CN104853774B - Il-20拮抗剂用于治疗肝脏疾病 - Google Patents

Il-20拮抗剂用于治疗肝脏疾病 Download PDF

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Abstract

用IL‑20拮抗剂减轻患有或怀疑患有肝脏疾病的对象的肝纤维化，该拮抗剂可以是阻断由IL‑20介导的信号转导途径的抗体。这些抗体包括特异性阻断IL‑20信号转导途径的抗IL‑20抗体和抗IL‑20R抗体。

Description

IL-20拮抗剂用于治疗肝脏疾病
发明背景
慢性肝细胞损伤导致肝纤维化和随后肝硬化的发展。肝纤维化是瘢痕过程，其中细胞外基质蛋白，包括胶原蛋白，积聚在肝脏以修复损伤。肝硬化涉及纤维带环绕的结节的再生。它是伴随肝血管变形的肝纤维化的高级阶段。尽管目前正开发用于延迟肝硬化的进展或甚至逆转硬化的众多治疗方法，但肝移植仍是治疗肝硬化的唯一治疗选择。Bataller等,J Clin Invest,2005,115(2):209-18和Schuppan等,Lancet.2008371(9615):838-51。
白介素IL-20(IL-20)是IL-10家族的成员，其包括IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24和IL-26。Blumberg等,2001,Cell 104:9-19；Pestka等,2004,Annu Rev Immunol 22:929-979。IL-20在单核细胞、上皮细胞和内皮细胞中表达，通过激活IL-20R1/IL-20R2或IL-22R1/IL-20R2的异质二聚体受体复合物作用于多种细胞类型。Dumoutier等,2001,JImmunol 167:3545-3549)。发现IL-20参与各种炎性疾病，如牛皮癣(Blumberg等,2001；Sa等,2007,J Immunol 178:2229-2240和Wei等，2005,Clin Immunol 117:65-72)、风湿性关节炎(Hsu等,2006,Arthritis Rheum 54:2722-2733)、动脉粥样硬化(Caligiuri等,2006,Arterioscler Thromb Vasc Biol 26:1929-1930和Chen等,2006,Arterioscler ThrombVasc Biol 26:2090-2095)、缺血性中风(Chen等,2009,J Immunol 182:5003-5012)和肾衰竭(Li等,2008,Genes Immun 9:395-404)。还参见Wei等,2006,J Biomed Sci 13:601-612。
发明内容
本发明是基于意外发现IL-20可能参与肝纤维化的发病机理以及结合到人IL-20或人IL20受体亚单位R1的抗体成功抑制了肝损伤小鼠的肝纤维化。
因此，本发明的一个方面涉及用于缓解对象肝纤维化或延迟肝纤维化发病的方法，包括给予有需要的对象有效量的IL-20拮抗剂。在一些实施方式中，IL-20拮抗剂是抑制IL-20介导的信号转导途径的抗体，如结合到IL-20蛋白(如，人IL-20)的抗体或结合到IL-20受体(如，人IL-20受体)的抗体。用于本文描述方法中的任何抗体可以是全长抗体或其抗原结合片段。或者抗体可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体。
当结合人IL-20的抗体用于本文描述的方法，它可以是单克隆抗体mAb7E、其抗原结合片段或其功能性变体。在一实施例中，mAb7E的功能性变体与mAb7E包含相同的互补决定区(CDR)。在另一实施例中，功能性变体是mAb7E的人源化抗体。该人源化抗体可包括重链可变区(VH)，其包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包括SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
或者，结合到人IL-20受体，如结合到IL-20R1亚单位、IL-20R2亚单位、IL-20R1/R2复合物、IL-22R1亚单位、或IL-22R1/IL-20R2复合物的抗体，可以用于本文描述的方法。在一些实施方式中，抗体结合人IL-20受体的亚单位R1。这种抗体可以是全长抗体或其抗原结合片段。它也可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、或单链抗体。在一实施例中，结合人IL-20受体亚单位R1的抗体是与单克隆抗体mAb51D或mAb7GW、或mAb51D或mAb7GW的功能性变体包含相同的VH和VL的抗体。功能性变体可以与mAb51D或mAb7GW包含相同的互补决定区(CDR)。或者，功能性变体可以是mAb51D或mAb7GW的人源化抗体。
本文描述的方法(如使用抑制IL-20信号转导途径的抗体的方法)中待治疗的对象可以是患者(如，人类患者)，该患者患有或怀疑患有肝纤维化，所述肝纤维化可与慢性肝脏疾病相关，如慢性HBV感染、慢性HCV感染、酗酒、非酒精性脂肪肝炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、脂肪肝病或特发性肝脏疾病。在一些实施例中，对象是患有或怀疑患有肝硬化的人类患者。
本发明的范围内还包括：(a)用于缓解对象肝纤维化或延迟肝纤维化的发作的药物组合物，该药物组合物含有本文描述的一种或多种IL-20拮抗剂(例如，抑制IL-20信号转导途径的抗体，如结合人IL-20或人IL-20受体(R1、R2或它们的复合物)的抗体)；和(b)刚描述的药物组合物在制备用于缓解或延迟肝纤维化/硬化发作的药物中的应用。
在以下说明书中阐述本发明一个或多个实施方式的细节。基于以下附图、数个实施方式的详细描述和所附权利要求，本发明的其他特征或优点是显而易见的。
附图说明
首先描述附图。
图1是实时PCR检测的mAb7E和mAb51D对大鼠肝细胞系Clone-9内TGF-β表达的抑制效果图。
图2是实时PCR检测的mAb7E和mAb51D对活化的rHSC细胞内TGF-β(图A)、TNF-α(图B)和Col-I(图C)表达水平的抑制效果图。
图3是mAb7E和mAb51D对短期CCl4诱导的肝损伤的保护效果图。图A：CCl4处理后在不同时间点患有CCl4诱导的短期肝损伤的小鼠内ALT的血清水平。图B：CCl4处理后在不同时间点患有CCl4诱导的短期肝损伤的小鼠内AST的血清水平。
图4是mAb7E和mAb51D对长期CCl4诱导的肝损伤的保护效果图。图A：CCl4处理后在不同时间点患有CCl4诱导的长期肝损伤的小鼠内ALT的血清水平。图B：CCl4处理后在不同时间点患有CCl4诱导的长期肝损伤的小鼠内AST的血清水平。
序列说明
SEQ ID NO:1是编码单克隆抗体mAb7E重链可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2是单克隆抗体mAb7E的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是编码单克隆抗体mAb7E轻链可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4是单克隆抗体mAb7E的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是编码衍生自mAb7E的人源化抗体HL1和HL2(前体形式，其包括信号肽)的重链可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6是衍生自mAb7E的人源化抗体HL1和HL2(前体形式，其包括信号肽)的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是编码衍生自mAb7E的人源化抗体HL1和HL2(成熟形式，缺乏信号肽)的重链可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8是衍生自mAb7E的人源化抗体HL1和HL2(成熟形式，缺乏信号肽)的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是编码人源化抗体HL2(前体形式，其包括信号肽)的轻链可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10是人源化抗体HL2(前体形式，其包括信号肽)的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是编码人源化抗体HL2(成熟形式，缺乏信号肽)的轻链可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12是人源化抗体HL2(成熟形式，缺乏信号肽)的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是人源化抗体HL1(成熟形式，缺乏信号肽)的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是单克隆抗体mAb7GW的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是编码单克隆抗体mAb7GW的重链的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16是单克隆抗体mAb7GW的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是编码单克隆抗体mAb7GW的轻链的核苷酸序列。
SEQ ID NO:18是单克隆抗体mAb51D的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是编码单克隆抗体mAb51D的重链的核苷酸序列。
SEQ ID NO:20是单克隆抗体mAb51D的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是编码单克隆抗体mAb51D的轻链的核苷酸序列。
发明详述
在过去的十年中，肝纤维化发展的细胞和分子机制已被提出。肝星状细胞(HSC)被认为是对增加肝脏内细胞外基质蛋白(ECM)沉积(导致肝纤维化)起关键作用的主要细胞群。HSC必须被活化以致它们从休眠的脂肪储存细胞转换成肌成纤维细胞样细胞，肌成纤维细胞样细胞能够合成广谱的细胞外基质蛋白。星状(Stella)细胞活化是肝纤维化(hapticfibrosis)的中心事件。HSC活化由两个主要阶段组成：启动阶段和持续阶段。前者是指早期旁分泌介导的基因表达与表型的变化，使细胞响应于其它细胞因子和刺激。接着，初始活化的HSC进入持续阶段，其中细胞保持激活状态，并产生各种ECM蛋白，导致肝纤维化。除了HSC活化，肝细胞产生TGF-β在肝纤维化的发病机理中也起重要作用，因为它是导致肝纤维化的强效纤维化因子。
本公开内容报道了意想不到的发现：(i)IL-20可能通过增强HSC活化和促进肝细胞生产TGF-β而参与肝纤维化的发病机理；和(ii)能够干扰IL-20信号转导途径的抗体(例如，mAb7E和mAb51D)成功逆转了肝纤维化动物模型中IL-20的纤维化效果。因此，本公开内容涉及使用有效量的IL-20拮抗剂治疗对象肝纤维化(例如，减轻肝纤维化或延迟肝纤维化的发病)的方法，所述IL-20拮抗剂可以是能干扰IL-20信号转导途径的抗体。
通用技术
除非另有说明，本发明的实践将使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的传统技术，这些技术都在本领域的技术范围内。文献中充分解释了这些技术，如分子克隆：实验手册，第二版(Sambrook等，1989)冷泉港出版社；寡核苷酸合成(M.J.Gait,ed.,1984)；分子生物学方法，胡马纳(Humana)出版社；细胞生物学：实验手册(J.E.Cellis,ed.,1998)学术出版社；动物细胞培养(R.I.Freshney,ed.,1987)；细胞和组织培养介绍(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)纳姆(Plenum)出版社；细胞和组织培养：实验规程(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell,eds.,1993-8)约翰·威利父子出版公司(J.Wiley and Sons)；酶学方法(学术出版社有限公司)；实验免疫学手册(D.M.Weir和C.C.Blackwell,eds.)；哺乳动物细胞基因转移载体(J.M.Miller和M.P.Calos,eds.,1987)；分子生物学实验室指南(F.M.Ausubel等，eds.,1987)；PCR：聚合酶链式反应(Mullis等，eds.,1994)；免疫学实验室手册(J.E.Coligan等，eds.,1991)；分子生物学简明手册(威利父子Wiley and Sons,1999)；免疫学(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；抗体(P.Finch,1997)；抗体：实用方法(D.Catty.,ed.,IRL出版社,1988-1989)；单克隆抗体：实用方法(P.Shepherd和C.Dean,eds.,牛津大学出版社,2000)；使用抗体：实验手册(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社,1999)；抗体(M.Zanetti和J.D.Capra,eds.,哈伍德学术出版社(Harwood Academic Publishers),1995)。
