KR20110039218A

KR20110039218A - 항－인간 인터루킨－２０ 항체

Info

Publication number: KR20110039218A
Application number: KR1020107029244A
Authority: KR
Inventors: 제스퍼 패스; 스브렌 오스터가드; 제스 쏜 클라우센
Original assignee: 노보 노르디스크 에이/에스
Priority date: 2008-06-30
Filing date: 2009-06-30
Publication date: 2011-04-15
Also published as: US20130039923A1; JP2011526591A; AU2009265808B2; EP2297203A1; ZA201008993B; MX2010013565A; US8287861B2; US20140141001A1; CN102137871A; WO2010000721A1; US20110091475A1; CA2728685A1; AU2009265808A1; RU2011101969A; BRPI0914916A2; TW201022288A; IL209717A0; US20140194599A1

Abstract

인간을 포함하는 하나 이상의 종에서 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체 모두의 IL20 매개 활성화를 감소시킬 수 있는 항-인간 IL20 단일클론 항체뿐만 아니라, 이런 항체로부터 설계하거나 얻을 수 있는 예를 들어, 항원-결합 항체 단편, 항체 유도체, 및 다중-특이성 분자와 같은 항원-결합 분자, 및 이런 항체 또는 다른 항원-결합 분자를 생산하는 방법을 기술한다. 이런 항체 또는 다른 항원-결합 분자는 자가 면역 또는 염증 질환 또는 장애를 포함하는 다양한 질병 및 장애의 치료에 사용할 수 있다.

Description

항－인간 인터루킨－２０ 항체{ANTI-HUMAN INTERLEUKIN-20 ANTIBODIES}

본 발명은 인간 단일클론 항-IL20 항체를 포함하는, 인간 인터루킨-20(IL-20)에 대한 항체뿐만 아니라 이의 생산 방법, 조성물 및 용도에 대한 것이다.

인터루킨-19(IL19), IL20, 및 인터루킨-24(IL24)는 인터루킨-10(IL10) 사이토카인 패밀리의 일원이다. 세 가지 인터루킨은 모두 IL20R1/IL20R2 이형 이중복합 수용체에 결합하여 신호를 전달한다. 또한, IL20 및 IL24(하지만 IL19는 아님)는 IL20R2 및 IL22R1로 구성된 수용체 복합체에 대한 리간드이다(Parrish-Novak et al., J Biol Chem 2002; 277: 47517-47523; Dumoutier et al., J Immunol 2001;167:3545-3549). 다른 IL10 패밀리 멤버와 함께, IL19 및 IL20은 적어도 IL19 및 IL20이 유사한 3-차원 구조를 가질 때, 나선형 사이토카인의 뚜렷한 서프패밀리를 형성하는 것으로 제시되었다(Chang et al., J Biol Chem 2003; 278: 3308-13).

IL20 및 그의 수용체는 건성 병변(Wei et al., Clin Immunol (2005) 117: 65-72; Rømer et al., J Invest Dermatol 2003; 121, 13061311; Wang et al., J Invest Dermatol 2006; 126: 1590-1599; Otkjær et al., Br J Dermatol 2005; 153: 911-918) 및 류마티스성 관절염 환자의 활액(Hsu et al., Arthritis Rheum 2006; 54: 2722-2733; Kragstrup et al., Cytokine 2008; 41: 16-2)에서 증가된 수준으로 존재한다. 그러므로 수용체 단편 또는 단일클론 항체를 사용하여 IL20 활성을 중화시키는 것은 다양한 염증 이상의 치료에 대한 장래성 있는 접근으로서 묘사되어 왔다(예를 들어, WO9927103, WO0146261, WO2003051384, WO2004085475, 및 WO2006086396). 예를 들면, 다중클론 항-IL20 항체가 건선의 이종 이식 모델에서 치료 상 효과적인 것을 발견하였다(Stenderup et al., Br J Dermatol 2006; 154: 11-35, Abstract P-12; Stenderup et al. Br J Dermatol 2009;160(2):284-96).

또한, 인간 IL20(hIL20)뿐만 아니라 hIL20에 결합하는 래트 또는 설치류 단일클론 항체의 항원성 에피토프가 기술되었다(예를 들어, WO2005052000, US20060142550, 및 WO2007081465). 그러나 환자 치료에 적절한 항체는 지금까지 제공되지 않았다. 본 발명은 이것들 및 당업계의 다른 요구를 설명한다.

발명의 개요

본 발명은 인간을 포함하는 하나 이상의 종에서 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 IL20-매개 활성화를 감소시킬 수 있는 항-hIL20 단일클론 항체를 제공한다. 전형적으로, 항체는 환자에게 투여하였을 때 항체에 대한 면역 반응의 위험을 최소화하기 위하여 전체적으로 인간의 것이거나 인간화된 것이다. 또한, 본 발명은 항-hIL20 항체를 고농도로 제형화할 수 있게 만드는, 개선된 가용성 성질을 갖는 항-hIL20 항체를 제공한다. 본 발명에서 기술한바, 예를 들어, 항원-결합 항체 단편, 항체 유도체, 및 다중-특이성 분자와 같은 다른 항원-결합 분자를 이런 항체로부터 설계하거나 얻을 수 있다.

또한, IL19에서 나선 E에 대응하는 hIL20 분자의 특정 조각에 결합하는 항체를 제공한다. 한 구체예에서, 항체의 에피토프는 성숙한 hIL20(서열번호 1)에서 D78-L93에 대응하는 조각에서 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어, H79, R83, S85, N90, F92, L93, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.

또한 본 발명의 어떤 항-hIL20 항체는 15D2 및 5B7을 포함하는 본 발명에서 기술한 하나 이상의 특정 인간 항-hIL20 항체로서 hIL20의 동일한 에피토프와 경쟁 및/또는 결합하거나 동일한 결합 경계면을 가질 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 알려진 항-IL20 항체보다 15D2 및/또는 5B7과의 경쟁에서 더욱 가능성이 있다.

다른 측면에서, 본 발명의 항체는 15D2 또는 5B7로서 하나 이상의 동일한 인간 V, D, 또는 J 조각으로부터 유래한 항원-결합 서열을 포함한다. 항체는 예를 들면, 본 발명에서 기술한 15D2 및/또는 5B7 항원-결합 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 하나 이상의 항원-결합 서열을 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산, 이런 핵산을 포함하는 발현 벡터, 이런 핵산을 포함하는 숙주 세포, 본 발명의 항체를 생산하는 숙주 세포, 적당한 조건 하에서 이런 숙주 세포를 배양하는 것에 의해 항-hIL20 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 이런 항체의 항체-결합 단편 및, 조작된 항체 단편, 항체 유도체, 이중 특이성 항체 및 다른 다중 특이성 분자를 포함하는 이런 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 분자를 제공한다. 또한, 이런 항체 또는 분자를 포함하는 약학적 조성물 및 키트 또는 다른 물건을 제공할 수 있다. 나아가, IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 IL20-매개 활성화를 감소시키거나 억제하는 방법 및, 이런 항체를 사용하여 류마티스성 관절염, 청소년 류마티스성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 자가 면역 또는 염증 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

도 1은 성숙한 hIL20(서열번호 1)의 아미노산 서열(a) 및, hIL20(서열번호 2), 인간 IL19(서열번호 3), 설치류 IL20(서열번호 4), 및 사이노몰구스 IL20(서열번호 5)의 전구체 형태의 정렬(b)을 보여준다. (a)에서, 15D2 및 5B7의 중요 에피토프 조각을 나타낸 진하게 표시한 잔기에 번호를 붙인 잔기는 IL19에서 나선 E와 일치한다. 진한 밑줄 친 잔기가 15D2 및 5B7 결합에 가장 중요한 것들인데 반해, 진한 이중 밑줄 친 잔기는 하고, 진하게 나타낸 잔기는 15D2 및/또는 5B7 결합에 매우 중요한 것으로 발견되었다. (b)에서, hIL20에서 밑줄 친 조각은 신호 서열이고, 다른 표시는 (a)와 동일하다.
도 2는 hIL19의 주형 1N1F.pdb로부터 화학적 연산 그룹의 분자 조작 환경(MOE) 소프트웨어를 사용하여 형성된 hIL20(IL19 명명법을 사용한)의 모델을 보여준다. 1N1F.pdb에서 hIL19/hIL20 서열 정렬 및 나선 지정을 사용하여, 또는 Corel Draw(Corel 법인)를 사용하여 생성하였다.
도 3은 15D2 중쇄 가변(VH) 부위(서열번호 6)(a), 5B7 VH 부위(서열번호 7)(b), 및 15D2/5B7 경쇄 가변(VL) 부위(서열번호 9)(c)의 분석, 및 보존(consensus) 서열(서열번호 8)에 따른 15D2 및 5B7 VH 부위의 정렬(d)을 나타낸다. 각 항체 서열은 각 아미노산 위치의 대응하는 카밧-넘버링을 보여주는, 대응하는 생식 계열 서열로 정렬한다. 각 서열에서, 카밧 도식에 따른 상응하는 상보성-결정 부위(CDR) 서열을 진한, 밑줄 친 텍스트로 나타낸다. VH1_03, D3-10, 및 JH6은 각각 서열번호 10, 12 및 14를 포함하는 서열과 상응하고, VKI_L18/JK4는 각각 서열번호 15 및 17을 포함하는 서열과 일치한다. D3-10, JH6, 및 JK4의 암호화 서열을 각각 서열번호 11, 13, 및 16에서 제공한다.
도 4는 각 아미노산 위치의 상응하는 카밧-넘버링을 갖는 IgG4 아이소타입의 몇몇 인간 항-IL20 항체의 VH(a) 및 VL(b) 부위 서열의 정렬을 보여준다. 각 서열에서 카밧 도식에 따른 상응하는 CDR 서열은 진한, 밑줄 친 텍스트로 나타낸다. (a) 2F6(서열번호 18), C3(서열번호 20), F18(서열번호 22), F56 및 F56/F18(서열번호 23), 5B7(서열번호 7), 및 15D2(서열번호 6)에 대한 중쇄 가변 서열, (b) 2F6(서열번호 19), C3(서열번호 21), F56_type 1, 15D2, 및 5B7(서열번호 9), 및 F56_type 2(서열번호 24)에 대한 경쇄 가변 서열.
도 5는 세 가지 다른 사이토카인 농도에서 hIL20R1/hIL20R2를 형질도입한 BaF-3 세포의 hIL20-(a), hIL19-(b), 및 hIL24-(c)에 의해 유도된 증식에 대한 억제 능력을 보여준다. (a) 투여량-의존적 반응은 hIL20-유도 증식의 억제에 대하여 검출하였다. hIL19-(b) 또는 hIL24-(c) 유도 증식의 억제는 사용한 15D2-농도 범위에서는 관찰되지 않았다(66 nM까지).
도 6은 15D2(a) 또는 5B7(b)에 대한 hIL20의 일차 펩티드 어레이의 결과를 보여준다. Y 축은 광학 밀도(OD, 형광 세기의 측정)를 가리킨다. 어떤 OD 값이 검출 한계보다 낮아서 모든 펩티드를 도면에 나타내지 않았음을 유념하라. (a)에서, 서열번호 1의 잔기 69-86(85), 73-90(86), 77-94(87), 81-98(88), 및 85-102(89)와 상응하는 펩티드를 나타내었다. 펩티드 87이 가장 높은 결합 활성을 갖는 펩티드로 나타났다. (b)에서, 잔기 49-66(19), 53-70(20), 57-74(21), 69-86(24), 73-90(25), 및 77-94(26)와 상응하는 펩티드를 나타냈다.
도 7은 15D2(a) 또는 5B7(b)에 대한 hIL20의 이차 펩티드 어레이 분석을 보여준다. 항체를 C- 및 N-말단으로부터 절단된 컨스트럭트에 대하여 실험하였다. 펩티드를 N-말단으로부터 발생하는 양전하를 막기 위해 모두 아세틸화하였다. (a)에서, 서열번호 1의 Y74 내지 K96→S86 및 K84와 상응하는 펩티드(각각 펩티드 1-12)를 왼쪽 컬럼에 보여주고, 서열번호 1의 Q75→I85 내지 K96과 상응하는 펩티드(각각 펩티드 13-24, 펩티드 22 및 23이 동일함)를 오른쪽 컬럼에 보여준다. (b)에서, 서열번호 1(각각 펩티드 1-12)의 Y74 내지 K96→S86 및 K84와 상응하는 펩티드를 왼쪽 컬럼에 보여주고, Q75→S84 내지 K96(각각 펩티드 13-24, 펩티드 22 및 23이 동일함)과 상응하는 펩티드를 오른쪽 컬럼에 보여준다.
도 8은 (a) 15D2 및 (b) 5B7에 대하여 서열번호 1의 잔기 Y74 내지 K96과 상응하는, 긴 에피토프 YQTPDHYTLRKISSLANSFLTIK의 Ala-scan을 보여준다. (a)에서, 나타낸 펩티드는 위치 78-96에서 알라닌 치환이 있는 서열번호 1의 잔기 78-96인, 펩티드 40-61과 각각 일치한다. (b)에서, 나타낸 펩티드는 위치 78-96에서 알리닌 치환이 있는 서열번호 1의 잔기 78-96인, 펩티드 1-22와 각각 일치한다.
도 9는 루시퍼라아제 분석에 의해 나타낸, 설치류 IL22R1/IL20R2 수용체의 설치류 IL20 활성화의 15D2 중화를 보여준다. 설치류 IL20 수용체 복합체 mIL20R1/mIL22R1은 BHK 세포로 형질도입시켰고, 10 nM의 설치류 IL20으로 자극하였다. 자극의 중화를 15D2의 1 마이크로그램/ml, 10 마이크로그램/ml 또는 50 마이크로그램/ml을 사용하여 조사하였다.
도 10은 루시퍼라아제 분석에 의해 나타낸, 인간 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체(a) 또는 사이노몰구스 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2(b)의 사이노몰구스 IL20 활성화의 15D2 중화를 보여준다.
도 11은 루시퍼라아제 분석에 의해 나타낸, 인간 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2의 인간 IL20-매개 활성화의 15D2 중화를 보여준다.
도 12는 15D2가 IL20의 가용성 형태에 결합하고, 수용체-결합 형태에는 결합하지 않는 것을 나타내는, IL19가 IL20-유도 증식의 15D2 차단을 복귀시키는 것을 보여주고, 이것은 수용체에 대한 IL19의 접근을 다른 방법으로 차단할 것이다.
도 13은 15D2 결합 경계면을 결정하기 위하여 아미드 수소/중수소 교환(HX)--질량 분석(MS) 실험에서 사용된 hIL20의 일차 서열을 보여준다. 일차 hIL20 서열(성숙한 Met-1 넘버링을 사용하여, 서열번호 1과 상응하는 잔기에서 +1 만큼 다름)은 상기 HX 분석 펩티드(수평 바로 표시)를 전시한다. 15D2의 존재 및 부재에서 모두 유사한 교환 패턴을 보이는 펩티드는 회색 바가 가리키고, 한편, 15D2 결합에서 감소된 중수소 통합을 보이는 펩티드는 검은색 바가 가리킨다.
도 14는 HX-MS 실험에서 개별 펩티드로부터 중수소 표지의 하위-위치를 보여준다. (a) IL20 일차 구조의 부위 60-93의 확대. 15D2의 존재 및 부재에서 모두 유사한 교환 패턴을 보이는 펩티드를 회색으로 색칠하고, 한편, 15D2 결합에서 감소된 중수소 통합을 보이는 펩티드는 검은색으로 색칠한다. 숫자는 15D2 결합에서 개별 IL20 부위에서 관찰된 중수소 수준의 차이를 가리킨다. (b) 펩티드로부터 나온 정보는 N-말단 및 첫 번째 결합 아미드의 완전한 오프-교환을 가정하는 단순 뺄셈에 의해 뻗은 작은 잔기에 서브-국지화되었다. 이후 중수소 수준을 91% 중수소를 함유하는 표지 반응에 대하여 정정하였고, 전체 잔기에 대한 백분율로 보고하였다.

정의

문맥에서 달리 언급하거나 부정하지 않는 한, 용어 "IL20" 또는 "IL-20"은 그것의 가공되지 않은 전구체(UniProt Q9NYY1; 서열번호 2), 성숙한 형태(서열번호 1, 잔기 1-24 신호 서열이 없는 UniProt Q9NYY1), 및/또는 예를 들어, 설치류 IL20(mIL20) 전구체(UniProt Q9JKV9; 서열번호 4), 또는 사이노몰구스 IL20(cIL20) 전구체(서열번호 5), 또는 이들의 성숙한 형태와 같은 전구체 hIL20(서열번호 2)에서 잔기 1-24와 상응하는 신호서열이 없는 이들의 자연-발생 변종 또는 오르쏘로그를 포함하는, Zcyto10라고도 알려진, 인간 인터루킨-20(hIL20)을 지칭한다.

본 발명의 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용하였고, 그리고 전장 단일 클론 항체, 다중 클론 항체 및 문맥에서 달리 언급하거나 부정하지 않는 한, 항원-결합 단편, 항체 변종, 및 이들의 다중 특이성 분자를 그들이 원하는 특이성 및/또는 생물학적 활성을 가지는 한 명확하게 포함한다. 보통, 전장 항체는 이황화 결합으로 서로 연결된 적어도 두 개의 중(H)쇄 및 두 개의 경(L)쇄 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 부위(본 발명에서 VH로 약기함) 및 중쇄 불변 부위로 구성된다. 중쇄 불변 부위는 세 가지 영역, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 부위(본 발명에서 VL로 약기함) 및 경쇄 불변 부위로 구성된다. 경쇄 불변 부위는 하나의 영역, CL로 구성된다. VH 및 VL 부위는 상보성 결정 부위(본 발명에서 CDR로 약기함)라고 불리는 과변이 부위 및 번역틀 부위(FR)라고 불리는 산재하는 보다 보존된 부위로 더 세분화된다. 각각의 VH 및 VL는 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 하기 순서로 정렬된 3 개의 CDR 및 네 개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 부위는 항원과 상호작용하는 결합 영역을 함유한다. 항체의 상산과 관련된 다양한 기술, 예를 들어, Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,(1988)을 본 발명에서 제공한다.

항체의 "항원-결합 단편"은 항원에 대한 결합을 검출할 수 있는 능력이 있는 전장 항체의 부분을 포함하는 분자이다. 항원-결합 단편은 기능적, 항원-결합 분자를 형성하기 위해 합성 링커에 의해 또는 재조합 방법에 의해 결합된, 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 다가 분자, 및 VL 및 VH 부위 또는 이들의 선택된 부분의 단일-사슬 컨스트럭트를 포함한다.

용어 "항체 유도체" 및 면역접합체"은 하나 이상의 아미노산이 예를 들어, 이차 분자에 항체를 연결하는, 예를 들어 알킬화, PEG화, 아실화, 에스테르 형성 또는 아미드 형성 등에 의해 화학적으로 변형된, 전장 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 포함하는 분자를 표시하기 위해 상호 교환적으로 사용하였다. 대표적인 변형은 PEG화, 시스테인-PEG화, 비오틴화, 방사성 동위 원소 표지 및 세포독성 제제와 같은 이차 제제와의 접합을 포함한다.

"다중 특이성 분자"는 적어도 두 개의 다른 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 분자를 생성하기 위하여 적어도 하나의 다른 기능적 분자(예를 들어 수용체에 대한 다른 항체 또는 리간드와 같은 다른 펩티드 또는 단백질)를 수반하거나 연결된 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편을 포함한다. 대표적인 다중 특이성 분자는 이중-특이성 항체 및 가용성 수용체 단편 또는 리간드와 연결된 항체를 포함한다.

본 발명에서 사용된바, 용어 "인간 항체"는 번역틀 및 CDR 부위 모두가 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 부위를 갖는 항체를 포함하는 것을 의도한다. 더욱이, 만약 항체가 불변 부위를 함유한다면, 불변 부위도 인간 면역글로불린 서열로부터 유래한다. 인간 생식계열 서열의 콜렉션은 예를 들어, NCBI 사이트에서 사용할 수 있다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 시험관 내 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된). 그러나, 본 발명에서 사용된바, 용어 "인간 항체"는 CDR 서열이 인간 번역틀 서열이 이식된 마우스와 같은 다른 포유 동물 종의 생식 계열로부터 유래한 항체를 포함하도록 의도하지 않는다.

"인간화" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소한의 서열을 함유하는 인간/비-인간 키메라 항체이다. 대부분에서, 인간화 항체는 수여자의 초-가변 부위로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 기능을 갖는 마우스, 래트, 토끼, 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 초가변 부위로부터의 잔기로 교체된 인간 면역글로불린(수여자 항체)이다. 어떤 보기에서, 인간 면역글로불린의 FR 잔기가 상응하는 비-인간 잔기("역-돌연변이")에 의해 교체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 공여자 항체에서 찾을 수 없는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더 정련하게 만든다. 일반적으로, 인간화 항체는 초가변 루프의 전체 또는 실질적으로 전체가 비-인간 면역글로불린의 그것과 상응하고, FR 잔기의 전체 또는 실질적으로 전체가 인간 면역글로불린 서열의 그것인 적어도 하나, 및 전형적으로 적어도 두 개의 가변 영역의 실질적인 전체를 포함할 것이다. 또한, 인간화 항체는 면역 글로불린 불변 부위(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 그것의 적어도 일부를 선택적으로 포함할 수 있다. 더욱 상세한 사항은 예를 들어, 문헌(Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329(1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992), WO 92/02190, 미국 특허 출원 20060073137, 및 미국 특허 6,750,325, 6,632,927, 6,639,055, 6,548,640, 6,407,213, 6,180,370, 6,054,297, 5,929,212, 5,895,205, 5,886,152, 5,877,293, 5,869,619, 5,821,337, 5,821,123, 5,770,196, 5,777,085, 5,766,886, 5,714,350, 5,693,762, 5,693,761, 5,530,101, 5,585,089, 및 5,225,539)을 참조하라.

본 발명에서 사용한 용어 "초가변 부위"는 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 부위는 경쇄 가변 영역에서 "상보성-결정 부위" 또는 "CDR"(잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 영역에서 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)로부터 나온 아미노산 잔기;(Kabat et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) 및/또는 경쇄 가변 영역에서 "초가변 루프"(잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3) 및 중쇄 가변 영역에서 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)에서 나온 이들 잔기; (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917) 및/또는 항체-항원 상호작용에서 가장 결정적인 잔기인 특이성-결정 잔기(SDR)(Kashmiri et al., Methods 2005;36:25-34)를 보통 포함한다. SDR은 예를 들어, 항체-항원 상호작용의 3D 구조적 분석을 사용하여, 또는 알려진 기술을 사용한 돌연변이 분석에 의해 결정할 수 있다. 전형적으로, 이 부위에서 아미노산 잔기의 넘버링은 앞의 카밧 et al.에서 기술한 방법에 의해 수행한다. 본 발명에서 "카밧 위치", "카밧에서와 같은 가변 영역 잔기 넘버링" 및 "카밧에 따라서"의 문구는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역에 대한 이 넘버링 시스템을 지칭한다. 카밧 넘버링 시스템을 사용하여, 펩티드의 실제 선형 아미노산 서열은 가변 영역의 FR 또는 CDR의 생략 또는 삽입에 상응하는 적은 또는 추가적 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 영역은 CDR H2의 잔기 52 이후에 단일 아미노산 삽입(잔기 52a 카밧에 따라서)을, 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기(예를 들어 잔기 82a, 82b, 및 82c, 등. 카밧에 따라서)를 포함할 수 있다. 잔기의 카밧 넘버링은 "표준" 카밧 번호 서열을 갖는 항체의 서열의 상동성 부위에서 정렬에 의해 주어진 항체에 대하여 결정할 수 있다( 도 3 및 4를 참조하라).

폴리펩티드의 "변종"은 참조 폴리펩티드, 전형적으로 천연 또는 "모"폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드 변종은 적어도 하나의 측면에서 모 폴리펩티드와 다른, 천연 아미노산 서열 내의 특정 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 소유할 수 있다.

용어 항체의 "에피토프" 또는 "항원성 결정자"는 어떤 항체가 결합하는 항원의 미리 결정된 부분이고, 아미노산의 화학적 활성 표면 그루핑 또는 당쇄로 일반적으로 구성된다. 단백질 에피토프를 결정하는 특정 아미노산은 상대적으로 소수일 수 있고, 전형적으로 항체에 대한 결합에 직접적으로 포함된 아미노산을 포함하지만, 항체가 결합했을 때 차단할 수 있다면, 항체에 대한 결합에서 직접적으로 포함되지 않더라도 다른 아미노산을 포함한다. 단백질 에피토프에서 아미노산은 서로 가까이 있거나, 항원의 길이를 따라서 널리 퍼져있을 수 있고, 접합에 의해 정확한 에피토프 형태를 가져올 수 있다. "형태적 에피토프"는 정확하게 접혔을 때 미리 결정된 항원에 의존하는 에피토프를 지칭하는데 반해, "선형 에피토프"는 정확하게 접히지 않았을 때, 예를 들어 변성된 형태 또는 에피토프를 포함하는 단편의 형태에서도 항체에 의해 인지될 수 있다.

