CN103435685B - 抗纤维介素蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗纤维介素蛋白单克隆抗体及其应用。本发明采用氨基酸序列为ADDHRDPGGNGGNGA的抗原多肽作为免疫原，免疫小鼠，经细胞融合，筛选得到一株稳定分泌抗纤维介素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CCTCC NO:C2012200；该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体能够与纤维介素蛋白发生特异性反应，具有明显的抗凝效应，并且同时表现出显著的抑制肝癌生长的作用（既可抑制肝癌HCCLM6细胞的增殖，又可下调肿瘤血管新生），其双重抑制多靶点阻断的抗癌效应在肝癌靶向治疗药物研发中具有重要的意义，在制备用于治疗肝癌的相关药物中应用前景广泛。

Description

抗纤维介素蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体，尤其涉及一种抗纤维介素蛋白的单克隆抗体以及分泌该抗纤维介素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明还涉及该单克隆抗体在制备用于治疗肝癌药物中的应用。

背景技术

纤维介素蛋白2（Fibrinogen-likeprotein2,fgl2）是近年来发现的一种促凝蛋白，又称为fgl2凝血酶原酶，属于纤维蛋白原相关蛋白超家族，最初在小鼠体内发现，随后又从人的外周血T淋巴细胞克隆出其cDNA序列。小鼠纤维介素（mfgl2）的基因位于第5号染色体，其编码蛋白由432个氨基酸组成；人纤维介素（fibroleukin,hfgl2）基因位于7q11,23，其基因序列分析提示fgl2基因全长约7kb，具有两个外显子，编码蛋白由439个氨基酸组成，其中前204个氨基酸由外显子1编码。mfgl2和hfgl2基因编码蛋白的氨基酸同源性大于70%，尤其羧基端225个氨基酸同源性超过90%。

Fgl2有两种类型：跨膜型fgl2和分泌型fgl2（solublefgl2,sfgl2）。跨膜型fgl2是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，其分子量大小为70kDa，主要表达在血管内皮细胞和巨噬细胞的表面，是一种凝血酶原酶，能够直接裂解凝血酶原成为凝血酶，从而快速启动凝血反应（LevyGA,LiuMF,DingJW,etal.Molecularandfunctionalanalysisofhumanprothrombinasegene(hflg2)anditsroleinviralhepatitis.AmJPathol,2000,156:1217-1225），小鼠和人的病毒性肝炎的肝细胞损伤中均可以观察到微血管中纤维蛋白的沉积和血栓形成；分泌型fgl2主要由T淋巴细胞分泌，其在免疫耐受方面发挥重要作用并且可导致自身免疫性疾病的发生。已有研究表明，fgl2与人、小鼠的病毒性肝炎、自发性流产以及移植排斥反应等均有密切关系（ParrRL,FungLS,RenekerJ,etal.Associationofmousefibrinogen-likeproteinwithmurinehepatitisvirus-inducedprothrombinaseactivity.JVirol,1995,69(8):5003）。

肿瘤的发生和发展与凝血机制之间存在某种联系早在1865年由法国学者ArmandTrousseau提出，促成这一关联的主要因素包括凝血酶和组织因子（tissuefactor，TF），除了在肿瘤患者体内促进高凝状态形成外，凝血酶被认为是肿瘤生长及转移病理生理学改变的重要环节。凝血酶作为一个血管新生的有力催化剂，其作用主要是通过凝血非依赖途径和凝血依赖途径共同实现的。在凝血非依赖途径中，凝血酶激活蛋白酶激活受体(proteaseactivatedreceptors,PARS)，从而影响肿瘤细胞及其微环境中其他细胞的增殖和功能；在凝血依赖途径中，凝血酶通过增加基质纤维蛋白的沉积，继而影响肿瘤微环境中各种因素的平衡，尤其是血管新生相关的细胞和因子。