IL-20拮抗剂以及包含该拮抗剂的药物组合物
IL-20是属于IL-10细胞因子家族的促炎细胞因子。本文描述的IL-20是指白细胞介素20和其保留至少部分IL-20活性的变体。如本文所用，IL-20包括所有哺乳动物物种的天然序列IL-20，包括人、犬、猫、马或牛。在一实施例中，IL-20是人IL-20(GenBank登录号NP_061194.2)。
IL-20通过结合到IL-20受体激活IL-20信号转导途径，IL-20受体是包含亚单位IL-20R1和IL-20R2(也称为RA和RB)的二聚复合物。该IL-20受体由三种功能不同的细胞因子即IL-19、IL-20和IL-24共享，表明该受体根据其结合到特定的细胞因子而介导不同的信号转导途径。IL-20也能结合到包含IL-20R2和IL-22R1的二聚复合物。本文描述的IL-20受体是指能结合到IL-20且被其激活的一种或多种多肽。本文描述的IL-20受体包括所有哺乳动物物种的IL-20R1、IL-20R2和IL-22R1，包括但不限于，人、犬、猫、马、灵长类动物或牛。人IL-20受体的例子包括hIL-20R1(GenBank登录号NM_014432.2)、hIL-20R2(GenBank登录号NM_144717.2)和hIL-22R1(NM_181309.1)。人IL-20受体的序列已有描述，例如，描述在美国专利号6,610,286、7,122,632、7,393,684和7,537,761；以及美国专利申请公开号2006/0263850A1、2006/0263851A1、2008/0247945A1和2009/0074661A1中。
本文描述的方法中使用的IL-20拮抗剂是阻断、抑制或降低(包括显著地)IL-20生物活性包括由IL-20信号转导(例如受体结合和/或激发对IL-20的细胞应答反应)介导的下游途径的分子。参见US2011/0064731，其通过引用全部并入本文。术语“拮抗剂”不意味任何特定机制的生物作用，并认为其明确包括和涵盖直接或间接的与IL-20的所有可能的药理学、生理学和生物化学相互作用。为本公开内容的目的，将明确地理解，术语“拮抗剂”涵盖所有先前确定的术语、标题和功能状态以及特征，其中IL-20本身(例如，人IL-20)、IL-20生物活性(包括但不限于其介导肝纤维化的任何方面的能力)或生物活性的后果在任何有意义的程度实质上被废除(nullified)、降低或中和，例如至少20％、50％、70％、85％、90％、100％、150％、200％、300％或500％，或10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或104倍。
示例性IL-20拮抗剂包括但不限于，抗IL-20抗体、针对IL-20的反义核酸(包括针对编码IL-20的核酸的反义核酸)、针对IL-20核酸的小干扰RNA(siRNA)、针对IL-20核酸的微小RNA(microRNA)、IL-20抑制化合物、抗IL-20R抗体(如，特异结合IL-20R1、IL-20R2的抗体或由此形成的二聚复合物)、针对IL-20受体亚单位的反义核酸分子、针对编码IL-20受体亚单位的核酸的siRNA或微小RNA、或IL-20R抑制化合物。在一些实施方式中，IL-20拮抗剂结合IL-20或IL-20受体并抑制IL-20-IL-20R复合物形成，从而抑制IL-20信号转导途径。在其他实施方式中，IL-20拮抗剂抑制或减少IL-20合成和/或产生(释放)。这种拮抗剂包括反义分子、siRNA和微小RNA。
能干扰IL-20信号转导途径的抗体
抗体(可以复数形式互换使用)是免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点特异性结合诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等的靶标。如本文所用，术语“抗体”不仅涵盖完整的(即全长)多克隆或单克隆抗体，而且包含其抗原结合片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(如，双特异性抗体)和包含所需要特异性的抗原识别位点的任何其他修饰构型的免疫球蛋白分子，包括抗体的糖基化变体，抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。抗体包括任何类型的抗体，如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类)，且抗体不必是任何特定类型。取决于其重链恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可归为不同类型。有五大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类型免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是公知的。
用于本文描述方法的抗体可以是鼠科、大鼠、人或任何其他来源(包括嵌合或人源化抗体)。在一些实施例中，抗体包括修饰的恒定区，如免疫惰性的恒定区，例如不触发补体介导的裂解，或不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。可以使用美国专利号5,500,362公开的方法评价ADCC活性。在其他实施方式中，如Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624、PCT申请号PCT/GB99/01441和/或UK专利申请号9809951.8中所描述来修饰恒定区。
任何本文描述的抗体可以是单克隆或多克隆的。“单克隆抗体”是指同源抗体群，“多克隆抗体”是指异源抗体群。这两个术语不限制抗体的来源或者制备抗体的方式。
在一实施例中，用于本文描述方法中的抗体是人源化抗体。人源化抗体是指非人(例如鼠科)抗体形式，其为特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链、或其抗原结合片段，包含来自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的具有所需特异性、亲和力和能力的CDR的残基取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应非人残基取代。此外，人源化抗体可以包括既不存在于受体抗体也不存在于引入的CDR或框架序列的残基，但是包括这些残基以进一步完善和优化抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个和通常两个可变区，其中全部或基本全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，全部或基本全部FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。最佳地，人源化抗体还将包含至少部分的免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)，典型地是至少部分的人免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)。抗体可以具有如WO 99/58572中描述的修饰的Fc区。其他形式的人源化抗体具有一或多个CDR(一，二，三，四，五，六)，其相对于原始抗体被改变，其也称为“衍生自”原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。人源化抗体也可以涉及亲和力成熟。
在另一实施例中，本文描述的抗体是嵌合抗体，其可以包括衍生自人抗体的重链恒定区和轻链恒定区。嵌合抗体是指具有衍生自第一物种的可变区或部分可变区和衍生自第二物种的恒定区的抗体。通常，在这些嵌合抗体中，轻链和重链的可变区均模拟衍生自一种哺乳动物(如，非人哺乳动物，如小鼠，兔和大鼠)的抗体的可变区，而不变部分与衍生自另一哺乳动物诸如人的抗体序列同源。在一些实施方式中，可以在可变区和/或恒定区进行氨基酸修饰。
在一些实施例中，本文描述的抗体特异性结合靶抗原，如人IL-20或人IL-20受体的两亚单位之一(如，IL-20R1)。“特异性结合”(在本文可互换使用)到靶标或表位的抗体是本领域公知的术语，检测该特异性结合的方法也是本领域公知的。如果与其他靶标相比，分子与特定靶抗原反应或结合得更频繁，更迅速，具有更长的持续时间和/或具有更大的亲和力，则该分子被认为显示出“特异性结合”。如果与其结合到其他物质相比，抗体以较大的亲和力(affinity)、亲合力(avidity)，更容易和/或以更长的持续时间结合到靶抗原，则抗体是特异性结合到靶抗原。例如，特异性(或优先)结合到IL-20表位的抗体是与其结合到其他IL-20表位或非IL-20表位相比，以较大的亲和力、亲合力，更容易和/或以更长的持续时间结合该IL-20表位的抗体。通过阅读该定义应理解，例如，特异性结合第一靶抗原的抗体可以或可以不特异性或优先结合第二靶抗原。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(虽然其可包括)专一结合。通常，但不必须，提及结合意味着优先结合。
能干扰IL-20信号转导途径的抗体可以是结合IL-20(如人IL-20)并抑制IL-20生物活性和/或IL-20介导的下游途径的抗体。或者，该抗体可以是结合IL-20受体(IL-20R)的抗体，如结合到IL-20受体亚单位之一或两者，并抑制IL-20触发的受体介导的下游信号转导途径。
(i)抗IL-20抗体
抗IL-20抗体是能结合到IL-20并抑制IL-20生物活性和/或IL-20信号转导介导的下游途径的抗体。在一些实施例中，用于本文描述方法中的抗IL-20抗体抑制IL-20信号转导途径至少20％、至少40％、至少50％、至少75％、至少90％、至少100％、或至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。抗IL-20抗体的实例包括但不限于，美国专利号7,435,800、7,115,714、7,119,175、7,151,166和7,393,684以及PCT公开号WO 2007/081465、WO 99/27103、WO 2004/085475和WO 2005052000中公开的那些。
抗IL-20抗体与IL-20(如人IL-20)的结合亲和力可以小于约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM或约50pM中任一到任何约2pM。结合亲和力可以用KD或解离常数表示，增加的结合亲和力对应减少的KD。检测抗体与IL-20结合亲和力的一种方法是通过测定该抗体的单功能Fab片段的结合亲和力。为获得单功能Fab片段，抗体(例如IgG)可用木瓜蛋白酶切割或重组表达。抗体的抗IL-20Fab片段的亲和力可以通过表面等离子共振(BIAcore3000TM表面等离子体共振(SPR)系统，BIAcore，INC，Piscaway NJ)确定。获得动力学结合速率(kon)和解离速率(koff)(通常在25℃检测)，通过koff/kon计算平衡解离常数(KD)值。
在一些实施方式中，抗体结合人IL-20，不显著结合衍生自另一哺乳动物物种的IL-20。在一些实施方式中，抗体结合人IL-20以及衍生自另一哺乳动物物种的一或多个IL-20。在还有的其他实施方式中，抗体结合IL-20，不显著与其他细胞因子(如相关细胞因子IL-10、IL-17A、IL-19、IL-22、IL-24和IL-26)交叉反应。抗体结合的表位可以是连续的或不连续的。
在一些实施方式中，本文描述的抗IL-20抗体是抗IL-20抗体7E，其是指单克隆抗体mAb 7E和它的功能性变体。MAb 7E由保藏在美国典型培养物保藏中心(10801大学大道，马纳萨斯，Va.20110-2209，USA)且保藏编号为PTA-8687的杂交瘤细胞系产生。在本申请被授予美国专利后，该杂交瘤细胞系将不可撤销地且没有限制/条件地对公众公开，且对于专利可实施期将从保藏之日起在ATCC保存至少30年，或在最近日期之后保存为期5年。
如下制备mAb7E重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列和编码核苷酸序列。
mAb 7E重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和氨基酸序列(SEQ ID NO:2)
mAb 7E轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)和氨基酸序列(SEQ ID NO:4)
mAb7E的功能性变体(等价物)具有与mAb7E基本相同的表位结合特异性，表现出相对于mAb7E至少20％(如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的中和IL-20介导的信号转导途径的活性。在一些实施方式中，mAb7E的功能性变体包含与mAb7E相同的负责抗原结合的区域/残基，如相同的CDR内决定特异性的残基或整个CDR。可以通过本领域已知的方法从mAb7GW或mAb51D的重链/轻链序列的氨基酸序列(如上所示)来鉴定负责抗原结合的区域/残基。参见，如，www.bioinf.org.uk/abs；Almagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)和Chothia等，J.Mol.Biol.227:799-817(1987)。