본 발명에서 사용된바 "특이적 결합"은 예를 들어 IL20과 같은 미리 결정된 항원에 결합하기 위한 항체의 능력을 지칭한다. 전형적으로 항체는 10^-8 또는 그 미만의 해리 상수(Kd)로 결합하고, 미리 결정된 항원 또는 가까이 관련된 분자(예를 들어, 오르쏘로그)를 제외한 비-특이적 항원(예를 들어, BSA)에 결합하는 그의 Kd보다 적어도 2-배인 Kd로 미리 결정된 항원에 결합한다.

두 개의 아미노산 서열의 문맥에서 용어 "실질적으로 동일한"은 적어도 대략 50, 적어도 대략 60, 적어도 대략 70, 적어도 대략 80, 적어도 대략 90, 적어도 대략 95, 적어도 대략 98, 또는 적어도 대략 99 퍼센트 서열 동일성을 공유하는 디폴트 갭 무게를 사용한 프로그램 GAP 또는 BEST-FIT에 의해서와 같이, 최적으로 정렬되었을 때의 서열을 의미한다.

두 개의 실질적으로 동일한 아미노산 서열에서 "상응하는" 아미노산 위치는 본 발명에서 지칭한 임의의 단백질 분석 소프트웨어에 의해, 전형적으로 디폴트 매개변수를 사용하여 정렬된 것들이다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적으로 관련되게 위치할 때, "작동가능하게 연결된"다. 예를 들면, 폴리펩티드의 분비에 참가하는 전-단백질로서 발현될 때, 전-서열 또는 분비 리더에 대한 DNA가 폴리펩티드에 대하여 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 줄 때, 암호화 서열에 작동 가능하게 연결되고; 또는 번역을 용이하게 하도록 위치할 때, 리보좀-결합 부위가 암호화 서열과 작동가능하게 연결된다. 보통, "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우, 인접하고, 선도 상(reading phase)에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해야만 하는 것은 아니다. 연결은 편리한 제한효소 부위에서 리게이션에 의해 성취할 수 있다. 만약 이런 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 고전적 실행에 따라 사용한다.

"분리된" 분자는 그것이 속한 분자의 클래스에 있어서 찾을 수 있는 조성물에서 우세한 종인 분자이다(즉, 그것은 조성물에서 분자의 타입의 적어도 대략 50%를 구성하고, 전형적으로 조성물에서 분자의 종의 적어도 대략 70%, 적어도 대략 80%, 적어도 대략 85%, 적어도 대략 90%, 적어도 대략 95%, 또는 그 이상을 구성할 것이다). 대개, 항체 분자의 조성물은 조성물에서 모든 존재하는 펩티드 종의 문맥에서 항체 분자에 대하여, 또는 제시한 용도의 문맥에서 적어도 실질적으로 활성인 펩티드 종에 대하여 98%, 98%, 또는 99% 균질하게 존재할 것이다.

본 발명의 문맥에서, "치료" 또는 "치료하는 것"은 문맥을 거스르지 않는 한, 하나 이상의 징후 또는 임상적으로 적절한 표명을 예방, 경감, 처리, 치료 또는 감소시키는 것을 지칭한다. 예를 들면, 질병 또는 장애의 징후나 임상적으로 적절한 표명이 확인되지 않는 환자의 "치료"는 예방법 또는 예방적 치료이므로, 질병 또는 장애의 징후 또는 임상적으로 적절한 표명을 확인한 환자는 보통 예방법 또는 예방적 치료를 구성하지 않는다.

문맥에서 달리 표현하게 가리키거나 명확히 반대하지 않는 한, 본 발명에서 용어 "또는"은 "및/또는"의 의미를 포함하여 사용한다.

수용체 또는 수용체 복합체의 "활성화"는 대조군과 비교하여 정상의 생리학적 조건 또는 병리 생리학적 조건 하에서 리간드가 수용체 또는 수용체 복합체에 결합한 다음 수용체 또는 수용체 복합체와 관련된 어떤 또는 모든 세포 내 신호전달 경로의 증가된 또는 감소된 활성을 의미한다. IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 경우, 수용체 활성화는 예를 들어, 실시예 9에서 기술한 하나와 유사한 루시퍼라아제 분석을 사용하여 분석할 수 있다. 수용체 또는 수용체 복합체의 "활성화를 감소시키는 것"은 수용체의 활성화를 대조군(예를 들어, 항체의 부재시 활성화의 수준)과 비교하여 적어도 대략 10%, 바람직하게는 적어도 대략 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 대략 30%, 가장 바람직하게는 적어도 대략 50%, 또는 그 이상 감소하는 것을 의미한다.

본 발명에서 기술한 항체 또는 다른 항원-결합 분자를 평가하기 위한 어떤 분석은 하나 이상의 "대조군"을 사용한다. "대조군"은 교과서에서 검색한 표준 값; 리간드(예를 들어, IL20), 수용체(예를 들어, IL20R1/IL20R2 및/또는 IL22R1/IL20R2), 또는 항체 없이 동일한 분석을 수행함으로써 얻은 값; 또는 비-특이적 분자(예를 들어, 비-특이적 항체)의 존재에서; 또는 당업계에서 사용하는 어떤 다른 참조 값일 수 있다. 수용체 활성화 분석 실험, 예를 들면, 수용체 복합체의 활성화를 감소시키기 위한 항체의 능력의 경우에서, 적절한 대조군 값은 항체의 부재 또는, 리간드, 수용체 복합체에 특이적으로 결합하지 않는 항체, 또는 수용체 활성화에 포함된 다른 구성 요소의 존재 하에서 수행한 분석에 의해 얻을 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 약학적 제형, 진단 용도 및 치료 용도에 적절한 인간 항-IL20 항체를 제공한다. 실시예에서 기술한바, 신규한 에피토프를 15D2 및 5B7로 지정된 두 개의 인간 항-IL20 항체에 대하여 확인하였다. 중요 에피토프 잔기를 hIL19에서 나선 E에 상응하는 hIL20의 부위에 대하여 맵핑하였다(Chang et al., J Biol Chem 2003; 278: 3308-13). 성숙한 hIL20 서열(서열번호 1)에서 잔기 D78 내지 H103에 상응하는 나선 E를 갖는, hIL19 명명법을 사용한 hIL20의 예측된 모델은 도 1에서 보여준다. 신규한 hIL20 에피토프에 결합하는 항체가 증식 분석에서 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체의 hIL20-매개 활성화를 모두 감소시키고, IL20-매개 수용체 활성화는 감소시키지만 IL19- 또는 IL24-매개 수용체 활성화는 감소시키지 않는 것을 발견하였다. 나아가, 에피토프는 hIL20 항원의 천연 및 변성 형태 모두뿐만 아니라 설치류 및 사이노몰구스 IL20에도 모두 존재하는 것을 발견했다. 또한, 15D2 및 5B7은 모두 적어도 대략 80 mg/ml의 농도에서 가용성이고, 인간 생식계열 유전자의 동일한 세트로부터 유래하는 것을 찾았다(실시예 3 및 도 3).

따라서 본 발명은 하나 이상의 기능적 성질, 하나 이상의 구조적 특성을 화합한 항체, 및/또는 다음 단락 및 실시예에서 기술한 하나 이상의 구조적 특성을 갖는 하나 이상의 기능을 화합한 항체를 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 hIL20, 또한, 추가적으로 하나 이상의 hIL20 오르쏘로그에 결합하고, 특이적으로 hIL20R1/hIL20R2 및 hIL22R1/hIL20R2 수용체 복합체 및/또는 그들의 오르쏘로그 모두의 hIL20 매개 활성화를 감소시키고, 및/또는 높은 가용성을 갖는 단일클론 인간 또는 인간화 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편과 같은 항체를 제공한다. 한 구체예에서, 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 부위 서열은 15D2 및 5B7 생식계열 및/또는 V, D, 또는 J 조각의 하나 이상으로부터 유래한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체의 CDR 및/또는 가변 서열은 15D2 및/또는 5B7의 하나 이상의 항원-결합 서열과 실질적으로 동일하다. 한 구체예에서, hIL20 서열(서열번호 1)에서 H79 내지 H103 조각의 하나 이상의 잔기와 상호작용하는 항체는 예를 들면, H79, R83, S85, N90, F91, L92, 또는 이들의 조합과 결합할 수 있다. 항체는 치료 용도에 적합한 임의의 형태, 예를 들어, 전장 항체 또는 이의 단편에 있을 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 VH1_03, D3-10, 및 JH6 유전자를 포함하는 인간 유전자의 세트로부터 유래한 중쇄 가변 부위를 포함하는 분리된 항-hIL20 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 부위는 카밧 잔기 50-65, 95-102, 및 31-35에 각각 상응하는 CDR2 및 CDR3 서열, 및, 선택적으로, 서열번호 8의 CDR1 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 부위는 VKI_L18 및 JK4 유전자를 포함하는 인간 유전자의 세트로부터 유래한 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 경쇄 가변 부위는 서열번호 9의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 부위는 서열번호 6 또는 서열번호 7의 서열을 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 항체는 IgG4 아이소타입이다.

한 측면에서, 본 발명은 hIL20에 결합하고, (a) IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 IL20-매개 활성화를 감소시키는 것; (b) 재조합적으로 IL20R1/IL20R2를 발현하는 BaF-3 세포의 IL20-매개 증식을 감소시키는 것; (c) 재조합적으로 IL20R1/IL20R2를 발현하는 BaF-3 세포의 IL19- 또는 IL24-매개 증식을 감소시키지 않는 것; (d) 대략 1 nM 또는 그 미만의 KD로 hIL20에 결합하는 것; 그리고 (e) 선택적으로 150 mM NaCl을 포함하는 대략 pH 7.4의 수성 완충액에서 적어도 대략 80 mg/ml의 용해도를 갖는 것으로부터 선택되는 하나 이상의 기능적 성질을 갖는, 인간 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 구체예에서, 항체는 특성(a) 내지 (d)를 갖는다. 한 구체예에서, 항체는 특성 (a) 내지 (e) 모두를 갖는다. 한 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 9를 포함하는 경쇄 가변 부위 및 서열번호 6 또는 서열번호 7을 포함하는 중쇄 가변 부위를 포함하는 항체와 hIL20에 대한 결합에서 경쟁한다. 한 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 성숙한 hIK20의 H79-H103(서열번호 1)으로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합한다. 한 구체예에서, 에피토프는 H79-L93로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기를 포함한다. 한 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 6 또는 서열번호 7의 카밧 잔기 31-35, 50-65, 및 95-102를 각각 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 부위를 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 서열번호 9의 카밧 잔기 24-34, 50-56 및 89-97을 각각 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 부위를 더 포함한다. 한 구체예에서, 항체 중쇄 및 경쇄 가변 서열은 예를 들어, 적어도 대략 80%, 적어도 대략 90%, 또는 적어도 대략 95%의 서열 동일성을 갖는 15D2 및/또는 5B7의 저마다의 중쇄 및 경쇄 가변 서열과 실질적으로 동일하다. 특정 구체예에서, 항체 IgG4 아이소타입이다.

한 측면에서, 본 발명은 약학적 조성물에서 용도에 대하여 충분한 가용성인 이런 인간 항-hIL20 항체를 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명은 예를 들어, 본 발명의 항체의 적어도 대략 80 mg/ml 또는 적어도 대략 100 mg/ml의 농도의 효과량, 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 한 구체예에서, 항체는 IgG4 아이소타입이고, VH1_03, D3-10, 및 JH6 유전자를 포함하는 인간 유전자의 세트로부터 유래한 중쇄 가변 부위 및/또는 VKI_L18 및 JK4 유전자를 포함하는 인간 유전자의 세트로부터 유래한 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함한다. 한 특정 구체예에서, 경쇄 가변 부위는 서열번호 9의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 부위는 서열번호 6의 서열을 포함한다. 한 특정 구체예에서, 경쇄 가변 부위는 서열번호 9의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 부위는 서열번호 7의 서열을 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 또는 약학적 조성물을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 염증 또는 자가 면역 장애의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 또는 약학적 조성물을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 염증 또는 자가 면역 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 또는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 또는 약학적 조성물을 투여하는 것에 의해 염증 또는 자가 면역 장애를 앓고 있거나, 위험이 있는 개체의 치료 방법을 제공한다.

이런 용도에 적절한 염증 또는 자가 면역 장애는 류마티스성 관절염, 청소년 류마티스성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 전신성 홍반성 루푸스, 또는 루푸스 신염, 또는 이들의 임의의 조합뿐만 아니라, 이들 질병의 공존이환, 상기 공존 이환의 제한 없는 예시가 될 심혈관 질환을 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 적절한 조건 하에서 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항체 또는 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항-IL20 항체 또는 항원-결합 단편을 재조합적으로 생산하는 방법을 제공한다. 숙주 세포는 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함한다.

hIL20에 특이적으로 결합하거나, 이들 성질 중 일부 또는 전부를 갖는 항체, 항원-결합 단편, 또는 다른 분자 생산, 특징화, 및 용도는 하기 단락에서 더욱 상세히 기술한다.

항-IL20 항체

본 발명의 항체는 항체의 특정 기능적 및/또는 구조적 특성 및 성질에 의해 특징지어졌다. 항-IL20 항체의 기능적 활성을 평가하기 위한 분석은 독립적인 단락 및 실시예에서 상세하게 기술하고, 예를 들어, 아미노산 서열과 같은 구조적 특성은 하기에서 기술한다.

기능적 성질

본 발명의 항체는 hIL20에 특이적으로 결합한다. 항체는 바람직하게는 높은 친화도, 예를 들면 10^-7 M 또는 그 미만의 KD, 10^-8 M 또는 그 미만의 KD, 1 nM 또는 그 미만의 KD, 대략 0.3 nM 또는 그 미만의 KD, 또는 대략 0.2 nM 또는 그 미만의 KD, 또는 대략 0.1 nM 또는 그 미만의 KD로 hIL20에 결합한다. 아세트산 나트륨 버퍼에서 재조합적으로 생산된 항-IL20 항체는 예를 들면, 재조합 hIL20과 Biacore 분석에서 대략 0.1 nM 또는 그 미만의 친화도, 선택적으로 대략 0.01-0.05 nM의 친화도로 결합할 수 있다(예를 들어, 실시예 12를 참조하라). 선택적으로, 항체는 마우스(예를 들어, mus musculus) 및/또는 사이노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis)를 포함하는 하나 이상의 비-인간 포유류로부터 나온 IL20에 직접적으로 결합할 수 있다(예를 들어, 실시예 2를 참조하라). 더욱이, 본 발명의 항체는 시험관 내 및/또는 생체 내에서 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 IL20-매개 활성화를 감소시키는 능력이 있다. 이것은 본 발명에서 기술하거나(예를 들어, 실시예 1, 2, 및 9-11을 참조하라) 당업계에 알려진 하나 이상의 분석에서 실험할 수 있다. 적절한 분석을 사용하여, 본 발명의 항체는 대조군(예를 들어, 임의의 항-hIL20 항체의 부재시)과 비교하여 인간 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 hIL20-매개 활성화를 적어도 대략 10%, 더욱 바람직하게는 적어도 20%, 한층 더욱 바람직하게는 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 60% 감소시킬 수 있다. 나아가 항체는 상응하는 리간드 및 수용체 복합체 오르쏘로그를 사용하여 마우스 및 사이노몰구스 원숭이와 같은 다른 종에서 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 IL20-매개 활성화를 감소시킬 수 있다(실시예 9를 참조하라).

본 발명의 항체는 재조합적으로 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2를 발현하는 BaF-3 세포의 IL20-매개 증식을 감소시키지만, 전형적으로 IL19- 및/또는 IL24-유도 증식에서는 유의한 효과가 없다(예를 들어, 실시예 2를 참조하라). 이런 분석에서, 본 발명의 항체는 증식을 대략 50 μM 또는 그 미만, 대략 5 μM 또는 그 미만, 대략 1 μM 또는 그 미만, 대략 0.5 μM 또는 그 미만, 대략 0.1 μM 또는 그 미만, 대략 0.05 μM 또는 그 미만, 또는 대략 0.02 μM 또는 그 미만의 EC50으로 감소시킨다. 예를 들면, 실시예 10에서 기술한 증식 분석에서, 재조합적으로 생산된 인간 항체 15D2는 0.02 μM 미만의 EC50을 가졌다.

본 발명의 항-IL20 항체는 임의의 기작에 의해 또는 다른 기작의 조합에 의해 hIL20-매개 수용체 복합체 활성화를 억제할 수 있다. 전형적으로, 항-hIL20 항체는 세포-관련 hIL20 수용체 또는 완전히 형성된 수용체 복합체에 결합하는 hIL20을 감소시키거나 막을 수 있다. 추가적으로 또는 선택적으로, 본 발명의 항체는 세포-관련 hIL20 단일-사슬 수용체 분자에 결합할 수 있지만, 수용체 복합체의 형성은 막지 않는다. 추가적으로 또는 선택적으로, 본 발명의 항체는 세포-관련 hIL20 단일-사슬 수용체 분자 및 완전히 형성된 수용체 복합체에 결합할 수 있지만, 수용체 복합체 활성화에 필요한 구조적 변화를 감소시키거나 억제하지 않는다. 어떤 하나 이상의 기작이 포함되어 있는지는 예를 들어, 어떤 항체가 hIL20이 존재할 때 인간 IL20R1, IL20R2, IL22R1 수용체 분자, 또는 IL20R1/IL20R2 및/또는 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체를 발현하는 세포와 회합하는지 실험하는 것에 의해 확인할 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는 hIL20R2에 대한 hIL20의 결합을 감소시킨다. 다른 특정 구체예에서, 항체는 적어도 하나의 인간 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 결합을 감소시키지 않는다. 본 발명의 특정 항체는 적어도 부분적으로 겹치거나, 선택적으로 D78을 제외한 IL19에서 나선 E에 상응하는 적어도 하나의 잔기를 포함하는 hIL20 에피토프에 결합한다. 학설에 제한되지 않고, 이 조각은 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2의 결합 및/또는 활성화에 포함된 IL20에서의 나선형 구조를 포함하거나 일부일 수 있다. hIL20의 모델을 위하여, hIL20-hIL19 서열 정렬 및 구조적 IL19 정보를 사용하여 구축하였고, 도 2를 참조하라. hIL20 서열에서, 이 조각은 성숙한 hIL20(서열번호 1)의 잔기 D78-H103을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 따라서 성숙한 hIL20(서열번호 1)의 D78-H103로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합한다. 특이적이고 구별된 다른 구체예에서, 에피토프는 D78-H103 조각에서 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 잔기를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 성숙한 hIL20에서 잔기 D78-K96 또는 H79-K96에 상응하는 조각에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 잔기를 포함하는 항체 결합 에피토프를 제공한다. 이 조각은 항-IL20 항체 5B7의 더 높은 친화도를 제공하는 에피토프를 함유한다. 항체는 15D2 에피토프의 중요 잔기를 함유하는 잔기 D78-L93에 상응하는 조각에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 잔기를 포함하는 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있다. 예를 들면, 항체는 H79-L93로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 항체는 5B7 에피토프의 중요 잔기를 함유하는 잔기 H79-N90에 상응하는 조각에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 잔기를 포함하는 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있다. 특이적이고 구별된 구체예에서, 에피토프의 모든 중요 잔기는 선택적으로 D78을 제외하고, 잔기 D78-H103, D78-K96, D78-L93, 또는 D78-N90에 상응하는 조각에 있다.

다른 측면에서, 항체는 성숙한 IL20에서 잔기 H79, R83, S85, N90, F91, 및 L92의 적어도 하나를 포함하는 에피토프에 결합한다. 특이적이고 구별된 구체예에서, 항체는 D78, H79, R83, S85, N90, F91, 및 L92의 2, 3, 4, 5, 6개, 또는 전체에 결합한다. 다른 구체예에서, 에피토프는 적어도 잔기 H79 및 N90을 포함한다. 추가적 구체예에서, 에피토프는 잔기 R83을 더 포함한다. 또 다른 구체예에서, 에피토프는 D78, S85, F91, 및 L92의 1, 2, 3개, 또는 전체를 더 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 하기에서 기술한, 5B7 또는 15D2 중 하나의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체로서 hIL20 위의 동일한 에피토프와 경쟁 및/또는 결합하는 항체를 제공한다. 따라서 이런 항체는 서열번호 9를 포함하는 경쇄 가변 부위 및 서열번호 6 또는 서열번호 7을 포함하는 중쇄 가변 부위를 포함하는 항체와 hIL20에 대한 결합에서 경쟁한다. 이런 항체는 본 발명에서 기술한바 표준 hIL20 결합 분석에서 15D2 및/또는 5B7과 경쟁하는 그들의 능력에 기반을 두고 확인할 수 있다(예를 들어, 하기 실시예 4 또는 "결합 분석"로 표제를 붙인 단락을 참조하라). hIL20에 대한 15D2 및/또는 5B7의 결합을 감소 또는 억제시키는 시험 항체의 능력은 hIL20에 대한 결합을 위해 15D2 및/또는 5B7과 경쟁할 수 있고, 따라서 15D2 및/또는 5B7과 같이 동일한 hIL20 조각 또는 에피토프에 결합할 수 있음을 증명한다. 바람직한 구체예에서, 5B7 및/또는 15D2와 같이 hIL20의 동일한 조각 또는 에피토프에 결합하는 항체는 인간 단일클론 항체이다. 본 발명에서 기술한바, 이런 인간 단일클론 항체는 당업계에서 알려진 방법에 따라 준비 및 분리할 수 있다.

특정 구체예에서, 항체는 WO2005052000(262.4.1.2.2.1, 262.5.1.6.4.4, 및 262.7.1.3.2.4)에서 기술한 임의의 래트 항체에 의해, 및/또는 US20060142550 및 WO2007081465에서 기술한 설치류 항체(7E)에 의해 결합된 것들에 비하여 다른 hIL20 조각 또는 에피토프에 결합하고, 나열한 마우스 또는 래트 항체 중 하나보다 hIL20에 대한 결합에서 15D2 및/또는 5B7과 더 경쟁한다. 다른 특정 구체예에서, 항체는 IL20 전구체(서열번호 2)의 잔기 42-102에 상응하는 조각에 결합하지 않는 인간 항체이다.

상술한 기능적 특징, 실시예에서 기술한 다른 기능적 특징, 및/또는 하기 단락에서 기술하는 구조적 특징의 임의의 조합은 본 발명의 항체에 의해 나타낼 수 있다.

구조적 특성

한 측면에서, 본 발명은 적어도 대략 50 mg/ml, 적어도 대략 60 mg/ml, 적어도 대략 70 mg/ml, 적어도 대략 80 mg/ml, 적어도 대략 90 mg/ml, 또는 적어도 대략 100 mg/ml의 농도의 수성 제형에서 형성되기에 적절한 안정성 및/또는 가용성 특징을 갖는 인간 항-IL20 항체를 제공하고, 수성 제형은 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 또는 담체를 더 포함할 수 있고, 전형적으로 중성 또는 생리학적 pH와 가까운 pH를 갖는다. 한 구체예에서, 항-IL20 항체는 선택적으로 20 mM 인산 나트륨 버퍼 및 150 mM NaCl을 포함하고 대략 7.4의 pH를 갖는 수성 제형에서 적어도 80 mg/ml의 용해도를 갖는다. 한 구체예에서, 항-IL20 항체는 선택적으로 20 mM 인산 나트륨 버퍼 및 150 mM NaCl을 포함하고 대략 7.4의 pH를 갖는 수성 제형에서 적어도 100 mg/ml의 용해도를 갖는다. 어떤 생식계열 서열로부터 유래한 인간 항-IL20 항체가 다른 것들보다 더욱 가용성이고, 그것에 의하여 수성 용액에서 더 높은 농도를 달성할 수 있음을 이제 발견하였다(예를 들어, 실시예 3을 참조하라). 이런 구체예는 하기에서 더욱 상세하게 기술한다.

바람직한 본 발명의 항체는 본 발명에서 기술한바 15D2 또는 5B7로 특징지어진 인간 단일클론 항체를 포함한다. 이들 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 CDR 서열은 하기 및 도 3에 제공한다.