肝癌是发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，通常多指的是原发性肝癌，其是临床上最常见的恶性肿瘤之一。根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，在癌症全球发病率中居第5位，死亡率居第3位。而我国乙肝患者众多，肝癌发病人数约占全球的55%，是全球肝癌发病率最高的国家，已严重威胁我国人民的健康和生命，其危险性不容小视。目前针对肝癌的治疗主要是早期采取手术切除，晚期采取局部治疗辅以放疗、全身化疗等。由于在肝癌早期,多数患者没有明显的相关阳性体征，所以超过70%的肝癌患者发现时已丧失手术治疗机会或者复发转移，针对这些患者的传统治疗方法效果十分局限。

分子靶向治疗是近年来发展起来的全新治疗方法，它的基本概念是以肿瘤细胞过度表达的细胞受体、关键基因和某些标志性分子为靶点，选择特异性阻断剂靶向性地干预这些位点或其信号通路，从而达到抑制肿瘤生长、进展及转移的效果。其中，单克隆抗体（monoclonalantibody,mAb）具有明确的作用位点和亲和力，并且特异性强、不良反应小，成为生命科学领域重要的分子靶向治疗药物，寻找针对肿瘤的特异性理想靶点成为全世界的科学研究热点。基于前期的研究发现，在结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌，肝癌等恶性肿瘤组织中均有较为广泛的fgl2凝血酶原酶的表达，fgl2凝血酶原酶催化生成的凝血酶，与由组织因子触发经典途径所生成的凝血酶共同影响着恶性肿瘤的生物学行为，成为抗肿瘤治疗的良好靶点。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗纤维介素蛋白的单克隆抗体以及分泌抗纤维介素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

本发明的目的之二是将上述抗纤维介素蛋白单克隆抗体或分泌抗纤维介素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株应用于制备用于治疗肝癌的药物，特别是该药物包括作为活性成分的上述单克隆抗体和药用载体。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明以氨基酸序列为SEQIDNo.1所示（ADDHRDPGGNGGNGA）的抗原多肽为免疫原，经免疫动物制备得到分泌抗纤维介素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。特别是，所述免疫原是根据小鼠纤维介素（mfgl2，GenBank：EDL03209.1）外显子1的氨基酸序列所合成的含有15个氨基酸的多肽，其位于mfgl2外显子1的第101至115位。

更具体地，本发明的分泌抗纤维介素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：（1）将氨基酸序列为SEQIDNo.1所示（ADDHRDPGGNGGNGA）的抗原多肽与血蓝蛋白偶联形成大分子抗原；（2）将所述大分子抗原免疫BALB/CJ小鼠；（3）将免疫小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤进行细胞融合，经筛选获得分泌抗纤维介素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

其中，步骤（2）中所述的免疫方式为腹腔注射；所述腹腔注射的次数为至少四次；所述至少四次腹腔注射的间隔时间为：首免后间隔两周进行二免，二免后间隔三周进行三免，三免后间隔十天进行四免，四免十天后对小鼠血清进行ELISA检测，若血清抗体呈阴性则继续进行免疫，直至小鼠血清抗体呈阳性。

特别是，所述至少四次腹腔注射的方式为：首免采用上述大分子抗原和弗氏完全佐剂混合形成的乳化剂进行，二免和三免采用上述大分子抗原和弗氏不完全佐剂混合形成的乳化剂进行，四免及四免以上直接采用上述大分子抗原进行；其中，首免时所述大分子抗原和弗氏完全佐剂（FCA）等体积进行混合（即将一定剂量的大分子抗原溶解于一定体积的溶液中，然后再与同体积的FCA进行混合），二免和三免所述大分子抗原和弗氏不完全佐剂等体积进行混合。

尤其是，进行首免至三免时，所述大分子抗原的剂量为每只小鼠160ug，进行四免及四免以上时，所述大分子抗原的剂量为每只小鼠320ug。

本发明经筛选得到一株稳定分泌抗纤维介素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CCTCCNO:C2012200；分类命名为：杂交瘤细胞株；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：中国，武汉，武汉大学；邮政编码是：430072；保藏时间是：2012年12月24日。

由上述抗纤维介素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体为IgG1亚类。抗体的效价检测结果表明：本发明杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体诱导小鼠产生的腹水效价为1：12000，细胞上清效价为1：40。

