WO2006070776A1

WO2006070776A1 - 抗ヒト可溶性フィブリンモノクローナル抗体及び当該抗体を用いる免疫学的測定方法

Info

Publication number: WO2006070776A1
Application number: PCT/JP2005/023848
Authority: WO
Inventors: Masanao Matsuo; Hiroyuki Ebinuma; Osamu Miyazaki; Kyoko Tanaka; Akiko Suzuki
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.
Priority date: 2004-12-28
Filing date: 2005-12-27
Publication date: 2006-07-06
Also published as: ES2367032T3; CA2594289A1; EP1832654B1; EP1832654A1; CN101087877A; JP4088328B2; JPWO2006070776A1; CN101087877B; EP1832654A4; ATE517991T1; US20080009077A1; US7829294B2

Abstract

　本発明は、フィブリノゲンのトロンビン消化によって生成する可溶性フィブリンのＡα鎖Ｃ末端領域に新たに生じる構造変化部位を特異的に認識する可溶性フィブリンに対するモノクローナル抗体、当該抗体を産生するハイブリドーマ、当該抗体を用いる免疫学的測定方法、及び当該測定方法によって被検試料中の可溶性フィブリンを測定し、被検試料の血液凝固亢進状態を評価する方法に関する。本発明のモノクローナル抗体を用いれば、初期の血液凝固亢進のみを反映する、プラスミンが作用していない可溶性フィブリンを特異的に検出できる。

Description

明細書

抗ヒト可溶性フイブリンモノクローナル抗体及び当該抗体を用いる免疫学的測定方法

技術分野

[0001] 本発明は、フイブリノゲンには反応せず、フイブリノゲンのトロンビン消化によって生成する可溶性フイブリンの A _α鎖 C末端領域に新たに生じる構造変化部位を特異的に認識する可溶性フイブリンに対するモノクローナル抗体であって、当該モノクローナル抗体の認識部位がプラスミン消化によって可溶性フイブリンから切り離されることにより当該モノクローナル抗体と当該プラスミン消化を受けた可溶性フイブリンとの反応性が消失することを利用して、可溶性フイブリンプラスミン分解物及び安定化フィプリンプラスミン分解物の影響を受けることなぐ可溶性フイブリンを特異的に検出するためのモノクローナル抗体、及び当該モノクローナル抗体を用いる免疫学的測定方法に関する。さらにまた、当該免疫学的測定方法によって被検試料中の可溶性フィプリンを測定し、被検体試料の血液凝固亢進状態を評価する方法に関する。

背景技術

[0002] 凝固線溶系の活性化に伴い血中に出現してくる分子マーカーの検出は、播種性血管内凝固症候群 (DIC)の早期診断や病態の把握に重要である。その中で、初期の凝固亢進を表すマーカーとして、可溶性フイブリンモノマー複合体（SFMC)が臨床応用されている。

[0003] 血管内で活性化され、生成したトロンビンは、フイブリノゲンの Α α鎖の N末端を切断し、フイブリノゲンを desAAフイブリンモノマーとし、更に B β鎖の Ν末端を切断して、 desAABBフイブリンモノマーを生成する力生成したフイブリンモノマーは血中のフイブリノゲンなどと複合体を形成し、 SFMCとして血中を循環する。この SFMCを検出することにより、血栓形成を早期に予測できることが知られている。

[0004] この SFMCを検出するために、これまで多くの特異的抗体や免疫学的測定方法が報告されている。例えば、 G. Soe等により、フイブリンモノマーがフイブリノゲンと結合したフイブリン'フイブリノゲン複合体が形成される際に E画分に生じた構造変化を認識するモノクローナル抗体として、 IF— 43抗体が報告されている。 IF— 43抗体のェピトープは、 Aひ鎖の N末端側の連鎖 17— 78のアミノ酸配列に存在する。 IF— 43抗体は、フイブリノゲン、フイブリンモノマー、プラスミンによるフイブリノゲン分解物及びフイブリン分解物には作用せず、血液凝固系を反映するという特徴を有する（特許文献 1及び非特許文献 1)。

[0005] し力ながら、 IF— 43抗体を用いた可溶性フイブリン測定用試薬 (ィアト口 SF、ャトロン社製）では、フイブリンモノマーのプラスミン分解物（フイブリンフラグメント X、 Y及び E)とフイブリノゲンとの反応生成複合体や、フイブリンモノマーのプラスミン分解物とフイブリノゲンのプラスミン分解物（フラグメント X、 Y又は D)との反応生成複合体にも作用することが知られている（特許文献 2)。このように、 IF— 43抗体はプラスミンが作用した可溶性フイブリンにも作用することから、純粋に凝固系のみを反映する抗体とは言い難い。

[0006] トロンビンによってフイブリノゲン A a鎖が切断を受けた N末端のアミノ酸配列を認識する抗体も報告されている。 U. SCHEEFERS— BORCHEL等は、フイブリンの N 末端のアミノ酸配列と同一の合成へキサペプチド（GPRWE)を免疫し、可溶性フィブリンに特異的な抗体を作製している（非特許文献 2)。一方、 A. Hamano等は、フイブリノゲンをバトロキソビン処理したフイブリンモノマーを免疫原として、可溶性フイブリンに特異的な抗体 (F405)を得てレ、る（特許文献 3及び非特許文献 3)。

