抗体産生の効率から同じ種類の
動物を使用するのが好適であり、例えばマウスを使用す
ることが可能である。
【0010】免疫に使用する抗原としては、精製ヒトフ
ィブリノーゲン溶液にウシトロンビンを作用させた混液
を使用可能であるが、この混液からトロンビンを除去
し、更にゲル濾過法等にて分画精製した可溶性フィブリ
ン複合体を使用するのが、一般的により効率的である。
【0011】可溶性フィブリン複合体で免疫したマウス
脾臓より調製した小リンパ球を含む脾細胞懸濁液とマウ
ス骨髄腫細胞懸濁液を用いて、ケーラー等の方法(ネイ
チャー256巻495頁1975年)により、目的の融
合細胞(ハイブリドーマ)を得ることが可能である。
【0012】可溶性フィブリン体と特異的に反応する抗
体は、上記で得たマウス・ハイブリドーマを試験管内で
或いはマウスの腹腔内で培養することによって製造でき
る。
【0013】
【作用】本発明の抗体は、ヒト可溶性フィブリン複合体
を特異的に認識するモノクローナル抗体であり、特殊な
前処理なしに血清中或いは血漿中SFMCと結合可能で
あり、既存の測定原理に基づく種々の免疫学的測定方法
に応用可能である。
【0014】上記免疫学的測定方法としては、放射免疫
測定法、酵素免疫測定法、ラテックススライド凝集法、
粒子(ラテックス等)免疫比濁法等がある。
【0015】
【実施例】次に本発明を実施例により更に具体的に説明
する。
【0016】実施例1 モノクローナル抗体の作成 1.可溶性フィブリン体の調製 10mg/mlの精製ヒトフィブリノーゲン溶液(0.
01M リン酸ナトリウム、0.1M NaCl、0.
005M EDTA−2Na緩衝液 pH7.0)に終
濃度で0.05単位のウシトロンビン(持田製薬)を添
加し、37℃で15分間反応させてフィブリンモノマー
を生成させた。
【0017】この溶液を10mlのベンザミジン−セフ
ァロースカラム(ファルマシア)に通し、トロンビンを
除去した。この10mgを上記緩衝液で緩衝化したTS
K−G4000SWGカラム(東ソー)にかけ、2.0
ml/minの流速でゲル濾過を行った。溶出時間45
〜54分に可溶性フィブリンのピークが、61分にはフ
ィブリノーゲンのピークが出現した
【図1】。
【0018】この可溶性フィブリン体をNative
PAGE、SDS−PAGE、還元SDS−PAGEで
分析し
【図2】、
【図3】、
【図4】、又併せてフィブリノペプチドAの放出量を測
定した成績から、この可溶性の複合体は、そのほとんど
が13因子が作用していないノンクロスリンクのフィブ
リンモノマー・フィブリノーゲン複合体又はフィブリン
ポリマー・フィブリノーゲン複合体であることを確認し
た。
【0019】2.抗体産生脾細胞の調製 この可溶性複合体溶液(1mg/ml)の100μlに
フロインドの完全アジュバンド120μlを混和し乳化
後、6週齢のBALB/Cマウスの皮下に免疫した。追
加免疫としてこの操作を3週おきに3回くり返した。最
終免疫から21日後に可溶性免疫複合体溶液の200μ
lを腹腔内に投与した(ブースター免疫)。
【0020】ブースターから3日後に脾臓細胞を摘出
し、細胞融合に使用した。
【0021】3.細胞融合 常法により赤血球を分離除去し、洗浄調整済みの上記脾
細胞とマウス骨髄腫細胞P3−NS1−1−Ag4−1
(NS−1)をポリエチレングリコール(PEG)40
00の存在下において融合させた。
【0022】融合後、HAT培地に懸濁した融合細胞を
96穴の培養プレートに分注し、増殖するハイブリドー
マを選択した。次にHT培地に交換し、約10日目に培
養上清中の抗体活性を検索した。
【0023】4.抗体産生細胞の確認と樹立 抗体産生細胞の確認は以下のELISA法にて実施し
た。
【0024】96穴ELISAプレートの各穴に0.0
1M炭酸・重炭酸緩衝液(pH9.0)で10μg/m
lに調整した可溶性複合体、フィブリノーゲン、フィブ
リノーゲンのプラスミン分解産物、可溶性クロスリンク
フィブリン及びそのプラスミン分解産物の夫々を100
μl加え、4℃で16時間放置した。次に0.05%T
w20−生理食塩水(Tw−PSS)の300μlずつ
で3回洗浄後、HT培養上清100μlを加え、37℃
で30分間反応させた。
【0025】Tw−PSSで3回洗浄し、ペルオキシダ
ーゼ標識抗マウスIgG抗体溶液100μlを加え、3
7℃で30分間反応、洗浄後、オルトフェニレンジアミ
ン・過酸化水素水で発色させ、リーダーで計測(492
nm)した。
【0026】可溶性複合体と反応する培養トレイ穴の細
胞を24穴のプレートに移し、培養を続け、ELISA
法にて特異性を確認したのち、限界希釈法にてクローニ
ングを行い可溶性複合体とのみ反応する画一したクロー
ン(SFQ01)を得た。
【0027】5.特異性の確認 SFQ01の産生する抗体の反応性について、Nati
ve PAGE及びSDS−PAGEウエスタンブロッ
ト法で確認した。
【0028】第13因子が作用していない、ノンクロス
リンクのフィブリンモノマー・フィブリノーゲン複合体
及びフィブリンポリマー・フィブリノーゲン複合体にの
み反応性を認め、フィブリノーゲン、フィブリノーゲン
のプラスミン分解産物、可溶性クロスリンクフィブリン
及びクロスリンクフィブリンのプラスミン分解産物とは
反応しなかった
【表1】
【0029】
【発明の効果】以上述べたように本発明はヒトノンクロ
スリンクのフィブリンモノマー・フィブリノーゲン複合
体及びフィブリンポリマー・フィブリノーゲン複合体を
保持する画分と特異的に反応するモノクローナル抗体で
あり、ヒトフィブリノーゲン及びそのプラスミン分解産
物、或いはヒトクロスリンクフィブリン及びそのプラス
ミン分解産物とは反応しないため、特殊な前処理なしに
血清中或いは血漿中のSFMCと結合可能であり、放射
免疫測定法、酵素免疫測定法、ラテックススライド凝集
法、粒子免疫比濁法等の種々の免疫学的測定方法に応用
可能である。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のモノクローナル抗体の性質を示した説
明図である。
【図2】本発明のモノクローナル抗体の性質を示した説
明図である。
【図3】本発明のモノクローナル抗体の性質を示した説
明図である。
【図4】本発明のモノクローナル抗体の性質を示した説
明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // A61K 39/395 9162−4B C12N 15/00 C (C12P 21/08 C12R 1:91)

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 血液凝固第13因子が作用していないヒ
    トノンクロスリンクのフィブリンモノマー・フィブリノ
    ーゲン複合体又はヒトフィブリンポリマー・フィブリノ
    ーゲン複合体を保持する画分とは反応するが、ヒトフィ
    ブリノーゲン及びそのプラスミン分解産物、或いはヒト
    クロスリンクフィブリン及びそのプラスミン分解産物と
    は反応しないことを特徴とする可溶性フィブリン複合体
    に対するモノクローナル抗体。
JP12736395A 1995-04-28 1995-04-28 可溶性フィブリン複合体に対するモノクローナル抗体 Pending JPH08301900A (ja)

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