Westernblot检测结果表明，本发明单克隆抗体能够与人肝癌组织全蛋白提取物中的flg2蛋白特异性结合，并且在fgl2高、中、低表达的人高侵袭性肝癌细胞系HCCLM6中，fgl2基因表达的水平与fgl2蛋白表达的水平相一致。

本发明的单克隆抗体对肿瘤细胞具有抗凝效应，能够显著抵制裸鼠人肝癌皮下移植瘤的生长，并且干预效果明显；此外，本发明单克隆抗体对HCCLM6细胞和HUVEC细胞的增殖均有抑制作用，对肿瘤组织、人肝癌角膜以及小鼠主动脉环血管新生具有抑制作用，还能够抑制肿瘤微环境中的细胞因子（如VEGF、Ang2）的分泌。由此说明，本发明的单克隆抗体具有双重抑制多靶点阻断的抗癌效应，特别是在肝癌靶向治疗药物研发中具有重要的意义，本发明的单克隆抗体及杂交瘤细胞株可应用于制备用于治疗肝癌的药物，并且应用前景广泛。

附图说明

图1是本发明单克隆抗体亚类鉴定结果；

图2是应用westernblot检测人肝癌组织中fgl2蛋白表达的结果；A：杂交瘤腹水；B：纯化后的单克隆抗体；

图3是fgl2基因及蛋白在低、中、高表达HCCLM6细胞系中的表达结果；A：蛋白表达；B：基因表达；1：fgl2低表达HCCLM6细胞系；2：fgl2中表达HCCLM6细胞系；3：fgl2高表达HCCLM6细胞系；

图4是采用单克隆抗体处理高表达HCCLM6细胞系后的抗凝效果检测结果；

图5是采用单克隆抗体对荷瘤裸鼠进行治疗时各时间点肿瘤体积变化结果；

图6是采用单克隆抗体对荷瘤裸鼠治疗终点时的肿瘤重量结果；

图7是采用单克隆抗体对荷瘤裸鼠治疗终点时的相对肿瘤增殖率结果；

图8是单克隆抗体对高表达HCCLM6细胞的作用结果；

图9是单克隆抗体对高表HUVEC细胞的作用结果;

图10是应用免疫组织化学检测肿瘤组织中血管新生的结果；A：PBS空白对照组；B：鼠IgG1阴性对照组；C：fgl2-mAb高剂量组（100ug）；

图11是肿瘤组织中微血管密度计数结果；

图12是单克隆抗体对肝癌诱导的小鼠角膜血管新生的作用结果；A：角膜模型裸鼠；B：IgG1阴性对照组；C：fgl-mAb治疗组(100ug/ml)；

图13是单克隆抗体对肝癌诱导的小鼠主动脉环血管新生的作用结果；A：IgG1阴性对照组；B：fgl-mAb治疗组（50ug/ml）；C：fgl-mAb治疗组（100ug/ml）；

图14是单克隆抗体对HCCLM6细胞中血管内皮因子分泌的作用结果；

图15是单克隆抗体对HUVEC细胞中促血管生成素2分泌的作用结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验材料

Balb/cJ雌性小鼠：6-8周龄，购自中国科学院上海实验动物中心；

雄性无胸腺裸鼠：6-7周龄，购自中国科学院上海实验动物中心；

Balb/cJ雌性小鼠：8-12周龄，购自中国科学院上海实验动物中心；

抗原多肽（命名为Pep3）：其氨基酸序列为ADDHRDPGGNGGNGA，由武汉市三鹰生物技术有限工程公司合成；

单抗亚型鉴定ELISA试剂盒：购自CELLWAY-LAB，型号C060101；

肝癌组织标本：取自同济医院肝脏外科肝癌患者，标本取材过程获准医院伦理委员会认可；

通用总蛋白质提取试剂盒：购自上海生工，货号：786-225；

人高侵袭性肝癌细胞系（HCCLM6）：购自上海复旦大学附属中同医院肝癌研究所；

脐静脉内皮细胞（HUVEC）：购自中国科学院细胞库；

鼠IgG1同型抗体（阴性对照）：购自SantaCruz，货号sc-2025；

CCK8试剂：购自日本同仁，货号CK04

实施例1单克隆抗体的制备

1、小鼠免疫

采用常规方法将抗原多肽（Pep3）与血蓝蛋白（KLH）进行化学连接形成大分子抗原（Pep3-KLH），以Pep3-KLH作为免疫原，对6-8周龄BALB/CJ雌性小鼠进行至少四次免疫。免疫方案如下：