[0007] し力ながら、これらの抗体のェピトープは、 Aひ鎖にトロンビンが作用して生成する N末端アミノ酸配列部位であることから、フイブリンモノマーのプラスミン分解物やそれらの複合体、更に安定化フイブリンのプラスミン分解物である XDP画分（DY、 DXD など）に作用すると考えられる。従って、凝固系及び線溶系の両方を反映することになり、純粋に凝固系のみを反映する抗体とは言えない。

[0008] また、フイブリノゲンの Aひ鎖の連鎖 148— 161のアミノ酸配列力なるペプチドと反応するモノクローナル抗体も報告されている（特許文献 4)。この抗体の認識部位は、プラスミンによって消化される Aひ鎖 C末端側には存在しないことから、可溶性フイブリンのプラスミン分解物や安定化フイブリンのプラスミン分解物に反応すると考えられ、純粋に凝固系を反映する抗体とは言い難い。 [0009] 以上のように、凝固系の亢進によって生成される可溶性フイブリンに対する従来の抗体は、線溶系が働いたことによって生じる可溶性フイブリンのプラスミン分解物や安定化フイブリンのプラスミン分解物を同時に認識するものが多ぐプラスミンが作用していない可溶性フイブリンを特異的に認識する抗体は知られておらず、純粋に血液凝固系を反映する測定法も報告されていなかった。

特許文献 1：国際公開第 95Z012617号パンフレット

特許文献 2：特開 2004— 53359公報

特許文献 3：国際公開第 98/59047号パンフレット

特許文献 4 :特開平 2— 028197公報

非特許文献 1 : G. Soe. , et al, Blood. 88, 2109— 21 17, 1996.

非特許文献 2 : U. SCHEEFERS— BORCHEL et al, Proc. Natl. Acad. Sci

. USA. 82, 7091 - 7095 , 1985.

非特許文献 3 : A. Hamano et al, Clinica Chimica Acta. 318, 25— 32, 20 02.

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0010] 従って、本発明の目的は、初期の血液凝固亢進を反映し、プラスミンが作用していない可溶性フイブリンのみを特異的に測定できるモノクローナル抗体、当該モノクローナル抗体を産生可能なハイプリドーマ、当該モノクローナル抗体を用いる可溶性フイブリンの免疫学的測定方法、及び当該免疫学的測定方法によって被検試料中の可溶性フイブリンを測定し、被検試料の血液凝固亢進状態を評価する方法を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0011] 本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究した結果、フイブリノゲンのトロンビン消化によって生成する可溶性フイブリンの A a鎖 C末端領域に新たに生じる構造変化部位を特異的に認識するモノクローナル抗体であって、可溶性フイブリンがブラスミン消化されると該抗体の認識部位が切り離されることにより、当該抗体の作用が消失するモノクローナル抗体を見出した。また、当該抗体を用いれば、血漿中のブラスミンが作用していない可溶性フイブリンを特異的に測定できることを見出し、本発明を完成させた。

[0012] すなわち、本発明は、フイブリノゲンのトロンビン消化によって生成する可溶性フイブリンの Aひ鎖 C末端領域に新たに生じる構造変化部位であって、可溶性フイブリンがプラスミン消化されると切り離される該部位を特異的に認識する可溶性フイブリンに対するモノクローナル抗体を提供するものである。

[0013] また本発明は、上記モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを提供するものである。

[0014] また本発明は、被検試料に上記モノクローナル抗体を反応させることを特徴とする試料中の可溶性フイブリンの免疫学的測定方法を提供するものである。

[0015] また本発明は、上記モノクローナル抗体を含有する可溶性フイブリン測定試薬を提供するものである。

[0016] 更に本発明は、上記免疫学的測定方法によって被検試料中の可溶性フイブリンを測定し、被検体試料の血液凝固亢進状態を評価する方法を提供するものである。発明の効果

[0017] 本発明のモノクローナル抗体によれば、可溶性フイブリンのプラスミン分解物や安定化フイブリンのプラスミン分解物を認識することなぐプラスミンが作用していない可溶性フイブリンを特異的に認識することができる。従って、本発明のモノクローナル抗体を用いることにより、血液凝固形成の初期の段階を高感度かつ迅速に測定することがでさる。

図面の簡単な説明

[0018] [図 1]実施例 3で行った、還元条件下で処理したフイブリノゲンに対する J2— 23抗体の反応性を解析した図である（A: CBB染色、 B：ウェスタンブロット）。

[図 2]実施例 4で行った、プラスミン消化したフイブリノゲンの各消化断片に対する J2 —23抗体の反応性をウェスタンプロット法で解析し、反応する消化断片を、 CBBにより蛋白染色した泳動図である。