15D2(서열번호 6)의 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호 6의 카밧 잔기 31-35(CDR1), 50-65(CDR2) 및 95-102(CDR3)에 상응하는 하기 CDR을 함유한다:

VH CDR1: NDIIH

VH CDR2: WINAGYGNTQYSQNFQD

VH CDR3: EPLWFGESSPHDYYGMDV

5B7(서열번호 7)의 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호 7의 카밧 잔기 31-35(CDR1), 50-65(CDR2) 및 95-102(CDR3)에 상응하는 하기 CDR을 함유한다:

VH CDR1: SHIMH

VH CDR2: WINAGYGNTKYSQNFQD

VH CDR3: EPLWFGELSPHDYYGMDV

15D2 및 5B7(서열번호 9)의 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호 9의 카밧 잔기 24-34(CDR1), 50-56(CDR2) 및 89-97(CDR3)에 상응하는 하기 CDR을 함유한다:

VL CDR1: RASQGISSALA

VL CDR2: DASSLES

VL CDR3: QQFNSYPLT

IL20, VH CDR 서열 모두에 결합하는 15D2 및 5B7이 본 발명의 다른 항-hIL20 결합 분자를 도출하기 위하여 "혼합 및 조화"될 수 있음이 주어졌다. 이런 "혼합 및 조화"된 항체의 hIL20-결합은 본 발명에서 기술한(예를 들어 유세포 분석, Biacore, ELISA) 결합 분석을 사용 및/또는 본 발명에서 기술한바 수용체-활성화 분석을 사용하여 시험할 수 있다. 따라서 본 발명은 15D2 또는 5B7의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3, 또는 이들의 조합을 포함하는 항체를 제공한다. CDR 부위는 카밧 시스템을 사용하여 묘사하였다(도 3). 이들 항체의 각각은 에피토프와 실질적으로 겹치는 hIL20과 결합할 수 있고, 이 항원-결합 특이성은 본 발명의 다른 항-hIL20 결합 분자를 도출하기 위한 "혼합 및 조화"(즉, 각각의 항체가 VH CDR1, 2 및 3 및 VL CDR1, 2 및 3을 함유할 수 있을지라도, 다른 항체로부터 나온 VH CDR이 혼합 및 조화될 수 있음)될 수 있는 CDR1, 2 및 3 부위, VH CDR1, 2 및 3 서열에 의해 우선 제공된다. 15D2 및 5B7 VH CDR는 상당한 구조적 유사성을 공유하고, 그러므로 혼합 및 조화할 수 있다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 (a) 5B7 또는 15D2로부터 나온 VH CDR1, (b) 5B7 또는 15D2로부터 나온 VH CDR2, 및 (c) 서열번호 9의 VL CDR을 포함하는 VL 서열과 선택적으로 결합된, 5B7 또는 15D2로부터 나온 VH CDR3을 포함하는 분리된 단일클론 항체를 제공한다. 또한, 이것은 하기에 대하여 보존적 VH CDR을 사용하여 설명할 수 있다.

5B7/15D2의 보존적 가변 중쇄 영역은 각각 서열번호 8의 카밧 잔기 31-35(CDR1), 50-65(CDR2) 및 95-102(CDR3)에 상응하는 하기 CDR을 함유한다(임의의 아미노산, 바람직하게는 하기에 나열된 것들 또는 그들의 보존적 치환을 제시하는 X와 함께):

VH CDR1: X2X3IX4H(X2: N 또는 S; X3: D 또는 H; X4: I 또는 M, 또는 그들의 임의의 보존적 치환)

VH CDR2: WINAGYGNTX5YSQNFQD(X5는 K, Q, 또는 그들의 임의의 보존적 치환이다)

VH CDR3: EPLWFGEX7SPHDYYGMDV(X7은 S, L, 또는 그들의 임의의 보존적 치환이다),

여기서 X2- X5 및 X7은 각각 서열번호 8의 잔기 31, 32, 34, 59, 및 106에 상응한다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 8의, CDR1과 선택적으로 결합된 중쇄 가변 부위 CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체를 제공한다. 한 구체예에서, 항체는 서열번호 8의 서열을 포함한다. 한 측면에서, 항체는 서열번호 6의, 선택적으로 CDR 1과 결합된 중쇄 가변 부위 CDR2 및 CDR3을 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 서열번호 6을 포함한다. 한 측면에서, 항체는 서열번호 7의, 선택적으로 CDR 1과 결합된 중쇄 가변 부위 CDR2 및 CDR3을 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 서열번호 7을 포함한다. 이들의 임의의 측면 또는 구체예에서, 항체는 서열번호 9의 경쇄 가변부위 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 전체 서열을 선택적으로 더 포함할 수 있다.

어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 특정 생식계열 중쇄 면역 글로불린 유전자, 또는 특정 생식계열 중쇄 면역글로불린 유전자의 조합으로부터 나온 VH 부위; 및/또는 특정 생식계열 경쇄 면역글로불린 유전자, 또는 특정 생식계열 경쇄 면역글로불린 유전자의 조합으로부터 나온 VL 부위를 포함한다.

예를 들면, 한 구체예에서, 본 발명은 VH1_03, D3-10, 및 JH6 유전자를 포함하는 인간 유전자의 세트로부터 유래한 중쇄 가변 부위를 포함하는 분리된 항-hIL20 항체를 제공한다. 중쇄 가변 부위는 예를 들면, 각각 카밧 잔기 50-65, 95-102, 및 31-35에 상응하는, 서열번호 8의 CDR2 및 CDR 3 영역, 그리고 선택적으로 CDR1 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 항체는 VKI_L18 및 JK4 유전자를 포함하는 인간 유전자의 세트로부터 유래한 경쇄 가변 부위를 더 포함한다. 경쇄 가변 부위는 예를 들면, 서열번호 9의 CDR1-CDR3 서열을 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명은 (a) 인간 D3-10 유전자 및 JH6 유전자로 재조합된 인간 VH1_03 유전자로부터 유래한 VH 영역을 포함하고, (b) 인간 JK4 유전자로 재조합된 인간 VKI_L18 유전자로부터 유래한 VL 영역을 포함하며, (c) hIL20에 특이적으로 결합하는 항체인, 분리된 항-hIL20 단일클론 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편을 제공한다. 예를 들면, 항체는 서열번호 9의 경쇄 가변 영역 및 서열번호 6 또는 서열번호 7의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용된바, 항체의 가변 부위가 인간 생식계열 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 얻어진 경우, 인간 항체는 특정 생식계열 서열의 "중쇄 또는 경쇄 가변 부위" 또는 "로부터 유래한" 또는 "의 산물"을 포함한다. 이런 시스템은 관심있는 항원으로 인간 면역글로불린 유전자를 갖는 형질전환 마우스를 면역화시키는 것 또는 관심있는 항원으로 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리가 제시된 파지를 스크리닝 하는 것을 포함한다. 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열"의" 또는 "로부터 유래한" 또는 "의 산물"이 인간 생식계열 면역글로불린의 아미노산 서열에 대한 인간 항체의 아미노산 서열을 비교하는 것 및 인간 항체의 서열에 대하여 가장 가까운 서열인 인간 생식계열 면역글로불린 서열(즉, 가장 큰 % 동일성)을 선택하는 것에 의한 것으로서 확인할 수 있다. 인간 항체는 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열"의" 또는 "로부터 유래한" 또는 "의 산물"은 생식계열 서열과 비교하여 예를 들면, 자연-발생 체세포 돌연변이 또는 부위-특이적 돌연변이 유발의 고의적 도입에 기인하는 아미노산 차이를 함유할 수 있는 것이다.

그러나 선택된 인간 항체는 전형적으로 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열에서 적어도 90% 동일하고, 다른 종(예를 들어, 설치류 생식계열 서열)의 생식계열 면역글로불린 아미노산 서열과 비교하였을 때, 인간의 것과 같은 인간항체를 확인하는 아미노산 잔기를 함유한다. 어떤 경우에서, 인간 항체 가변 서열은 재조합된 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열에 대하여 아미노산 서열에서 적어도 95%, 또는 한층 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.

전형적으로, 특정 인간 생식계열 서열로부터 유래한 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열로부터 단지 10개 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 어떤 경우에서, 인간 항체는 재조합된 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열로부터 단지 8개, 단지 5개, 또는 단지 4,3,2 또는 1개 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 본 발명에서 기술한 바람직한 15D2 및 5B7의 아미노산 서열과 일치하거나 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 부위를 포함하고, 항체는 본 발명의 항-hIL20 항체의 원하는 기능적 성질을 유지한다. 예를 들면, 본 발명은 (a) VH 영역은 서열번호 6, 7, 및 8로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (b) VL 부위는 서열번호 9와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 (c) 항체는 hIL20에 특이적으로 결합하고, 본 발명에서 기술한 기능적 성질 중 적어도 하나, 바람직하게는 본 발명에서 기술한 기능적 성질의 몇몇을 나타내는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 단일클론 항체를 제공한다.

다른 구체예에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 앞에서 설명한바, 서열에 대하여 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다. 앞에서 설명한바, 서열의 VH 및 VL 부위에 대하여 높은 동일성(즉, 80% 또는 그 이상)을 갖는 VH 및 VL 부위를 갖는 항체는 서열번호 6-9를 암호화하는 핵산 분자를 돌연변이유발(예를 들어, 부위-특이적 또는 PCR-매개 돌연변이유발)한 다음, 본 발명에서 기술한 기능적 분석을 사용하여 유지하는 기능(예를 들어, hIL20 결합 친화도 또는 그의 수용체 복합체의 hIL20-매개 활성화의 감소)에 대하여 암호화된 변형된 항체를 실험하는 것에 의해 얻을 수 있다.

두 서열 사이의 백분율 동일성은 두 서열의 최적의 정렬을 위하여 도입할 필요가 있는, 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유하는 동일한 위치의 수의 함수(즉, % 동일성=동일한 위치의 #/위치의 전체 #×100)이다. 두 서열 사이의 서열의 비교 및 백분율 동일성의 결정은 서열 분석 소프트웨어에서 수학적 알고리즘을 사용하여 성취할 수 있다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하는, 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 배정된 유사성의 측정을 사용하여 맞춘다.

두 아미노산 서열 사이의 백분율 동일성은, 예를 들어, Blossum 62 matrix 또는 PAM250 matrix 중 하나, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 무게 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 무게를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지(http://www.gcg.com에서 사용가능함)에서 GAP 프로그램으로 포함된 Needleman 및 Wunsch(J. Mol. Biol. 48:444-453(1970)) 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다.

또한, 폴리펩티드 서열은 디폴트 또는 추천된 매개변수를 적용하는 FASTA를 사용하여 비교할 수 있다. GCG Version 6.1.에서 프로그램, FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)는 정렬 및 쿼리 및 조사 서열 사이에서 가장 겹치는 부위의 백분율 서열 동일성을 제공한다(Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98; Pearson, Methods Mol. Biol. 2000;132:185-219).

또한, 두 아미노산 서열 사이의 서열 동일성은 PAM120 무게 잔기 표, 12의 갭 길이 벌점 및 4의 갭 벌점을 사용하여 ALIGN 프로그램(version 2.0)으로 통합될 수 있는 E. Meyers 및 W. Miller(Comput. Appl. Biosci., 1988;11-17)의 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다.

데이터베이스에서 함유된 다른 서열에 대하여 서열을 비교하기 위한 다른 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 디폴트 매개변수를 사용하는 blastp이다. 예를 들어, 각각이 참고문헌으로서 본 발명에 포함되는 문헌(Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990;215:403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402 (1997))을 참조하라. 본 발명의 단백질 서열은 거기서 예를 들면, 관련 서열을 찾기 위하여 공공 데이터베이스에 대한 조사를 수행하기 위해 "쿼리 서열"로서 사용할 수 있다. 이런 조사는 Altschul, et al. 1990(supra)의 XBLAST 프로그램(version 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 단백질 조사는 본 발명의 항체 분자와 동족인 아미노산 서열을 얻기 위하여 XBLAST 프로그램, score = 50, 단어길이 = 3으로 수행할 수 있다. 비교 목적에 대한 갭이 있는 정렬을 얻기 위하여, 갭이 있는 BLAST는 Altschul et al., 1997(supra)에서 기술된 것과 같이 사용할 수 있다. BLAST 및 갭이 있는 BLSAT 프로그램을 사용할 때, 저마다의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)은 디폴트 매개변수를 사용할 수 있다. http://www. ncbi.nlm.nih.gov.을 참조하라.

어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VH 부위 및 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL 부위를 포함하고, 하나 이상의 이들 CDR 서열은 본 발명에서 기술한 바람직한 항체; 15D2 및 5B7, 또는 이들의 보존적 변형에 기반을 둔 명기된 아미노산 서열을 포함하고, 항체는 본 발명의 항-hIL20 항체의 원하는 기능적 성질을 유지한다. 따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편을 제공하고: (a) VH 부위 CDR3 서열은 서열번호 6 및 7의 CDR 및 이들의 보존적 변형으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; (b) VL 부위 CDR3 서열은 서열번호 9의 CDR3 또는 이들의 보존적 변형의 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 (c) 항체는 hIL20에 특이적으로 결합하고, 본 발명에서 기술한 기능적 성질의 적어도 하나, 더욱 바람직하게는 본 발명에서 기술한 기능적 성질의 몇몇을 나타낸다.

나아간 구체예에서, VH 부위 CDR2 서열은 서열번호 6 또는 7의 CDR2, 및 이들의 보존적 변형으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 VL 부위 CDR2 서열은 서열번호 9의 CDR2 또는 이들의 보존적 변형을 포함한다.

나아간 구체예에서, VH 부위 CDR1 서열은 서열번호 6 또는 7의 CDR1, 및 이들의 보존적 변형으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 VL 부위 CDR1 서열은 서열번호 9의 CDR1 또는 이들의 보존적 변형을 포함한다.

본 발명에서 사용된바, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 유의하게 영향을 주거나 바꾸지 않는 아미노산 변형을 지칭하는 것을 의도한다. 이런 보존적 변형은 아미노산 치환, 삽입 및 결실을 포함한다. 변형은 부위-특이적 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발과 같은 당업계에 알려진 표준 기술에 의해 본 발명의 항체로 도입시킬 수 있다.

"보존적" 아미노산 치환은 전형적으로 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 특성의 곁쇄를 갖는 아미노산 잔기로 바꾸는 것들이다. 유사한 곁쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 곁쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 곁쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 무전하 극성 곁쇄(예를 들어 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 곁쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-가지화 곁쇄(예를 들어 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 곁쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)의 아미노산을 포함한다.

따라서 본 발명의 항체의 CDR 부위 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 곁쇄 패밀리로부터 나온 다른 아미노산 잔기로 바꿀 수 있고, 변형된 항체는 본 발명에서 기술한 기능적 분석을 사용하여 유지된 기능(즉, 상기 (c),(d) 및 (e)에서 설명한 기능)에 대하여 시험할 수 있다.

항원-결합 단편

본 발명에서 기술한바 본 발명의 항-hIL20 항체는 전장 항체 또는 이들의 항원-결합 단편으로서 제조할 수 있다. 전장 항체는 예를 들어, IgG 및 IgM을 포함하는 임의의 적절한 클래스의 것일 수 있다. 항체의 특정 클래스 및/또는 아이소타입은 의도된 치료적 사용에 따라서 선택할 수 있다. 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 아이소타입은 예를 들어, IgG1 및 IgG3보다 IgG4 및 IgG2가 더 낮은 친화도를 갖는, 백혈구에 발현된 Fc-수용체에 대하여 다른 친화도를 갖는다.

항원-결합 단편의 예시는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)3, Fv(전형적으로 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 영역), 단일-사슬 Fv(scFv; 예를 들어, Bird et al., Science 1988;242:423-426; 및 Huston et al. PNAS 1988;85:5879-5883을 참조하라), dsFv, Fd(전형적으로 VH 및 CH1 영역), 및 dAb(전형적으로 VH 영역) 단편; VH, VL, VhH, 및 V-NAR 영역; 단일 VH 및 단일 VH 사슬을 포함하는 1가 분자; 미니항체, 이가항체, 3가 항체, 4가 항체, 및 카파 항체(예를 들어, Ill et al., Protein Eng 1997;10:949-57을 참조하라); 카멜 IgG; IgNAR; 뿐만 아니라 분리된 CDR 또는 항원-결합 잔기 또는 폴리펩티드가 기능적 항체 단편을 형성하는 것으로서 함께 상호작용 또는 결합할 수 있을 때, 하나 이상의 분리된 CDR 또는 기능적 파라토프를 포함한다. 항체 단편의 다양한 타입은 예를 들어, 문헌(Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;23:1126-1136; WO2005040219, 및 공개된 미국 특허 출원 20050238646 및 20020161201)에 기술되거나 개괄되어 있다.

항체 단편은 고전적 재조합 또는 단백질 공학 기술을 사용하여 얻을 수 있고, 단편은 완전한 항체인 것과 같이 동일한 방법으로 항원-결합 또는 다른 기능에 대하여 스크리닝 할 수 있다.

다양한 기술이 항체 단편의 생산을 위하여 개발되어 왔다. 고전적으로, 이들 단편은 전장 항체의 프로테아제에 의한 효소적 분해에 의해 유래하였다(예를 들어, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science, 229:81(1985)을 참조하라). 그러나, 이들 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산할 수 있다. 선택적으로, Fab'-SH 단편은 E. coli로부터 직접적으로 회수하고, F(ab')2 단편을 형성하기 위하여 화학적으로 결합시킬 수 있다(Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). 다른 접근방법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접적으로 분리할 수 있다. 다른 구체예에서, 선택의 항체는 단일-사슬 Fv 단편(scFv)이다. WO 1993/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458을 참조하라. 또한, 항체 단편은 예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,870에서 기술한 것과 같은, 예를 들면, "선형 항체"일 수 있다. 이런 선형 항체 단편은 단일 특이성 또는 이중 특이성일 수 있다.

다중 특이성 분자

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-hIL20 항체, 또는 항원-이의 단편을 포함하는 다중 특이성 분자를 특징으로 한다. 이런 다중 특이성 분자는 hIL20에 대한 적어도 하나의 첫 번째 결합 특이성 및 이차 표적 에피토프에 대한 두 번째 결합 특이성을 포함하는 이중 특이성 분자를 포함한다.

이중 특이성 분자의 하나의 타입은 이중 특이성 항체이다. 이중 특이성 항체는 적어도 두 개의 다른 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 이중 특이성 항체를 만드는 방법은 당업계에 알려져 있고, 전장 이중 특이성 항체의 고전적 생산은 두 개의 사슬이 다른 특이성을 가질 때, 보통 두 개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동 발현을 기반으로 한다(Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). 이중 특이성 항체는 본 발명에서 기술한 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어 F(ab')2 이중 특이성 항체) 또는 임의의 다른 항원-결합 단편으로서 제조할 수 있다.

다른 다중 특이성 분자는 하나 이상의 다른 비-항체 단백질에 대한 hIL20-결합 항체 모이어티의 융합으로부터 생산되는 것들을 포함한다. 이런 다중 특이성 단백질 및 어떻게 이들을 구축하는지에 대해서는 당업계에서 설명되었다. 예를 들어, 문헌(Dreier et al. (Bioconjug. Chem. 9(4): 482-489 (1998)); 미국 특허 6,046,310; 미국 특허 출원 번호 20030103984; 유럽 특허 출원 1,413,316; 미국 특허 출원 번호 20040038339; von Strandmann et al., Blood(2006;107:1955-1962.), 및 WO 2004056873)을 참조하라.

또한, 두 개 원자가 이상의 다중 특이성 분자가 고려된다. 예를 들면, 삼중 특이성 항체를 제조할 수 있다. Tutt et al., J. Immunol, 147: 60(1991).

본 발명의 다중 특이성 분자는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 결합 특이성 성분을 접합시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들면, 다중 특이성 분자의 각각의 결합 특이성은 따로따로 생성될 수 있고, 이후 다른 하나에 접합된다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드일 때, 다양한 결합 또는 교차-결합 제제를 공유 접합을 위해 사용할 수 있다. 교차-결합 제제의 예시는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세트산(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피온산(SPDP), 및 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로학산-1-카르복실산(설포-SMCC)를 포함한다(예를 들어, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648을 참조하라). 다른 방법은 문헌(Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83), 및 Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375))에서 기술한 것들을 포함한다. 바람직한 접합 제제는 Pierce Chemical Co.(Rockford, IL)에서 모두 구입 가능한 SATA 및 설포-SMCC이다.

결합 특이성이 항체일 때, 그들은 두 개의 중쇄의 C-말단 힌지 부위의 설프히드릴 잔기를 통해 접합할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 힌지 부위는 홀수, 바람직하게는 하나의 설프히드릴 잔기를 함유하도록 접합 전에 변형된다.

선택적으로, 모든 결합 특이성은 동일한 벡터에 암호화되고, 동일한 숙주 세포에서 조립될 수 있다. 이 방법은 이중 특이성 분자가 mAb×mAb, mAb×Fab, Fab×F(ab')2 또는 리간드×Fab 융합 단백질일 때, 특히 유용하다. 본 발명의 이중 특이성 분자는 하나의 단일 사슬 항체 및 결합 결정자를 포함하는 단일 사슬 분자이거나, 두 개의 결합 결정자를 포함하는 단일 사슬 이중 특이성 분자일 수 있다. 이중 특이성 분자는 적어도 두 개의 단일 사슬 분자를 포함할 수 있다. 이중 특이성 분자를 제조하는 방법은 예를 들면 미국 특허 번호 5,260,203; 미국 특허 번호 5,455,030; 미국 특허 번호 4,881,175; 미국 특허 번호 5,132,405; 미국 특허 번호 5,091, 513; 미국 특허 번호 5,476,786; 미국 특허 번호: 5,013,653; 미국 특허 번호 5,258,498; 미국 특허 번호 5,482,858; 미국 특허 출원 공개 20030078385, Kontermann et al., (2005) Acta Pharmacological Sinica 26(1):1-9; Kostelny et al., (1992) J. Immunol. 148(5):1547-1553; Hollinger et al., (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448; 및 Gruber et al. (1994) J. Immunol. 152: 5368에서 기술한다.

항체 변종

본 발명의 항체는 나아가 변형된 항체 또는 항체 "변종"을 조작하기 위한 초기 재료로서 본 발명에 기술된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열을 갖는 항체를 사용하여 제조할 수 있고, 변형된 항체는 모 항체로부터 변형된 성질을 가질 수 있다. 항체는 가변 부위(즉, VH 및/또는 VL)의 하나 또는 모두 내에서, 예를 들면, 하나 이상의 CDR 부위 및/또는 하나 이상의 번역틀 부위 내에서 하나 이상의 잔기를 변형시키는 것에 의해 조작할 수 있다. 추가적으로 또는 선택적으로, 항체는 불변 부위 내에서, 예를 들면 항체의 작동자 기능을 바꾸기 위해 잔기를 변형하는 것에 의해 제조할 수 있다. 선택적으로, 항체의 항원-결합 부분으로부터 항원-결합 단편, 항체 유도체, 면역접합체, 및 다중 특이성 분자와 같은 다른 컨스트럭트까지 제조할 수 있다.

표준 분자 생물학 기술을 변형된 항체 서열을 제조하고 발현하기 위해 사용할 수 있다.

비록 항체 변종 또는 유도체가 "모" 항체와 비교하여 적어도 하나의 변형된 성질을 전형적으로 갖더라도, 항체 변종 또는 유도체는 본 발명에서 기술한 항-hIL20 항체의 기능적 성질의 하나, 일부 또는 대부분을 유지할 수 있고, 기능적 성질은 (a) hIL20-매개 활성화 of 인간 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 hIL20-매개 활성화를 감소시키는 것, (b) 바람직하게는 실질적으로 유사한 효능 또는 친화도를 갖고 설치류 및 사이노몰구스 IL20 오르쏘로그에 결합하는 것; (c) hIL20에 대한 결합에서 하나 이상의 15D2 및 5B7과 경쟁하는 것, 및 (d) 나선 E에 상응하는 조각에서 에피토프와 결합하는 것(도 2)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상술한 기능적 특징의 임의의 조합, 및/또는 실시예에서 기술한 것과 같은 기능적 특징은 본 발명의 항체에 의해 나타낼 수 있다.

항체 변종 및 유도체의 기능적 성질은 당업계에서 사용가능한 및/또는 본 발명에서 기술한 표준 분석을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들면, hIL20에 결합하는 항체의 능력은 실시예에서 설명한 것들과 같이, 표준 결합 분석을 사용하여 결정할 수 있다(예를 들어, Biacore, 유세포 분석, 또는 ELISA).

가변 부위 변형

수행할 수 있는 가변 부위 조작의 하나의 타입은 CDR 접목술이다. 항체는 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 부위(CDR)에 존재하는 아미노산 잔기를 통해 항원과 우세하게 상호작용한다. 이런 이유에서, CDR내의 아미노산 서열은 CDR의 바깥쪽의 서열보다 개별 항체 사이에서 더욱 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 다른 특성을 갖는 다른 항체로부터 번역틀 서열을 이식한 특정 자연-발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축하는 것에 의해 특정 자연-발생 항체의 성질을 미믹 하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다(예를 들어, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033; 미국 특허 번호 5,225,539 to Winter, 및 미국 특허 번호 5, 530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 to Queen et al.을 참조하라). 따라서, 본 발명의 구체예는 단일클론 항체 15D2 또는 5B7의 VH 및/또는 VL CDR 서열을 포함하는 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합 부분과 관계가 있지만, 번역틀 서열은 이들 항체와 다르다.

번역틀 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공공의 DNA 베이터베이스 또는 출판된 참고문헌으로부터 얻을 수 있다. 예를 들면, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 부위 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 "dBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase의 인터넷에서 사용가능함)뿐만 아니라, 그것의 각각의 내용이 참고문헌으로써 본 발명에 포함되는 문헌(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836)에서 찾을 수 있다.

본 발명의 항체에서 사용하기에 바람직한 번역틀 서열은 선택된 본 발명의 항체에 의해 사용된 번역틀 서열과 구조적으로 유사한, 예를 들어, 15D2 또는 5B7의 VH1_03, D3-10, JH6, VKIL_18, 및/또는 JK4 서열과 유사한 것들이다. 15D2 또는 5B7의 VH CDR1, 2 및 3 서열은 어떤 번역틀 서열이 유도하는 생식계열 면역글로불린 유전자에서 찾을 수 있는 동일한 서열을 갖는 번역틀 부위에 이식할 수 있거나, CDR 서열은 생식계열 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이 서열을 함유하는 번역틀 부위에 이식할 수 있다. 예를 들면, 항체의 항원 결합 능력을 유지하거나 강화시키기 위해 번역틀 부위 내의 잔기를 돌연변이 시키는 것의 이익을 어떤 보기에서 찾았다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 to Queen et al.을 참조하라).