首免，将Pep3-KLH溶于一定体积（如200uL）生理盐水，再与等体积FCA混合后制成乳化剂，对小鼠进行腹腔注射，其中每只小鼠使用Pep3-KLH的剂量为160ug；二免于首免后两周进行，将Pep3-KLH与FICA等体积混合后制成乳化剂，对小鼠进行腹腔注射，其中每只小鼠使用Pep3-KLH的剂量为160ug；三免于二免后三周进行，方法和剂量与二免相同；四免于三免后十天进行，将320ug的Pep3-KLH溶于一定体积（如200uL）生理盐水后，对小鼠进行腹腔注射；四免十天后，对小鼠进行内眦静脉取血，通过ELISA法检测血清抗体，如果血清抗体呈阴性，则每间隔十天继续进行下次免疫，直至小鼠血清抗体呈阳性，四免后每次免疫方法和剂量同四免。

2、细胞融合

断颈处死血清抗体呈阳性的小鼠，无菌取其脾脏细胞，按照脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞5：1的比例进行细胞融合，融合后的杂交瘤细胞铺于48孔细胞培养板，采用HAT选择培养基进行培养。

3、阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆

将培养七天后的杂交瘤细胞用常规ELISA法检测细胞上清，从而筛选阳性杂交瘤细胞，ELISA具体操作步骤为：

将Pep3多肽用包被液稀释成0.05ug/ml，以每孔100ug包被酶标板，于4℃过夜；次日，扣去包被液，洗涤3次后，每孔加入200ul封闭液（5%BSA），于37℃孵育1小时后洗涤3次、拍干；然后每孔加入100ul培养七天后的杂交瘤细胞上清，于37℃孵育2小时后洗涤3次；再每孔加入100ul辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG（1：4000），于37℃孵育1小时后洗涤5次，加入四甲基联苯胺（TMB）显色底物液，于37℃避光显色15分钟，加终止液（2M的硫酸）终止反应，采用酶标仪于OD450读取吸光度，以P/N≥2.1作为阳性判定标准，同时设置空白对照（新鲜HAT选择培养基）、阴性血清对照（未免疫小鼠血清）以及阳性血清对照（免疫后小鼠多抗，来源于华中科技大学同济医学院附属同济医院感染免疫研究室），挑选出抗纤维介素蛋白的杂交瘤细胞克隆孔；

采用有限稀释法对筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，直至亚克隆检测结果的阳性率达到100%，最终筛选出一株稳定分泌抗纤维介素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株（命名为SF9），其微生物保藏号是：CCTCCNO:C2012200。

4、单克隆抗体的大量制备

将SF9细胞株进行扩大培养，收集细胞后腹腔注射降植烷致敏的BALB/CJ小鼠，其中每只注射1ml（含SF9细胞1×10⁶个）；在注射后10天收获腹水，于1200转/分钟离心，除去沉淀，收集上层腹水，分装后于-20℃保存。

5、单克隆抗体的纯化

利用GEAKTAFPLC快速蛋白液相色谱系统及ProteinG亲和层析柱（GEHitrapproteinGHP）进行亲和层析纯化，具体方法如下：

用5倍体积起始缓冲液（0.02mol/L磷酸缓冲液，PH值7.6）平衡亲和层析柱后，将样品（腹水与等体积2×PBS缓冲液的混合液）缓慢加入层析柱，控制加样流速为0.5ml/min，待样品完全进入层析柱后以10倍磷酸缓冲液洗脱杂蛋白，杂蛋白洗脱完后再用5倍柠檬酸缓冲液（0.1mol/L柠檬酸缓冲液，PH值3.2）进行蛋白洗脱，控制洗脱流速为1ml/min，以每管1ml收集洗脱液，其中经UV-280nm检测收集到的第2次洗脱峰为纯化的单克隆抗体（简写为fgl2-mAb或anti-fgl2），经免疫活性鉴定后采用0.45微米的滤膜进行过滤，然后于-20℃保存。