[図 3]6種類の合成ペプチドと本発明モノクローナル抗体との競合阻害を示す図である。 [図 4]実施例 6で行った、可溶性フイブリンと LTIA試薬との反応性を示した図である。発明を実施するための最良の形態

[0019] 本明細書において「可溶性フイブリン」とは、フイブリンモノマー（desAAフイブリンモノマー及び desAABBフイブリンモノマー）、並びにフイブリンモノマー複合体（フイブリンポリマー、フイブリンモノマー'フイブリノゲン複合体、フイブリンモノマー ' FDP複合体及びフイブリンモノマーとその他生体中の蛋白質との複合体）を示す。

[0020] 本発明のモノクローナル抗体は、上記可溶性フイブリンに作用し、フイブリノゲン、フイブリンモノマーのプラスミン分解物及び安定化フイブリンのプラスミン分解物には作用しない特徴を有する。

[0021] また、本発明のモノクローナル抗体のェピトープは、フイブリノゲンのトロンビン消化によって生成する可溶性フイブリンの A a鎖 C末端領域に新たに生じる構造変化部位であって、可溶性フイブリンのプラスミン消化によって切り離される部位に存在する。プラスミン消化を受けた可溶性フイブリンに対するモノクローナル抗体の認識作用は消失する。詳細には、当該ェピトープは、フイブリノゲンがプラスミンで消化を受けた際に生成するフラグメントの内、フイブリノゲン Aひ鎖上の C末端フラグメントにあつて、 Aひ鎖の 425番目のアミノ酸を N末端とする分子量約 16KDaの消化断片ぺプチド中に存在する。

さらに詳細には、当該ェピトープは、当該フイブリノゲン Aひ鎖の 502— 521番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド中に存在する。本発明のモノクローナル抗体は、当該フイブリノゲン Aひ鎖の 502— 521番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識するものであれば特に制限されない。

[0022] このように、フイブリノゲン自体とは反応せず、フイブリノゲンのトロンビン消化によつて生成する可溶性フイブリンの A a鎖 C末端領域に新たに生じる構造変化部位であつて、可溶性フイブリンのプラスミン消化によって切り離される部位に存在するモノクローナル抗体は今まで知られておらず、本発明のモノクローナル抗体は新規なものである。可溶性フイブリンの A ct鎖の C末端部位の構造変化については、これまで明確な報告はなされていないが、 Y. I. Veklichらの報告によれば Bio Chem, 199 3 ; 268, 13577— 13585. )、プラスミンによって A α鎖力ら切り離されるフラグメントは、 A a鎖のアミノ酸配列 220番目を N末端とする分子量 40KDaの消化断片である。このことから、本発明のモノクローナル抗体の認識部位力プラスミンによって切り離されるフラグメントに含まれていることが分かる。また、この報告ではフイブリノゲンの存在形態が電子顕微鏡によって明らかにされている。 2本存在するフイブリノゲンの A ひ鎖の C末端領域は、中性条件下では中央の Eドメインに結合し、トロンビン消化によってフイブリノペプチドが切断されると、 Eドメインに結合していた Aひ鎖の C末端領域は解離する。この解離により Aひ鎖の C末端領域の構造変化が生じるが、本発明のモノクローナル抗体はこの構造変化部位を特異的に認識するものである。

[0023] 本発明のモノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。

使用する免疫原としては、生成したフイブリンモノマー又は可溶性フイブリンが好ましい。トロンビン作用のみを受けた（プラスミン作用を受けていなレ、）フイブリノゲンやノ仆ロキソビン処理したフイブリノゲンなどを用いてもよい。フイブリンモノマーは、例えば U. SCHEEFERS— BORCHEL等の方法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 , 7091 - 7095, 1985.コに従って調製できる。具体白勺に ίま、 desAAフイブリンモノマーは、フイブリノゲン溶液にバトロキソビンを作用させ、生じたフイブリンクロットを尿素又は酸により可溶化することにより得られ、 desAABBフイブリンモノマーは、フイブリノゲン溶液にトロンビンを作用させ、生じたフイブリンクロットを尿素又は酸により可溶化することにより得られる。また、フイブリノゲンにバトロキソビンやトロンビンを作用させる際に、非常に少量で処理することにより、クロットを生じない条件下の処理液をそのまま用いることもできる。更に、フイブリノゲンにプラスミンを作用させ、切り離される A α鎖の C末端フラグメントを用いてもよく、 A a鎖の C末端フラグメントの一部と同一配列のポリペプチド、好ましくは前記 502— 521ポリペプチドを合成し、その合成ぺプチドを用いてもよい。

[0024] 免疫に用いる動物は特に限定されないが、例えばマウス、ラットなどが挙げられる。

免疫方法は、一般的な手法に従って行うことができる。例えば、免疫原を通常の緩衝液や生理食塩水に懸濁させたもの、あるいは免疫原と完全フロイントアジュバンドなどの補液との混合物を、動物の皮下、皮内、腹腔などに投与して一時刺激後、必要に応じて同様の操作を繰り返し行う。抗原の投与量は投与経路、動物種に応じて適宣決定されるが、通常の投与量は 1回当たり 10 μ g〜 lmg程度が好ましレ、。