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 항-hIL20 항체 예를 들어, 15D2 및 5B7의 구조적 특징은 hIL20에 대한 결합과 같은, 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능적 성질을 유지하는 구조적으로 관련된 항-hIL20 항체를 생성하는데 익숙하다. 예를 들면, 5B7 또는 15D2의 하나 이상의 CDR 부위, 또는 이의 변종은 추가적인, 재조합적으로-조작된 본 발명의 항-hIL20 항체를 생성하기 위하여 알려진 번역틀 부위 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 결합할 수 있다. 조작 방법을 위한 시작 재료는 본 발명에서 제공한 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열 또는 이들의 하나 이상의 CDR 부위이다. 조작된 항체를 생성하기 위하여, 본 발명에서 제공한 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열, 또는 이들의 을 갖는 항체를 실질적으로 준비(즉, 단백질로서 발현)하는 것이 필요하지 않다. 오히려, 서열에 함유된 정보를 원래 서열로부터 유래한 "이차 세대" 서열을 생성하는 것에 대한 시작 재료로서 사용하고, 이후 "이차 세대" 서열은 단백질로서 제조 및 발현한다.

따라서 다른 구체예에서, 본 발명은 (a) (i) 서열번호 6 또는 7로부터 나온 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 부위 항체 서열, 및 (ii) 서열번호 9로부터 나온 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위 항체 서열을 제조하는 단계; (b) 적어도 하나의 변형된 항체 서열을 생성하기 위하여 첫 번째 항체 서열 및/또는 두 번째 항체 서열 내에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변형시키는 단계; 및 (c) 변형된 항체 서열을 제조하는 단계; 및 (d) 단백질로서 변형된 항체 서열을 발현시키는 단계를 포함하는 항-hIL20 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

가변 부위 변형의 다른 타입은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 부위 내에서 아미노산 잔기를 돌연변이 시키고, 그것에 의해 관심있는 항체의 하나 이상의 결합 특성(예를 들어, 친화도)을 변화시키는 것이다. 부위-특이적 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발은 돌연변이를 도입하기 위해 수행할 수 있고, 항체 결합, 또는 다른 관심있는 기능적 성질에 있어서의 효과는 본 발명에서 기술한바 및 실시예에서 제공한 시험관 내 또는 생체 내 분석에서 평가할 수 있다. 바람직하게는 보존적 변형(상술한바)을 도입한다. 돌연변이는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실일 수 있다. 게다가, 단일 CDR 부위 내에서 전형적으로 단지 8개, 더욱 전형적으로 단지 5개 잔기를 변형시킨다.

따라서, 다른 구체예에서, 본 발명은 서열번호 6 또는 7의 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 또는 하나 이상의 이들 CDR에서 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱 또는 여덟 개 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위; 및 서열번호 9의 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 또는 하나 이상의 이들 CDR에서 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱 또는 여덟 개 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는, 분리된 항-hIL20 단일클론 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편을 제공한다.

본 발명의 조작된 항체는 예를 들어, 항체의 성질을 개선하기 위하여, VH 및/또는 VL 내의 번역틀 잔기에 대하여 변형을 만든 것들을 포함한다. 전형적으로 이런 번역틀 변형은 항체의 면역유발성을 감소시키기 위해 만든다. 예를 들면, 하나의 접근은 상응하는 생식계열 서열에 대하여 하나 이상의 번역틀 잔기를 "역돌연변이"하는 것이다. 더욱 특이적으로 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 그 항체가 유래한 생식계열 서열과 다른 번역틀 잔기를 함유할 수 있다. 이런 잔기는 그 항체가 유래한 생식계열 서열에 대하여 항체 번역틀 서열을 비교하는 것에 의해 확인할 수 있다.

예를 들면, 15D2 및 5B7에 대하여, 상응하는 생식계열 서열과 다른 VH 잔기를 도 3에서 "*"로 나타낸다. 되돌아가기 위하여, 예를 들어, 그들의 생식계열의 배치에 대하여 번역틀 부위 서열, CDR 밖의 체세포 돌연변이는 예를 들면, 부위-특이적 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 생식계열 서열로 "역돌연변이"될 수 있다(예를 들어, 15D2 VH 영역의 잔기 13, 68, 및/또는 15D2 VH 영역의 82A 또는 5B7 VH 영역의 잔기 13, 30 및/또는 82A는 VH 아미노산으로부터 생식계열 아미노산으로 "역돌연변이"될 수 있다). 또한, 이런 "역돌연변이된" 항체는 본 발명에 의해 포괄되는 것으로 의도한다.

번역틀 변형의 다른 타입은 T 세포 에피토프를 제거하고, 그것에 의해 항체의 잠재적인 면역유발성을 감소시키기 위하여, 번역틀 부위, 또는 오히려 하나 이상의 CDR 부위 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이 시키는 것을 포함한다. 이런 접근은 또한 "탈면역화"로 지칭하고, Carr et al.에 의해 미국 특허 출원 번호 20030153043에서 더욱 상세하게 기술한다.

Fc 변형

삽입에서 또는 번역틀 또는 CDR 부위에 만들어지는 변형에 대한 대안으로서, 본 발명의 항체는 전형적으로 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 단백질 안정성 및/또는 항원-의존적 세포내 세포독성, 또는 이들의 부재와 같은, 항체의 하나 이상의 기능적 성질을 바꾸기 위하여, Fc 부위 내에 변형을 포함시키기 위해 조작할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 항체의 하나 이상의 기능적 성질을 다시 바꾸기 위해 화학적으로 변형되거나(예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음), 그의 당쇄화를 바꾸기 위해 변형될 수 있다. 이들 구체예의 각각은 하기에서 더욱 상세히 기술한다. Fc 부위에서 잔기는 카밧에 따라서 번호를 붙인다.

원한다면, 항체의 클래스를 알려진 기술에 의해 "전환"시킬 수 있다. 이런 기술은 예를 들어 직접적인 재조합 기술(예를 들어, US 특허 4,816,397을 참조하라) 및 세포-세포 융합 기술(예를 들어, 미국 특허 5,916,771을 참조하라)의 사용을 포함한다. 예를 들면, IgM 분자로서 원래 생산된 항체는 IgG 항체로 클래스 전환될 수 있다. 클래스 전환 기술은 또한 하나의 IgG 서브클래스를 다른 것, 예를 들어, IgG1에서 IgG2로 전환시키는데 익숙할 수 있다. 따라서 본 발명의 항체의 작동자 기능은 다양한 치료 용도에 따라 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM 항체로 아이소타입 전환에 의해 변할 수 있다. 불변 부위에 대한 대표적인 cDNA 서열은 예를 들어, GenBank를 통해 사용할 수 있고, 그의 전체로서 본 발명에 참고문헌으로서 통합되는 그의 각각은 하기와 같다:

인간 IgG1 불변 중쇄 부위: GenBank 기탁 번호: J00228;

인간 IgG2 불변 중쇄 부위: GenBank 기탁 번호: J00230;

인간 IgG3 불변 중쇄 부위: GenBank 기탁 번호: X04646;

인간 IgG4 불변 중쇄 부위: GenBank 기탁 번호: K01316; 및

인간 카파 경쇄 불변 부위: GenBank 기탁 번호: J00241.

한 구체예에서, CH1의 힌지 부위는 힌지 부위가 변형된, 예를 들어, 증가하거나 감소된 시스테인 잔기의 수로 변형된다. 이 접근은 Bodmer et al.에 의해 미국 특허 번호 5,677,425에서 더 기술한다. CH1의 힌지 부위의 시스테인 잔기의 수는 예를 들면, 경쇄 및 중쇄의 조립을 촉진시키거나, 항체의 안정성을 증가 또는 감소를 변형시킨다.

다른 구체예에서, 항체의 Fc 힌지 부위를 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 돌연변이 시킨다. 더욱 특이적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 경계면 부위에 도입하고, 이런 항체는 천연 Fc-힌지 영역 SpA 결합 보다 약화된 스타필로코실 단백질 A 결합을 갖는다. 이 접근은 Ward et al.에 의해 미국 특허 번호 6,165,745에서 더욱 상세히 기술한다. 다른 구체예에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 변형된다. 다양한 접근이 가능하다. 예를 들면, 하나 이상의 하기 돌연변이를 도입할 수 있다: Ward에 의해 미국 특허 번호 6,277,375에서 기술한 것과 같은 T252L, T254S, T256F. 선택적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위하여, 항체는 Presta et al.에 의해 미국 특허 번호 5,869, 046 및 6,121,022에서 기술된바, IgG의 Fc 부위의 CH2 영역의 두 개의 루프로부터 얻은 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유하기 위해 CH1 또는 CL 부위 내에서 변형시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, Fc 부위는 항체의 작용자 기능을 바꾸기 위하여 다른 아미노산 잔기로 적어도 하나의 아미노산 잔기를 교체함으로써 변형할 수 있다. 예를 들면, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 다른 아미노산 잔기로 교체할 수 있고, 이런 항체는 작동자 리간드에 대한 친화도는 변형되지만, 모 항체의 항원-결합 능력은 유지된다. 친화도가 바뀐 것에 대한 작동자 리간드는 예를 들면, Fc 수용체 또는 보체의 C1 구성요소일 수 있다. 이 접근은 Winter et al.이 미국 특허 번호 5,624, 821 및 5,648,260 모두에서 더욱 상세하게 기술한다. 다른 예시에서, 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 다른 아미노산 잔기로 교체될 수 있고, 이런 항체는 변형된 C1q 결합 및/또는 폐지된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 갖는다. 이 접근은 Idusogie et al.에 의해 미국 특허 번호 6,194,551에서 더욱 상세히 기술한다. 다른 예시에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 변경되고, 그것에 의해 보체를 고정하는 항체의 능력이 바뀐다. 이 접근은 Bodmer et al.에 의해 PCT 공개 WO 94/29351에서 더 기술한다. 또 다른 예시에서 Fc 부위는 항체 의존성 세포 내 세포독성(ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키는 것 및/또는 하기 위치에서 하나 이상의 아미노산을 변형하는 것에 의해 Fcy 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키는 것을 변형한다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이 접근은 Presta에 의해 PCT 공개 WO 00/42072에서 더 기술한다. 게다가, FcyRl, FcyRII, FcyRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1에서의 결합 부위가 맵핑되었고, 개선된 결합을 갖는 변종도 보고되었다(Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604를 참조하라). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서의 특정 돌연변이는 FcRIII에 대한 개선된 결합을 보여주었다. 선택적으로, 하기의 조합 돌연변이는 개선된 FcyRIII 결합을 보여주었다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A.

불변 부위는 예를 들어, 두 개의 1가 VH-VL 단편으로 분리된 이가 항체의 위험을 감소시키기 위하여, 안정화된 항체에 대하여 더 변형시킬 수 있다. 예를 들면, IgG4 불변 부위에서, 카밧 넘버링 시스템에 따른 위치 241의 세린(S, Ser) 잔기는 힌지에서 완벽한 이황화 결합 형성을 허용하기 위해 프롤린(P, Pro) 잔기로 돌연변이될 수 있다(예를 들어, Angal et al., Mol Immunol. 1993;30:105-8을 참조하라). EU 색인 넘버링 시스템에 따라, 카밧 잔기 241은 잔기 228에 상응한다.

당쇄화 변형

한층 다른 구체예에서, 항체의 당쇄화를 변형한다. 예를 들면, 비당쇄화 항체를 만들 수 있다(즉, 항체에서 당쇄화가 결핍됨). 당쇄화는 예를 들면, 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위하여 변형할 수 있다. 이런 탄수화물 변형은 항체 서열 내에서 하나 이상의 당쇄화 부위를 바꾸는 것에 의해 성취할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 아미노산 치환이 하나 이상의 가변 부위 번역틀 당쇄화 부위의 제거를 야기하고, 그것에 의해 그 부위의 당쇄화를 제거하도록 만들 수 있다. 이런 비당쇄화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킨다. 이런 접근은 Co et al.에 의해 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861에서 더욱 상세하게 기술한다. 추가적으로 또는 선택적으로, 항체는 푸코실 잔기의 감소된 양을 갖는 저 푸코실화 항체 또는 증가된 양갈래 GlcNac 구조를 갖는 항체와 같은, 당쇄화의 변경된 타입을 갖도록 만들 수 있다. 이런 변경된 당쇄화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 설명되어 왔다. 이런 탄수화물 변형은 예를 들면, 변경된 당쇄화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시키는 것에 의해 성취할 수 있다. 변경된 당쇄화 기구를 갖는 세포는 당업계에서 기술되어 있고, 본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위해 숙주 세포로서 사용할 수 있고, 그것에 의해 변경된 당쇄화를 갖는 항체를 생산한다. 예를 들면, Hanai et al.에 의한 EP1176195가 푸코실 전이효소를 암호화하는 FUT8 유전자를 기능적으로 붕괴시킨 세포주, 이런 세포주에서 발현된 항체가 저부코실화 나타내는 것을 기술한다. Presta에 의한 PCT 공개 WO 03/035835는 Asn(297)-연결 탄수화물에 푸코스를 부착하는 능력이 감소된 변종 CHO 세포주, Lecl3 세포, 이 숙주 세포가 발현하는 항체의 저푸코실화를 또한 야기하는 것을 기술한다(또한 Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740을 참고하라). Umana et al.에 의한 PCT 공개 WO 99/54342는 당단백질-변형 글리코실 전이효소(예를 들어, 베타(l,4)-N-아세틸글루코스아미닐전이효소 III(GnTIII))를 발현하는 조작된 세포주, 조작된 세포주에서 발현된 이런 항체가 항체의 증가된 ADCC 활성을 야기하는 증가된 양갈래 GlcNac 구조를 나타내는 것을 기술한다(또한 Umana et al.(1999) Nat. Biotech. 7:176 180을 참조하라).

본 발명의 항체를 조작하는 방법의 어떤 구체예에서, 돌연변이는 항-hIL20 항체 암호화 서열의 전부 또는 일부에 따라서 임의로 또는 선택적으로 도입할 수 있고(예를 들어, 15D2 또는 5B7 암호화 서열), 최종의 변형된 항체는 본 발명에서 기술한바 결합 활성 및/또는 다른 기능적 성질에 대하여 스크리닝할 수 있다. 돌연변이 방법은 당업계에서 기술되어 왔다. 예를 들면, Short에 의한 PCT 공개 WO 02/092780은 포화 돌연변이유발, 합성 리게이션 조립, 또는 이들의 조합을 사용한 항체 돌연변이의 생성 및 스크리닝 방법을 기술한다.

선택적으로, Lazar et al.에 의한 PCT 공개 WO 03/074679는 항체의 이화학적 성질을 최적화하기 위하여 컴퓨터 스크리닝 방법을 사용한 방법을 기술한다.

항체 유도체

본 발명의 범주에 있는 항체 유도체(또는 면역접합체)는 이차 제제에 접합되거나 공유적으로 결합된 항-hIL20 항체를 포함한다.

예를 들면, 한 측면에서, 본 발명은 세포독성 제제에 접합되거나 공유적으로 결합된 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 본 발명에서 사용한바 용어 "세포독성 제제"는 예를 들어, 세포-표면 hIL20 수용체에 대한 IL-20-결합을 통해, 그것이 상호작용하는 세포를 죽이는 능력이 있는 분자이다. 세포독성 또는 세포억제 효과를 갖는 모이어티의 임의의 타입은 치료용 방사성동위 원소, 독성 단백질, 약물, 독소, 면역조절자, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 올리고뉴클레오티드, 효소 억제자, 치료용 방사성 핵종, 혈관신생 억제자, 화학치료 약물, 빈카 알칼로이드, 아드라사이클린, 에피도필로톡신, 탁산, 대사 길항 물질, 알킬화 제제, 항생제, COX-2 억제자, SN-38, 항진균제, 항혈관신생 및 항아폽토시스 제제, 특히 독소루비신, 메토트렉사트, 탁솔, CPT-11, 캄토테칸, 질소 머스타드, 겜시타빈, 알킬 설폰산, 니트로소우레아, 트리아젠, 엽산 유도체, 피리미딘 유도체, 퓨린 유도체, 백금 정합 복합체, 슈도모나스 외독소, 리신, 아브린, 5-플루오로유리딘, 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 스트필로코칼 엔테로톡신-A, 미국자리공 항바이러스 단백질, 겔로닌, 디프테린 독소, 슈도모나스 외독소, 및 슈도모나스 내독소 및 기타와 같은 독성 소분자를 포함하는 본 발명의 세포독성 접합체를 형성하기 위해 존재하는 항체에 접합될 수 있다(예를 들어, 이들의 전체 정보 공개가 본 발명에 참고문헌으로써 포함되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995); Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001); Pastan et al. (1986) Cell 47:641; Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44:43; 미국 특허 번호 6,077,499를 참조하라). 독소가 동물, 식물, 곰팡이 또는 미생물 기원의 것일 수 있거나, 화학적 합성에 의해 새로 생성될 수 있음이 올바로 인식될 것이다.

다른 구체예에서, 항체는 검출 목적에 적절한 치료용 방사성 핵종 또는 방사성 핵종과 같은 방사성 동위 원소로 유도체화한다. I-131, 인듐-111, 류테튬-171, 비스무트-212, 비스무트-213, 아스타틴-211, 구리-62, 구리-64, 구리-67, 이트륨-90, 요오드-125, 요오드-131, 인-32, 인-33, 스칸듐-47, 은-111, 갈륨-67, 프라세오디뮴-142, 사마륨-153, 테르븀-161, 디스프로슘-166, 홀뮴-166, 레늄-186, 레늄-188, 레늄-189, 납-212, 라듐-223, 악티늄-225, 철-59, 셀레늄-75, 비소-77, 스트론튬-89, 몰리브덴-99, 로듐-105, 팔라듐-109, 프라세오디뮴-143, 프로메튬-149, 에르븀-169, 이리듐-194, 금-198, 금-199, 및 납-211을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 적절한 방사성 동위 원소의 임의의 수를 사용할 수 있다. 일반적으로, 방사성 핵종은 전자 방사에 대하여 바람직하게는 20 내지 6,000 keV, 바람직하게는 60 내지 200 keV 범위 범위, 베타 방사에 대하여, 100-2,500 keV, 및 알파 방사에 대하여 4,000-6,000 keV의 붕괴 에너지를 갖는다. 또한, 바람직한 것은 알파-입자의 생성과 함께 실질적으로 부식하는 방사성 핵종이다.

본 발명의 항체 접합체는 약물 모이어티가 고전적 치료제를 제한하지 않는 것으로 해석될 때, 주어진 생물학적 반응을 변형시키기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 소유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이런 단백질은 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소와 같은 효소적 활성 독소 또는 이의 활성 단편; 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ와 같은 단백질; 또는 림포킨, 인터루킨-l("IL1"), 인터루킨-2("IL2"), 인터루킨-6("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 다른 성장 인자와 같은 생물학적 반응 변형자를 포함할 수 있다.

이차 제제는 다수의 임의의 사용할 수 있는 방법을 사용하여 항체에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 예를 들면, 제제는 이황화 결합 형성을 통해, 또는 항체의 Fc 부위에서 탄수화물 모이어티를 통해 감소된 항체 구성요소의 힌지 부위에 부착할 수 있다(예를 들어, 이들의 전체 정보 공개가 본 발명에 참고문헌으로써 포함되는 Yu et al. (1994) Int. J. Cancer 56: 244; Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995), Cattel et al. (1989) Chemistry today 7:51-58, Delprino et al. (1993) J. Pharm. Sci 82:699-704; Arpicco et al. (1997) Bioconjugate Chernistry 8:3; Reisfeld et al. (1989) Antihody, Immunicon. Radiopharm. 2:217을 참조하라). 또한, 문헌(Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982))을 참조하라.

세포독소의 타입의 나아간 논의에 대하여, 항체에 치료제를 부착하기 위한 링커 및 방법은 또한, 문헌(Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.)을 참조하라.

다른 구체예에서, 이차 제제는 정량적 또는 정성적으로 관찰 또는 측정할 수 있는 임의의 분자일 수 있는 검출가능한 모이어티이다. 본 발명의 접합된 항체에서 유용한 검출가능한 마커의 예시는 방사성 동위 원소, 형광 다이 또는 항원/항체(IL20과 다른 항체), 렉틴/탄수화물; 아비딘/비오틴; 수용체/리간드; 또는 분자로 각인된 중합체/인화 분자 시스템 중 임의의 하나의 멤버와 같은 상보적 결합 쌍의 멤버이다.

또한, 이차 제제는 항체 또는 이들의 항원-결합 단편의 순환 반감기를 증가시키기 위한 의도로 선택적으로 폴리머일 수 있다. 이런 중합체를 펩티드에 부착시키기 위한 대표적인 중합체 및 방법은 예를 들어, 미국 특허 번호 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; 및 4,609,546에서 설명한다. 추가적인 실례가 되는 중합체는 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티를 포함한다. 본 발명에서 사용된바, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드와 같은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용해온 PEG의 임의의 형태를 포함하는 것을 의도한다. 예를 들면, 전장 항체 또는 항체 단편은 대략 2000 및 대략 20,000 사이, 예를 들어, 대략 3,000-12,000과 같은 대략 1,000 및 대략 40,000 사이의 분자량을 갖는 하나 이상의 PEG 분자에 접합시킬 수 있다. 항체 또는 이의 단편을 PEG화하기 위하여, 항체 또는 단편은 전형적으로 활성 에스테르 또는 PEG의 알데하이드 유도체와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 항체 또는 항체 단편에 하나 이상의 PEG 그룹이 부착하는 조건 하에서 반응시킨다. 바람직하게는, PEG화는 활성 PEG 분자(유도체 활성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행한다. 어떤 구체예에서, PEG화될 항체는 당쇄화 항체이다. 단백질을 PEG화시키기 위한 방법은 당업계에 알려져 있고, 본 발명의 항체에 적용할 수 있다. 예를 들면, WO2004099231, WO2003031464, EP154316(Nishimura et al.에 의한) 및 EP401384(Ishikawa et al.에 의한)를 참조하라.

핵산

본 발명의 다른 측면은 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자와 관계있다. 핵산은 전체 세포에서, 세포 용해물에서, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태에서 존재할 수 있다. 알칼리/SDS 처치, CsCI 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 잘 알려진 다른 방법을 포함하는 표준 기술에 의해, 예를 들어, 다른 세포 핵산 또는 단백질인 다른 세포 구성요소 또는 다른 오염원으로부터 정제되었을 때, 핵산은 "분리"되거나 "실질적으로 순수"하게 된다. 문헌(F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York)을 참조하라. 본 발명의 핵산은 예를 들면, DNA 또는 RNA일 수 있으며, 인트론 서열을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 바람직한 구체예에서, 핵산은 cDNA 분자이다.

본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 하이브리도마(예를 들어, 더 아래에서 기술한 것과 같은 인간 면역글로불린 유전자를 갖는 형질전환 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체에 대하여, 하이브리도마에 의해 만들어진 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 얻을 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리(예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 사용하여)로부터 얻은 항체에 대하여, 항체를 암호화하는 핵산은 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 본 발명의 바람직한 핵산 분자는 IgG2 또는 IgG4 아이소타입, 더욱 바람직하게는 IgG4의 15D2 또는 5B7 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄 서열을 암호화하는 것들이다.

일단 VH 및 VL 조각을 암호화하는 DNA 단편을 얻으면, 이들 DNA 단편은 예를 들면, 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자에 대한 가변 부위 유전자를 전환시키는 표준 재조합 DNA 기술에 의해 더 조작할 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편은 항체 불변 부위 또는 신축성 링커와 같은 다른 단백질을 암호화하는 다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 이 문맥에서 사용한바, 용어 "작동가능하게 연결된"은 두 개의 DNA 단편이 두 개의 DNA 단편에 의해 암호화하는 이런 아미노산 서열이 번역틀을 유지한 채로 연결되는 것을 의미하는 것을 의도한다.

VH 부위를 암호화하는 분리된 DNA는 중쇄 불변 부위(CH1, CH2 및 CH3)를 암호화하는 다른 DNA 분자에 VH-암호화 DNA를 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자를 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 부위 유전자의 서열은 당업계에 알려져 있고(예를 들어, Kabat, E. A., el al. (l991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242를 참조하라), 이들 부위를 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 중쇄 불변 부위는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 부위일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG4 불변 부위이다. Fab 단편 중쇄 유전자에 대하여, VH-암호화 DNA는 오직 중쇄 CH1 불변 부위를 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.

VL 부위를 암호화하는 분리된 DNA는 VL-암호화 DNA를 경쇄 불변 부위를 암호화하는 다른 DNA 분자, CL에 작동가능하게 연결하는 것에 의해 전장 경쇄 유전자(뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)를 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 부위 유전자의 서열은 당업계에 알려져 있고(예를 들어, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242를 참조하라), 이들 부위를 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 경쇄 불변 부위는 카파 또는 람다 불변 부위일 수 있지만, 가장 바람직하게는 카파 불변 부위이다.

scFv 유전자를 생성하기 위하여, VH- 및 VL-암호화 DNA 단편은 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 암호화하는 신축성 링커를 암호화하는 다른 단편에 작동가능하게 연결되고, 이런 VH 및 VL 서열은 신축성 링커에 의해 VL 및 VH 부위가 연결된, 인접하는 단일-사슬 단백질로서 발현될 수 있다(예를 들어, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554를 참조하라).