此外，抗体内CDR区的确定也是本领域已知的。至少有两种技术用于确定CDR：(1)基于跨物种序列变异的方法(即Kabat等.免疫学感兴趣的蛋白序列“Sequences ofproteins of Immunological Interest”(第5版,1991,美国国立卫生研究院,马里兰州贝塞斯达))；和(2)基于抗原抗体复合物的结晶研究方法(Chothia等.(1989)Nature342:877；Al-lazikani等(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。如本文所用，CDR可以指通过任一方法或通过两种方法的组合来定义的CDR。
在一些实施例中，mAb7E的功能性变体包括VH链和VL链，VH链包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，与相应的mAb7E的VH CDR至少75％(如80％、85％、90％、95％或98％)相同；VL链包括VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，与相应的mAb7E的VH CDR至少75％(如80％、85％、90％、95％或98％)相同。
或者，mAb7E的功能性变体包括VH链和VL链，VH链与mAb7E的VH链(成熟或前体)至少75％(如80％、85％、90％、95％或98％)相同，VL链与mAb7E的VL链(成熟或前体)至少75％(如80％、85％、90％、95％或98％)相同。
使用由Karlin和Altschul改进(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993)的Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990)的算法检测两氨基酸序列的“百分比相同度”。该算法并入Altschul等.J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)。可以采用XBLAST程序开展BLAST蛋白研究，分数＝50，字长＝3，从而获得与感兴趣的蛋白分子同源的氨基酸序列。当两序列间存在间隙时，可以采用Altschul等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)25(17):3389-3402,1997中描述的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在其他实施例中，mAb7E的功能性变体包括VH链和/或VL链，与mAb7E的VH CDR相比，VH链在VH CDR区(VH CDR1、CDR2和/或CDR3)包括至多5(如1、2、3、4或5)个氨基酸残基变异；与mAb7E的VH CDR相比，VL链在VL CDR区(VL CDR1、CDR2和/或CDR3)包括至多5(如1、2、3、4或5)个氨基酸残基变异。
mAb7E的功能性变体也在美国专利号7,611,705和US2011/0064731中被披露，两者通过引用并入本文。
在一实施例中，mAb7E的功能性变体是衍生自mAb7E的人源化抗体。以下提供的示例性人源化mAb7E抗体HL1和HL2，还参见美国专利申请13/477,476。
人源化抗IL-20抗体HL1和HL2的VH链的氨基酸序列及编码核苷酸序列
下划线的区域表示信号肽，粗体/斜体区域是CDR。SEQ ID NOs:8和7分别表示成熟VH氨基酸序列(缺乏信号肽)和它的编码核苷酸序列。
人源化抗IL-20抗体HL2的VL链(VL2)的氨基酸序列和编码核苷酸序列
下划线的区域表示信号肽，粗体/斜体区域是CDR。SEQ ID NOs:12和11分别表示成熟VL氨基酸序列(缺乏信号肽)和它的编码核苷酸序列。
人源化抗体HL1包括与HL2相同的VH链和与HL2的VL相同的VL链(SEQ ID NO：13；成熟形式)，但HL2的成熟VL的位置2的I残基被F取代。
本文还公开了上述人源化抗体HL1和HL2的功能性变体。这些功能性变体可以包括VH链和VL链，VH链包括与HL1和HL2的VH的氨基酸序列(前体或成熟形式；分别为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8)至少85％(如，90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列，VL链具有与HL2的VL的氨基酸序列(前体或成熟形式；分别为SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:12)至少85％(如，90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。这些变体能够结合到IL-20分子，特别是人IL-20分子。在一些实施例中，相对于上述示例性人源化抗体，变体具有类似的抗原-结合亲和力(如，具有Kd<4x 10-9)。
(b)抗IL-20R抗体
抗IL-20R抗体是能结合IL-20R(如，结合到它的两亚单位的任一或两者，或结合到二聚复合物)的抗体，并抑制IL-20R生物活性和/或IL-20介导的它的下游途径。在一些实施例中，用于本文描述方法中的抗IL-20抗体抑制IL-20信号转导途径至少20％、至少40％、至少50％、至少75％、至少90％、至少100％或至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。在一些实施例中，抗IL-20R抗体特异性结合IL-20R1，如人IL-20R1。该抗体可以对IL-20R2或IL-20R1/IL-20R2复合物具有低亲和力，或不结合IL-20R2或IL-20R1/IL-20R2复合物。在其他实施例中，抗IL-20R抗体特异性结合IL-20R2，如人IL-20R2。该抗体可以对IL-20R1或IL-20R1/IL-20R2复合物具有低亲和力，或不结合IL-20R1或IL-20R1/IL-20R2复合物。在还有的其他实施例中，本文描述的抗IL-20R抗体特异性结合IL-20R1/IL-20R2复合物。
抗IL-20R抗体与IL-20R或其亚单位(如人IL-20R或人IL-20R1)的结合亲和力可以小于约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM或约50pM任一到任何约2pM。结合亲和力可以用KD或解离常数表示，增加的结合亲和力对应减少的KD。检测抗体到IL-20R结合亲和力的一种方法是通过测定该抗体的单功能Fab片段的结合亲和力。为获得单功能Fab片段，抗体(例如IgG)可用木瓜蛋白酶切割或重组表达。抗体的抗IL-20R Fab片段的亲和力可以通过表面等离子共振(BIAcore3000TM表面等离子体共振(SPR)系统，BIAcore，INC，Piscaway NJ)确定。获得动力学结合速率(kon)和解离速率(koff)(通常在25℃检测)；通过koff/kon计算平衡解离常数(KD)值。
在一些实施方式中，抗体结合人IL-20R或其亚单位(如，人IL-20R1)，不特异性结合衍生自另一哺乳动物物种的IL-20R。在一些实施方式中，抗体结合人IL-20R以及来自另一哺乳动物物种的一或多个IL-20R。在还有的其他实施方式中，抗体结合IL-20R，不显著与其他细胞因子受体交叉反应。抗体结合的表位可以是连续的或不连续的。
在一些实施方式中，用于本文描述方法中的抗体是具有与单克隆抗体mAb7GW或mAb51D的重链和轻链可变区相同的重链和轻链可变区(VH和VL)的抗体，mAb7GW或mAb51D的功能等价物、单克隆抗体、或其抗原结合片段。US2011/0256093，其通过引用全部并入本文。以下示出的是mAb7GW和mAb51D的重链和轻链的氨基酸序列，连同它们的编码核苷酸序列。
mAb7GW重链：
氨基酸序列(SEQ ID NO：14)
核苷酸序列(SEQ ID NO：15)
mAb7GW轻链
氨基酸序列(SEQ ID NO：16)
核苷酸序列(SEQ ID NO：17)
mAb51D重链
氨基酸序列(SEQ ID NO：18)
核苷酸序列(SEQ ID NO：19)
mAb51D轻链
氨基酸序列(SEQ ID NO：20)
核苷酸序列(SEQ ID NO：21)
mAb7GW或mAb51D的功能性变体具有与mAb7GW或mAb51D相同的表位结合特异性，表现出相对于mAb7GW或mAb51D至少20％(如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的中和IL-20R1介导的信号转导途径的活性。在一些实施方式中，mAb7GW或mAb51D的功能性变体包含与mAb7GW或mAb51D相同的负责抗原结合的区域/残基，如相同的CDR内决定特异性的残基或整个CDR。可以通过本领域已知方法由mAb7GW或mAb51D的重链/轻链序列的氨基酸序列(如上所示)来鉴定负责抗原结合的区域/残基。参见，如，www.bioinf.org.uk/abs；Almagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)和Chothia等，J.Mol.Biol.227:799-817(1987)。
在一些实施例中，mAb7GW或mAb51D的功能等价物(变体)包括VH链和VL链，VH-链包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，与相应的mAb7GW或mAb51D的VH CDR至少75％(如80％、85％、90％、95％或98％)相同；VL链包括VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，与相应的mAb7GW或mAb51D的VH CDR至少75％(如80％、85％、90％、95％或98％)相同。
或者，mAb7GW或mAb51D的功能等价物包括VH链和VL链，VH链与mAb7GW或mAb51D的VH链(成熟或前体)至少75％(如80％、85％、90％、95％或98％)相同，VL链与mAb7GW或mAb51D的VL链(成熟或前体)至少75％(如80％、85％、90％、95％或98％)相同。
在其他实施例中，mAb7GW或mAb51D的功能等价物包括VH链和/或VL链，与mAb7GW或mAb51D的VH CDR相比，VH链在VH CDR区(VH CDR1、CDR2和/或CDR3)包括至多5(如1、2、3、4或5)个氨基酸残基变异；与mAb7GW或mAb51D的VH CDR相比，VL链在VL CDR区(VL CDR1、CDR2和/或CDR3)包括至多5(如1、2、3、4或5)个氨基酸残基变异。
(c)抗体制备
可以通过本领域已知的任何方法制备本文描述的能干扰IL-20信号转导途径的抗体。参见，例如Harlow和Lane,(1988)抗体：实验手册,冷泉港实验室,纽约。
在一些实施方式中，可以采用常规杂交瘤技术制备对靶抗原特异性的抗体(如，人IL-20或IL-20R1)。全长靶抗原或其片段，任选连接到载体蛋白如KLH，可以用于免疫宿主动物以产生结合该抗原的抗体。免疫接种宿主动物的途径和时间安排一般是符合刺激和生产抗体的既定和常规技术，如本文进一步描述。生产小鼠、人源化和人抗体的一般技术是本领域已知的并在本文中描述。考虑任何哺乳动物对象包括人类或其中的抗体生产细胞可以被操纵从而作为生产哺乳动物包括人杂交瘤细胞系的基础。典型地，宿主动物腹腔内、肌内、口服、皮下、足跖和/或皮内接种一定量的免疫原，包括如本文描述的。
采用Kohler,B.和Milstein,C.(1975)Nature 256:495-497的一般体细胞杂交技术或Buck,D.W.,等,In Vitro,18:377-381(1982)改进的技术可以从淋巴细胞和永生化骨髓瘤细胞制备杂交瘤。有用的骨髓瘤细胞系，包括但不限于X63-Ag8.653以及来自索尔克研究所细胞配送中心(圣迭戈，加利福尼亚州，美国)(Salk Institute,Cell DistributionCenter,San Diego,Calif.,USA,)的那些，可以用于杂交。通常，技术涉及使用融合剂如聚乙二醇或使用本领域技术人员公知的电方式融合骨髓瘤细胞和淋巴细胞。融合后，将细胞从融合培养基中分离，并在选择生长培养基如次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培养基中生长，以消除未杂交的亲本细胞。本文描述的任何介质，补充有或没有血清，可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一替代，EBV永生化B细胞可用于产生本发明的抗IL-20单克隆抗体。如果需要的话，扩增杂交瘤并亚克隆，并且通过常规免疫检测程序(如，放射免疫法，酶联免疫法或荧光免疫法)检测上清液的抗免疫原活性。
可以用作抗体来源的杂交瘤包括产生能干扰IL-20信号转导途径的单克隆抗体的母体杂交瘤的所有衍生物、后代细胞。产生这些抗体的杂交瘤可以使用已知程序在体外或体内生长。如果需要的话，可以通过常规免疫球蛋白纯化程序，如硫酸铵沉淀，凝胶电泳，透析，色谱和超滤从培养基或体液中分离单克隆抗体。如果存在不需要的活性，可以去除，例如通过将制备物流过由免疫原附着于固相而制备的吸附剂，并从免疫原洗脱或释放所需抗体。用利用双官能或衍生剂(例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)，戊二醛，琥珀酸酐，SOC1，或R1N＝C＝NR，其中R和Rl是不同的烷基)偶联到蛋白(对待免疫物种具有免疫原性，如钥孔血蓝蛋白，血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)的靶抗原或含有靶氨基酸序列的片段来免疫宿主动物可以产生抗体(如单克隆抗体)群。