[0025] 細胞融合に用いる免疫細胞は、最終免疫の 3〜4日後に摘出した脾臓細胞が好適である。また、前記免疫細胞と融合させる骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）としては、既に確立されている公知の各種細胞株が好ましぐ例えばマウスにおける NS1 (P3/ NSl/l-Ag4- l) [Eur. J. Immunol. 6 : 511— 519 (1976) ]、 SP2/0-Agl 4 [Nature 276 : 269 (1978) ]、 P3_X63—Ag8. 653 ^. Immunol. 123 : 1548 (1979) ]、 P3-X63— Ag8U. 1 [Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81 : 1 (1978 ) ]等や、ラットにおける Y3— Agl . 2. 3. [Nature 277： 131— 133 (1979) ]、 YB 2/0 (YB2/3HL/P2. Gi l . 16Ag. 20) [Methods Enzymol. 73B : 1 (198 1) ]等が挙げられる。

[0026] 細胞融合には、通常用いられるポリエチレングリコール（PEG)、センダイウィルス（ HVJ)等を使用することができる。細胞融合の手法は通常の方法と同様であり、例えば骨髄細胞と骨髄細胞に対して約:!〜 10倍の免疫細胞との混合ペレットに、平均分子量 1000〜6000のポリエチレングリコールを 30〜60%の濃度で滴下し、混合する。ハイプリドーマの選択は、通常の選択培地、例えば HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）を使用する。 HAT培地で培養して得られたハイプリドーマを用いて、通常の限界希釈法により、目的とする抗体産生株の検索及び単一クローン化を行えばよい。

[0027] 目的とする抗体産生株は、例えば ELISA法、 RIA法等により、プラスミンの作用を受けていない可溶性フイブリンに特異的に反応し、フイブリノゲン、フイブリンモノマーのプラスミン分解物及び安定化フイブリンのプラスミン分解物には反応しない抗体を産生するハイプリドーマを選択することにより得られる。

具体的には、まず培養上清中のモノクローナル抗体を、抗マウス IgG抗体等を介して固定化し、可溶性フイブリン及びフイブリノゲンを含有する試料を反応させる。次に、酵素などで標識した抗フイブリノゲン抗体を反応させ、可溶性フイブリンのみに反応し、かつフイブリノゲンとは反応しないモノクローナル抗体を選択する。更に、プラスミン分解物であるフイブリンフラグメント X、 Y又は Eや安定化フイブリン分解物 (XDP)とは反応しないモノクローナル抗体を選択する。このようにして、ェピトープがプラスミンによって切り離されるフラグメントに存在するモノクローナル抗体を作製すればよい。

[0028] 当該モノクローナル抗体は、常法に従レ、ハイプリドーマを培養し、培養上清から分離する方法、前記ハイプリドーマをこれと適合性のある哺乳類動物に投与し、腹水として回収する方法により製造できる。

[0029] 従来の任意の免疫学的測定方法に本発明のモノクローナル抗体を適用することにより、ヒト体液中のプラスミンの作用を受けていない可溶性フイブリンを特異的に測定すること力 Sできる。

例えば、 ELISA法で測定する場合には、精製した可溶性フイブリンを標準品として次のような方法で可溶性フイブリンを定量できる。即ち、本発明のモノクローナル抗体を固定化した ELISAプレートに、希釈した検体試料を添加し反応させた後、酵素標識した抗フイブリノゲンポリクローナル抗体を反応させ、発色後の吸光度の変化から試料中に存在するプラスミンの作用を受けていない可溶性フイブリンを特異的に定量できる。 LTIA法で測定する場合には、精製した可溶性フイブリンを標準品として次のような方法で定量することができる。即ち、本発明のモノクローナル抗体の少なくとも 1 種を不溶性担体であるラテックス粒子に感作し、検体試料に接触させることにより、試料中の可溶性フイブリンを介して抗体感作ラテックス粒子同士が架橋し凝集を生じるため、この凝集度の変化から当該可溶性フイブリンを特異的に定量できる。検体試料としては、可溶性フイブリンを含有するヒト体液であれば特に制限されず、例えば血液、尿等が挙げられる。

[0030] LTIA法等における抗体感作ラテックス粒子のラテックス粒子としては、ラテックス凝集反応を利用した免疫学的凝集反応及び凝集阻止反応において、一般的に用いられている微粒子の担体であれば特に制限されなレ、が、工業的に大量生産することができる有機系微粒子が好ましい。このような有機系微粒子としては、例えば、スチレン、塩化ビュル、アクリロニトリル、酢酸ビュル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビュル系モノマーの単独重合体又は共重合体；スチレン—ブタジェン共重合体、メチルメタタリレート一ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等が挙げられる。また、このような有機系微粒子に、カルボキシル基、第一級ァミノ基、力ルバモイル基、水酸基、アルデヒド基等の官能基が結合した反応性有機系微粒子も好ましく使用することができる。上記のラテックス粒子の中では、抗原又は抗体の吸着性に優れ、生物学的活性を長期間安定に保持できる点から、ポリスチレン、スチレン一ブタジエン共重合体等のポリスチレン系ラテックス粒子が好ましい。