항체 생산

본 발명의 단일클론 항체(mAbs)는 고전적 단일클론 항체 방법론, 예를 들어, Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함하는, 다양한 기술에 의해 생산할 수 있다. 체세포 혼성화 절차가 바람직하더라도, 원칙적으로, 단일클론 항체를 생산하는 것에 대한 다른 기술, 예를 들어, B 림프구의 바이러스성 또는 발암 형질전환을 사용할 수 있다.

하이브리도마를 제조하기 위한 하나의 바람직한 동물 시스템은 설치류 시스템이다. 융합을 위해 면역화된 지라 세포의 분리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 융합 파트너(예를 들어, 설치류 골수종 세포) 및 융합 절차로서, 당업계에 알려져 있다. 본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 또한 확립된 기술을 사용하여 설치류 단일클론 항체의 서열에 기반을 두어 제조할 수 있다. 예를 들면, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 암호화하는 DNA를 관심있는 설치류 하이브리도마로부터 얻을 수 있고, 비-설치류(예를 들어, 인간) 면역글로불린 서열을 함유하기 위하여 조작할 수 있다. 예를 들면, 키메라 항체를 생성하기 위하여, 설치류 가변 부위는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 인간 불변 부위에 연결할 수 있다(예를 들어, Cabilly et al.에 의한 미국 특허 번호 4,816,567 참조). 인간화 항체를 생성하기 위하여, 설치류 CDR 부위는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 인간 번역틀 내로 삽입시킬 수 있다(예를 들어, Winter에 의한 미국 특허 번호 5,225,539, 및 Queen et al.에 의한 미국 특허 번호 5,530,101; 5, 585,089; 5,693,762 및 6,180,370을 참고하라).

바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간 단일클론 항체이다. hIL20에 대하여 유도된 이런 인간 단일클론 항체는 마우스 시스템보다 인간 면역 시스템 부분을 갖는 형질전환 또는 트랜스 염색체 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이들 형질전호나 및 트랜스 염색체 마우스는 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로서 본 발명에서 지칭된 마우스를 포함하고, "인간 Ig 마우스"로 본 발명에서 집단적으로 지칭한다. HuMAb 마우스(Medarex, Inc.)는 내재적으로 u 및 k 사슬 유전자좌가 불활성화된 표적 돌연변이와 함께 비정렬된 인간 중쇄(p 및 y) 및 K 경쇄 면역글로불린 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 유전자 미니 유전자좌를 함유한다(예를 들어, Lonberg, et al. (1994) Nature 368: 856-859를 참조하라). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 K의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 대한 반응에서 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스 유전자가 고 친화성 인간 IgGK 단일클론을 생성하기 위하여 클래스 전환 및 체세포 돌연변이를 겪는다(Lonberg, N. et al. (1994), supra; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). HuMAb 마우스의 제조 및 사용, 및 이런 마우스에 의해 옮겨지는 유전체 변형은 그의 모든 내용이 특이적으로 본 발명에 그 전체로서 참고문헌으로 포함되는 문헌(Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993)International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912 2920; Taylor, L. et al. (1994) International immunology 6: 579-591; and Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851)에서 더 기술한다. 모두 Lonberg 및 Kay에 의한 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5, 877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429; Surani et al.에 의한 미국 특허 번호 5,545,807; 모두 Lonberg 및 Kay에 의한 PCT 공개 번호 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962; 및 Korman et al에 의한 PCT 공개 번호 WO 01/14424를 더 참조하라. 다른 구체예에서, 본 발명의 인간 항체는 인간 중쇄 트랜스유전자 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 갖는 마우스와 같이 트랜스유전자 및 트랜스염색체에서 인간 면역 글로불린 서열을 갖는 마우스를 사용하여 일으킬 수 있다. "KM 마우스"로 지칭하는, 이런 마우스는 Ishida et al.에 의해 PCT 공개 WO 02/43478에서 더욱 상세하게 기술한다. 더욱이, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 선택적 형질전환 동물 시스템을 당업계에서 사용가능하며, 본 발명의 항-hIL20 항체를 일으키기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, Xenomouse(Abgenix, Inc.)라고 불리는 선택적인 형질전환 시스템을 사용할 수 있고; 이런 마우스는 예를 들면, Kucherlapati et al.에 의해 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 및 6,162,963에서 기술한다. 게다가 인간 면역글로불린을 발현하는 선택적인 트랜스염색체 동물 시스템을 당업계에서 사용가능하며, 본 발명의 항-hIL20 항체를 일으키기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, "TC 마우스"라 불리는, 인간 중쇄 트랜스염색체 및 인간 경쇄 트랜스염색체 모두를 갖는 마우스를 사용할 수 있고; 이런 마우스는 문헌(Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727)에서 기술한다. 더욱이, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스염색체를 갖는 소가 당업계에서 기술된바 있고(Kuroiwa et al.(2002) Nature Biotechnology 20:889-894), 본 발명의 항-hIL20 항체를 일으키는데 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 인간 단일클론 항체는 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리의 스크리닝을 위하여 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 인간 항체를 분리하기 위한 이런 파지 디스플레이 방법을 당업계에서 확립했다. 예를 들면: Ladner et al.에 의한 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 Dower et al.에 의한 5,571,698; 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717; McCafferty et al.에 의한 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197; 및 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; Griffiths et al.에 의한 6,582,915 및 6,593,081을 참조하라. 또한, 본 발명의 인간 단일클론 항체는 면역화 동안 인간 항체 반응을 생성할 수 있는 인간 면역 세포로 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수 있다. 이런 마우스는 예를 들면, Wilson et al.에 의해 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767에서 기술한다.

인간 Ig 마우스가 본 발명의 인간 항체를 일으키는데 사용될 때, 이런 마우스는 문헌(Lonberg, N. et al.(1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al.(1996) NatureBiotechnolo,gy 14: 845-851; 및 PCT 공개 WO 98/24884 및 WO 01/14424)에서 기술한 것과 같이 hIL20 항원의 정제 또는 농축한 제형으로 면역화시킬 수 있다. 바람직하게는, 마우스는 6-16주령에 첫 번째 주입될 것이다. 예를 들면, hIL20 항원의 정제 또는 농축된 제형을 복강 내로 인간 Ig 마우스를 면역화하기 위하여 사용할 수 있다.

투여하는 항원(예를 들어, hIL20 폴리펩티드)의 형태 및 양뿐만 아니라 투여 스케줄 및 예를 들어, 완전 후룬즈 아주번트 또는 불완전 후룬즈 아주번트와 같은 아주번트의 잠재적 사용은 당업계에서 확립된 방법에 따라 각각의 항원-마우스 시스템에 전형적으로 최적화한다.

안와 출혈에 의해 얻은 혈장 샘플을 사용한 면역화 프로토콜의 과정동안 관찰할 수 있고, 혈장 또는 혈청은 ELISA에 의해 검출할 수 있고(하기에 기술한바), 항-hIL20 인간 면역글로불린의 충분한 역가를 갖는 마우스는 융합에 사용할 수 있다. 마우스는 희생하여 비장을 제거하기 3일 전에 항원의 정맥주사로 신장시킬 수 있다. 각각의 면역화에 대하여 2-3개의 융합이 수행될 필요가 있을 것으로 예측된다.

본 발명의 인간 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터 나온 지라세포 및/또는 림프절 세포를 마우스 골수종 세포주와 같은 적당한 불멸화시킨 세포주에 분리 및 융합시킬 수 있다. 결과적인 하이브리도마는 항원-특이적 항체의 생산에 대하여 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, 면역화된 마우스로부터 나온 비장 림프구의 단일 세포 부유물을 50% PEG와 1-6 개의 P3X63-Ag8.653 비분비 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL 1580)로 융합시킬 수 있다. 선택적으로, 세포는 전기융합에 의해 융합시킬 수 있다. 세포를 평면 바닥 마이크로타이터 플레이트에 대략 2×10⁵로 깐 다음, 20% 태아 클론 혈청, 18% "653" 조건 배지, 5% 오리겐(IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 5mM HEPES, 0.055 mM 2-머캅토에탄올, 50 units/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 50 mg/ml 겐타마이신 및 1×HAT(Sigma; HAT을 융합한지 24 후에 첨가함)을 함유하는 선택 배지에서 2주 동안 배양하였다. 대략 2주 후, 배지에 들어있는 HAT를 HT로 교체하여 배양할 수 있다. 이후, 개별 웰을 인간 단일클론 IgM 및 IgG 항체에 대하여 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. 일단 광범한 하이브리도마 성장이 일어나면, 배지는 보통 10-14일 후 관찰할 수 있다. 항체를 분비하는 하이브리도마는 재도말하고, 다시 스크리닝할 수 있으며, 만약 인간 IgG에 대하여 여전히 양성인 경우, 단일클론 항체를 적어도 두 번의 한계 희석에 의해 서브클로닝할 수 있다. 안정된 서브클론은 이후 특징화를 위해 조직 배양 배지에서 항체의 소량을 생성하기 위하여 시험관 내에서 배양할 수 있다. 인간 단일클론 항체를 정제하기 위하여, 선별된 하이브리도마는 단일클론 항체 정제를 위하여 2-리터의 회전-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 상청액을 단백질 A-세파로즈(Pharmacia, Piscataway, N.J.)를 사용한 친화도 크로마토그래피 전에 여과 및 농축할 수 있다.용출한 IgG는 순도를 보증하기 위해 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 확인할 수 있다. 버퍼 용액은 PBS로 교체할 수 있고, 농도는 분광기에 의해 결정할 수 있다. 단일클론항체는 분주한 후 -80℃에서 저장할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 당업계에서 잘 알려진 것처럼 예를 들면, 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질도입 방법의 조합을 사용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산할 수 있다(예를 들어, Morrison, S.(1985) Science 229:1202).

예를 들면, 항체, 또는 이의 항체 단편을 생산하기 위하여, 경쇄 및 중쇄의 일부 또는 전장을 암호화하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술(예를 들어 관심있는 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용한 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)에 의해 얻을 수 있고, DNA를 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 대하여 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터 안으로 삽입시킬 수 있다. 이 문맥에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 항체 유전자를 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그들의 의도된 기능을 제공하도록 벡터 내로 리게이션시키는 것을 의미하도록 의도한다.

발현 벡터 및 발현 대조군 서열은 사용한 발현 숙주 세포와 양립할 수 있는 것을 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 분리된 벡터 내로 삽입시킬 수 있고, 더욱 전형적으로, 두 유전자는 같은 발현 벡터 내로 삽입시킨다. 항체 유전자는 표준 방법에 의해 발현 벡터 내로 삽입한다(예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터의 상보적인 제한효소 부위의 리게이션, 또는 제한효소 부위가 없다면, 무딘 말단 리게이션). 본 발명에서 기술한 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 부위는 임의의 항체 아이소타입의 전장 항체 유전자를 생성하기 위해, 원하는 아이소타입의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 부위를 이미 암호화하는 발현 벡터 내로 VH 조각이 CH 조각과 벡터 내에서 작동가능하게 연결되고, VL 조각이 CL 조각과 벡터 내에서 작동가능하게 연결되도록 그들을 삽입함으로써 사용할 수 있다. 추가적으로 또는 선택적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진시키는 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 번역틀에 맞게 연결되는 벡터에 클로닝할 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 기원의 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질에서 나온 신호 펩티드)일 수 있다.

항체 사슬 유전자에 추가하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 지닌다. 용어 "조절 서열"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 조절하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 대조군 요소(예를 들어 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것을 의도한다. 이런 조절 서열은 예를 들면, Goeddel(Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))에서 기술한다.

당업자라면, 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계가 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현의 수준, 등과 같은 이런 인자에 의존하는 것을 올바로 인식할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마 바이러스로부터 유래한 프로모터 및/또는 인핸서와 같은, 포유동물 세포에서 단백질 발현의 고 수준을 지시하는 바이러스 요소를 포함한다. 선택적으로 유비퀴틴 프로모터 또는 p-글로빈 프로모터와 같은 비바이러스성 조절 서열을 사용할 수 있다. 여전히, SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입 1의 긴 말단 반복으로부터 나온 서열을 함유하는 SRa 프로모터 시스템과 같이 조절 요소는 다른 기원으로부터 나온 서열로 구성된다(Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

항체 사슬 유전자 및 조절 서열의 삽입에서, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어 복제 기원) 및 선별 가능한 마커 유전자와 같은 추가적인 서열을 지닐 수 있다. 선별 가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 촉진한다(예를 들어 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017, all by Axel et al.을 참조하라). 예를 들면, 전형적으로 선별 가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에서 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉사트와 같은 약물에 대한 저항성에 기여한다. 바람직한 선별 가능한 마커 유전자는 디히드로폴산 환원효소(DHFR) 유전자(메토트렉사트 선택/증폭이 있는 dhfr-숙주 세포에서의 사용을 위하여) 및 네오 유전자(G418 선별을 위하여)를 포함한다.

경쇄 및 중쇄의 발현을 위하여, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터를 표준 기술에 의해 숙주 세포로 형질도입한다. 용어 "형질도입"의 다양한 형태는 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 외래 DNA의 도입을 위해 일반적으로 사용되는 다양한 광범위한 기술, 예를 들어, 전기천공법, 칼슘-인산염 침전, DEAE-덱스트란 형질도입 등을 포괄하는 것을 의도한다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포 모두에서 발현하는 것이 이론상 가능할지라도, 진핵 세포, 및 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서 항체를 발현하는 것이 정확한 접힘 및 면역학적으로 활성 항체로 조립하고 분비하는데 원핵 세포 보다 더욱 적당하다. 항체 유전자의 원핵세포 발현은 활성 항체의 고 수율의 생산에 비효과적인 것이 보고되었다(Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO cells)(Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Nail. Acad. Sci. USA 77:4216-4220에 기술된, DHFR 선별 마커와 함께 사용하는 dhfr-CHO 세포, 예를 들어, R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621을 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와의 사용을 위한, 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에서 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포내로 도입될 때, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현, 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 자란 배양 배지로의 항체의 분비를 허용하기에 충분한 시간의 기간 동안 숙주 세포를 배양하는 것에 의해 생산한다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.

항체 특징화

생산 또는 정제 후에, 또는 스크리닝 또는 선택 절차의 일부로서, 본 발명의 항-hIL20 항체의 기능적 특징을 조사할 수 있다. 관심있는 기능적 성질은 예를 들어, hIL20에 대한 항체 결합 특이성, hIL20 오르쏘로그에 대한 항체 결합, 참조 항체(예를 들어, 5B7 및 15D2와 같은)와의 항체 경쟁, 항체가 결합하는 에피토프, 항체-항원 상호작용의 친화도, 항체의 길항적 특성, 및 가용성을 포함한다.

다음은 항체 특징화에 대한 대표적인 분석의 간단한 설명이다. 일부는 다른 단락 및/또는 실시예에서 더 기술한다.

결합 분석

본 발명은 hIL20에 결합하는 항체, 및 항원-결합 단편, 변종, 및 이의 면역 접합체를 제공한다. 임의의 광범위한 다양한 분석이 hIL20에 대한 항체의 결합을 평가하기 위해 사용할 수 있다. 특히, ELISA, 방사성 동위 원소면역분석, 웨스턴 블롯, BIACORE, 및 다른 경쟁 분석에 기반을 둔 프로토콜이 사용에 적절하고, 당업계에 잘 알려져 있다. 나아가, 경쟁 분석을 포함하는 몇몇의 결합 분석은 실시예에서 기술한다.

예를 들면, 시험 항체를 표적 단백질 또는 에피토프의 존재에서 배양하고(예를 들어, IL20 또는 이의 일부), 비결합된 항체를 씻어내고, 및 결합된 항체의 존재를 예를 들어, 검출용 방사성 동위 원소, 질량 분석과 같은 물리적 방법, 또는 예를 들어, 세포 형광 분석(예를 들어 FACScan)을 사용한 직접 또는 간접적으로 검출된 형광표지를 사용하여 평가하는, 단순한 결합 분석을 사용할 수 있다. 이런 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 대조군, 비-특이적 항체로 본 양 이상의 결합의 양은 표적에 대하여 항체가 특이적으로 결합하는 것을 지칭한다.

이런 분석에서, 표적 세포 또는 단백질에 결합하는 시험 항체의 능력은 대조군 단백질, 예를 들어 구조적으로 비관련된 항원에 대하여 일으켜진 항체, 또는 동일한 표적에 결합하는 비-Ig 펩티드 또는 단백질의 (음성)능력과 비교할 수 있다. 임의의 적절한 분석을 사용하여 대조군 단백질보다 25%, 50%, 100%, 200%, 1000%, 또는 그 이상의 증가된 친화도를 갖는 표적 세포 또는 IL20에 결합하는 항체 또는 단편은 표적에 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 상호작용"한다고 말하며, 하기에 기술된 치료 방법에서 사용하기에 바람직하다. IL20에 대하여 (양성)대조군 항체, 예를 들어 15D2 또는 5B7의 결합에 영향을 미치기 위한 시험 항체의 능력을 또한 평가할 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 생물학적 특징 및/또는 15D2 또는 5B7과 상당한 VH 및/또는 VL 서열 동일성을 공유하는 항-hIL20 항체를 제공한다. 하나의 대표적인 생물학적 특징은 15D2 또는 5B7 에피토프, 또는 15D2 또는 5B7 항체가 결합하는 hIL20의 세포 밖 영역에서 저마다의 부위에 대한 결합이다. 15D2 또는 5B7 에피토프에 결합하는 항체에 대한 스크리닝하기 위해, 문헌(Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988))에서 기술한 것과 같은 일상의 교차-차단 분석을 수행할 수 있다.

대표적인 교차-차단 또는 경쟁 분석에서, 15D2 또는 5B7(대조군) 항체 및 시험 항체를 혼합(또는 전-흡착)하고, IL20을 함유하는 샘플에 적용한다. 어떤 구체예에서, 하나는 IL20-함유 샘플에 적용시키기 전에 시간의 기간 동안에 대한 시험 항체(예를 들어, 1:10 또는 1:100)의 다양한 양으로 전-혼합된 대조군 항체일 것이다. 다른 구체예에서, 대조군 및 시험 항체의 다양한 양은 항원/표적 샘플에 노출되는 동안 간단히 혼합될 수 있다. 하나가 자유 항체(예를 들어, 비결합된 항체를 제거하기 위한 분리 또는 세척 기술을 사용함으로써)로부터의 결합 및 시험 항체로부터의 대조군 항체를 구분할 수 있는 동안(예를 들어, 다른 혼합물 사이를 구별하기 위하여, 종- 또는 아이소타입- 특이적 이차 항체를 사용함으로써, 검출가능한 표지로 대조군 항체를 특이적으로 표지함으로써, 또는 질량 분석과 같은 물리적 방법을 사용함으로써), 시험 항체가 항원에 대한 대조군 항체의 결합을 감소시킨다면, 하나는 시험 항체가 대조군으로서 실질적으로 동일한 에피토프를 인지하는 것을 가리키는 것을 결정할 수 있을 것이다. 이 분석에서, 완전히 엉뚱한 항체의 존재에서 (표지된) 대조군 항체의 결합이 고가치를 조절한다. 저가치의 대조군은 경쟁이 표지된 항체의 결합을 일으키고, 감소시킬 때, 비표지된 대조군 항체와 함께 비표지된 (양성) 대조군 항체를 배양하는 것에 의해 얻을 수 있다.

실험 분석에서, 시험 항체의 존재에서 표지된 항체 반응성의 유의한 감소는 대조군 항체로서, 동일한 에피토프와 경쟁하거나 실질적으로 결합하는 시험 항체임을 가리키는 것이다. 대략 1:10 및 대략 1:100 사이의 대조군: 시험 항체 또는 혼합물의 임의의 비율에서 적어도 50% 또는 더욱 바람직하게는 70%로 항원/표적에 대한 표지된 대조군의 결합을 감소시키는 임의의 시험 항체 또는 혼합물은 대조군으로서 실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정자와 경쟁하거나 결합하는 항체 또는 혼합물인 것으로 여겨진다. 바람직하게는, 이런 시험 항체 또는 혼합물은 적어도 90%로 항원/표적에 대한 대조군의 결합을 감소시킬 것이다. 그럼에도 불구하고, 대조군 항체의 결합을 감소시키는 임의의 혼합물 또는 항체 또는 임의의 측정 가능한 범위의 혼합물을 본 발명에서 사용할 수 있다.

한 구체예에서, 경쟁은 유세포 분석 시험에 의해 평가할 수 있다. IL20과 관계있는 세포는 hIL20 수용체와 특이적으로 결합하는 것으로 알려진 대조군 항체와 먼저 배양하고, 이후 예를 들어, 형광 색소 또는 비오틴으로 표지할 수 있는 시험 항체와 배양한다. 시험 항체는 만약 대조군 항체의 포화량으로 전배양시켜 얻은 결합(형광의 평균)이 대조군과의 전배양 없이 얻은 결합의 80%, 바람직하게는, 50%, 40% 또는 그 미만일 때, 대조군과 경쟁하는 것으로 말한다. 선택적으로, 시험 항체는 실험에 대하여 항체의 포화량으로 전배양시킨 세포에서 표지된 대조군(형광 색소 또는 비오틴에 의해)에서 얻은 결합이 항체와의 전배양 없이 얻은 결합의 80%, 바람직하게는 50%, 40%, 또는 그 미만일 때, 대조군과 경쟁하는 것으로 말한다. 대표적인 항체 경쟁 분석에 대한 실시예 4를 참조하라.

기능적 분석

본 발명의 항체는 시험관 내 및/또는 생체 내에서 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 IL20-매개 활성화를 감소시키는 능력이 있다. 다양한 적절한 분석이 당업계에 알려져 있다.

예를 들면, 실시예는 하기 원리에 기반을 둔 수용체 복합체 활성화를 검출하는 루시퍼라아제 분석을 기술한다. 간략하면, IL20 결합 및 수용체 복합체 형성에서, 관련된 JAK 키나아제는 자가 인산화하고, STAT3 단백질을 인산화할 수 있다. 인산화된 STAT3은 핵 내로 들어갈 수 있고, 루시퍼라아제를 암호화하는 유전자 옆에 위치한 프로모터의 특정 DNA 요소에 결합한다. 이후 루시퍼라아제가 발현되고, 기질 발광소를 밝게 변환시킬 수 있고, 이후 검출 및 정량할 수 있다.

IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 활성화를 시험하는 것에 대한 시험관 내 분석의 다른 타입은 예를 들어, 인간 또는 다른 종으로부터 나온 IL20 수용체 복합체로 형질도입시킨 BaF-3 세포의 증식에 기반을 둔다. 이런 분석은 예를 들면, hIL20R1/hIL20R2 또는 hIL22R1/hIL20R2를 형질전환시킨 BaF-3 세포의 IL20-유도 증식의 중화 효과에 대하여 시험할 수 있다. BaF-3 세포는 IL3 의존적이고, 그들의 성장 배지에서 IL3의 첨가 후 시험관 내에서 증식한다. 만약, IL3을 사용할 수 없다면, 세포는 이미 IL 고갈의 수 시간 후에 아폽토시스의 신호를 보내고, 수 일 내에 죽을 것이다. 형질도입된 BaF-3 세포가 그들의 IL20 수용체 복합체를 통해 자극되면, 그들은 분열하기 시작할 것이고, IL3을 필요로 하지 않는다. 증식의 억제에 대한 특이적 분석은 실시예에서 기술한다.

가용성 분석

가용성, 즉, 용액 내에서 도달할 수 있는 항체의 농도를 실험하기 위한 적절한 분석을 실시예 3 및 문헌(Harris, E.L.V. (1989) In Harris, E.L.V. and Angal,S. (eds), Protein Purification Methods. A Practical Approach. IRL Press, New York, 예를 들어, pp. 131-133을 참조하라)에서 기술한다.

약학적 제형

한 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 담체와 함께 본 발명에서 기술한 것과 같은 항-hIL20 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 15D2 및 5B7을 포함하는 본 발명의 인간 항체는 고농도가 종종 유리하거나 필요할 때, 예를 들어, 피하 투여에 사용할 때, 약학적 제형을 위해 적절하다.

또한, 그 전체가 본 발명에 참고문헌으로써 포함되는 WO2006003179에서 기술한 약학적 제형 및 투여 방법을 본 발명의 항체 및 용도를 위해 사용할 수 있다.

본 발명의 하나의 목적은 전형적으로 수성 또는 동결-건조 제형(재구성을 위해)에서, 1 mg/ml 내지 150 mg/ml, 1 mg/ml 내지 200 mg/ml, 또는 1 mg/ml 내지 500 mg/ml의 농도로 존재하는 본 발명의 항체를 포함하는 약학적 제형을 제공하는 것이고, 상기 제형은 2.0 내지 10.0의 pH, 전형적으로 중성 pH 근처를 가진다. 바람직하게는, 수성 제형에서, 항체는 최소 대략 50 mg/ml, 적어도 대략 60 mg/ml, 적어도 대략 70 mg/ml, 적어도 대략 80 mg/ml, 적어도 대략 90 mg/ml, 또는 적어도 대략 100 mg/ml의 농도에서 가용성 형태로 존재한다. 제형은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 및/또는 담체를 더 포함할 수 있다. 이들은 예를 들어, 버퍼 시스템뿐만 아니라, 보존제, 등장제, 킬레이트제, 안정제 및/또는 계면활성제를 포함할 수 있다. 적절한 담체가 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, Remington: The Science 및 Practice of Pharmacy, ¹⁹th edition, 1995.에 기술되어 있다.