试验例1单克隆抗体的鉴定

1、单克隆抗体的效价测定

将含有单克隆抗体的腹水和杂交瘤细胞上清（10⁷个细胞培养24小时后的上清）用PBS进行10倍系列稀释后，用上述ELISA法进行效价测定，结果表明：腹水效价为1：12000，细胞上清效价为1：40。

2、单克隆抗体的亚类鉴定

采用单抗亚型鉴定ELISA试剂盒进行亚类鉴定，将细胞培养上清按1:100稀释后，取150ul按照试剂盒说明书检测单抗亚型，结果如图1所示；结果表明：本发明的单克隆抗体SF9为IgG1亚类。

3、单克隆抗体的免疫活性鉴定

将经手术切除后病理证实为原发性肝癌的肝癌组织标本，用通用总蛋白质提取试剂盒按照试剂盒中的说明书进行总蛋白质的提取，得到人肝癌组织全蛋白提取物；

采用western-blot法检测腹水及纯化的单克隆抗体的免疫活性，western-blot操作步骤为：将人肝癌组织全蛋白提取物与预染蛋白Marker进行SDS-PAGE电泳（胶浓度为12%），电泳产物转印至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），然后将PVDF膜置于TBST中洗涤三次，每次5分钟，再用5%脱脂奶粉溶液于室温封闭2小时，再分别加入一定比例稀释的腹水及纯化单克隆抗体（1：400稀释），同时以β-actin为内参，于4℃摇床过夜后，用TBST洗涤3次，加5%FBS/TBST稀释的山羊抗鼠Ig-HRP(1：4000)，于室温摇床温和摇动1小时后，TBST洗涤3次，用ECL化学发光法进行显色；

Western-blot检测结果如图2所示，结果表明：杂交瘤腹水中含有能够与人肝癌组织全蛋白提取物中70KD左右的蛋白（即fgl2）特异性结合的抗体，并且纯化后的单克隆抗体仅与人肝癌组织全蛋白提取物中70KD左右的蛋白特异性结合，说明本发明制备的腹水中含有单克隆抗体，并且所述单克隆抗体能够与fgl2进行特异性结合。

4、单克隆抗体的特异性鉴定

以人高侵袭性肝癌细胞系(HCCLM6）作为fgl2中表达HCCLM6细胞系，通过miRNA干扰fgl2建立fgl2低表达HCCLM6细胞系，通过TNF-α40ng/ml建立fgl2高表达HCCLM6细胞系（LiuY等DownregulationofFGL2/prothrombinasedelaysHCCLM6xenografttumourgrowthanddecreasestumourangiogenesis.[J]liverInt.32(10):1585-95,2012）；

用25cm²培养瓶分别培养上述低、中、高表达HCCLM6细胞系，待培养瓶长满细胞后，去除培养基，用1ml预冷的PBS洗涤两次，用细胞刮收集细胞，于900rpm离心5min后弃上清，加200μl细胞裂解液（含PMSF），于冰上裂解30min，再于12000g、4℃离心5min，取上清，采用BCA法测定蛋白浓度后，加入2×loadingBuffer至终浓度为1×，最后置沸水浴中煮沸变性5min，制得蛋白样品；

采用western-blot法检测蛋白样品中fgl2蛋白的表达水平，结果如图3A所示，同时通过常规PCR检测各细胞系中fgl2基因的表达水平，结果如图3B所示；

结果表明：在低、中、高表达HCCLM6细胞系中，fgl2蛋白的表达水平呈依次增加，fgl2基因的表达水平也呈依次增加，说明flg2蛋白表达的水平与PCR检测的基因表达水平相一致。