[0031] ラテックス粒子の形状は特に制限されなレ、が、その平均粒子径は、ラテックス粒子表面の蛋白質と測定対象物質との凝集反応の結果生じる凝集体が肉眼又は光学的に検出できるに充分な大きさが望ましい。好ましい平均粒子径としては 0. 02-1. 6 mであり、特に 0. 03〜0. 5 x mカ好ましレ、₀

[0032] ラテックス粒子に本発明のモノクローナル抗体を感作する方法としては特に制限されず、公知の方法が使用できる。例えばラテックス粒子表面に物理的に吸着させる方法、官能基を有するラテックス粒子表面に共有結合、免疫的結合によって感作する方法などが挙げられる。

[0033] 本発明の可溶性フイブリン測定試薬には、本発明のモノクローナル抗体を感作したラテックス粒子の他に、 BSA、ショ糖等の安定剤、アジ化ナトリウム等の防腐剤を適宜加えてもよい。本発明の可溶性フイブリン測定試薬に、更に希釈液を組み合わせてラテックス凝集反応用キットとしてもよい。この希釈液には、必要に応じて上記の安定剤や防腐剤を添加することができる。

実施例

[0034] 次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

[0035] 実施例 1 モノクローナル抗体の調製

(1)ハイプリドーマの調製

PBSに溶解したヒト精製フイブリノゲンにバトロキソビン処理を行い生成した可溶性フイブリンを免疫原とした。この免疫原を完全フロイントアジュバンド (GIBCO社製）と 1対 1で混和乳化し、 0· lmg/0. lmL (ェマルジヨン）で 6週齢の雌 BALB/Cマウスの皮下に 1週間間隔で 6回投与後、最終免疫の 3日後に脾臓を摘出した。摘出した脾臓から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞 SP2/0— Agl4とを 6対 1の割合で混合し、 50%ポリエチレングリコール 1540 (和光純薬工業社製)存在下にて細胞融合させた。融合細胞は脾臓細胞として 2. 5 X 10⁶/mLになるように HAT培地に懸濁し、 96穴培養プレート（CORNING社製）に 0. 2mLずつ分注した。これを 5%C〇ィ

2 ンキュベータ一中で 37°Cにて培養し、おおよそ 2週間後に、ハイプリドーマの生育してきたゥエルの培養上清について、次に示す ELISA法にしたがって、可溶性フイブリンに対する抗体の産生が有望な株を選択した。

[0036] まず、マイクロプレート（NUNC社製）にャギ抗マウス IgG (Fc)抗体 (JACKSON社製）を介し、各培養上清中の IgGを固相化した。これに、可溶性フイブリン及びフイブリノゲン、フイブリン X、 Y、 Ε、安定化フイブリン分解物 (XDP)を反応させた。さらにべルォキシダーゼ標識抗フイブリノゲンゥサギポリクローナル抗体 (DAKO社製）を反応させた後、オルトフヱ二レンジァミン (東京化成社製）を含むペルォキシダーゼ基質溶液を加え発色させ、 1. 5N硫酸を加え発色を停止した後、マイクロプレートリーダー（ Abs. 492nm)で測定し、可溶性フイブリンに対して高い反応性を示す力フイブリノゲン、フイブリン X、 Y、 Ε、及び安定化フイブリン分解物 (XDP)には反応性を示さな力つた株を選択した。このハイプリドーマを限界希釈法によるクローン化を行い、抗可溶性フイブリンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ J2— 23)を 1種樹立した。このハイプリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒 3 05 -8566 日本国茨城県つくば巿東 1— 1— 1 中央第 6)に 2004年 12月 3日に寄託番号（FERM BP— 10172)として寄託された。尚、以下の記載において、ハイブリドーマ (J2— 23)から分泌される抗可溶性フイブリンモノクローナル抗体を J2— 23抗体と称する。

[0037] (2)モノクローナル抗体の調製

2週間前にプリスタン 0. 5mLを腹腔内に注射しておいた 12週齢の雌 BALB/Cマウスに、上記で得られたハイプリドーマを細胞数 0. 5 X 10⁶個の量で腹腔内に投与した。約 14日後に腹水を採取し、遠心処理して上清を得た。上清を等量の吸着用緩衝液（3molZL NaCl- 1. 5mol/L Glycine _Na〇H、 pH8. 5)と混和後、濾過した。この濾液を吸着用緩衝液で平衡ィ匕したプロテイン Aカラム（フアルマシア社製 )に通して抗体をカラムに吸着させた後、 0. lmol/Lクェン酸緩衝液（pH3. 0)で力ラムより溶出させ、抗可溶性フイブリンモノクローナル抗体 (J2— 23抗体）を精製した。