또한, 적절한 항체 제형은 이미 개발된 다른 치료용 단일클론 항체를 사용한 경험을 시험하는 것에 의해 결정할 수 있다. Rituxan(Rituximab), Herceptin(Trastuzumab) Xolair(Omalizumab), Bexxar(Tositumomab), Campath(Alemtuzumab), Zevalin, Oncolym, Humira와 같은 몇몇의 단일클론 항체는 임상적 상황에서 효과적인 것을 나타내었고, 유사한 제형이 본 발명의 항체와 사용할 수 있다. 예를 들면, 단일클론 항체는 주사를 위해 9.0 mg/mL 염화나트륨, 7.35 mg/mL 구연산나트륨 이수화물, 0.7 mg/mL 폴리소르베이트 80에서 i.v. 투여를 위해 제형화된 100 mg(10 mL) 또는 500 mg(50 mL) 중 하나의 단일-사용 유리병에서 10 mg/mL의 농도로 공급할 수 있다. pH는 6.5 근처이다. 선택적으로, 항체는 인산염 버퍼, 또는 히스티딘, 수크로오스 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 용액 내에서 제형화할 수 있다.

진단 용도

또한, 본 발명의 hIL20-항체는 비-치료 용도를 갖는다. 예를 들면, 항-hIL20 항체는 IL20 단백질에 대한 진단 분석, 예를 들어, 특정 조직, 조직 표본(예를 들어, 윤활액) 또는 혈청에서 그것의 존재를 검출하는 것에 또한 유용할 수 있다.

진단 용도를 위하여, 항체는 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 보통 다음 카테고리로 분류할 수 있는 다양한 표지들이 사용가능하다:

(a) ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, 및 ¹³¹I와 같은 방사성 동위 원소. 항체는 예를 들면, 문헌(Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991))에서 설명한 기술을 사용하여 방사성 동위 원소로 표지할 수 있고, 방사성활성 형광 집계를 사용하여 측정할 수 있다.

(b) 희토류 원소(유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린 및 텍사스 레드와 같은 형광 표지를 사용할 수 있다. 형광 표지는 예를 들면, 상기 문헌(Current Protocols in Immunology)에서 개시된 기술을 사용하여 항체에 접합시킬 수 있다. 형광은 형광계를 사용하여 정량할 수 있다.

(c) 다양한 효소-기질 표지를 사용할 수 있고, 미국 특허 번호 4,275,149는 이들 중 일부에 대한 개관을 제공한다. 효소는 보통 다양한 기술을 사용하여 측정할 수 있는 발색성 기질의 화학적 변화를 촉진한다. 예를 들면, 효소는 분광광도계로 측정할 수 있는 기질의 색깔 변화를 촉진할 수 있다. 선택적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학 발광을 바꿀 수 있다. 효소적 표지의 예시는 루시퍼라아제(예를 들어, 반딧불 루시퍼라아제 및 박테리아성 루시퍼라아제; 미국 특허 번호 4,737,456), 발광소, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말산염 탈수소화 효소, 우레아제, 양고추냉이 페록시다아제(HRPO)와 같은 페록시다아제, 알칼리 인산분해효소, 베타-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 당 산화효소(예를 들어, 포도당 산화효소, 갈락토오스 산화효소, 및 글루코스-6-인산염 탈수소화 효소, 이종고리 산화효소(요산 분해 효소 및 잔틴 산화효소와 같은), 락토페록시다아제, 마이크로페록시다아제, 등을 포함한다. 항체에 효소를 접합시키는 기술은 문헌(O'Sullivan et al, "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzymology (Ed., J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166 (1981))에서 기술한다.

또한, 항체는 생체 내 진단 분석에서 사용할 수 있다. 보통, 항체는 방사성 핵종 또는 예를 들어, 핵 자기 공명, 또는 다른 당업계에서 알려진 수단에 의해 검출가능한 비-방사성 지시자로 표지한다. 바람직하게는, 표지는 예를 들어, ¹²⁵I, ¹³¹I, ⁶⁷Cu, ^99mTc, 또는 ¹¹¹In와 같은 검출용 방사성 동위 원소이다. 표지된 항체는 숙주, 바람직하게는 혈류를 통해 투여하고, 숙주 내에서 표지된 항체의 존재 및 위치를 분석한다. 이 이미징 기술은 윤활액 및 윤활막에서 IL20의 가시화에 의해 검출, 스테이징, 또는 문제의 질병 또는 장애, 예를 들면, 류마티스성 관절염, 청소년 류마티스성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 전신성 홍반성 루푸스 및/또는 루푸스 신염의 치료에서 적절하게 사용한다. 방사성 동위 원소는 요오드화를 위한 금속-킬레이트 혼합물 요오드생성 기술을 포함하는 임의의 수단에 의해 단백질에 접합시킨다.

편의에 관한 문제로서, 본 발명의 항체는 진단 분석을 수행하기 위한 지침서와 함께 키트에서, 즉, 시약의 포장된 조합을 미리 결정된 양으로 제공할 수 있다. 항체가 효소로 표지되어 있을 때, 키트는 효소에 의해 요구되는 기질 및 보조 인자를 포함할 것이다(예를 들어, 검출가능한 크로모포어 또는 플루오로포어를 제공하는 기질 전구체). 삽입에서, 다른 부형제는 안정제, 버퍼(예를 들어, 차단 버퍼 또는 용해 버퍼) 등과 같은 것을 포함할 수 있다. 다양한 시약의 비교량은 분석의 감도를 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 내 농도에 대하여 제공하기 위하여 널리 다양할 수 있다. 특히, 시약은 용해에서 적당한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 것인 부형제를 포함하는, 보통 감압하에 동결건조한 건조 분말로서 제공할 수 있다.

치료 용도

본 발명에서 기술한바, 인간 또는 인간화 항-hIL20 항체를 사용하여 환자를 치료하는 방법을 또한 본 발명에서 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명은 인간 환자에게 투여하기 위한 약학적 조성물의 제조에서 본 발명에서 기술한바 인간 또는 인간화 항체의 용도를 제공한다. 전형적으로 환자는 자가 면역 또는 염증 질환 또는 장애를 앓고 있거나 그에 대한 위험이 있다.

한 측면에서, 본 발명의 항체 및 다른 혼합물로 치료할 이상 또는 장애는 류마티스성 관절염, 청소년 류마티스성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 궤양성 대장염 및 크론병과 같은 염증성 장 질환, 전신성 홍반성 루푸스, 또는 루푸스 신염, 및 임의의 이들의 조합뿐만 아니라, 이들 질병과 관련한 공존이환, 상기 공존 이환의 제한 없는 예시가 될 심혈관 질환을 포함한다. 나아간 측면에서, 다른 대표적인 이상은 청소년 류마티스 관절염, 골관절염, 다른 척추관절증 이외에 강직성 척추염, 전신성 경화(경피증), 특발성 염증성 근 질환(피부근염, 다발성 피부근염), 맥관염, 전신성 맥관염, 측두 동맥염, 동맥경화, 유육종증, 중증 근무력증, 자가 면역 용혈성 빈혈(면역 범혈구감소증, 발작성야간혈색소뇨증), 악성 빈혈, 자가 면역 혈소판 감소증(특발성 혈소판감소성 자반병, 면역-매개 혈소판 감소증), 갑상선염(그레이브병, 하시모토 갑상선염, 청소년 림프구성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 진성 당뇨병, 2형 당뇨, 면역-매개 신장 질병(사구체신염, 신세뇨관 간질성 신염, 자가 면역 난소염), 췌장염, 자가 면역 고환염, 자가 면역 포도막염, 항-인지질 증후군, 다발성 경화증에 추가하여 중추 신경계 및 말초 신경계의 탈미엘린화 질병, 특발성 탈미엘린화 말초신경병증 또는 길랑-바레 증후군, 및 만성 염증 탈미엘린화 말초신경병증, 전염성 간염(A, B, C, D, E형 및 다른 비-간친화성 바이러스성 간염), 자가 면역 만성 활성 간염, 바이러스성 간염, 일차 쓸개즙 간경변증, 육아종성 간염, 베게너육아종증, 베체트병, 및 경화성 담관염과 같은 간담즙성 질병, 셀리악병, 글루텐-과민성 장병, 및 휘플씨병과 같은 염증성 장 질환, 수포성 피부병, 다형성 홍진 및 접촉 피부염을 포함하는 자가 면역 또는 면역-매개 피부병 아토피 피부염, 포진피부염, 심상성 천포창, 백반증(백반), 천식, 알레르기성 비염, 아토피 피부염, 음식과민증 및 두드러기와 같은 알러지성 질환, 패혈증, 내독소혈증, 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증 및 과민성 폐렴과 같은 폐의 면역성 질병, 만성폐쇄성 폐질환, 및 이식편거부반응 및 이식편대숙주병을 포함하는 기관 또는 골수 이식과 관련한 질병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

예를 들면, 한 측면에서, 항-IL20 항체는 진통제, 면역억제 제제(예를 들어, B 세포 고갈 제제 및 T 세포 억제제와 같은 B- 또는 T 세포 길항제; 보체 억제제), 코르티코스테로이드, 및 항-TNF알파 제제 또는 다른 항-사이토카인 또는 항-사이토카인 수용체 제제, 및 항-신생혈관 제제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 다른 항-염증 제제와의 조합으로 사용한다. 특이적 예시는 메토트렉사트, TSG-6, Rituxan 또는 다른 B 세포 치료, 항-IL12 항체, CTLA4-Fc 융합 단백질, IL1-수용체 길항제, IL1 항체, IL15 항체, IL18 항체, 및 항-IL6R 항체를 포함한다. 조합 치료의 나아간 예시를 하기에서 제공한다.

하나 이상의 다른 제제 또는 접근이 본 치료와 조합하여 사용되었을 때, 각각의 치료를 분리하여 수행하였을 때 관찰된 효과의 부가적인 결과를 결합할 필요는 없다. 적어도 부가적인 효과가 보통 바람직함에도 불구하고, 상기 단일 치료의 하나의 IL20 활성 또는 다른 이로운 효과의 임의의 감소가 이로울 것이다. 또한, 시너지 효과를 나타내기 위해 결합된 치료에 대한 특정 요구는, 이것이 확실히 가능하고 유리할지라도, 없다. IL20-기반 치료는 예를 들어, 수 분 내지 몇 주 및 몇 달의 범위의 간격에 의해 다른 치료보다 앞서거나 이후일 수 있다. 또한, 항-IL20 조성물 또는 다른 제제 중 하나의 한 번 이상의 투여를 사용할 것을 구상한다. 제제는 수 일 또는 몇 주씩 걸러서 교환할 수 있게 투여할 수 있고; 또는 다른 제제 치료의 주기에 이어 항-IL20 치료의 주기를 줄 수 있다. 임의의 사건에서, 모든 것은 투여의 시간에 상관없이, 치료상 이로운 효과를 발휘하기에 효과적인 결합된 양으로 모든 제제를 전달하는 것을 요구한다.

류마티스성 관절염

류마티스성 관절염(RA)은 관절 연골에 대한 결과적인 손상이 있는 다중 관절의 윤활막에 주로 포함되는 만성 전신성 자가 면역 염증 질환이다. 병인은 관절액 및 혈액에서 고 수준에 이른 면역 복합체의 결과적인 형성과 함께, 류마토이드 인자, 자가 IgG에 대하여 유도된 자가 항체의 생산에 의존하고, 관련한 T 림프구이다. 관절에서 이들 복합체는 윤활막으로의 림프구 및 단핵구의 두드러진 침투 및 그 후의 두드러진 윤활액 변화를 유도할 수 있고; 관절 간격은 다수의 호중구가 첨가된 유사한 세포에 의해 침투된다. 영향을 받는 조직은 종종 대칭적인 패턴의 일차 관절이다. 그러나, 또한 관절-외 질병이 두 가지 주된 형태로 일어난다. 한 형태는 폐섬유증, 맥관염, 및 피부 궤양의 진행하는 관절 질병 및 폐섬유증, 맥관염 및 전형적인 병변의 전진과 함께 관절-외 병변의 발달이다. 관절-외 질병의 두 번째 형태는 RA 질환 단계의 후기, 때때로 관절 질환이 나은 다음에 발병하는 소위 펠티 증후군이고, 호중구감소증, 혈소판 감소증 및 비장비대증을 존재를 포함한다. 이것은 경색, 피부 궤양 및 괴저의 형성과 함께 다중 기관에서 맨관염을 수반할 수 있다. 또한 환자는 종종 영향을 받는 관절을 덮은 피하 조직에서 류마티스 결절을 발달시키고, 후기의 결절은 침투한 혼합 염증 세포에 의해 둘러싸인 괴저성 중심을 갖는다. RA에서 일어날 수 있는 다른 명단은 폐섬유증, 건선각결막염, 및 류마티스결절과 함께 심막염, 늑막염, 관상 동맥염, 간질성 폐렴을 포함한다. IL20은 류마티스성 관절염 윤활액에서 증명된 바 있다(Hsu et al. (2006) Arthritis Rheum. 54, 2722-2733; Kragstrup et al., (2008) Cytokine 41, 16-23), and IL20 receptor expression has been demonstrated in rheumatoid Arthritis synovium (Hsu et al., (2006) Arthritis Rheum. 54, 2722-2733; Sakurai et al., (2008) Rheumatology (Oxford) 47, 815-820).

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 류마티스성 관절염(RA)의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 방법은 RA를 갖는 환자에게 항-hIL20 항체의 효과량을 전달하는 단계 또는 RA가 발달할 상당한 위험에 있는 것으로 확인/진단하는 단계를 포함하고, 이런 RA는 치료 또는 예방된다. 나아간 측면에서, IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 IL20-매개 활성화를 검출가능하게 감소시키는 능력이 있는 항체이다. 한 측면에서, 방법은 RA의 치료 또는 예방(가능한 만큼)과 일치하는 방법에서 하나 이상의 바이오마커의 조절을 야기한다(예를 들어, 혈청 IL-6, TNF-a, IL1, VEGF, TIFF R, IL2R, shed CD4, shed CD8, 및/또는 C 활성 단백질). 본 발명의 항체를 최적으로 시험할 수 있는 RA의 생체 내 모델은 미국 특허 번호 6,414,218 및 미국 특허 출원 번호 20030005469에서 기술한다(관련된 원리 및 모델은 예를 들면 문헌(ooley, P. H., Animal Models of Arthritis, eds. J. H. Klippel and P. A. Dieppe, Mosby Publishers (London), 1998; Erning et al., Arthritis Res, 4 Suppl 3:S 133-40, 2002; Holmdahl et al., Ageing Res Rev, 1(1): 135-47, 2002; Anthony et al., Clin Exp Rheumatol, 17(2) :240-4,1999; Durie et al., Clin Immunol Immunopathol, 73(1):11-8, 1994; and Muller-Ladner et al., Drugs Today (Bare), 35(4-5):379-88, 1999)에서 기술한다).

다른 측면에서, 방법의 실행은 환자/숙주의 말단 관절에서 윤활액의 염증의 검출가능한 감소를 야기한다. 한 측면에서, 방법은 방사선 사진의 변질을 막는 단계 및, 예를 들어, 환자 또는 숙주에서 방사선 사진 진행에서의 저하, 부풀고 약해진 관절의 저하(허용가능한 분석적 표준에 의해 결정된 것처럼), 및/또는 유의하게 개선된 생활 수준(예를 들어, RA 건강 사정 질문서의 장애 점수에서의 저하에 의해 결정된 것처럼)에 의해 나타나는 환자 또는 숙주에서 생리학적 기능을 개선하는 단계에서 기인한다. 항체는 단독 또는 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID), COX-2 억제자, 진통제, 코르티코스테로이드(예를 들어, 프리디니손, 히드로코르티손), 금, 면역억제제(예를 들어, 메토트렉사트), B 세포 고갈 제제(예를 들어, Rituxan), B 세포 작용제(예를 들어, LymphoStat-B) 및 항-TNF알파 제제(예를 들어, Embrel, Humira 및 Remicade), 항-IL1 수용체 길항제(예를 들어, Kineret), 항-IL15 항체, 또는 질병-변형 항-류마티스 약물(DMARD)과 같은 하나 이상의 다른 항-RA 제제와의 조합으로 사용할 수 있다.

탈미엘린화 질병

다발성 경화증(MS); 특발성 탈미엘린화 말초신경병증 또는 길랑-바레 증후군; 및 만성 염증 탈미엘린화 말초신경병증을 포함하는 중추신경계 및 말초신경계의 탈미엘린화 질병은 자가 면역 기반을 갖는 것으로 믿어지고, 올리고덴드로사이트에 또는 미엘린에 직접적으로 유발한 손상의 결과로서 신경세포 탈미엘린화를 야기한다. MS에서 질병 유도 및 진행이 T 림프구에 의존적이라는 증거가 있다. MS는 T 림프구-의존성이고, 재귀-감퇴 코스 또는 만성 진행 코스 중 하나를 갖는 탈미엘린화 질병이다. 병인을 알려져 있지 않고; 그러나, 바이러스 감염, 유전적 경향, 환경 및 자가 면역성이 모두 기여한다. 병변은 두드러지게 T 림프구에 의해 매개된 미세아교 세포의 침투 및 대식 세포의 침투를 함유하고; CD4+ T 림프구는 병변에서 우세한 세포 타입이다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 MS를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 방법은 MS를 갖는 환자에게 항-hIL20 항체의 효과량을 전달하는 단계 또는 MS가 발달할 상당한 위험에 있는 것으로 확인/진단하는 단계를 포함하고, 이런 MS는 치료 또는 예방된다. 항체는 단독 또는 Tyzabri과 같은 다른 항-MS 제제와 조합하여 사용할 수 있다.

염증성 장 질환

다른 측면에서, 본 발명은 크론병 또는 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환(IBD)의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.

염증성 장 질환을 치료하는 방법은 IBD를 갖는 인간 환자에게 항-hIL20 항체의 효과량을 전달하는 단계 또는 IBD가 발달할 상당한 위험에 있는 것으로 확인/진단하는 단계를 포함하고, 이런 IBD는 환자에서 치료 또는 예방된다. 항체는 단독 또는 메살라민(설프아자라진 및 올살라진 및 발살라자이드와 같은 5-아미노살리실산(5-ASA)를 함유하는 다른 제제를 포함)을 함유하는 약물, 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID), 진통제, 코르티코스테로이드(예를 들어, 프리디니손, 하이드로코르티손), TNF-억제자(아디리무맙(Humira), 에타네르셉트(Enbrel) 및 인플릭시맙(Remicade)을 포함), 항-IL12 항체, 면역억제제(6-머캅토퓨린, 아자티오프린 및 사이클로스포린 A와 같은), 및 항생제와 같은 다른 항-IBD 제제와 조합하여 사용할 수 있다.

건선

건선은 T 림프구-매개 염증 질환이다. 병변은 T 림프구, 대식 세포 및 항원 가공 세포, 및 일부 호중구의 침투를 함유한다. IL20 및 그의 수용체는 건선 병변에서 증가된 수준에서 존재한다(Wei et al., Clin Immunol (2005) 117: 65-72; Rømer et al., J Invest Dermatol 2003; 121, 13061311; Wang et al., J Invest Dermatol 2006; 126: 1590-1599; Otkjær et al., Br J Dermatol 2005; 153: 911-918).

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 건선을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 방법은 건선을 갖는 환자에게 항-hIL20 항체의 효과량을 전달하는 단계 또는 건선이 발달할 상당한 위험에 있는 것으로 확인/진단하는 단계를 포함하고, 이런 건선은 환자에서 치료 또는 예방된다. 항체는 단독 또는 광선 요법, 국소 치료(예를 들어, 타르, 국소 글루코코르티코이드), 또는 전신성 치료(예를 들어, 메토트렉사트, 합성 레티노이드, 사이클로스포린), 항-TNF알파 제제(예를 들어, Embrel, Humira, Remicade), T 세포 억제자(예를 들어, Raptiva), 비타민 D 유도체, p38 미토겐-활성 단백질 키나아제(MAPK) 억제자뿐만 아니라 Rituxan와 같은 생물학적 제제와 같은 하나 이상의 다른 항-건선 치료와의 조합으로 사용할 수 있다.

건선성 관절염

건선성 관절염은 피부, 관절, 힘줄의 추가 부위, 인대, 및 근막에 영향을 주는 만성 염증성 관절이고, 보통 건선과 관련한다.(건선이 있는 환자의 대략 7%에서 건선성 관절염이 발달함). 많은 증거들이 T-세포 매개 가공이 건선성 관절염의 병리 생리학을 작동시키는 것을 시사한다. 또한, 단핵구가 건선성 관절염에서 역할하며, 건선성 관절염이 있는 환자의 관절에서 파괴적인 변화를 매개하는 매트릭스 메탈로프로테아제의 생산에 기여한다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 건선성 관절염의 치료 및/또는 예방을 위한 방법을 제공한다. 방법은 건선성 관절염을 갖는 인간 환자에게 항-hIL20 항체의 효과량을 전달하는 단계 또는 건선성 관절염이 발달할 상당한 위험에 있는 것으로 확인/진단하는 단계를 포함하고, 이런 건선성 관절염은 환자에서 치료 또는 예방된다. 항체는 단독 또는 비스테로이드성 항-염증 약물(아스피린, 이부프로펜), 메토트렉사트, 합성 레티노이드, 사이클로스포린, 코르티코스테로이드, 항-TNF알파 제제(예를 들어, Embrel, Humira, Remicade)와 같은 하나 이상의 다른 항-건선성 관절염 처치와의 조합에서 사용할 수 있다.

전신성 홍반성 루푸스

전신성 홍반성 루푸스(SLE)에서, 질병의 중심적 매개자는 자가 단백질/조직에 대한 자가-반응 항체의 생산 및 그 후의 면역-매개 염증의 생성이다. 항체는 직접 또는 간접적으로 조직 상해를 매개한다. 비록 T 림프구가 조직 손상에 직접적으로 포함된 증거를 보여준 적은 없지만, T 림프구는 자가-반응 항체의 발달에 필요하다. 질병의 생성은 따라서 T 림프구 의존적이다. 신장, 폐, 근골격계, 점액 피부, 눈, 중추 신경계, 심혈관계, 위장 기관, 골수 및 혈액을 포함하는 다중 기관 및 시스템이 임상적으로 영향을 받는다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 SLE의 치료 및/또는 예방을 위한 방법을 제공한다. 방법은 SLE를 갖는 인간 환자에게 항-hIL20 항체의 효과량을 전달하는 단계 또는 SLE가 발달할 상당한 위험에 있는 것으로 확인/진단하는 단계를 포함하고, 이런 SLE는 환자에서 치료 또는 예방된다. 항체는 단독 또는 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID), 진통제, 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레디니손, 하이드로코르티손), 면역억제제(사이클로포스파미드, 아자티오프린 및 메토트렉사트와 같은), 말라리아 예방약(하이드록시클로로퀴닌과 같은) 및 dsDNA 항체(예를 들어 LIP 394)의 생산을 억제하는 생물학적 약물과 같은 다른 항-SLE 제제와의 조합에서 사용할 수 있다.

당뇨

I형 진성 당뇨병 또는 인슐린-의존성 당뇨는 췌장 섬 B 세포의 자가 면역 파괴이고; 이 파괴는 자가-항체 및 자가-반응 T 세포에 의해 매개된다. 인슐린 또는 인슐린 수용체에 대한 항체는 또한 인슐린-비-응답성의 표현형을 생산할 수 있다.

따라서, 다른 측면에서, 항-IL20 항체는 I형 진성 당뇨병을 앓고 있거나, I형 진성 당뇨병이 발달할 상당한 위험이 있는 환자에게 환자의 이상을 치료 또는 예방하기에 충분한 양으로 및 조건하에서 전달한다. 항체는 단독으로 또는 인슐린, 또는 베타 세포 성장 또는 생존 인자, 또는 항-CD3 항체와 같은 면역조절 항체와 같은 다른 항-당뇨 제제의 조합으로 사용할 수 있다.

이식

이식편거부반응 및 이식편대숙주병(GVHD)을 포함하는 이식 관련 질병은 T 림프구-의존성이고; T 림프구 기능의 억제는 개량적이다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 이식 거부반응의 있음직함을 감소시키는 방법을 제공한다(또는 이식 거부반응-관련 조건의 심각성을 감소시키거나 징후까지의 시간을 연장시키는 것, 즉, 동종 이식편의 생존을 연장시키는 것). 방법은 조직/장기 이식의 수여자가 되거나, 최근에 된 인간 환자에게 항-hIL20의 효과량을 전달하는 단계를 포함하고, 이런 거부반응의 있음직함은 직접적으로 감소한다(예를 들어, 대조군과 비교하여). 치료할 수 있는 조직 이식의 예시는 간, 폐, 신장, 심장, 소장 및 췌장 섬 세포뿐만 아니라 골수-이식 및 이식편대숙주질병(GCHD)의 치료를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 항체는 단독 또는 면역억제 제제(예를 들어 사이클로스포린, 아자티오프린, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 마이코페놀레이트 모페틸, 시릴리머스, 라파마이신, 타크롤리머스), 항-전염성 제제(예를 들어, 아시클로비어, 클로트리마졸, 간시클로비어, 니스타틴, 트리메토프림설파르네톡사졸), 이뇨제(예를 들어 부메타니드, 푸로세마이드, 메토라존) 및 궤양 약(예를 들어, 시메티딘, 파르노티딘, 란소프라졸, 오메프라졸, 라니티딘, 수크랄페이트)과 같은 이식 거부반응을 억제하기 위한 다른 제제와의 조합에서 사용할 수 있다. 조혈제 이식을 위하여, 조혈 성장 인자(예를 들어, 에리스로포이에틴, G-CSF, GM-CSF, IL3, IL11, 트롬모포이에틴, 등) 또는 항균제(예를 들어, 항생제, 항바이러스제, 항곰팡이제)를 보조 치료로서 투여할 수 있다.