如果需要的话，感兴趣的抗体(单克隆或多克隆的)(如通过杂交瘤产生)可以被测序，然后多核苷酸序列可以克隆到用于表达或繁殖的载体。编码感兴趣的抗体的序列可被保持在宿主细胞载体内，然后可以扩增宿主细胞并冷冻供将来使用。或者，多核苷酸序列可用于基因操做以“人源化”抗体或改善亲和力(亲和力成熟)或抗体的其他特征。例如，如果抗体用于人类临床试验和治疗，恒定区可以工程化以更类似于人恒定区以避免免疫应答。可能需要遗传操作抗体序列以获得与靶抗原的更强亲和力和抑制由IL-20介导的信号途径的更大功效。对本领域技术人员来说显而易见的是可对抗体进行一个或多个多核苷酸改变并仍然保持其对靶抗原的结合特异性。
在其他实施方式中，可以通过使用已经被工程化以表达特定的人免疫球蛋白的市售小鼠获得完全人抗体。为产生更可取(如完全人抗体)或更强健的免疫应答而设计的转基因动物也可用于产生人源化或人抗体。该类技术的实例为Amgen,Inc.(弗里蒙特,Calif.)的XenomouseRTM，以及Medarex,Inc.(普林斯顿,N.J.)的HuMAb-mouseRTM和TC mouseTM。在另一个替代方案中，可以通过噬菌体展示技术重组生产抗体。参见，例如美国专利号5,565,332、5,580,717、5,733,743和6,265,150；以及Winter等，(1994)Annu.Rev.Immunol.12:433-455。或者噬菌体展示技术(McCafferty等，(1990)Nature348:552-553)可以用于从来自未免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)区基因库体外产生人抗体和抗体片段。
可以通过常规方法制备完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段。例如，通过胃蛋白酶消化抗体分子可以产生F(ab')2片段，通过还原F(ab')2片段的二硫键能产生Fab片段。
遗传工程抗体，如人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体和双特异性抗体可以通过如常规重组技术生产。在一实施例中，可用常规程序(如通过采用能特异结合编码单克隆抗体重链和轻链的寡核苷酸探针)容易地分离和测序编码对靶抗原特异性的单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，DNA可放入一个或多个表达载体中，然后转染入不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞，猿猴COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中实现单克隆抗体的合成。参见如，PCT公开号WO 87/04462。然后可以修饰DNA，例如通过采用人重链和轻链恒定区的编码序列取代同源鼠序列，Morrison等，(1984)Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851，或通过共价接合到免疫球蛋白编码序列，非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列。以这种方式，可以制备具有靶抗原结合特异性的基因工程抗体，如“嵌合”或“杂交”抗体。
为生产“嵌合抗体”开发的技术是本领域众所周知的。参见如，Morrison等.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851；Neuberger等.(1984)Nature 312,604和Takeda等.(1984)Nature 314:452。
用于构建人源化抗体的方法也是本领域众所周知的。参见如，Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989)。在一实施例中，按照本领域中已知的方法对非人母抗体VH和VL的可变区进行三维分子建模分析。接着，使用相同的分子建模分析来鉴定被预测对正确CDR结构的形成重要的框架氨基酸残基。平行地，使用母VH和VL序列作为搜索查询从任何抗体基因数据库来识别具有与那些非人母抗体同源的氨基酸序列的人VH和VL链。然后选择人VH和VL受体基因。
所选择的人受体基因内的CDR区可以替换为来自非人母抗体或其功能性变体的CDR区。必要时，被预测在与CDR区相互作用中重要的母链的框架区域内的残基(见上文描述)可以用于代替人受体基因内的相应残基。
可以通过重组技术连接编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列来制备单链抗体。优选地，在两可变区之间掺入柔性接头。或者，可以调整为生产单链抗体描述的技术(U.S专利号4,946,778和4,704,692)从而生产噬菌体scFv文库，可以采用常规程序从文库识别对IL-20R1或IL-20R2特异性的scFv克隆。进一步筛选阳性克隆从而鉴定抑制IL-20受体活性的那些。
本领域已知和本文描述方法获得的抗体可以采用本领域公知的方法来表征。例如，一种方法是识别抗原结合的表位，或“表位定位”。本领域有很多方法用于定位和表征蛋白上表位的位置，包括溶解抗体-抗原复合物的晶体结构，竞争测定，基因片段表达测定，以及合成肽测定，例如，在Harlow和Lane,使用抗体,实验手册,冷泉港实验室出版社,冷泉港,N.Y.,1999的第11章所描述的。在另一个实施例中，表位定位可以用于检测抗体结合的序列。表位可以是线性表位，即包含在单段氨基酸中，或由不一定包含在单段(一级结构线性序列)内的氨基酸三维相互作用形成的构象表位。可以分离或合成(例如，重组地)不同长度(如，至少4-6个氨基酸长)的肽，并用于与抗体的结合测定。在另一实施例中，可以在系统筛选中使用衍生自靶抗原序列的重叠肽并检测抗体结合来确定抗体结合的表位。根据基因片段表达测定，编码靶抗原的开放阅读框随机或通过特定的遗传构建而分段，确定抗原的表达片段与待测试抗体的反应性。基因片段可以，例如，在放射性氨基酸的存在下，通过PCR产生，然后在体外转录并翻译成蛋白。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳确定抗体与放射性标记的抗原片段的结合。某些表位还可以通过利用噬菌体颗粒(噬菌体文库)的表面上展示的随机肽序列的大文库来鉴定。或者，可以在简单的结合测定中测试明确的重叠肽片段文库与测试抗体的结合。在另外的实施例中，可以进行抗原结合域诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变从而识别表位定位所需的、足够的和/必须的残基。例如，可以使用靶抗原突变体进行结构域交换实验，靶抗原突变体中IL-20多肽的多个片段已被衍生自密切相关的但抗原性不同的蛋白(如神经营养因子蛋白家族另一成员)序列取代(交换)。通过评估抗体与突变IL-20的结合，可以评价特定抗原片段对于抗体结合的重要性。
或者，可以使用已知结合到相同抗原的其他抗体进行竞争试验从而测定抗体是否如其他抗体那样结合到相同表位。竞争试验是本领域技术人员公知的。
其他IL-20拮抗剂
除了上述能干扰IL-20信号转导途径的抗体之外的IL-20拮抗剂可以用于本文描述的方法。
在本发明的一些实施方式中，IL-20拮抗剂包括至少一反义核酸分子，该反义核酸分子能阻断或减少功能性IL-20(如人IL-20)或IL-20受体亚单位(如IL-20R1)的表达。IL-20和IL-20受体亚单位的核苷酸序列是已知的且容易从公开的数据库获得。参见上文公开内容。制备特异性结合靶mRNA而不与其他多核苷酸交叉反应的反义寡核苷酸分子是常规的。示例性的靶位包括但不限于，起始密码子，5'调节区，编码序列和3'非翻译区。在一些实施方式中，寡核苷酸约10-100个核苷酸长，约15至50个核苷酸长，约18至25个核苷酸长，或更长。寡核苷酸可以包括骨架修饰，如，例如，本领域公知的硫代磷酸酯键，和2'-0糖修饰。
或者可以采用基因敲除、吗啉代寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA或RNAi)、微小RNA或核糖酶来降低IL-20/IL-20R表达和/或释放，这些方法是本领域公知的。RNA干扰(RNAi)是一种方法，其中dsRNA指导信使RNA的同源序列特异性降解。在哺乳动物细胞中，可通过小干扰RNA(siRNA)的21-核苷酸双链体引发RNAi，而不激活宿主干扰素响应。用于本文公开方法中的dsRNA可以是siRNA(包含两个独立和互补的RNA链)或短发夹RNA(即，形成紧密发夹结构的RNA链)，可以基于靶基因序列来设计这两者。或者，它可以是微小RNA。
任选地，如上述本文描述方法中待用的核酸分子(如，反义核酸，小干扰RNA或微小RNA)包含非天然存在的核糖碱基、糖、或核苷间共价键(骨架)。这样修饰的寡核苷酸赋予期望的性质，例如增强的细胞吸收，改进的与靶核酸的亲和力，和增加的体内稳定性。
在一实施例中，核酸具有修饰的骨架，包括保留磷原子的那些(参见如，美国专利3,687,808、4,469,863、5,321,131、5,399,676和5,625,050)和不具有磷原子的那些(参见如，美国专利5,034,506、5,166,315和5,792,608)。含磷修饰骨架的实例包括但不限于，具有3'-5'连接键或2'-5'连接键的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硒磷酸(selenophosphates)和硼磷酸酯(boranophosphates)。这些骨架也包括具有相反极性即3'-3'、5'-5'或2'-2'连接键的那些。不包括磷原子的修饰骨架由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成。这样的骨架包括具有吗啉代键(部分从核苷的糖部分形成)的那些；硅氧烷骨架；硫化物，亚砜和砜骨架；富马酰(formacetyl)和硫代富马酰(thioformacetyl)骨架；亚甲基富马酰和硫代富马酰骨架；核糖乙酰(riboacetyl)骨架；含烯烃骨架；氨基磺酸盐骨架；亚甲基亚氨和亚甲基肼骨架；磺酸盐和磺酰胺骨架；酰胺骨架和具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其他骨架。
在另一实施例中，在公开方法中使用的核酸包括一种或多种取代的糖部分。该取代的糖部分在它们的2'位可以包括以下基团之一：OH、F、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基、O-炔基、S-炔基、N-炔基和O-烷基-O-烷基。在这些基团中，烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1-C10烷基或C2-C10-烯基和炔基。它们在它们的2'位还可以包括杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸药代动力学性质的基团、或用于改善寡核苷酸药效性质的基团。优选取代的糖部分包括具有2'-甲氧基乙氧基、2'-二甲基氨氧乙氧基和2'-二甲基氨乙氧基乙氧基的那些。参见Martin等，Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504。
在又一实施例中，核酸包括一个或多个修饰的天然核酸碱基(即腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶和尿嘧啶)。修饰的核酸碱基包括以下文献中描述的那些：美国专利3,687,808；聚合物科学和工程简明百科,第858-859页,Kroschwitz,J.I.,ed.约翰威利父子公司,1990；Englisch等，应用化学,国际版,1991,30,613和Sanghvi,Y.S.,第15章,反义研究和应用,第289-302页,CRC出版社,1993。这些核酸碱基中的某些对增加反义寡核苷酸与其靶核酸的结合亲和力是特别有用的。这些包括5-取代嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代嘌呤(例如，2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶)。参见Sanghvi,等，eds.,反义研究和应用,CRC出版社,Boca Raton,1993,第276-278页。
可以通过本领域中已知的方法合成任何核酸。参见如，Caruthers等，1992,酶学方法211,3-19,Wincott等，1995,核酸研究.23,2677-2684,Wincott等，1997,分子生物学方法.74,59,Brennan等，1998,生物技术生物工程,61,33-45和Brennan,美国专利号6,001,311。也可以用标准技术从表达载体转录并分离。
在其他实施方式中，IL-20拮抗剂包括至少一IL-20或IL-20R抑制化合物。如本文所用，"IL-20抑制化合物"或“IL-20R抑制化合物”是指除抗IL-20或抗IL-20R抗体之外的直接或间接降低、抑制、中和、或消除IL-20/IL-20R生物活性的化合物。IL-20/IL-20R抑制化合物应该表现出以下任意一个或多个特征：(a)结合IL-20或IL-20R并抑制它的生物活性和/或IL-20信号转导功能介导的下游途径；(b)预防、改善或治疗肝纤维化/肝硬化的任何方面；(c)阻断或降低IL-20受体活化；(d)增加IL-20或IL-20R的清除；(e)抑制(减少)IL-20或IL-20R合成、产生或释放。本领域技术人员可以制备其它小分子抑制化合物。