[0038] 実施例 2 抗可溶性フイブリンモノクローナル抗体 J2— 23抗体）の免疫グロブリンクラス及び特異性の同定（1)

J2— 23抗体の免疫グロブリンクラスを ELISA法（ZYMED社製）により同定したところ、 IgGl、 κ軽鎖であった。

J2— 23抗体を、 PBSで 5 x gZmLの濃度に調整後、 96穴 ELISAプレート（NUN C社製）に 50 LZウエノレカロえ、 4。Cで一夜インキュベートした。プレートを PBSで 3回洗浄後、ブロッキング液（1%BSAを含む PBS)を 100 x L/ゥヱル加え、 1時間ブロッキングした。ブロッキング液を除去後、ブロッキング液により希釈した表 1に記載の各種抗原を 50 /i L/ゥエル加え、室温で 1時間インキュベートした。ブロッキング液で 3回洗浄した後、ペルォキシダーゼ標識抗フイブリノゲンゥサギポリクローナル抗体を加え、室温で 1時間インキュベートした。再びブロッキング液で 3回洗浄した後、実施例 1のペルォキシダーゼ基質溶液を 50 /i L/ゥヱル加えた。 10分後、 1. 5N硫酸を 50 μ L/ゥエル加え、 492nmにおける吸光度を測定した。

[0039] 表 1中、フイブリノゲン (以下、 Fbgと表記することがある）はシグマ社製の精製品をゲルろ過法によりさらに精製して用いた。 desAAフイブリンモノマー（以下、 desAAF bnと表記することがある）及び desAABBフイブリンモノマー（以下、 desAABBFbnと表記することがある）は、精製された Fbgに、ノ仆ロキソビン又はトロンビンをそれぞれ作用後、生じたクロットを酸で可溶化して調製した。更に、 desAAFbn— Fbg複合体及び desAABBFbn_Fbg複合体は、酸可溶化 desAAFbn及び desAABBFbnを各々 Fbg溶液に添カ卩し、複合体形成によって高分子化した画分をゲルろ過法により分離し調製した。 Fbgフラグメント X及び Yは、いずれも市販品（国際バイオ社製）を使用した。フイブリンフラグメント X及び Yは、前記 Fbgフラグメント X及び Yをトロンビン処理して、フイブリンフラグメント X及び Yとした。 Fbgフラグメント E、フイブリンフラグメント E、 Dダイマー（DD)及び Dモノマー（D)は、市販品（国際バイオ社製）を用いた。 DD ZEを含む XDP画分は、フイブリン塊にプラスミンを作用させ、消化物をゲルろ過で分離後、高分子画分を XDP画分とした。

[0040] 結果を表 1に示す。表 1において、「 +」は、サンドイッチ ELISA法で反応し、「_」は、反応しなかったことを表す。

[0041] [表 1] 抗原 J2-23抗体

フイブリノゲン ―

desAAフイブリンモノマー +

desAAフイブリンーフィプリノゲン複合体 +

desAABBフイブリンモノマー +

desAABBフイブリン—フィプリノゲン複合体 +

フイブリノゲンフラグメント X ― フィプリンフラグメント X ―

フイブリノゲンフラグメント Y ―

フイブリンフラグメント Y ― フイブリノゲンフラグメント E ― フィプリンフラグメント E -

DD/Eを含む XDP画分 -

DD -

D -

[0042] 表 1から明らかなように、本発明のモノクローナル抗体 tF2 _ 23抗体）は、各種液相の抗原に対して、 desAAFbn、 desAAFbn_Fbg複合体、 desAABBFbn、及び de sAABBFbn_Fbg複合体に反応し、未処理の Fbg、プラスミンによるフイブリノゲン分解物（FbgDPすなわち、フイブリノゲンフラグメント X、フイブリノゲン Y、フイブリノゲン Ε及び D)及びフイブリン分解物（FbnDPすなわち、フイブリンフラグメント X、フイブリンフラグメント Y、フイブリンフラグメント E、 DD/Eを含む XDP画分、 DD)には反応しないことが判明した。

[0043] 実施例 3 抗可溶性フイブリンモノクローナル抗体 2 _ 23抗体）の特異性の同定（2 )

実施例 2で評価した各種抗原を、非還元条件下で SDS— PAGE分離後、 PVDF 膜に転写し、 3%スキムミルクを含む PBST (0. 05%Tween20を含む PBS)で 1時間ブロッキング後、一次抗体としてモノクローナル抗体ひ2— 23抗体）、二次抗体としてペルォキシダーゼ標識抗マウス IgG抗体 (Biosource international社製）を反応させた。 PVDF膜を PBSTで洗浄後、ジァミノベンチジンを基質として加え、発色させた。その結果、 desAAFbn及び desAABBFbn以外に Fbgにも反応することが確認されたが、各種 FbgDPには反応は認められな力た。更に、 Fbgを還元条件下で処理し同様の操作を行ったところ、 A a鎖に強レ、反応が認められた（図 1)。