다른 자가 면역 또는 염증 질환

다른 분리된 측면에서, 본 발명은 질병 또는 장애를 갖는 인간 환자에게 항-hIL20 항체의 효과량을 전달하는 단계 또는 질병 또는 장애가 발달할 상당한 위험이 있는 것으로 확인/진단하는 단계를 포함하는, 다른 자가 면역 또는 염증 질환 또는 장애를 치료 및/예방하기 위한 방법을 제공하고, 질병 또는 장애가 하기에서 기술하는 하나일 때, 환자에서 치료 또는 예방된다. 항체는 단독 또는 질병 또는 장애를 치료하기 위해 사용되는 다른 치료제와의 조합에서 사용할 수 있다.

청소년 류마티스 관절염은 16세 미만에서 종종 시작하는 만성 특발성 염증 질환이다. 그것의 표현형은 RA와 일부 유사성을 갖고; 류마토이드 인자 양성인 일부 환자를 청소년 류마티스성 관절염으로서 분류한다. 질병은 세 가지 주된 카테고리로 서브-분류한다: 소수관절, 다관절, 및 전신성. 관절염은 심할 수 있고, 전형적으로 파괴적이며, 관절 강직 및 지체된 성장을 야기한다. 다른 징후는 만성 전방성 포도막염 및 전신성 유전분증을 포함할 수 있다.

척추관절증은 일부 공통된 임상적 특징 및 HLA-B27 유전자 산물의 발현과 공통된 관계를 갖는 장애의 그룹이다. 장애는 강직성 척추염, 라이터 증후군(활성 관절염), 염증성 장 질환과 관련된 관절염, 건선과 관계된 척추염, 청소년의 척추관절증 및 구분되지 않는 척추관절증의 징후를 포함한다. 특징적인 특징은 첨추염을 동반하거나 동반하지 않는 천장골염; 염증 비대칭 관절염; HLA-B27(클래스 I MHC의 HLA-B 유전자좌의 대립유전자로 혈청학적으로 결정됨)과의 관련; 눈 염증, 및 다른 류마티스 질병과 관련한 자가 항체의 부재를 포함한다. 질병의 유도의 열쇠로서 가장 관련된 세포는 클래스 I MHC 분자에 의해 표적 항원을 제시하는 세포인, CD8+ T 림프구이다. CD8+ T 세포는 만약 클래스 I MHC 대립유전자 HLA B27이 MHC 클래스 I 분자에 의해 발현된 외부 펩티드라면, 그것에 대하여 반응할 수 있다. HLA-B27의 에피토프가 박테리아 또는 다른 미생물 항원성 에피토프를 미믹하고 따라서 CD8+ T 세포 반응을 유도할 수 있다는 가설을 세웠다.

전신성 경화(경피증)는 병인이 알려지지 않았다. 질병의 특질은 피부의 경결이고; 아마 이것은 활성 염증 과정에 의해 유도된다. 경피증은 국소 또는 전신성일 수 있고; 혈관의 병변이 일반적이고, 미세혈관계에서의 내피세포 손상은 전신성 경화의 발달에서 초기 및 중요한 이벤트이고; 혈관 손상은 면역 매개일 수 있다. 면역학적 기초는 피부 병변에서 침투한 단핵구 세포의 존재 및 많은 환자에서 항-핵 항체의 존재에 의해 암시된다. ICAM-1은 피부 병변에서 섬유아세포의 세포 표면에서 종종 규제되지 않는데, 이것은 이들 세포와의 T 세포 상호작용이 질병의 병인으로 역할을 할 수 있음을 시사한다. 포함된 다른 기관은 위장관: 비정상적 연동/운동성에서 기인한 평활근 위축 및 섬유증; 신장: 결과적인 감소된 신장 피질 혈액 흐름을 갖는 작은 궁상 및 소엽사이 동맥에 영향을 주는 동심원 내피밑 내막 증식이 단백뇨, 질소혈 및 고혈압을 야기하고; 골격근: 위축, 간질 섬유증; 염증; 폐: 간질 폐렴 및 간질 섬유증; 및 심장: 수축 밴드 괴사, 흉터/섬유증을 포함한다.

피부근염, 다발성 피부근염 및 기타를 포함하는 특발성 염증 근 질환은 근육 약화를 야기하는 알려지지 않은 병인의 만성 근육 염증의 장애이다. 근육 상해/염증은 종종 대칭적이고, 진행성이다. 자가항체는 대부분의 형태에서 관련된다. 이들 근염-특이적 자가항체는 단백질 합성에 포함된 구성요소, 단백질 및 RNA에 대하여 직접 표적하여 기능을 억제한다.

쇼그렌 증후군은 면역-매개 염증 및 눈물선 및 타액선의 결과적인 기능적 파괴에 기인한다. 질병은 염증 결합 조직 질병과 관련하거나 동반될 수 있다. 질병은 모두 작은 RNA-단백질 복합체인, Ro 및 La 항원에 대한 자가항체 생산과 관련한다. 병변은 다른 징후를 갖는 건선각결막염, 구강건조증 또는 담도계 간경화, 말단 또는 지각성 신경병증, 및 촉지자색반을 포함하는 다른 관계를 야기한다.

전신성 맥관염은 일차 병변이 염증 및 영향을 받은 관 및 어떤 경우에서 최종적인 말단-장기 기능장애에 의해 공급된 조직에 허혈/괴사/파괴를 야기하는 혈관에 대한 이후의 손상이다. 맥관염은 또한 류마티스성 관절염, 전신성 경화 등과 같은 다른 면역-염증 매개 질병, 또한, 특히 면역 복합체의 형성과 관련된 질병에 대한 이차 병변 또는 후유증으로서 일어날 수 있다. 일차 전신성 맥관염 그룹에서 질병은 전신성 괴사 맥관염: 결정성 다발성 동맥염, 알레르기성 폐포염 및 육아종증, 다발성맥관염; 베게너육아종증; 림프종양 육아종증; 및 거대 세포 동맥염을 포함한다. 여러 가지 종류의 맥관염은 점액피부 림프절 증후군(MLNS 또는 가와사키병), 분리된 CNS 맥관염, 베체트병, 폐쇄혈전혈관염(버거씨병) 및 피부 괴사 세정맥염을 포함한다. 언급된 맥간염의 대부분의 타입의 발병 기작은 혈관벽에서 면역글로불린 복합체의 침전, 이후의 ADCC, 보체 활성화 중 어느 하나, 또는 둘 다를 통한 염증 반응의 유도에서 일차적으로 기인하는 것으로 믿어진다.

유육종증은 신체에서 가까운 임의의 조직에서 상피모양 육아종의 존재에 의해 특징지어진 알려지지 않은 병인의 이상이고, 폐의 연루가 대부분 공통이다. 병인은 활성화된 대식 세포 및 림프 세포에 의해 분비된 국소 및 전신성 활성 산물의 분비로부터 기인한 이후의 만성 후유증을 갖는 질병의 부위에서 이들 세포 타입의 영속성을 포함한다.

자가 면역 용혈성 빈혈, 면역 범혈구감소증, 및 발작성 야간 혈색소뇨증을 포함하는 자가 면역 용혈성 빈혈은 적혈구의 표면에 발현된 항원에 대하여 반응하는 항체의 생산에 기인하고(그리고 게다가 일부 경우에서 혈소판을 포함하는 다른 혈구세포) 및 보체 매개 용해 및/또는 ADCC/Fc-수용체-매개 기작을 통해 이들 항체가 코팅된 세포의 제거를 반영한다.

다른 임상적 상황에서 혈소판감소성 자반병, 및 면역-매개 혈소판 감소증을 포함하는 자가 면역 혈소판 감소증에서 혈소판에 부착하는 항체 또는 보체 중 어느 하나 및 이후의 보체 용해, ADCC 또는 Fc-수용체 매개 기작에 의한 제거 혈소판 파괴/제거의 결과로서 일어난다.

그레이브병, 하시모토 갑상선염, 청소년 림프구성 갑상선염, 및 위축성 갑상선염을 포함하는 갑상선염은 갑상선에서 존재하고, 종종 갑상선에 대하여 특이적인 단백질과 반응하는 항체의 생산과 함께 갑상선 항원에 대한 자가 면역 반응의 결과이다. 자발적인 모델을 포함하는 실험 모델이 존재한다: 래트(BUF 및 BB 래트) 및 닭(비만 닭 계통); 유도성 모델: 티로글로불린, 갑상선 마이크로솜 항원(갑상선 페록시다아제)으로 면역화한 동물.

사구체신염 및 신세뇨관 간질성 신염을 포함하는 면역 매개 신장 질병은 신장 항원에 대한 자가활성 항체 또는 T 세포의 생산의 결과로서 직접적으로 또는 다른, 비-신장 항원에 대하여 활성인 신장에서 항체 및/또는 면역 복합체의 침천의 결과로서 간접적으로 중 어느 하나로 신장 조직에 대한 항체 또는 T 림프구 매개 상해의 결과이다. 따라서 면역-복합체의 형성에 기인한 다른 면역-매개 질병은 또한 간접적인 후유증으로서 면역 매개 신장 질병을 유도할 수 있다. 직접 및 간접적 면역 기작은 모두 결과적인 장기 기능 손상 및 일부 경우에서 신장 기능 부전으로의 진행과 함께 신장 조직에서 병변 발달을 생산/유도하는 염증 반응을 야기한다. 체액성 및 세포성 면역 기작은 모두 병변의 병인에 포함될 수 있다.

호산구성 폐렴; 특발성 폐섬유증, 및 과민성 폐렴을 포함하는 염증 및 섬유성 폐질환은 조절되지 않는 면역-염증 반응을 포함할 수 있다. 이런 반응의 억제는 치료적 이점이 될 것이다.

수포성 피부병, 다형성 홍진, 및 접촉 피부염을 포함하는 자가 면역 또는 면역-매개 피부병은 자가-항체에 의해 매개되고, 이것의 생성은 T 림프구 의존적이다.

천식; 알레르기성 비염; 아토피 피부염; 음식과민증; 및 두드러기를 포함하는 알러지병은 T 림프구 의존적이다. 이들 질병은 T 림프구 유도 염증, IgE 매개-염증 또는 이들의 조합에 의해 우세하게 매개된다.

IL20 항체의 효과량뿐만 아니라 전체 투여 요법이 질병 및 환자의 임상적 상태에 따라 다양할 것임을 이해할 것이고, 교대로, 임상적으로 수득한 질병 점수와 같은 하나 이상의 임상적 매개변수에 반영시킬 것이다. 예를 들면, 류마티스성 관절염에 있어서 질병의 심각성 및/또는 치료의 결과는 부은 관절의 수; 통증; 이동성; 및/또는 공식 질병 스코어 ACR 20/50 또는 70을 조사함으로써 평가할 수 있다. 1형 당뇨에 있어서, 질병의 심각성 및/또는 치료의 결과는 혈당량 또는 이의 변화량, HblC 수준, 필요한 인슐린의 양, 등을 측정함으로써 평가할 수 있다. 다발성 경화증에 있어서, 뇌 염증은 뇌 스캐닝을 통해 평가할 수 있다. 조혈제 이식 거부반응에 있어서, 질병의 심각성(접목의 실패) 및/또는 치료의 결과는 골수파괴성 조절을 겪은 환자에서 증가된 호중구 감소증, 혈소판 감소증 및 적혈구 트랜스융합 의존의 증거에 의해, 그리고 비-골수파괴성 조절을 겪은 환자에서 키메라현상을 관찰하는 것의 실패에 의해 평가할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 치료 결과에서 검출가능한 효과는 다른 치료(예를 들어, 다른 약물 또는 치료의 양 및/또는 기간에서의 감소를 포함)에 대한 필요의 감소, 입원 수 및/또는 기간의 감소, 병에 기인한 휴무일의 감소, 등을 포함한다. 효과량이 일상적 실험에 의해, 값의 매트릭스를 구축하는 것 및 매트릭스에서 다른 점을 시험하는 것에 의해 당업자에 의해 결정될 수 있음이 나아가 이해될 것이다.

투여량

항체의 투여를 위해, 투여량은 숙주 체중의 대략 0.0001 내지 100 mg/kg, 더욱 일반적으로는 0.01 내지 5 mg/kg의 범위이다. 예를 들면, 투여량은 대략 0.3 mg/kg 체중, 대략 1 mg/kg 체중, 대략 3 mg/kg 체중, 대략 5 mg/kg 체중 또는 대략 10 mg/kg 체중 또는 1-10 mg/kg의 범위 내일 수 있다. 대표적인 치료 요법은 매주 두 번, 매주 한 번, 매 2주마다 한번, 매 3주마다 한 번, 매 4주마다 한 번, 매달 한 번, 매 3달마다 한 번 또는 매 3 내지 6달마다 한번의 투여를 수반한다. 본 발명의 항-hIL20 항체에 대한 대표적인 투여 요법은 하기 투여 스케줄 중 하나를 사용하여 주어지는 항체를 정맥 투여 또는 피하 주사를 통해 대략 1, 3 또는 10 mg/kg 체중을 포함한다: (i) 2-4번째 투여에서 매 1-3 주마다, 이후엔 매 2달마다 투여량을 로딩하는 단계, (ii) 매 4주; (iii) 매주 마다, 또는 임의의 다른 최적의 투여. 일부 방법에서, 다른 결합 특이성을 갖는 두 개 이상의 단일클론 항체를 지시한 범위 이내에 있는 각각의 투여된 항체의 케이스 투여량에서 동시에 투여한다. 항체는 보통 다중 시점에서 투여한다. 단일 투여량 사이의 간격은 예를 들면, 매주, 매달, 매 3달 또는 매년일 수 있다. 또한, 간격은 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정하는 것에 의해 지시된 것으로서 불규칙할 수 있다. 일부 방법에서, 투여량은 대략 1-1000 μg/ml, 일부 방법에서는 대략 25-300 μg/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 맞춘다. 항체는 적은 빈도의 투여가 요구될 때, 서방형 제형으로서 투여할 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자에서 항체의 반감기에 의존하여 다양할 것이다. 일반적으로, 인간 항체는 인간화 항체, 키메라 항체, 및 비인간 항체에 비하여 긴 반감기를 보인다. 투여의 투여량 및 빈도는 치료가 예방용 또는 치료용인지 여부에 의존하여 다양할 수 있다. 예방적 용도에서, 상대적으로 낮은 투여량을 긴 시간의 기간 동안 상대적으로 드문 간격으로 투여한다. 일부 환자는 그들의 삶의 나머지 동안 치료를 받는 것을 계속한다. 치료 용도에서, 질병의 진행이 감소되거나 끝날 때까지, 그리고 바람직하게는 환자가 질병의 징후의 일부 또는 전부의 개선을 보일 때까지, 상대적으로 짧은 간격으로 상대적으로 높은 투여량을 때때로 요구한다. 이후에, 환자는 예방적 요법으로 투여할 수 있다.

당업자에 의해 이해될 것인 바, 항암제의 적당한 투여량은 항암제가 단독 또는 다른 제제와의 조합으로 투여된 이상 치료에서 이미 사용된 것들에 근접할 것이다. 투여량에서의 변화량은 치료될 이상에 의존하여 아마 일어날 것이다. 처치를 투여하는 의사는 개별 피험체에 대하여 적당한 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

제조 제품

본 발명의 다른 구체예에서, 상술한 장애의 치료에 유용한 재료를 함유하는 제조 제품을 제공한다. 예를 들면, 제조 제품은 본 발명에서 기술한바 인간 또는 인간화 항-hIL20 항체를 항체의 효과량으로 인간에서 자가 면역 또는 염증 질환 또는 장애와 같은 장애를 치료하기 위해 사용자를 지도하는 지침서와 함께 함유하는 용기를 포함할 수 있다. 제조 제품은 전형적으로 용기 및 용기 내에 삽입된 또는 용기와 결합한 라벨 또는 포장을 포함한다. 적절한 용기는 예를 들면, 병, 유리병, 주사기, 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 이상을 치료하는데 효과적인 조성물을 담고, 살균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 정맥 주사 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통하는 마개를 갖는 유리병일 수 있다). 조성물에서 적어도 하나의 활성 제제는 본 발명의 인간 또는 인간화 항-hIL20 항체, 또는 이런 항체를 포함하는 항원-결합 단편 또는 항체 유도체(예를 들어, 면역접합체)이다. 라벨 또는 포장에 조성물이 예를 들어, 류마티스 관절염, 청소년 류마티스성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 또는 이들의 조합과 같은 이상을 치료하기 위해 사용된다는 지시를 삽입한다.

게다가, 제조 제품은 (a) 본 발명의 인간 또는 인간화 항체를 포함하는 조성물을 내부에 함유하는 첫 번째 용기, 그리고 (b) 인간 또는 인간화 항체와 다른 치료제를 포함하는 조성물을 내부에 함유하는 두 번째 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 구체예에서 제조 제품은 첫 번째 및 두 번째 조성물이 자가 면역 또는 염증 질환 또는 장애를 치료하기 위해 조합되어 사용할 수 있음을 가리키는 포장 삽입물을 더 포함할 수 있다. 이런 치료제는 이전의 단락에서 기술한 임의의 보조 치료일 수 있다. 선택적으로, 또는 추가적으로, 제조 제품은 주사를 위한 세균 발육 저지 용액(BWFI), 인산-버퍼 살린, 링거액 및 포도당 용액과 같은 약학적으로 허용가능한 버퍼를 포함하는 두 번째(또는 세 번째) 용기를 더 포함할 수 있다. 그것은 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하는 상업적이고 사용자의 견지에서 원하는 다른 재료를 더 포함할 수 있다.

실시예

본 발명의 더 상세 사항은 하기 비-제한적 실시예에 의해 설명한다.

실시예 1: 인간 항-hIL20 항체에 의한 IL20-유도 증식의 억제

일련의 실험을 IL20R1+hIL20R2(본 발명에서 "hIL20R")로 형질도입한 BaF-3 세포의 hIL20 유도 증식의 효과를 중화시키는 인간 항-hIL20 단일클론 항체의 능력을 조사하기 위하여 수행하였다.

재료 & 방법

배지 및 버퍼. 배양 배지: Glutamax와 함께 로웰 박 기념 연구소(RPMI 1640), 10% 가열 불활성화 우 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)(BioWhitaker Cat.No. DE17-602E), 1 mg/ml 제네티신(GIBCO Cat.No. 10131-019), 200 μg/ml 제오신(Invitrogen 45-0430), 1 ng/ml 설치류 IL-3(TriChem ApS Cat.No. 213-13), 50 μM 2-머캅토에탄올(Gibco Cat.No. 31350-010). 분석 배지: Glutamax와 함께 RPMI 1640, 10% 가열 불활성화 FBS, 1% P/S(BioWhitaker Cat.No. DE17-602E), 1 mg/ml 제네티신(GIBCO Cat.No. 10131-019), 200 μg/ml 제오신(Invitrogen 45-0430), 50 μM 2-머캅토에탄올(Gibco Cat.No. 31350-010). AlamarBlue dye:(BioScource, Dal1100)를 증식을 평가하기 위하여 사용하였다. 형광 세기를 여기 555-12 nm 및 방사 590 nm의 형광분광계(bmg POLARstar+ Galaxy)에서 측정하였다.

항체, 세포 및 사이토카인. 마우스를 FCA에 포함된 20 μg의 인간 IL-20을 피하 주사하는 것에 이은 FIA에 포함된 20 μg의 인간 IL-20의 두 개의 주사에 의해 면역화 시켰다. 높은-반응자 마우스를 25 μg의 hIL20을 정맥 주사하여 부스트 시켰고, 비장을 3일 후 채취하였다. 비장 세포를 골수종 세포주와 융합시켰다(K, G & Milstein C.(1976), European J. Immunology, 6:511-19). 상청액을 간접적 hIL-특이적 ELISA에서 인간 IL-20 항체 생산에 대하여 스크리닝 하였고, 정제하였다. 토끼 항-hIL20 다중클론 항체(pAb)를 14일 간격에서 50 μg hIL20으로 4 번, 한 달에 한번 10 μg/ml hIL20으로 5번 면역화시킨 토끼에 의해 생산하였다. 혈청을 정제하였다(2313B). BaF-3(hIL20R) 세포는 hIL20R1(Zcytor7) 및 hIL20R2(Dirs1) 및 신호전달 경로 및 전사 단백질(STAT)-프로모터 요소의 조절 하에서 루시퍼라아제를 지니는 플라스미드 KZ134에 대한 유전자로 형질도입한 BaF-3 세포주로부터 나왔다. BaF-3 세포주는 피로마이신(Zcytor7) 및 제오진(Dirs1)에서 선별에 의해 생성하였고, 자이모지네틱스 연구소에서 받았다.

자극 분석. 초기 자극 분석을 억제 분석에서 사용할 hIL20의 수준을 평가하기 위하여 진행하였다. BaF-3(hIL20R) 세포를 분석 배지에서 잔여 IL-3을 제거하기 위하여 완전히 세척하였다. 이후 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 10⁴-5×10⁴세포/웰로 살포하였다(편평-웰 시각 플레이트 Packard cat.S00190). hIL20(10^-7M 내지 10^-13M)의 일련의 희석을 웰에 첨가하였고, 세포는 있지만 hIL20은 없는 추가적인 웰을 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 37℃, 5% CO₂에서 3일 동안 배양하였다. 배양기간의 마지막 6 시간 동안, 10 μl alamarBlue를 각 웰에 첨가하였다. 세포를 여기 555-12 nm 및 방사 590 nm의 형광분광계(bmg POLARstar+ Galaxy에서 형광 세기를 분석하였다. 억제 분석을 위하여, IL20의 불변 농도를 세포를 자극하기 위하여 사용하였다. 이 농도를 증식 분석에서 대부분의 본 발명자들의 분석에서 10^-9 M hIL20에 상응하는 최대 자극의 대략 90%에 기반을 두고 선택하였다.

억제 분석. 세척한 BaF-3(hIL20R) 세포의 1×10⁴-5×10⁴세포/웰을 분석 배지에서 마이크로타이터 웰에 첨가하였고, 오직 세포만을 함유하는 음성 대조군으로서 사용하는 웰을 제외하고 10^-9 M hIL20(최종 농도)을 첨가하였다. 이 농도는 IL20 사이토카인에 대한 최대 자극의 대략 90%에 상응한다. 항체의 일련의 희석(즉, 100 μg 및 2-배 희석을 세포 및 사이토카인을 이미 함유하는 웰에 첨가하였다(세포+hIL20만을 함유하는 양성 대조군으로 사용하는 웰을 제외하고). 세포, 사이토카인 및 항체의 혼합물을 37℃, 5% CO₂에서 72시간 동안 100 μl/웰에서 배양하였다. 배양의 마지막 6시간에 alamarBlue의 10 μl/웰을 포함하였다. 플레이트를 여기 555-12 nm 및 방사 590 nm의 형광분광계(bmg POLARstar+ Galaxy)에서 형광 세기를 분석하였다. 곡선을 그리고, 효능(최대 억제의 절반(IC50))을 Prism 4(GraphPad PRISM 소프트웨어 Inc.)를 사용하여 계산하였다.

효능을 1-(항체의 최대 억제/(사이토카인의 초기 자극 - 사이토카인의 자극 없음) *100%로 계산하였다.

결과

10^-9 M hIL20에서의 BaF-3(hIL20R)의 초기 자극은 투여량 반응 곡선으로부터 선택하였다. 억제 분석의 시리즈로부터의 결과를 표 1에 나타낸다. 효능(IC50)은 다른 억제 항체 사이에서 변하였다. 15D2는 가장 강력한 억제자 중 하나였으며, 가장 적은 분석 내 편차를 가졌다. 또한 15D2는 다중클론 토끼 항-hIL20 항체 표본과 비교하여 높은 친화도를 가졌다.

hIL20 유도된 증식의 억제

	1e-9 M hIL20에서 IL20 유도된 증식의 억제, IC50(μM)
항-IL20	1	2	3	4	5	6	7
2F6	15,4	13,88	1,67	0,36	1,8	0,32	15,38
F56(LC: F56type1; HC: F56)				0,04	0,73
F18(LC: F56type1; HC: F18)					0,05
C3	-	-	-			-
5B7	0,26	4,54	0,76			0,2
15D2	0,18	0,42	0,34			0,12	0,4358
C11	0,26	2,0	0,37				0,1860
F18(하이브리도마에서 유래한 것)				0,12	0,09
F56(하이브리도마에서 유래한 것)	4,97
41A6		5,36	3,12	1,32			3,118
41F10		5	4,7	2,55
42A5 54F10 24		0,66	0,21				2,560 4,971

실시예 2: IL20-, IL19- 또는 IL24-유도 증식의 경쟁적 억제

인간 항체 15D2를 사이노몰구스 IL20 및 마우스 IL20을 중화시키기 위한 그의 능력에 대하여 시험하였다. 마우스 및 사이노몰구스 IL20은 모두 BaF-3(hIL20R) 세포에서 증식을 유도할 수 있다. 또한, 15D2를 BaF-3(hIL20R)에서 hIL19 또는 hIL24에 의해 유도된 증식의 억제에 대하여 시험하였다. hIL19 또는 hIL24는 모두 hIL20R1+hIL20R2 수용체에 결합하였다.