在一些实施方式中，IL-20或IL-20R抑制化合物是IL-20突变体、IL-19突变体或IL-24突变体，其可以结合IL-20受体但不诱发信号转导。这种突变体可以阻断野生型IL-20结合至IL-20受体，从而阻止IL-20信号转导。
在其他实施方式中，本文描述的IL-20或IL-20R抑制化合物是小分子，其分子量可以为约100至20,000道尔顿、500至15,000道尔顿、或1000至10000道尔顿中任一。小分子库是市售的。可以使用本领域已知的任何方式施用小分子，包括吸入，腹膜内，静脉内，肌肉内，皮下，鞘内，心室内，口服，肠内，肠胃外，鼻内或经皮。通常，当本发明的IL-20-拮抗剂是小分子时，它将以0.1至300毫克/千克患者体重的比率分为一到三个或更多剂量施用。对于正常体重的成年患者，可以施用每剂1毫克至5克的剂量。
以上提及的小分子可以从化合物库中获得。该库可以是空间可寻址(spatiallyaddressable)平行固相或溶液相库。参见如，Zuckermann等.J.Med.Chem.37,2678-2685,1994和Lam Anticancer Drug Des.12:145,1997。合成化合物库的方法是本领域公知的，如，DeWitt等.PNAS USA 90:6909,1993；Erb等.PNAS USA 91:11422,1994；Zuckermann等.J.Med.Chem.37:2678,1994；Cho等.科学Science 261:1303,1993；Carrell等.AngewChem.Int.Ed.Engl.33:2059,1994；Carell等.Angew Chem.Int.Ed.Engl.33:2061,1994和Gallop等.J.Med.Chem.37:1233,1994。化合物库可存在于溶液中(如，HoughtenBiotechniques 13:412-421,1992)，或在珠(Lam Nature 354:82-84,1991)、芯片(FodorNature 364:555-556,1993)、细菌(美国专利号5,223,409)、孢子(美国专利号5,223,409)、质粒(Cull等.PNAS USA 89:1865-1869,1992)，或噬菌体(Scott和Smith科学249:386-390,1990；Devlin科学249:404-406,1990；Cwirla等.PNAS USA87:6378-6382,1990；FeliciJ.Mol.Biol.222:301-310,1991和美国专利号5,223,409)上。
在其他实施方式中，IL-20拮抗剂可以是包含IL-20受体(如IL-20R1、IL-20R2或IL-22R1)的胞外部分的多肽，其中多肽特异性结合到11-20并阻断它和一个或多个IL-20受体相互作用。在一些实施方式中，IL-20受体的胞外部分融合到抗体的Fc结构域。PCT WO01/46232中描述可溶性受体的实例。
IL-20拮抗剂的鉴定
可以使用本领域已知的方法，通过检测和/或测量IL-20生物活性的降低、改善或中和来鉴定或表征IL-20拮抗剂。例如，ELISA型试验适合用于通过检测通过IL-20级联活化的蛋白的磷酸化来定性或定量检测IL-20介导的激酶激活。实例包括JNK、ERK、AKT、p38、STAT3和TRAF6。
也可以通过孵育候选试剂和IL-20或IL-20R并监测以下任意一个或多个特征来鉴定IL-20拮抗剂：(a)结合IL-20或IL-20R并抑制它的生物活性和/或IL-20信号转导功能介导的下游途径；(b)预防、改善或治疗肝纤维化/肝硬化的任何方面；(c)阻断或降低IL-20受体活化；(d)增加IL-20或IL-20R的清除；(e)抑制(减少)IL-20或IL-20R合成、产生或释放。在一些实施方式中，通过孵育候选试剂和IL-20或IL-20R并监测结合以及伴随的IL-20或IL-20R生物活性的下降或中和来鉴定IL-20拮抗剂。可以采用纯化的(一种或多种)IL-20或IL-20R多肽、或细胞天然表达或转染表达的(一种或多种)IL-20或IL-20R多肽进行结合试验。在一实施方式中，结合试验是竞争结合试验，其中对候选抗体与已知IL-20拮抗剂竞争结合IL-20或IL-20R的能力进行评估。可以以各种形式，包括ELISA形式进行该测定。在其他实施方式中，通过孵育候选试剂和IL-20或IL-20R(如，IL-20R1)并监测伴随的IL-20R1/IL-20R2复合物形成或IL-20R2/IL-22R1复合物形成的抑制来鉴定IL-20拮抗剂。初始鉴定后，可以通过已知测试靶标生物活性的生物试验来进一步确定并完善候选IL-20拮抗剂的活性。或者，可以采用生物试验直接筛选候选物。
以下提供的实施例提供可以用于筛选候选IL-20拮抗剂的一些方法。生物试验包括但不限于在候选IL-20拮抗剂存在下流式细胞术检测IL-20到细胞的竞争结合，以及肾上皮细胞内L-20诱导的细胞凋亡的抑制。此外，RT-PCR或实时PCR可以用于直接检测IL-20表达或检测IL-20上调的基因如TNFα、MCP-1、IL-1β、IL-6和VEGF的表达。
药物组合物
一种或多种上述IL-20拮抗剂可以与药学上可接受的载体(赋形剂)(包括缓冲液)混合，从而形成药物组合物用于缓解肝纤维化/硬化。“可接受的”是指载体必须与组合物的活性组分相容(优选地，能够稳定活性组分)并对待治疗的对象无害。包括缓冲液的药学上可接受的赋形剂(载体)是本领域已知的。参见如，Remington:药剂学科学和实践(TheScience and Practice of Pharmacy),第20版.(2000)Lippincott Williams和Wilkins,Ed.K.E.Hoover。在一实施例中，本文描述的药物组合物包含多于一种识别靶抗原不同表位的抗IL-20或抗IL-20R抗体。在另一实施例中，药物组合物包括至少两种不同类型的IL-20拮抗剂(如，一抗体和一小分子)。
本发明待用的药物组合物可以包括冻干制剂或水性溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。(Remington:药剂学科学和实践(The Science and Practice ofPharmacy),第20版.(2000)Lippincott Williams和Wilkins,Ed.K.E.Hoover)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度对接受者是无毒的，可以包含缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇，和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或右旋糖酐；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属配合物(如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM,PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本文进一步描述药学上可接受的赋形剂。
在一些实施例中，本文描述的药物组合物包括包含IL-20拮抗剂(如抗体)的脂质体，可以通过本领域已知的如Epstein,等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang,等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980)和美国专利号4,485,045和4,544,545中描述的方法制备。具有增强的循环时间的脂质体在美国专利号5,013,556中公开。可以通过反相蒸发法采用包括磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物生成特别有用的脂质体。通过特定孔径的滤器挤出脂质体从而获得具有所需直径的脂质体。
活性组分(如，IL-20拮抗剂)也可以包封在微囊(例如，通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊，分别例如羟甲基纤维素或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、胶体药物递送系统(例如脂质体，白蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)中或微乳液中。这些技术是本领域已知的，参见如，Remington,药剂学科学和实践(The Science andPractice of Pharmacy),第20版,麦克出版社(Mack Publishing)(2000)。
在其他实施例中，本文描述的药物组合物可以配制成持续释放形式。合适的持续释放制剂包括包含抗体的固态疏水性聚合物的半透性基质，其中基质是定型产品形式，例如，薄膜或微囊。持续释放基质的实例包括聚酯，水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚交酯(美国专利号3,773,919)，L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸酯共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)，乙酸异丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
要用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这可容易地通过例如无菌过滤膜过滤完成。治疗性抗体组合物通常置于具有无菌存取口的容器中，例如，静脉内溶液袋或具有皮下注射针头可刺穿的塞子的小瓶。
本文描述的药物组合物可以是单位剂型，如片剂，丸剂，胶囊，粉剂，颗粒剂，溶液或悬浮液，或栓剂，用于口服，肠胃外或直肠给药，或通过吸入或吹入施用。
为了制备固体组合物如片剂，主要的活性组分可以与药物载体混合，所述药物载体如常规的片剂成分，如玉米淀粉，乳糖，蔗糖，山梨醇，滑石，硬脂酸，硬脂酸镁，磷酸二钙或树胶(gums)，和其它药物稀释剂，例如水，以形成含有本发明化合物或其无毒的药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预制剂组合物。当提及这些预制剂组合物为均匀时，是指活性组分在整个组合物中均匀分散使得组合物可以容易地再分成等效的单位剂型，如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将这种固体预制剂组合物再分成含有0.1至500毫克本发明活性组分的上述类型的单位剂型。新型组合物的片剂或丸剂可以被包衣或者另外复合以提供具有延长作用优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包括内剂量和外剂量组分，后者是包裹前者的形式。两组分可以通过肠溶层分开，肠溶层用于抵抗胃内崩解并使内组分完整进入十二指肠或被延迟释放。多种材料可用于这样的肠溶层或包衣，此类材料包括许多聚合酸和聚合酸与这样的材料如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的混合物。
合适的表面活性剂包括，特别是，非离子表面活性剂，如聚乙二醇山梨聚糖(例如Tween.TM.20、40、60、80或85)和其它山梨聚糖(例如Span.TM.20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物适宜包括0.05-5％的表面活性剂，可以为0.1-2.5％。应理解，可以加入其它成分，例如甘露醇或其它药学上可接受的载体，如果需要的话。
合适的乳液可使用市售的脂肪乳剂，例如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM和LipiphysanTM来制备。活性组分可以或者溶解在预混合乳液组合物中，或者，它也可以溶解在油(如大豆油，红花油，棉籽油，芝麻油，玉米油或杏仁油)以及磷脂(如卵磷脂，大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合形成的乳液中。应理解，可以加入其它成分，例如甘油或葡萄糖，以调整该乳液的张力。合适的乳液通常含有至多20％的油，例如，5至20％。脂肪乳剂可包含0.1-1.0.im，特别是0.1-0.5.im的脂肪滴，pH为5.5-8.0的范围。
乳液组合物可以是通过将IL-20拮抗剂与IntralipidTM或其成分(大豆油，卵磷脂，甘油和水)混合而制备的那些。
用于吸入或吹入的药物组合物包括药学上可接受的水性或有机溶剂或它们的混合物中的溶液和悬浮液，以及粉剂。液体或固体组合物可含有合适的上述药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，通过口服或鼻呼吸途径施用组合物以达到局部或全身效果。
在优选无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物可以通过使用气体来雾化。雾化的溶液可以直接从雾化设备吸入或雾化设备可以接到面罩、帐幕或间歇正压呼吸机。可以从以适当的方式递送制剂的设备施用溶液、悬浮液或粉末组合物，优选口服或经鼻。
IL-20拮抗剂用于治疗肝纤维化