[0044] 以上の結果より、本発明のモノクローナル抗体 J2— 23抗体）のェピトープは、液相中の未変性の Fbgには出現しておらず、 Fbgを変性させることにより、 Fbgの Aひ鎖上に出現することが判明した。その部位は、 J2— 23抗体が各種 FbgDPには反応しないことから、可溶性フイブリンにプラスミンが作用して切り離されたフラグメントに存在することが判明した。

[0045] 実施例 4 抗可溶性フイブリンモノクローナル抗体 2 _ 23抗体）のェピトープ解析（1 )

実施例 3で得られた知見をもとに、 Aひ鎖上のェピトープ位置を以下に示す方法で解析した。精製 Fbgを 10mmol/Lトリス緩衝液（ρΗ8· 0)を用いて 10mg/mLとなるように溶解した溶液に、プラスミン (クロモジェニックス社製）を最終濃度 0· 2単位/ mLとなるように添加し、 37°Cで 30分消化させた。その後、最終濃度 500単位/ mL となるようにァプロチニン (三菱ゥエルファーマ社製）を加え、プラスミン活性を失活させた。この消化液を還元処理した後、 SDS— PAGE 15— 25%で分離後、 PVDF へ転写し、 CBB染色及び上記実施例 3と同様に本発明のモノクローナル抗体 CJ2— 23抗体）を用いてィムノブ口ティングを行った。

[0046] その結果、約 16kDaの J2— 23抗体と反応する消化断片が認められた（図 2の矢印のバンド)。 CBB染色されたその消化断片を切り出し、 N末端アミノ酸配列を調べた結果、 Fbg A a鎖の 425番目を N末端とする配列（TGKEKVTS)であった。

この配列は、 Fbgがプラスミン消化によって Fbg _Xに変化する際に、切り離されるフラグメント中にあることから、本発明のモノクローナル抗体のェピトープは、 Fbgの A ひ鎖上にあり、かつプラスミンで消化を受け、切り離される Aひ鎖の C末端領域に存在することが判明した。更に、本発明の抗体のェピトープは、このプラスミン消化フラグメントの内、 Aひ鎖の 425番目以降に存在することが判明した。プラスミン消ィ匕 Aひ鎖 C末端フラグメントに反応性を示す可溶性フイブリンに対する抗体は、これまで知られてレ、なレ、新規な抗体である。

[0047] 実施例 5 抗可溶性フイブリンモノクローナル抗体 2 _ 23抗体）のェピトープ解析（2 )

実施例 4で得られた知見をもとに、 Aひ鎖上のェピトープ位置を以下に示す方法で、さらに解析を進めた。 [0048] Doolittleらの方法（Biochemistry 1977, 16： 1703)に基づき、 Fbg力ら Aひ鎖を分離精製した。精製 A α鎖を Endoproteinase Asp - N (シグマ社製）を用いて消化後、実施例 4と同様にして、ィムノブロッテイングを行った。

その結果、 7〜8kDaに消化断片が認められ、その消化断片の N末端アミノ酸配列を調べた結果、 Fbg A a鎖の 502番目を N末端とする配列（DTAST)であった。この消化断片の分子量及び Asp _ Nの切断部位がァスパラギン酸のアミノ基側であることから推察して、 502〜573番目のペプチドであると推測した。

[0049] 次に、上記消化断片のアミノ酸配列に相当するペプチドを、 502番目を始めとして 6種類（AA502— 521、 AA512— 531、 AA522— 541、 AA532— 551、 AA542 561、 AA552— 571 )を合成し、以下に示す方法で、本発明のモノクローナル抗体 J2— 23抗体）のェピトープの絞込みを行った。

[0050] まずャギ抗マウス IgG (Fc)抗体を PBSで 5 /i g/mLの濃度に調整後、マイクロプレートに 50 /i L/ゥエル加え、 4°Cで 1夜インキュベートした。プレートを PBST (0. 05 %Tween20を含む PBS)にて 3回洗浄後、ブロッキング液（BSA—PBST)を 100 μ L/ゥヱルカ卩ぇ、室温で 1時間インキュベートした。 PBSTで 3回洗浄後、本発明のモノクローナル抗体 J2— 23抗体）を BSA—PBSTで 0· 2 μ g/mLの濃度に調整後 5 O x L/ゥエル加え、室温で 1時間インキュベートした。 PBSTで 3回洗浄後、 0〜： 100 μ gZmLに BSA—PBSTで希釈した各合成ペプチドを 25 μ L/ゥヱル加え、室温で 30分間インキュベートした。続いて、後述する実施例 6で調製した可溶性フイブリンを BSA— PBSTで 1 μ gZmLに調製後、 25 μ LZゥェルカ卩ぇ、室温で 1時間インキュペートした。 PBSTで 3回洗浄後、 BSA—PBSTで 5000倍に希釈した HRP—ゥサギ抗ヒト Fibrinogen抗体（DAKO社製）を 50 μ L/ゥヱル加え、室温で 1時間インキュペートした。 PBSTで 3回洗浄後、実施例 1のペルォキシダーゼ基質溶液を 50〃L /クェノレカロ免た。 10分後、 1. 5N硫酸を 50 z L /ウエノレカロ免、 492nmにおける吸光度を測定した。