5、单克隆抗体的抗凝功能鉴定

用不同浓度的（0.1ng/mL、1ng/mL、100ng/mL）纯化单克隆抗体（flg2-mAb）以及鼠IgG1同型抗体处理fgl2高表达HCCLM6细胞系24h后，胰酶消化收集细胞，计数后重新用PBS悬浮，并调整细胞浓度至2×10⁶/ml，细胞悬液冻存于-80℃，临检测前将其经液氮反复冻融三次，振荡器混匀，以获得最大的细胞总PCA；

取上述细胞悬液样品各100μl加入洁净玻璃试管中，依次加入100μl正常人的血浆，于37℃水浴中孵育2分钟后，加入37℃预热的100μl25mM的CaCl₂溶液，将试管在水浴中迅速晃动，用移液枪200ul枪头反复吹打同时立即开动秒表计时，管中出现白色絮状凝固物时枪头堵塞，停止计时，重复三次，取平均值，得到凝血时间，结果如图4所示；

结果表明：采用不同浓度的纯化单克隆抗体处理fgl2高表达HCCLM6细胞系后，凝血时间均有所延长，并且相对鼠IgG1具有统计学差异（P＜0.05），表明本发明的单克隆抗体对HCCLM6肿瘤细胞具有抗凝效应。

试验例2单克隆抗体对荷瘤裸鼠的药效试验

将人高侵袭性肝癌细胞HCCLM6扩大培养后，用PBS制成浓度为10⁶个/mL的细胞悬液；

取6-7周龄雄性无胸腺裸鼠，在超净工作台内乙醚吸入麻醉后，消毒，选取背部每只皮下注射200ul上述制备的细胞悬液（约2×10⁵个细胞），术后隔日观察祼鼠皮下移植瘤生情况并测量记录其最长直径和最短直径，通过以下公式计算肿瘤体积，肿瘤增大至100mm³时，即构建得到裸鼠皮下移植瘤模型；

肿瘤体积＝（长径×短径²）÷2

本试验分为5组，分别为：PBS空白对照组；鼠IgG1阴性对照组（100ug/次）；fgl2-mAb高剂量组（100ug/次）、中剂量组（75ug/次）、低剂量组（50ug/次），将构建的模型裸鼠随机分入各组，每组10只小鼠，进行腹腔注射给药，每周给药两次，其中每周第一次给药后间隔两天进行第二次给药，第二次给药后间隔三天进行下一周的第一次给药（例如：每周的周一和周四进行给药），共给药4周；

开始给药后，观察裸鼠皮下移植瘤的动态生长变化，并于在下次给药的前一天测量肿瘤的最长直径和最短直径，计算肿瘤体积、相对肿瘤体积及相对肿瘤增殖率；在试验结束时，剥离肿瘤后称重，得到肿瘤重量；其中：

肿瘤体积（TV）=1/2×a×b²；其中：a为肿瘤的最长直径，b为肿瘤的最短直径；

相对肿瘤体积（RTV）=Vt/V₀；其中，V₀为分笼给药时即d0测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积；

相对肿瘤增殖率（T/C）%=TRTV/CRTV*100%；其中，TRTV为治疗组的RTV，CRTV为阴性对照组的RTV；

通过肿瘤体积、肿瘤重量及相对肿瘤增殖率来评价fgl2-mAb的抗肿瘤效应，结果如图5-7所示。其中：图5为肿瘤体积结果，结果表明：空白对照裸鼠和阴性对照组裸鼠皮下瘤生长速度明显快于各剂量给药组；图6为治疗终点时的肿瘤重量，结果表明：低、中、高三个剂量的给药组中，裸鼠肿瘤重量分别是阴性对照组裸鼠的51.5%、29.8%和20%；图7为相对肿瘤增殖率结果，其中低、中、高三个剂量组裸鼠的相对肿瘤增殖率分别为50.1%、39.7%、16.4%，由此表明fgl2-mAb可以显著抑制裸鼠人肝癌皮下移植瘤的生长，干预和治疗效果明显。