为实施本文公开的方法，将有效量的上述药物组合物通过合适的途径施用于需要治疗的对象(如人)，如静脉内给药，如作为推注，或通过连续输注一段时间，通过肌内，腹膜内，脑脊髓内，皮下，关节内，滑膜内，鞘内，口服，吸入或局部途径。市售的液体制剂喷雾器，包括喷射喷雾器和超声喷雾器对于给药是有用的。液体制剂可以直接雾化，冻干粉可重构后进行雾化。或者，可以使用氟碳制剂和计量剂量吸入器来气雾化IL-20拮抗剂，或作为冻干和研磨的粉末吸入。
待用本发明方法治疗的对象可以是哺乳动物，更优选是人。哺乳动物包括，但不限于，农场动物，运动动物，宠物，灵长类动物，马，狗，猫，小鼠和大鼠。需要治疗的人类对象是患有肝纤维化、有患肝纤维化风险、或怀疑患有肝纤维化(如，肝硬化)的人类患者。可以通过医学检查如实验室检查、肝功能检查、肝活检、CT扫描、或超声波来确定患有肝纤维化的对象。怀疑患有肝纤维化的对象可能表现出该病的一种或多种症状，例如转氨酶(AST和ALT)水平、碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转移酶水平升高，胆红素(为硬化进展的标记)水平升高，白蛋白水平降低，凝血酶原时间增加，球蛋白水平升高，白细胞减少症和嗜中性白血球减少症，和/或凝血缺陷。有患肝纤维化风险的对象可以是具有该病的一种或多种危险因素的对象。例如与肝纤维化相关的危险因素包括：(a)病毒感染，尤其是HBV或HCV感染，(b)年龄(肝纤维化在50岁以上人群更频繁发生)，(c)性别(男性比女性发生迅速)，(d)重度饮酒，(d)脂肪肝，和(f)胰岛素耐受。
如本文所用的“有效量”是指赋予对象治疗效果所需的各活性剂的量，所述各活性剂或者单独使用或者与一种或多种其它活性剂组合使用。如本领域技术人员所熟知的，根据治疗的具体病况，病况的严重程度，个体患者参数包括年龄、身体状况、身高、性别和体重，治疗的持续时间，并行治疗的性质(如果有的话)，给药的具体途径和保健医生知识和经验范围内的类似因素，有效量可以改变。这些因素对本领域一般技术人员来说是公知的，可以用不超过常规的实验来解决。通常优选的是使用最大剂量的各组分或它们的组合，也就是基于合理医学判断的最高安全剂量。但本领域一般技术人员将会理解，出于医学原因、心理原因或实际上任何其他原因，患者可能坚持要求较低剂量或可耐受的剂量。
经验的考虑，如半衰期，通常将有助于剂量的确定。例如，与人免疫系统相容的抗体，如人源化抗体或完全人抗体，可以用于延长抗体的半衰期并防止抗体被人免疫系统攻击。可以确定给药频率并在治疗期间进行调整，通常但不必须，根据肝纤维化/肝硬化的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。或者，IL-20拮抗剂的持续释放制剂可能是合适的。实现持续释放的各种制剂和装置是本领域已知的。
在一实施例中，对于已经给予IL-20拮抗剂一种或多种施用的个体，可以经验性地确定本文描述的IL-20拮抗剂的剂量。给予个体递增剂量的拮抗剂。为评价拮抗剂的效力，可以关注肝纤维化指示(如AST和ALT水平)。
通常，为施用本文描述的任何抗体，初始候选剂量可以是约2mg/kg。为本公开内容的目的，典型的日剂量可以是约0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg中任何到30mg/kg至100mg/kg或更高的范围，取决于上文提及的因素。对于在几天或更长时间中的反复给药，取决于病情，治疗是持续的直到出现所需的症状抑制或直到获得足够的治疗水平从而减轻肝纤维化或硬化，或其症状。典型的剂量方案包括施用初始剂量为约2mg/kg，随后每周抗体维持剂量为约1mg/kg，或随后每隔一周抗体维持剂量为约1mg/kg。但是，其他剂量方案可以是有用的，取决于医生希望获得的药代动力学衰减模式。例如，计划一周1-4次的剂量。在一些实施方式中，可以使用约3μg/mg-约2mg/kg(如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg和约2mg/kg)的剂量范围。在一些实施方式中，给药剂量频率是每周、每2周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周或每10周一次；或每月、每2月或每3月或更长时间一次。通过常规技术和试验容易监测该治疗进程。剂量方案(包括使用的抗体)可以随时间改变。
当IL-20拮抗剂不是抗体时，可以以约0.1-300mg/kg患者体重的比率分为1-3个剂量施用，或如本文所公开的。在一些实施方式中，对于正常体重的成年患者，可以施用的剂量范围为约0.3-5.00mg/kg。特定的剂量方案，即剂量、时间设置和重复，将取决于特定的个体、个体的医疗史以及个别药剂的性质(如药剂的半衰期和本领域已知的其他考虑)。
为本公开的目的，IL-20拮抗剂的适当剂量将取决于采用的具体IL-20拮抗剂(或其组合物)，肝纤维化/肝硬化的类型和严重程度，施用拮抗剂是否用于预防或治疗目的，先前的疗法，患者的临床史和对拮抗剂的响应，以及主治医师的判断。通常临床医师会施用IL-20拮抗剂，例如抗IL-20或抗IL-20R抗体，直至达到实现期望结果的剂量。IL-20拮抗剂的施用可以是连续的或间歇性的，这取决于，例如，接受者的生理条件，施用目的是治疗还是预防，和本领域技术从业者所知的其他因素。IL-20拮抗剂(例如如果IL-20拮抗剂是抗IL-20抗体)的施用可以是在一段预选的时间中基本上连续或可以是一系列间隔剂量，如，发生肝纤维化或硬化之前、期间或之后。
如本文所用，术语“治疗”是指包括一种或多种活性剂的组合物应用或施用于对象，其患有肝纤维化，有肝纤维化症状或易感该疾病，以治病、治愈、缓和、减轻、改变，矫正，缓解，改善或影响疾病、疾病的症状或对疾病的易感性为目的。
缓解肝纤维化或硬化包括延迟疾病的发展或进展，或降低疾病严重程度。缓解疾病不一定需要疗效(curative results)。如本文所用，“延迟”疾病(如肝纤维化或硬化)的发展是指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或拖延疾病的进展。该延迟可以是不同的时间长度，取决于疾病史和/或被治疗的个体。“延迟”或缓解疾病发展或延迟疾病发作的方法是在给定时间框内降低发展一种或多种疾病症状的可能和/或在给定时间框内减轻症状程度的方法(当与不使用该方法相比)。这种比较通常基于临床研究，使用足以得到统计学显著结果的若干对象。
疾病的“发展”或“进展”是指疾病的最初临床表现和/或随后的进展。可以采用本领域已知的标准临床技术检测和评估疾病的发展。但是，发展也指可能检测不到的进展。为本公开内容的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生，复发和发作。如本文所用，肝纤维化的"发作"或"发生"包括最初的发作和/或复发。
在一些实施方式中，本文描述的IL-20拮抗剂(如，抗IL-20抗体或抗IL-20R抗体，如抗IL-20R1抗体)以足以降低IL-20受体/IL-20介导信号转导水平至少20％(如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量施用于需要治疗的对象。在其他实施方式中，以有效降低对象AST和/ALT酶活性的量施用拮抗剂。或者，以有效反转HSC细胞活化(可被IL-20诱导)的量施用拮抗剂。
医学领域一般技术人员所知的常规方法，根据要治疗的疾病类型或疾病的部位，可用于将药物组合物给予对象。该组合物也可以通过其他常规途径给药，如通过口服，肠胃外给药，通过吸入喷雾，局部，直肠，经鼻，颊，阴道或通过植入的容器给药。术语“肠胃外”用于本文包括皮下，皮内，静脉内，肌内，关节内，动脉内，滑膜内，胸骨内，鞘内，病灶内和颅内注射或输注技术。此外，它可以通过可注射的药性持久(depot)途径如使用1、3或6个月持久可注射或可生物降解的材料和方法来给予对象。
可注射组合物可包含各种载体，如植物油，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺，乳酸乙酯，碳酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯，乙醇和多元醇(甘油，丙二醇，液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，水溶性抗体可以通过滴注方法给药，由此输注含有抗体和生理学上可接受的赋形剂的药物制剂。生理学上可接受的赋形剂可包括，例如，5％葡萄糖，0.9％生理盐水，林格氏溶液或其他合适的赋形剂。肌内制剂，例如，抗体的合适的可溶盐形式的无菌制剂，可以溶解在药用赋形剂如注射用水、0.9％生理盐水、或5％葡萄糖溶液中并给药。
在一实施方式中，IL-20拮抗剂通过位点特异性或靶向局部递送技术给药。位点特异性或靶向局部递送技术的实例包括IL-20拮抗剂的各种可植入的药性持久源(depotsources)或局部输送导管，如输液导管，留置导管，或针导管，合成移植物，外膜包裹，分流器和支架或其他可植入装置，位点特异性载体，直接注射，或直接应用。参见如，PCT公开号WO 00/53211和美国专利号5,981,568。
也可以使用包含反义多核苷酸、表达载体、或亚基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向递送。受体介导的DNA递送技术在例如以下文献中描述，Findeis等，TrendsBiotechnol.(1993)11:202；Chiou等，基因疗法：直接基因转移的方法的应用(GeneTherapeutics:Methods And Applications Of Direct Gene Transfer)(J.A.Wolff,ed.)(1994)；Wu等，J.Biol.Chem.(1988)263:621；Wu等，J.Biol.Chem.(1994)269:542；Zenke等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:3655；Wu等，J.Biol.Chem.(1991)266:338。包含多核苷酸的治疗组合物在基因治疗方案中以约100ng到约200mgDNA的量用于局部给药。在一些实施方式中，在基因治疗方案期间也可以使用约500ng-约50mg、约1μg-约2mg,约5μg-约500μg和约20μg-约100μg DNA或更高的浓度范围。
可以使用基因递送载体递送本文描述的治疗性多核苷酸和多肽。基因递送载体可以是病毒或非病毒来源的(通常参见Jolly,癌症基因治疗(1994)1:51；Kimura,人基因治疗(1994)5:845；Connelly,人基因治疗(1995)1:185和Kaplitt,自然遗传学(1994)6:148)。可以使用内源哺乳动物或异源启动子和/或增强子诱导这样的编码序列的表达。编码序列的表达可以是组成型或调控型。
用于递送所需多核苷酸并在所需细胞内表达的病毒基载体是本领域已知的。示例性的病毒基载体包括但不限于，重组逆转录病毒(参见如，PCT公开号WO 90/07936、WO 94/03622、WO 93/25698、WO 93/25234、WO 93/11230、WO 93/10218、WO 91/02805、U.S.Pat.Nos.5,219,740和4,777,127、GB专利号2,200,651和EP专利号0345242)，甲病毒基载体(如，辛德毕斯(Sindbis)病毒载体，塞姆利基(Semliki)森林病毒(ATCC VR-67，ATCCVR-1247)，罗斯河(Ross River)病毒(ATCC VR-373，ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923，ATCC VR-1250，ATCC VR 1249，ATCC VR-532))和腺相关病毒(AAV)载体(参见如，PCT公开号WO 94/12649，WO 93/03769，WO 93/19191，WO 94/28938，WO 95/11984和WO95/00655)。也可以使用如Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147中描述的连接到灭活腺病毒的DNA的给药。
也可以使用非病毒递送载体和方法，包括但不限于，连接或未连接到单独的灭活腺病毒的聚阳离子缩合DNA(参见如，Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147)，配体连接的DNA(参见如，Wu,J.Biol.Chem.(1989)264:16985)，真核细胞递送载体细胞(参见如，美国专利号5,814,482，PCT公开号WO 95/07994，WO 96/17072，WO 95/30763和WO 97/42338)和核电荷中和或与细胞膜融合。也可以采用裸DNA。典型的裸DNA导入方法在PCT公开号WO 90/11092和美国专利号5,580,859中描述。可以作为基因递送载体的脂质体在美国专利号5,422,120，PCT公开号WO 95/13796，WO 94/23697，WO 91/14445和EP专利号0524968中描述。其他方法在Philip,Mol.Cell.Biol.(1994)14:2411和Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91:1581中描述。
表达载体可用于指导本文描述的任何蛋白基IL-20拮抗剂(如，抗IL-20抗体或抗IL-20R抗体)的表达也是显而易见的。例如，能阻断(从部分到完全阻断)IL-20和/或IL-20生物活性的其他IL-20受体片段是本领域已知的。
本文描述方法中使用的具体的给药方案，即剂量，时间设置和重复，将取决于具体的对象和对象的医疗史。