[0051] その結果を図 3に示す。 6種類の合成ペプチドの内、 AA502— 521のみ競合阻害反応が認められたことから、本発明のモノクローナル抗体 (J2— 23抗体）のェピトープは、 Fbgの A ct鎖の 502〜521番目のアミノ酸配列を認識することが確認された。このことは、 Fbgにトロンビンが作用した際に生成する可溶性フイブリンの Aひ鎖 C末端領域、少なくとも 502〜521番目付近の構造が変化することを示すものであり、本発明のモノクローナル抗体 t[2_ 23抗体）は、この構造変化を特異的に認識する、可溶性フイブリンに特異的な抗体とレ、える。

[0052] 実施例 6 ラテックス凝集反応 (LTIA)を用いた可溶性フイブリンの測定

(1)抗体感作ラテックスの調製

モノクローナル抗体 (J2— 23抗体）を 20mmolZLトリス塩酸緩衝液（pH7. 5)で 0 . 7mg/mLとなるように希釈した抗体液と、 1%ラテックス溶液 (粒径 0. 2 x m、積水化学工業社製)を等量ずつ混和し、 4°Cで約 2時間攪拌した。更に、 1%BSAを等量加え 1時間攪拌した後、遠心（100, 000 X g、 5分間）処理した。沈降したラテックスを 0. 5%BSAを含む 5mmol/L M〇PS (pH7. 0)で懸濁し、抗体感作ラテックスを得た。

[0053] (2)可溶性フイブリンの調製

実施例 2と同様に、酸可溶性 desAAFbn又は desAABBFbnを調製し、ヒトクェン酸血漿にそれぞれ最終濃度 0〜50 μ g/mLとなるように添加したものを可溶性フィブリンとした。

[0054] (3)可溶性フイブリンの測定

0. 4%BSA及び 0. 5molZL塩化ナトリウムを含む 30mmolZLトリス塩酸緩衝液（ pH8. 5)を調製し (第 1試薬）、上記で調製した抗体感作ラテックス (第 2試薬)を用いて、生化学自動分析装置日立 7170形にて測定した。自動分析装置内の 37°Cの反応セルに、上記で調製した可溶性フイブリン 3 z L及び第 1試薬 100 z L添加し、第 1 試薬添加から 5分後、第 2試薬 100 を添加し、 5分間抗原抗体反応をさせた。そして、主波長 570nm及び副波長 800nmにて、ポイント 18から 34の間の、反応前後の吸光度変化を測定した（図 4)。添加した desAAFbn又は desAABBFbnの濃度に対応した吸光度変化が認められたことから、本発明のモノクローナル抗体を使用することにより、血中の可溶性フイブリン量を測定できることが確認された。

Claims

請求の範囲

[I] フイブリノゲンのトロンビン消化によって生成する可溶性フイブリンの A ct鎖 C末端領域に新たに生じる構造変化部位を特異的に認識する可溶性フイブリンに対するモノクローナル抗体。

[2] 前記認識部位が、フイブリノゲンがプラスミン消化によってフイブリノゲン Xに変換される際に切り離されるフイブリノゲン Aひ鎖の C末端フラグメントに存在する請求項 1記載のモノクローナル抗体。

[3] 前記認識部位が、フイブリノゲン A a鎖の 425番目のアミノ酸を N末端とする分子量約 16KDaのペプチド中に存在する請求項 1又は 2記載のモノクローナル抗体。

[4] 前記認識部位が、フイブリノゲン Α α鎖の 502— 521番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項 1又は 2記載のモノクローナル抗体。

[5] 可溶性フイブリン力フイブリンモノマー又はフイブリンモノマー複合体である請求項

1〜4のいずれか 1項記載のモノクローナノレ抗体。

[6] フイブリンモノマー複合体力フイブリンポリマー、フイブリンモノマー'フイブリノゲン複合体又はフイブリンモノマ一 · FDP複合体である請求項 1〜5のいずれか 1項記載のモノクローナル抗体。

[7] フイブリノゲン、フイブリンモノマーのプラスミン分解物及び安定化フイブリンのプラスミン分解物に作用しない請求項 1〜6のいずれ力 4項記載のモノクローナル抗体。

[8] 請求項 1〜7のいずれ力 1項記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。

[9] 被検試料に請求項:!〜 7のいずれか 1項記載のモノクローナル抗体を反応させることを特徴とする試料中の可溶性フイブリンの免疫学的測定方法。

[10] 不溶性担体に固定された請求項 1〜7のいずれか 1項記載のモノクローナル抗体を用いる請求項 9記載の測定方法。

[I I] 請求項 1〜7記載のいずれ力 1項記載のモノクローナル抗体を含有する可溶性フィブリン測定試薬。

[12] 請求項 9又は 10記載の測定方法によって被検試料中の可溶性フイブリンを測定し、被検試料の血液凝固亢進状態を評価する方法。