试验例3单克隆抗体对肿瘤细胞和血管内皮细胞的抑制作用

收集对数生长期的HCCLM6细胞和脐静脉内皮细胞HUVEC，调整细胞浓度铺96孔平底板，使每孔200ul培养基（含5×10⁴细胞），在HCCLM6细胞各孔中加40ng/ml的TNF-α进行刺激，在HUVEC细胞各孔中加100IU/ml的IL-2进行刺激，将板置于温箱中培养过夜，待细胞贴壁后，加入浓度为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml的fgl2-mAb以及阴性对照鼠IgG110ng/ml，其中每个浓度设立5个复孔，于5%CO₂、37℃孵育24小时后，每孔加入CCK8试剂20ul，继续培养30min后在酶标仪OD450nm处测量各孔吸光值，结果如图8和图9所示，结果表明：fgl2-mAb对HCCLM6细胞和HUVEC细胞的增殖均有抑制作用，当单克隆抗体浓度为100ng/ml并且作用24小时后，其对HCCLM6细胞和HUVEC细胞的抑制率分别为29.1%和51.1%。

试验例4单克隆抗体对血管新生的抑制作用

1、单克隆抗体对肿瘤组织中血管新生的抑制作用

1．1免疫组织化学检测

取上述荷瘤裸鼠的药效试验中的PBS空白对照组、鼠IgG1阴性对照组（100ug/次）和fgl2-mAb高、中、低剂量组裸鼠皮下瘤组织的石蜡切片，采用免疫组织化学检测肿瘤组织中血管新生的情况，具体步骤如下：

依次采用二甲苯、无水乙醇、90%乙醇及80%乙醇处理各组裸鼠的石蜡切片

5min(其中二甲苯处理两次)，再用PBS洗涤3次（每次5min），使石蜡切片脱蜡至水化；然后用3%过氧化氢处理10min，封闭内源性过氧化物酶后，用PBS洗涤3次；再将切片浸入0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液（PH6.0）修复抗原，于微波高火处理5min后，再于微波低火处理15min，自然冷却后用PBS洗涤3次；采用5%BSA封闭30min后，倒掉（勿洗），然后滴加血小板-内皮细胞粘附分子（CD31：1:200），同时设立以山羊抗鼠IgG代替一抗的对照，于4℃过夜后，PBS洗涤3次，再滴加HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体，于37℃孵育1h后，用PBS洗涤3次；再进行DAB显色，于镜下观察，流水冲洗5min后，用苏木素染核，自来水冲洗5min，然后依次用80%乙醇处理2min、90%乙醇处理2min无水乙醇处理2min、二甲苯处理3min，用中性树胶封片，于37℃烤干后，用显微镜进行观察，以胞膜出现棕染为阳性，结果如图10所示；结果表明：空白对照组和阴性对照组裸鼠皮下瘤组织出现较多棕染的内皮细胞，多位于间质中，而fgl2-mAb高剂量组未见明显的内皮细胞棕染。

1.2、肿瘤微血管密度（MVD）计数

根据Weidner方法计算MVD计数，具体步骤为：用低倍镜（40～100倍）扫视玻片，寻找3个血管密度最高的区域（称为“热点”，即棕黄染色密度最高的区域），然后在高倍镜下（200～400倍）计数视野内被染色的血管数，计数3个视野，取其均值作为MVD，结果如图11所示；结果表明：fgl2-mAb高剂量组裸鼠的微血管数目明显少于PBS空白对照组及IgG1阴性对照组，表明本发明的单克隆抗体对肿瘤组织中血管新生具有一定地抑制作用。

2、单克隆抗体对角膜血管新生的抑制作用

收集对数生长期HCCLM6细胞，取6-7周龄雄性无胸腺裸鼠，在超净工作台内，经乙醚吸入麻醉后，用酒精棉球对其眼周皮肤进行消毒，固定裸鼠，并充分暴露眼球，将注射器中HCCLM6细胞摇匀，轻轻插入裸鼠角膜，每只眼剂量为5ul（约2×10⁵个细胞），用金霉素眼膏涂抹眼球，连续给药至角膜血管新生模型建模成功（LiuY等DownregulationofFGL2/prothrombinasedelaysHCCLM6xenografttumourgrowthanddecreasestumourangiogenesis.[J]liverInt.32(10):1585-95,2012）；