在一些实施方式中，多于一种IL-20拮抗剂，如抗体和小分子IL-20抑制化合物，可以给予需要治疗的对象。拮抗剂可以是相同类型或彼此不同。至少一、至少二、至少三、至少四、至少五种不同的IL-20拮抗剂可以共同给药。通常，这些IL-20拮抗剂具有没有不利相互影响的互补活性。IL-20拮抗剂也可以与用于增强和/或补足药剂有效性的其他药剂联用。
可以通过本领域公知的方法评价治疗功效，如监控治疗中的患者的AST和/或ALT水平。参见如，以下实施例2。
用于缓解肝纤维化的试剂盒
本发明还提供用于缓解肝纤维化/硬化的试剂盒。该试剂盒可以包括包含IL-20拮抗剂(如抗体，如mAb7E或它的功能性变体，mAb7GW或它的功能性变体，或mAb51D或它的功能性变体)的一个或多个容器。在一些实施方式中，IL-20拮抗剂是本文描述的能干扰IL-20信号转导途径的任何抗体。在其他实施方式中，试剂盒包含IL-20拮抗剂，所述拮抗剂不是刚刚提到的抗体。
在一些实施方式中，试剂盒可以包括用于根据本文描述的任何方法的说明书。所包括的说明书可包括对根据本文所述任何方法给予IL-20拮抗剂以治疗、延迟发作或缓解肝纤维化/硬化的描述。试剂盒还可包括基于鉴别个体是否患有肝纤维化来选择适合治疗的个体的描述。在还有的其他实施方式中，说明书包括将IL-20拮抗剂给予有患肝纤维化风险的个体的描述。
关于IL-20拮抗剂应用的说明书通常包括信息，如用于所需治疗的剂量、给药时间安排和给药途径。容器可以是单位剂量，散包装(bulk package)(如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明试剂盒内提供的说明书通常是写在标签或包装插页(如试剂盒内包含的纸页)上的说明，但机器可读说明(例如，载入磁或光存储盘上的说明)也可以接受。
标签或包装插页表明组合物用于治疗、延迟发作和/或缓解肝纤维化或硬化。可以为实施本文所述任何方法提供说明书。
本发明的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于，小瓶，瓶，广口瓶，软包装(例如密封的聚脂薄膜或塑料袋)和类似物。还预期包装与特定设备组合使用，例如吸入器，经鼻给药装置(例如，雾化器)或输液设备，诸如微型泵。试剂盒可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。容器也可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。组合物中至少一种活性试剂是IL-20拮抗剂，例如抗IL-20抗体。
试剂盒可任选地提供额外的组分，例如缓冲液和解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相连的标签或包装插页。在一些实施方式中，本发明提供包括上述试剂盒内容的制品。
无需进一步详尽说明，据信本领域技术人员可根据上面的描述，利用本发明至其最大限度。因此，以下具体实施方式应解释为仅仅是说明性的，并不以任何方式限制本公开内容的其余部分。本文引用的所有出版物为提及的目的或内容而通过引用并入本文。
实施例1：IL-20与肝脏疾病的关联
材料和方法
临床样本
自国立成功大学附属医院(台南，台湾)从六位患者获得肝活检样本，包括3例肝纤维化(早期)和3例肝硬化(肝纤维化晚期)。从SUPER BIO CHIPS购买三个正常患者的肝脏样本。如下所述通过实时PCR分析11个非硬化肝组织和9个硬化肝组织。
大鼠IL-20重组蛋白的表达和纯化
大鼠IL-20的片段(GenBank登录号NM_001143881.1或GI:219842194)，从Leu25到Leu176，通过PCR扩增并插入到pSecTag2A载体。将所得质粒导入293T细胞用于表达大鼠IL-20蛋白。使用金属亲和色谱纯化表达的蛋白。
细胞培养
大鼠肝细胞克隆-9细胞，正常细胞株，购自美国典型培养物保藏中心。这些细胞在包含10％FBS的DMEM/F12培养基(Hyclone)中培养。
如前所述通过原位酶消化肝并梯度超速离心从雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠分离原代大鼠肝星状细胞(rHSC)。Corazza等，Semin Immunopathol.,2009,31(2):267-77。分离的rHSC细胞保持在包含10％FBS的DMEM/HG(Hyclone)中。
在处理前在1％培养基中培养细胞，然后暴露于本文描述的各种条件。
IL-20功能试验以及mAb7E和mAb51D的中和能力
采用(a)大鼠IL-20(200ng/ml)、(b)mAb7E(2μg/ml)、(c)大鼠IL-20(200ng/ml)和mAb7E(2μg/ml)、(d)mAb51D(2μg/ml)、(e)大鼠IL-20(200ng/ml)和mAb51D(2μg/ml)、(f)mIgG(2μg/ml)和(g)大鼠IL-20(200ng/ml)以及对照mIgG(2μg/ml)处理克隆-9细胞和rHSC细胞不同的时间。
石蜡切片和培养的细胞的免疫细胞化学(IHC)染色
采用二甲苯去除切片上的石蜡并使用梯度乙醇再水化。细胞在3.7％多聚甲醛中固定，然后采用含0.1％Triton X-100的PBS渗透。通过将切片和细胞浸入含有背景消除组分(DakoCytomation)的抗体稀释液中将它们封闭，然后用封闭试剂中的一级抗体孵育。根据romulin AEC色原试剂盒(Biocare公司)的说明书实施以下的程序，并采用Mayer氏苏木精(J.T.Backer)复染。试验中使用的抗体如下购买：对IL-20R1、IL-20R2、IL-22R1特异性的抗体和mIgG同种型对照获自R&D系统；对PCNA特异性的抗体获自Genetex.0
反转录PCR(RT-PCR)和实时PCR
使用Trizol试剂(Life Technologies生命技术公司)从细胞或组织提取总RNA并根据厂商的说明书进行反转录。采用扩增的PCR和实时PCR和基因特异性引物分析mRNA的表达水平。GAPDH为内部对照。
采用荧光检测系统(LightCycler 480；Roche)用SYBR绿I(Roche)化学完成扩增的PCR产物的检测。用于实时PCR的特异性引物与用于扩增PCR的那些相同。GAPDH的水平为内部对照。
细胞周期分析
采用A条件培养基处理克隆-9细胞24小时。处理后，收集细胞并用PBS洗涤，然后用70％乙醇固定，并在4℃存储24小时。在用冷PBS洗涤3次后，采用100μg/ml PI和50μg/ml无脱氧核糖核酸酶的核糖核酸酶A给细胞染色10分钟。采用FACScan流式细胞仪(BectonDickinson)评价PI染色细胞的DNA荧光。采用WinMDI 2.8软件对亚-G0/G1和G2/M期的细胞比例进行定量。
免疫印迹分析
采用细胞裂解缓冲液(细胞信号转导(Cell signaling))制备克隆-9细胞裂解物。使用抗p21WAF1的特异性第一抗体根据厂商的说明书进行免疫印迹。β-肌动蛋白用作内部对照。
细胞增殖试验
通过MTT试验确定原代rHSC细胞的增殖。在条件培养基中孵育72小时后，细胞与0.5mg/mL浓度的溴化3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑(MTT，Sigma)混合3小时。吸出上层清液，加入DMSO(Sigma)以溶解蓝色结晶。检测550纳米吸光度。
迁移试验
采用容纳有8μm孔径聚碳酸酯过滤器(Nucleopore)的博伊登(Boyden)室检验rHSC迁移水平。上部孔装载有104rHSC。下部室充满条件培养基。在37℃孵育博伊登室8小时。附着在过滤器下侧的细胞在100％甲醇中固定并采用刘氏染色(TonyarBiotech)进行染色。通过对15个随机选择的视野计数来显微确定过滤器下表面上细胞的数量。
结果
IL-20在肝脏疾病中高表达
为检测IL-20是否参与肝脏疾病的发病机理，采用免疫组织化学染色检测患有纤维化、肝硬化和肝细胞癌患者的肝活组织检查样本内IL-20的表达水平。IL-20在肝星状细胞，以及在纤维化患者、肝硬化患者和肝细胞癌患者的肝细胞内高表达。在非肝硬化样本中没有观察到IL-20过表达。这些结果表明IL-20的表达水平与肝纤维化如肝硬化高度相关。
IL-20诱导克隆-9细胞内TGF-β1表达
为探究IL-20在肝细胞内较高表达是否与肝纤维化/硬化的发病机理相关，IL-20对正常大鼠肝细胞克隆-9的作用被检测。
采用实时PCR分析IL-20表达。RT-PCR和免疫组织化学(IHC)染色显示IL-20及其受体都在克隆-9细胞内表达。结果表明IL-20可以以自分泌的方式对肝细胞起作用。
CCl4对克隆-9细胞的细胞毒作用研究如下。克隆-9细胞与CCl4(10μM)孵育指定的时间阶段。CCl4处理诱导了克隆-9细胞内IL-20的表达。TGF-β1是肝细胞增殖的关键因子。为检测IL-20对肝细胞的影响，分析了克隆-9细胞内TGF-β1mRNA的表达。IL-20增加了TGF-β1mRNA水平。图1。此外，抗IL-20单克隆抗体mAb7E和抗IL-20R1单克隆抗体mAb51D有效中和了克隆-9细胞内IL-20诱导TGF-β1表达。图1。
IL-20通过上调克隆-9细胞内的p21WAF1而增加了细胞周期停滞
TGF-β1可以通过引起G1/S停滞和上调p21WAF1表达而抑制细胞周期进程。Albrecht等,Oncogene.1998,16(16):2141-50；Li等,J Biol Chem.1995,270(10):4971-4和Datto等,Proc Natl Acad Sci U S A.1995,92(12):5545-9。实施如本文描述的流式细胞术以检测IL-20是否能影响细胞周期分布。结果表明在24小时IL-20增加了G0/G1期停滞细胞的百分数，且该IL-20诱导的细胞周期停滞被mAb7E和mAb51D援救。此外，IL-20显著增加了克隆-9细胞内细胞周期抑制剂p21WAF1的表达水平。该IL-20诱导的p21WAF1过表达再一次被mAb7E和mAb51D中和。这些结果表明IL-20可以诱导TGF-β表达并通过上调p21WAF1削弱肝细胞增殖，导致肝纤维化发展。在本研究中发现抗IL-20和IL-20受体IL-20R1的抗体扭转这一进程。
IL-20诱导原代大鼠HSC活化
HSC是肝内主要的细胞群。这些细胞负责增加的细胞外基质蛋白沉积。HSC必须被活化从而从休眠的脂肪储存细胞类型变换成肌成纤维细胞样细胞，然后合成广谱的细胞外基质蛋白。表达α-SMA的活化HSC负责通过沉淀过量异常成分的ECM和增加的收缩性引起门静脉高压的肝窦部分(sinusoidal component)和纤维化。Bataller等,J ClinInvest.2005,115(2):209-18；Crary等,Hepatology,1998,28(3):738-43和Pinzani等,Semin Liver Dis.1999；19(4):397-410。
代表“静态”表型的培养不到48小时的原代大鼠HSC细胞，和代表“活化”表型的培养10-14天的原代HSC细胞用于本研究。参见Sommerfeld等,J Biol Chem.2009,284(33):22173-83。
为检测IL-20是否参与大鼠HSC活化，通过实时PCR分析培养1天(0代)、7天(1代)和20天(3代)的大鼠HSC细胞的IL-20和α-SMA mRNA水平。结果表明在静态大鼠HSC的活化进程期间IL-20和α-SMA mRNA水平上调。为确认IL-20在静态大鼠HSC活化中的作用，采用实时PCR分析用IL-20处理的静态大鼠HSC细胞内α-SMA和TGF-βmRNA的水平。IL-20增加了α-SMA以及TGF-β、TNF-a和Col-I的mRNA水平，mAb7E和mAb51D中和该活性。参见如，图2。
在活化的HSC内IL-20上调了TGF-β1表达并刺激TNF-α表达、增殖和迁移
为检测IL-20处理的活化大鼠HSC细胞内TGF-β的表达，通过实时PCR分析TGF-βmRNA水平。结果表明在IL-20处理的活化大鼠HSC细胞内TGF-βmRNA水平升高，mAb7E和mAb51D抑制了IL-20诱导的表达。IL-20还上调了炎性细胞因子TNF-α、ECM组分Col-I的表达。再一次，mAb7E和mAb51D抑制了IL-20诱导的这些蛋白的过表达。
采用博伊登室和MYY试验分析IL-20处理的活化大鼠HSC内的增殖和迁移活动。IL-20调节了活化大鼠HSC细胞的迁移活动和增殖。
一并考虑，以上结果表明，在活化的rHSC内IL-20提高了TGF-β、TNF-α的表达，增进了ECM形成，增强了细胞增殖和迁移。这些IL-20诱导的活动被mAb7E和mAb51D抑制。
实施例2：抗IL-20和抗IL-20R1抗体在CCl4诱导的肝损伤小鼠模型内的保护作用
材料和方法
CCL4诱导的肝损伤动物模型
10到12周的C57BL/6J、IL-20R1+/+、IL-20R1+/-或IL-20R1-/-小鼠用于本研究。各实验组包括3-5只小鼠。对于短期CCl4诱导的肝损伤，通过腹膜内(I.P.)注射将单一剂量1ml/kg体重(1:5v/v，在矿物油中)的CCl4给予小鼠。对于长期CCl4诱导的肝损伤，通过IP每周两次将剂量为1ml/kg体重的CCl4给予小鼠，共8周。对照小鼠注射相似体积的橄榄油。
抗体处理
具有短期CCl4诱导肝损伤的C57BL/6J小鼠在施用CCl4后每天一次皮下注射3mg/kgmAb7E，或者在施用CCl4前每天一次预注射6mg/kg mAb51D 3天。在CCl4处理后1小时实施第一次mAb7E注射，在CCl4处理前1小时进行第一次mAb51D注射。
具有长期CCl4诱导肝损伤的C57BL/6J小鼠在施用CCl4后注射3mg/kg mAb7E，或者在施用CCl4前预注射6mg/kg mAb51D。对照组小鼠皮下注射相同体积的对照mIgG(Peprotech).