将模型小鼠随机分为3组：即模型裸鼠组、IgG1阴性对照组和fgl2-mAb治疗组，每组5只小鼠，对对照组和治疗组分别给予浓度为100ug/ml的鼠IgG1和纯化的单克隆抗体，以200ul/次的剂量进行滴眼给药，每天1次，连续一周，一周后观察角膜内肿瘤诱导的血管生成情况，拍照并记录观察结果，结果如图12所示；结果表明：fgl2-mAb治疗组相对于模型裸鼠及IgG1对照组，人肝癌角膜血管新生显著减少，说明本发明的单克隆抗体对人肝癌角膜血管新生具有抑制作用。

3.3fgl2-mAb对小鼠主动脉环血管新生的抑制作用

取8-12周龄Balb/cJ雌性小鼠的胸主动脉，立即置于含有冷DMEM培养基的细胞培养皿中，以细显微镊及虹膜剪小心地去除主动脉周围的纤维脂肪组织（注意避免损伤主动脉壁），将血管剪成1mm长的动脉环,在DMEM培养基中反复洗涤5次后,置于预先包被有基质胶的48孔板中,在环上及环周滴加100ul基质胶,使主动脉环位于基质胶中心,于室温放置5min使基质胶凝固，然后立即加入含HCCLM6细胞（1×10⁶个）的DMEM培养基，每孔1ml，于温箱继续培养，3天后确认组织固定良好，无污染，于各孔随机分入IgG1对照组（100ug/ml）、fgl2-mAb治疗组1（50ug/ml），fgl2-mAb治疗组2（100ug/ml），隔日给药，并补充培养基保证培养体系总容量为1ml，1周后观察血管新生情况，结果如图13所示；结果表明：治疗组小鼠肝癌细胞诱导的主动脉环血管新生明显减少，说明本发明的单克隆抗体对小鼠主动脉环血管新生具有抑制作用。

试验例5单克隆抗体对细胞因子分泌的抑制作用

收集对数期HCCLM6细胞和HUVEC细胞，重新悬浮，使细胞浓度为1×10⁶/ml，铺入平底96孔板，待细胞贴壁后，设IgG1对照组（100ng/ml）、fgl2-mAb100ng/ml组、fgl2-mAb1ng/ml组，每组5个复孔，每孔总体积200ul，置于温箱中孵育，在培养24小时和72小时收集上述各组细胞共培养上清液，利用博士德ELISA试剂盒检测HCCLM6细胞血管内皮生长因子（VEGF）和HUVEC细胞促血管生成素2(ang-2)分泌水平，结果如图14和15所示；结果表明：与IgG1对照组相比，fgl2-mAb组处理HCCLM6细胞后，细胞上清中VEGF分泌水平有所降低，其相对于对照组具有显著性差异，此外fgl2-mAb处理HUVEC细胞后，细胞上清中ang-2分泌水平有所降低，其相对于IgG1对照组具有显著性差异，说明本发明的单克隆抗体对细胞因子分泌具有一定地抑制作用。

Claims (6)

1.一种分泌抗纤维介素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将氨基酸序列为SEQIDNo.1的抗原多肽与血蓝蛋白偶联形成大分子抗原；

将所述大分子抗原免疫BALB/CJ小鼠，得到免疫小鼠；

将所述免疫小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤进行细胞融合，经筛选后获得分泌抗纤维介素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以便由所述杂交瘤细胞株分泌抗纤维介素蛋白单克隆抗体。

2.一种由权利要求1制备的杂交瘤细胞株分泌得到的抗纤维介素蛋白单克隆抗体。

3.一种将权利要求2所述的抗纤维介素蛋白单克隆抗体用于制备治疗肝癌发生的肿瘤的药物的用途。

4.一种将权利要求2所述的抗纤维介素蛋白单克隆抗体用于制备抑制肿瘤组织中血管新生的药物的用途。

5.一种将权利要求2所述的抗纤维介素蛋白单克隆抗体用于制备抑制肿瘤组织中VEGF细胞因子分泌的药物的用途。

6.一种将权利要求2所述的抗纤维介素蛋白单克隆抗体用于制备的抑制肿瘤组织中Ang-2细胞因子分泌的药物的用途。