组织学
利用苏木精和伊红(H&E)对肝石蜡切片进行染色。石蜡切片的天狼星红染色用于定性评价胶原结构和纤维化程度。如前所述定量纤维化形成。
肝羟脯氨酸测定
采用经调整的Friedman等,Gastroenterology.2008,134(6):1655-69和Oh等,Apoptosis.2007,12(7):1339-47中描述的方法检测肝组织内表达的羟脯氨酸的总量，其作为胶原沉积和纤维化的定量检测。简要地，冷冻的肝组织样本(50-60毫克)在6N HCl中在110℃水解12小时。水解物溶于50％异丙醇内，并与42mmol/L醋酸钠内的0.84％氯胺-T孵育，然后在560nm光测量定量相对羟脯氨酸(毫克/克肝)。各单独组织的羟脯氨酸含量以微克羟脯氨酸/毫克组织湿重表示。
血清天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶
通过检测天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的水平检测有CCl4诱导肝损伤的小鼠的肝功能。这两种酶的活性以单位每升(U/L)表示。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
利用酶联免疫吸附试剂盒(R&D system)根据厂商的说明书检测有CCl4诱导肝损伤的小鼠的IL-20的血清水平。
结果
抗IL-20和抗IL-20R1抗体保护小鼠免受短期CCl4诱导的肝损伤伤害。
CCl4诱导的肝损伤已被用作研究动物中诱导的肝脏硬化症响应的肝毒素动物模型，其模拟人肝纤维化/硬化。因此，CCl4诱导的肝损伤动物广泛用于评价药物和饮食抗氧化剂的治疗潜能。Hsu等，Food Chem Toxicol.2010,48(6):1644-53。
为进一步确定IL-20参与肝细胞损伤且IL-20拮抗剂可以有效中和肝脏疾病中IL-20的活性，分析有短期CCl4诱导肝损伤的小鼠中mAb7E和mAb51D的保护作用。注射CCl4后3天处死CCl4诱导的短期肝损伤小鼠。在这些小鼠中发现血清IL-20水平显著升高。
通过在施用CCl4后皮下注射抗体来分析短期CCl4诱导肝损伤的小鼠内mAb7E和mAb51D的保护作用。在施用CCl4后24小时、48小时和72小时检测AST和ALT的水平。在24小时短期CCl4诱导肝损伤的小鼠内AST和ALT的血清水平快速升高到峰值。图3。从24小时到72小时，与对照组相比，mAb 7E处理显著抑制了AST和ALT活性的升高。图3A和图3B。通过ELISA和实时PCR检测肝组织和血清内TGF-β(细胞周期调节剂)的mRNA水平。TGF-β水平和血清AST和ALT水平的下降表明mAb7E和mAb51D保护了肝细胞免受CCl4诱导肝损伤的伤害。
在72小时进行肝切片的PCDA免疫化学染色从而研究肝细胞增殖。发现分离自施用CCl4后用mAb7E和mAb51D处理的小鼠的肝切片内PCNA阳性细胞的量增加。与采用对照mIgG处理的小鼠相比，在用mAb7E和mAb51D处理的小鼠内检测到较大量的肝细胞，表明mAb7E和mAb51D显著增加了PCNA+细胞的量。
淋巴细胞募集到肝是炎症的特征。Adams等，Lancet.1997,349(9050):490-5。通过实时PCR检测肝组织内趋化因子MCP-1、KC和MIP-2β的表达水平。结果表明mAb7E和mAb51D抗体显著降低了炎症浸润并减少了肝组织内的炎症应答。
抗IL-20和抗IL-20R1抗体保护小鼠免受长期CCl4诱导肝损伤的伤害
为测试mAb7E和mAb51D在长期CCl4诱导肝损伤中的治疗潜能，如本文描述的长期CCl4诱导肝损伤小鼠模型用于本研究。在施用CCl48周后处死长期CCl4诱导肝损伤小鼠。在施用CCl4后这些小鼠的IL-20血清水平也增高。
如上所述，TGF-β可以上调ECM的产生和沉积，这可以导致肝纤维化进展。此处，还通过实时PCR和ELISA检测了肝组织内TGF-βmRNA水平和血清内TGF-β蛋白水平。结果表明与对照小鼠相比，mAb7E和mAb51D降低了长期CCl4诱导肝损伤小鼠内TGF-β的表达。
与对照小鼠相比，用mAb7E和mAb51D处理长期CCl4诱导肝损伤小鼠显著降低了这些小鼠血清内的ALT和AST水平。图4。该结果与通过H&E染色的肝组织学实验结果一致。
长期CCl4诱导肝损伤导致肝纤维化，如通过天狼星红染色示出。为直接量化纤维化程度，通过检测肝羟脯氨酸含量测定总肝胶原。发现与采用mIgG对照处理的小鼠相比，mAb7E和mAb51D两者显著降低长期CCl4诱导肝损伤小鼠内总肝羟脯氨酸含量。
肝纤维化导致以α-SMA表达为特征的静态HSC的活化。采用实时PCR分析长期CCl4诱导肝损伤小鼠模型内的α-SMA mRNA水平。结果表明与采用对照mIgG处理的小鼠相比，mAb7E和mAb51D两者显著抑制HSC活化。
活化的HSC释放TGF-β并提高趋化性。通过实时PCR检测TNF-α和MCP-1mRNA的水平。发现TNF-α和MCP-1的表达被提升，且mAb7E和mAb51D两者抑制长期CCl4诱导肝损伤小鼠内这些蛋白的过表达。
活化HSC内TIMP的表达被上调，导致MMP活性的抑制和随后的胞外空隙内基质蛋白的累积。Schuppan等,Semin Liver Dis.2001,21(3):351-72。通过采用实时PCR分析TIMP-1、TIMP-2、MMP-2和MMP-12mRNA的水平。本研究获得的结果表明，mAb7E和mAb51D降低了TIMP表达并逆转了MMP表达。
以上结果清楚示出，mAb7E和mAb51D显著保护了小鼠不受CCl4诱导的短期和长期肝损伤的伤害，表明这些抗体在缓解肝纤维化/硬化和治疗肝脏疾病中是有效的。
实施例3：IL-20R1敲除小鼠抵抗短期和长期CCl4诱导肝损伤
分析IL-20R1缺失对IL-20诱导肝损伤的影响。根据以上描述的方案采用CCl4处理IL-20R1+/+小鼠和IL-20R1-/-小鼠从而诱导短期肝损伤。通过实时PCR和ELISA分别检测处理的小鼠的肝组织内的TGF-βmRNA水平和处理的小鼠的血清内TGF-β蛋白水平。在24小时、48小时和72小时还检测AST和ALT的酶活性。IL-20R1-/-小鼠与IL-20R1+/+小鼠相比表现出显著降低的TGF-β水平和血清AST和ALT活性。IL-20R1-/-小鼠内PCNA+细胞比IL-20R1+/+小鼠内的少得多。
炎症趋化因子MCP-1、KC和MIP-2β在处理的小鼠的肝组织内的表达水平也采用实时PCR检测。与野生型小鼠相比，这些趋化因子在IL-20R1-/-小鼠的水平显著降低，表明在IL-20R1缺失小鼠内肝炎症显著减少。
根据以上描述的方案，也采用CCl4处理IL-20R1+/+小鼠和IL-20R1-/-小鼠以诱导长期肝损伤。施用CCl48周后，IL-20R1-/-小鼠内的TGF-β水平和血清AST和ALT水平比IL-20R1+/+小鼠内的显著降低。这些结果与通过H&E染色的肝组织学一致。CCl48周处理导致小鼠肝内出现肝纤维化，如天狼星红染色所分析的。IL-20R1缺失导致与IL-20R1+/+小鼠相比，总胶原(羟脯氨酸)含量水平显著下降。
采用实时PCR分析α-SMA、Col-I、VEGF-1、TNF-α、TIMP-3、TIMP-4、MMP-2、MMP-12和MMP-13的mRNA水平。相对于IL-20R1+/+小鼠，IL-20R1-/-小鼠表现出显著下降的这些蛋白的表达。
其他实施方式
本说明书中披露的全部特征可以任何组合被组合。在本说明书中公开的每个特征可由起到相同、等同或类似目的的替代特征所代替。因此，除非另外明确说明，否则公开的每个特征仅是一般系列的等同或类似特征的一个例子。
本领域技术人员从以上描述中容易确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明精神和范围的情况下可以对本发明作出各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。因此其他实施方式也可在权利要求范围内。

Claims (16)

1.一种IL-20拮抗剂的用途，用于制备一种药物组合物，所述药物组合物用于给予有需要的对象用于缓解或延迟对象肝纤维化发作，其中所述IL-20拮抗剂是抑制IL-20介导的信号转导途径的抗体。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗体是结合人IL-20的抗体。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述抗体是全长抗体或其抗原结合片段。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体mAb7E、其抗原结合片段或其功能性变体，所述功能性变体与mAb7E包含相同的互补决定区(CDR)。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述功能性变体是mAb7E的人源化抗体。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述人源化抗体包括：包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链可变区(VH)，以及包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗体是结合人IL-20受体亚单位R1的抗体，且所述结合人IL-20受体亚单位R1的抗体是与单克隆抗体mAb51D或mAb7GW或其功能性变体包含相同VH和VL链的抗体，其中所述功能性变体与mAb51D或mAb7GW包含相同的互补决定区(CDR)。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述抗体是全长抗体或其抗原结合片段。
10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体。
11.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述功能性变体是mAb51D或mAb7GW的人源化抗体。
12.如权利要求1-11任一项所述的用途，其特征在于，所述对象是患有或怀疑患有肝纤维化的人类患者。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述肝纤维化与慢性HBV感染、慢性HCV感染、酗酒、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、脂肪肝脏疾病或特发性肝脏疾病相关。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述脂肪肝脏疾病为非酒精性脂肪肝炎。
15.如权利要求1-11任一项所述的用途，其特征在于，所述对象是患有或怀疑患有肝硬化的人类患者。
16.如权利要求1-11任一项所述的用途，其特征在于，所述对象是患有或怀疑患有肝纤维化的人类患者。
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