재료 & 방법

배지 및 버퍼. 실시예 1을 참조하라.

항체, 세포 및 사이토카인. 실시예 1을 참조하라. 인간 및 사이노몰구스 IL20을 E. coli에서 생산하였다. 마우스 IL20을 BioSource International Inc.로부터 얻었다. 인간 IL19 및 IL24를 R&D Systems로부터 얻었다.

자극 분석. 실시예 1에서 기술한 동일한 초기 자극 분석을 사용하여, 억제 분석에서 사용할 hIL20, 사이노몰구스 IL20 및 마우스 IL20의 초기 농도를 평가하기 위하여 초기 자극 분석을 수행하였다. hIL19 및 hIL24를 사용한 초기 자극을 동일한 방법에 의해 평가하였다. 억제 분석에서 IL19 및 hIL24의 세 가지 다른 초기 농도를 사용하는 것을 결정하였다.

억제 분석. (1) 사이노몰구스 IL20 및 마우스 IL20 유도된 증식의 항-hIL20 mAb에서의 효과: BaF-3(hIL20R) 세포의 1×10⁴-5×10⁴ 세포/웰을 분석 배지에서 마이크로타이터 웰로 첨가하였고, 10^-9 M hIL20, 사이노몰구스 IL20 또는 마우스 IL20(최종 농도)을 오직 세포만을 함유하는 음성 대조군으로 사용하는 웰을 제외하고 각 웰에 첨가하였다. 이 농도는 사이토카인을 사용한 최대 자극의 대략 90%에 상응한다. 항체 1400-250-15D2의 일련의 희석(100 μg 및 2-배 희석)을 세포 및 사이토카인을 벌써 함유하는 웰에 첨가하였다(오직 세포+사이토카인을 함유하는 양성 대조군을 위해 사용된 웰을 제외하고).

(2) hIL19 및 hIL24 유도된 증식에서 항-hIL20 mAb의 효과: 세척한 BaF-3(hIL20R) 세포의 1×10⁴-5×10⁴세포/웰을 분석 배지에서 마이크로타이터 웰에 첨가하였고, hIL20, hIL19 또는 hIL24 중 어느 하나의 사이토카인의 세 가지 다른 농도(10^-8M, 10^-9M 및 10^-10 M 최종 농도)를 오직 세포만을 함유하는 음성 대조군으로 사용한 웰을 제외하고, 각 웰에 첨가하였다. 이 농도는 사이토카인을 사용한 최대 자극의 대략 90%에 상응한다. 항체 15D2의 일련의 희석(100 μg 및 2-배 희석)을 세포 및 사이토카인을 이미 함유하는 웰에 첨가하였다(오직 세포+사이토카인을 함유하는 양성 대조군으로 사용한 웰을 제외하고).

두 개의 분석에서, 세포, 사이토카인 및 항체의 혼합물을 37℃, 5% CO₂에서 72시간 동안 100 μl/웰에서 배양하였다. 배양의 마지막 6시간에 alamarBlue의 10 μl/웰을 포함하였다. 플레이트를 여기 555-12 nm 및 방사 590 nm의 형광분광계(bmg POLARstar+ Galaxy)에서 형광 세기를 분석하였다. 곡선을 그리고, 효능(최대 억제의 절반(IC50))을 Prism 4(GraphPad PRISM Software Inc.)를 사용하여 계산하였다.

효능(항체에 의한 억제 백분율)을 1-(항체의 최대 억제/(사이토카인의 초기 자극 - 사이토카인의 자극 없음) *100%로 계산하였다.

결과

사이노몰구스 IL20 및 마우스 IL20 유도된 증식에서의 항-hIL20 mAb 효과. BaF-3(hIL20R) 세포를 인간, 사이노몰구스 또는 마우스 IL20으로 자극시켰을 때, 세포가 증식하였고, 이 증식은 투여량 의존적인 방법으로 항-hIL20 mAb 15D2에 의해 억제할 수 있다. 15D2의 효능은 모든 세 가지 사이토카인에 대하여 66 mM IL20에서의 100%에 근접하였다. hIL20R에 대한 친화도가 세 가지 사이토카인에서 달라서 항체의 효능을 직접적으로 비교하지 못하였다.

hIL19 및 hIL24 유도된 증식에서의 항-hIL20 mAb의 효과. BaF-3(hIL20R) 세포를 hIL20, hIL19 또는 hIL24의 세 가지 다른 농도로 자극시켰다(도 5). 투여량-의존적 반응을 hIL20 유도된 증식의 억제에 대하여 검출하였다(도 5A). 이 실험을 이후 hIL19 및 hIL24 실험에서 양성 대조군으로 사용하였다. 처음에 BaF-3(hIL20R) 세포가 hIL19로 자극되었을 때, hIL19의 세 가지 초기 농도의 어떤 것을 사용하였는지 개의치 않고 15D2는 증식을 억제할 수 없었다(도 5B). 세포를 hIL24로 처음 자극시켰을 때에서 동일한 결과를 얻었다(도 5C).

따라서, 15D2는 BaF-3(hIL20R) 세포의 사이노몰구스 IL20-유도뿐만 아니라 마우스 IL20-유도 증식을 억제하였으나, BaF-3(hIL20R)의 hIL19 또는 hIL24-유도 증식은 15D2에 의해 억제되지 않았다.

실시예 3: 가용성

동일한 과정으로 HEK293 세포에서 생산 및 정제한 IL20에 대한 7가지의 다른 인간 IgG4 항체를 50 kD의 컷-오프 무게로 Amicon Ultra(Millipore Corp, MA)의 타입의 원심분리 여과를 사용하여, 용액 내에서 고 농도를 달성하기 위한 그들의 능력을 비교하였다. 모든 표본은 1 시간 동안 제조사의 지시에 따라 원심분리하였다. 항체의 초기 농도는 0.5 내지 1.8 mg/ml의 범위였고, 모든 항체는 pH 7.4에서 20 mM Na-인산염, 150 mM NaCl에서 제형화하였다. 시험한 항체의 VH 및 VL 서열은 도 4a 및 4b에서 각각 나타낸다.

표 2는 Amicon Ultra 50 kD 원심분리 필터를 사용한 인간 항-IL20 IgG4 항체의 농축 후의 농도 및 회수율을 보여준다. 가장 높은 농도(100 mg/ml보다 높음)는 15D2가 도달하였고, 80 mg/ml보다 높은 5B7이 그 뒤를 잇는데, 이것들 모두는 또한 높은 회수율을 가졌다. 증가된 2량체화의 신호를 보인 2F6을 제외한 모든 항체는 동적 빛 산란 분석에서 보인 것처럼 고 농도에서 그의 단량체 구조를 유지하였다.

인간 항-hIL20 항체의 가용성 및 회수

항-IL20	농도(mg/ml)	회수율(%)
2F6	50	80
F56(HC: F56; LC: F56type1)	14	48
F18(HC: F18; LC: F56type1)	31	64
F56/F18(HC: F56/F18; LC: F56type1)	24	42
C3	53	80
5B7	84	79
15D2	109	81

생식계열 서열을 드러내는 항체 중쇄 및 경쇄 가변 부위의 가변 부위 아미노산 및/또는 핵산 서열의 분석은 표 3에서 나타낸다. 또한 서열번호 25의 서열 및 동일한 F56type1을 갖는 HC를 나타내는 추가적인 항체, C11(실시예 1을 참조하라)을 서열 분석하였다.

인간 항-IL20 항체의 VL, VH, 및 생식계열 서열

경쇄	생식계열
2F6(서열번호 19)	VKI_L24/JK4
C3(서열번호 21)	VKIII_L6/JK2
F56type1, 15D2, 및 5B7(서열번호 9)	VKI_L18/JK4
F56type2(서열번호 24)	VKIII_A27/JK1
중쇄
2F6(서열번호 18)	VH2_05/D3_10/JH4
C3(서열번호 20)	VH4_39/D_/JH6
F18(서열번호 22)	VH1_03/D_/JH4
F56 및 F56/F18(서열번호 23)	VH1_03/D_/JH4
5B7(서열번호 7)	VH1_03/D3_10/JH6
15D2(서열번호 6)	VH1_03/D3_10/JH6

실시예 4: hIL20에 대한 항체의 결합

표면 플라즈몬 공명(SPR) 실험을 개별 인간 항-hIL20 항체가 재조합 hIL20에 대하여 동시에 결합하는지 여부를 결정하기 위하여 BiacoreT100에서 수행하였다. 비교를 위해, 262.4.1.2.2.1, 262.5.1.6.4.4 및 262.7.1.3.2.4로 지정되고, WO 2005/052000에서 기술한 세 가지 IL20R1/IL20R2-중화 래트 항-hIL20 mAb를 포함하였다. 입체 방해 및 형태적 변화가 기여하는 것과 같은 인자에도 불구하고, 동시적 결합에 대한 무능은 공통된 또는 겹치는 에피토프를 가리킨다.

재료 & 방법

실험은 항-hIL20 항체를 고정시킨 CM5 칩에서 수행하였다. 각각의 항체를 표준 아민 커플링에 의해 ~1000 RU의 수준으로 분리된 칩에 고정시켰다. 모든 표본은 러닝-버퍼, HBS-EP pH 7.4(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0,005% 폴리소르배트 P20)에서 희석하였다. 재조합 hIL20(10 μg/ml)을 180 초 동안, 이어서 15D2(10 μg/ml)의 주사를 180 초 동안 주입하였다.

결과

인간 항체 15D2 및 5B7은 재조합 hIL20에 동시에 결합하지 않아, 공통된 또는 겹치는 에피토프를 가리킨다. 반대로 15D2는 262.4.1.2.2.1, 262.5.1.6.4.4 또는 262.7.1.3.2.4 mAb의 각각과 동시에 결합할 수 있었는데, 15D2의 에피토프가 262.4.1.2.2.1, 262.5.1.6.4.4 및 262.7.1.3.2.4의 그것과 다른 것을 가리킨다.

실시예 5: 변성된 hIL20에 대한 항체의 결합

인간 항-IL20 항체가 완전히 변성된 항원에도 결합하는지 여부를 결정하기 위해 이 실험을 행하였다. 만약 결합 활성이 검출되지 않는다면, 펩티드 어레이는 에피토프 맵핑에 적당하지 않을 것이다(아래를 참조하라). 변성된 항원에 대한 결합에 대하여 시험하기 위해, 천연 및 변성된 hIL20 표본으로 SDS-PAGE에 이어, 검출을 위해 15D2 및 5B7을 사용한 웨스턴 블롯을 수행하였다.

재료 & 방법

재조합 hIL20을 50mM DTT를 함유하는 샘플 버퍼(NuPage, Invitrogen)에서 10분 동안 끓여 변성시켰다. 표본으로 SDS-PAGE(샘플버퍼를 포함하는 20 μl/웰)를 실시하였고, 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 일차 mAb(차단 버퍼(Novex, Invitrogen)에 포함된 10 μg/ml)와 반응시키고, 이어서 HRP-접합 토끼 항-인간 IgG 다중클론 Ab(DAKO)으로 반응시켰다. 밴드를 TMB-기질(Kem-En-Tech)을 사용하여 가시화하였다.

결과

15D2 및 5B7은 모두 항원의 천연 및 변성된 형태를 인식하였고, 이것은 에피토프의 연속성(선형)을 가리킨다.

실시예 6: 펩티드 결합의 표면 플라즈몬 공명 분석

SPR 실험을 항-hIL20 항체 15D2, 262.4.1.2.2.1, 262.5.1.6.4.4 또는 262.7.1.3.2.4가 hIL20(서열번호 2)의 비처리된 전구체의 잔기 42-102에 상응하는, 성숙한 hIL20(서열번호 1)의 잔기 18-78에 상응하는 부위에 결합하는지 여부를 결정하기 위하여 수행하였다. 항체는 hIL20의 천연 및 변성된 형태 모두를 인지하는 것을 보여주었다(15D2에 대하여, 앞을 참조하라).

재료 & 방법

10개 잔기의 프레임 쉬프트가 있는 다섯 개의 20 머 펩티드를 합성하였다:

1) IRNGFSEIRGSVQAKDGNID(서열번호 1의 잔기 18-37)

2) SVQAKDGNIDIRILRRTESL(서열번호 1의 잔기 28-47)

3) IRILRRTESLQDTKPANRSS(서열번호 1의 잔기 38-57)

4) QDTKPANRSSLLRHLLRLYL(서열번호 1의 잔기 48-67)

5) LLRHLLRLYLDRVFKNYQTPD(서열번호 1의 잔기 58-78)

N-말단 비오틴을 함유하는 펩티드를 스트렙타비딘 코팅(SA) 칩 위의 개별 유동 세포에 고정시켰다(500 RU). 120초 동안 모든 유동 세포에 걸쳐 개별 항체(5 μg/ml)를, 이후 180초에 해리상을 주입하였다. 실험을 Biacore3000 및 BiacoreT100 기구에서 수행하였다. 결과를 Scrubber2 소프트웨어(BioLogic Software Pty Ltd)를 사용하여 평가하였다.

결과

펩티드에 대한 15D2, 262.5.1.6.4.4 또는 262.7.1.3.2.4의 결합은 검출되지 않았다. 래트 항-hIL20 mAb 262.4.1.2.2.1은 그들의 펩티드 4 및 5에 대한 결합을 증명하였고, 그것은 그들의 공유된 서열 LLRHLLRLY에 대한 결합을 가리킨다. 모든 mAb는 고정된 손상되지 않은 비오틴화 IL20에 대한 결합을 증명하였다.

실시예 7: 일차 펩티드 어레이("펩티드 보행")

4 잔기의 프레임 쉬프트가 있는 18머 hIL20 펩티드로 구성되는 펩티드 어레이를 형광-표지 항-hIL20 항체 15D2 또는 5B7에 대하여 수행 및 스크리닝 하였다.

재료 및 방법

에피토프 어레이의 합성. 에피토프 매핑 어레이를 본질적으로 제조사로부터 제공된 프로토콜을 사용하여 어레이 합성기(Multipep Spot, Intavis, 독일) 위에서 셀룰로오스 쉬트(Aims-Scientific, 독일)에 합성하였다. Fmoc-아미노산을 Novabiochem(독일)에서 구입하였고, 0.3 M 하이드로벤조트리아졸(HOBt)을 함유하는 N-메틸피롤리디논(NMP)에 0.3 M의 최종 농도로 용해시켰다. 커플링은 디이소프로필카르보디이미드(DIC)로 활성화 시키는 것에 의해 수행하였고, Fmoc 그룹의 탈보호는 NMP에서 20% 피페리딘에 의해 수행하였다. 개별 서열을 어레이 합성기가 수분하는 소프트웨어에 의해 설계하였다. 합성 후 보호 그룹을 트리이소프로필실란(TIPS)을 95% 함유하는 트리플루오로아세트산(TFA)을 쉬트에 60분 동안 처치하는 것에 의해 제거하였다. 이후 디클로로메탄(DCM) 및 N-메틸피롤리디논(NMP) 및 최종적으로 물로 세척하였다.

항체의 표지. 스크리닝은 형광 표지된 항체를 사용하여 수행하였다. 표지는 제조사의 매뉴얼에 따라 NAP5 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 1% NaHCO₃에 대한 겔-여가 항체 스탁에 의해 수행하였다. 여기에 이어서 DMSO에 용해된 5(6)-카르복시플루오레세인 N-하이드록시숙시니미드 에스테르(Sigma, C1609)의 등가물 25 몰을 첨가하였다. 커플링이 2 시간 동안 계속되는 것을 허용하였고, 이어서 비결합된 플루오레세인을 제거하기 위하여 TRIS 세척 버퍼(50 mM TRIS, pH = 7,4, 0.15 M NaCl, 0,1 M ArgHCl, 0,05% Tween 20)로 겔여과하였다.

어레이의 스크리닝 및 분석. 어레이의 스크리닝은 30 ml 배양 버퍼(0,5% BSA, 50mM TRIS, pH = 7,4, 0,15M NaCl, 0,1 M ArgHCl, 0,05% Tween 20)에 10 μl의 항체를 첨가하는 것에 의해 수행하였다. 쉬트를 1-2 시간 동안 배양한 다음, 세척 버퍼로 5 회 세척하였다. 이후 쉬트를 레이저 스캐너(Typhoon 9410, GE Healthcare)를 사용하여 스캔하였고, 이미지 파일(.gel 형식)을 전용 어레이 소프트웨어 ArrayPro Analyzer(배지 Cypernetics, 미국)를 사용하여 분석하였다. 형광 세기를 측정하였고, 나아간 분석을 위하여 Prism 5(GraphPad Software, 미국)로 이출하는 아라비아 숫자로 변환시켰다.

결과

15D2 및 5B7이 성숙한 hIL20(서열번호 1)에서 잔기 73-96에 대하여 상응하는, 전구체(서열번호 2)의 잔기 97-120에 상응하는 부위에 위치하는 선형 에피토프에 모두 결합하는 것을 명백히 가리키는, 일차 펩티드 어레이 분석으로부터의 결과는 도 6에서 나타낸다.

실시예 8: 이차 펩티드 어레이 분석 말단 결실

에피토프의 길이를 좁히고, 어떤 잔기가 항-IL20 항체 15D2 및 5B7의 결합에 중요한지 평가하기 위하여, 다양한 절단의 어레이를 만들었다. 또한 알파-스캔을 포함하였다(단락 5). 재료 및 방법에 대하여, 실시예 7을 참조하라.

결과

hIL20 C-말단으로부터의 절단은 펩티드 4 내지 7로부터의 15D2 결합에서 점차적인 감소를 드러낸다(도 7a). 결합 활성에서 더욱 갑작스런 감소는 D(Asp) 및 H(His)의 제거가 친화도를 극적을 감소시켰을 때, N-말단 절단에서 보였다. 전체적으로, 결과는 최소의 에피토프는 서열번호 1의 잔기 78 내지 93에 상응하는 서열 DHYTLRKISSLANSFL을 갖는 것을 보여주었다.

5B7에 대하여, 절단은 N-말단으로부터 결실이 있을 때, 결합에서 갑작스런 감소를 드러내었다(도 7B). 결합 활성에서 대략 50%의 감소를 D(Asp)를 제거하는 것 및 H(His)를 제거하는 것이 검출하지 못하는 결합에 대한 친화도를 극적으로 감소시킬 때, N-말단 절단을 보였다. C-말단으로부터의 제거는 N(Asn)을 제거하는 것보다 친화도에서 덜 갑작스런 감소를 야기한다. 전체적으로, 결과는 5B7 에피토프가 DHYTLRKISSLANSFLTIK(서열번호 1의 잔기 78-96)가 더 길기는 하지만, 더 높은 친화도를 나타내는 서열 DHYTLRKISSLAN(서열번호 1의 잔기)을 갖는 것을 가리킨다. 이것은 어떤 구조적 요구, 예를 들어, α-나선 의존성의 존재를 가리킨다.

Ala 스캔의 결과는 15D2에 대하여 서열번호 1의 세 잔기, H79(His-79), R83(Arg-83) 및 N90(Asn-90)이 결합에 가장 중요한 것을 명백히 가리킨다(도 8a). 또한, 민감하지만, 더 작은 범위는 D78(Asp-78), S86(Ser-86), F92(Phe-92) 및 L93(Leu-93)이었다. 잔기 H79 및 N90은 또한 5B7 결합에서 가장 중요하였고, R83(Arg)도 꽤 중요하게 나타났다(도 8b).

결론적으로, 도 1에서 나타낸 인간 항-hIL20 항체 15D2 및 5B7은 모두 유사한 길이 및 특이성의 선형 에피토프(기능적)에 결합한다. hIL20 전구체(서열번호 2)에서 H103, R107, 및 N114에 상응하는; 성숙한 hIL20(서열번호 1)의 잔기 H79, R83 및 N90(진하게 및 단일 선으로 표시한)이 가장 중요하고, 잔기 D78, S86, F92 및 L93(진하게 및 이중선으로 표시한)이 알맞게 중요한 것을 찾았다. 두 항체 사이의 주된 차이는 R83이 15D2 결합과 비교하여 5B7 결합에서 약간 덜 중요한 것이다.

15D2/5B7 에피토프의 위치 및 가장 중요한 잔기의 위치는 동족 단백질 IL19의 결정 구조를 사용하여 나타내었다(Chang et al. J Biol Chem 2003; 278: 3308). IL19의 나선 E에 상응하는 에피토프의 위치를 발견하였고, hIL20에서 가장 중요한 잔기; 서열번호 1의 H79, R83, 및 N90은 용매로 노출된다. hIL20 잔기 H79가 hIL19에서 프롤린임을 유념하라.

실시예 9: IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 IL20 활성화의 중화

이 실시예는 인간 항체 15D2가 재조합적으로 발현된 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 설치류, 사이노몰구스, 및 hIL20 활성화를 중화시키는 능력이 있음을 보여준다.

재료 및 방법

IL20 수용체의 클로닝. 인간 IL20 수용체, IL22R1(EMBL BC029273), IL20R1(EMBL AF184971) 및 IL20R2(EMBL AY358305)를 NHEK(정상 인간 상피 케라티노사이트) cDNA로부터 PCR-증폭시켰고, pcDNA3,1+(제오신)(IL22R1 및 IL20R1) 및 pcDNA3,1+(hygro)(IL20R2)로 클로닝하였다. 마우스 IL20 수용체, mIL22R1(EMBL AY103454), mIL20R1(EMBL AK054215) 및 mIL20R2(EMBL BC107264)를 마우스 간, 고환 및 피부 cDNA를 각각 주형으로 사용한 PCR에 의해 클로닝하였다. 이들 IL20R 서열의 각각은 그의 전체가 참조로서 통합된다. mIL22R1 및 mIL20R1 PCR-산물은 pcDNA3,1+(zeo)로 클로닝하였고, mIL20R2는 pcDNA3,1+(hygro)로 클로닝하였다. 사이노몰구스 IL20 수용체, cynoIL22R1(서열번호 28), cynoIL20R1(서열번호 26) 및 cynoIL20R2(서열번호 27)를 사이노몰구스 피부 cDNA를 사용한 PCR에 의해 클로닝하였다. cynoIL20R1 및 cynoIL22R1 수용체를 pcDNA3,1+(제오신)로 삽입하였고, cynoIL20R2를 pcDNA3,1+(네오마이신)로 삽입하였다.

하기의 5' 및 3' 프라이머를 암호화 cDNA의 PCR-증폭에 사용하였다.

인간 IL22R1: agaattccaccatgaggacgctgctgacca 및 gctcgagacagggaggaagcaccaag(서열번호 29 및 30)

인간 IL20R1: cgaattcccttggtttctggggaag 및 gctcgagcacaggaaacaaaaggcaaa(서열번호 31 및 32)

인간 IL20R2: agaattctggaaagaaacaatgttctaggtcaa 및 gctcgagcttcacctgggcccttcc(서열번호 33 및 34)

설치류 IL22R1: ccgaattcgccaccatgaagacactactgaccatc 및 cttgcggccgctcaggattcccactgcacagtc(서열번호 35 및 36)

설치류 IL20R1: ttgaattcgccaccatgcacactcccggga 및 ttgcggccgcctagctttccatttgtacatgtaacc(서열번호 37 및 38)

설치류 IL20R2: ttggatccgccaccatgatttcccagggagtctg 및 ttgcggccgctcaagtctgtgagatccagac(서열번호 39 및 30)

사이노몰구스 IL22R1: agaattccaccatgaggacgctgctgacca 및 gctcgagacagggaggaagcaccaag(서열번호 41 및 42)

사이노몰구스 IL20R1: gtgggactgagcagtctgctg 및 aggcaaaaggaagtgttggca(서열번호 43 및 44)

사이노몰구스 IL20R2: agaattctggaaagaaacaatgttctaggtcaa 및 gctcgagcttcacctgggcccttcc(서열번호 45 및 46)

STAT-리포터 KZ136은 SRAT-요소 및 혈청 반응 요소(SRE)를 함유하는 루시퍼라아제 리포터이다(Poulsen-LK et al. J Biol Chem 1998; 273:6228-6232).

일시적 형질 도입에서 루시퍼라아제 분석. 0일: BHK 세포를 T80 플라스크에 40%의 융합성(confluency)로 시드하였다. 1일: 수용체 사슬 1(IL20R1 또는 IL22R1)의 2.5 마이크로그램 및 사슬 2(IL20R2)의 2.5 마이크로그램 및 루시퍼라아제 리포터(KZ136)의 2.5 마이크로그램의 7.5 마이크로그램 DNA를 36 마이크로리터 FuGene(Roche Applied Science)을 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라, 형질도입하였다. 2일: 세포를 Versene을 사용하여 분리하였고, 웰당 20,000개 세포를 검은 시각 플레이트에 시드하였다. 세포가 표면에 잘 재접착된 후, 배지를 무-혈청 배지로 교환하였다. 3일: 10 mM IL20의 20 마이크로리터 또는 무-혈청 배지의 20 마이크로리터를 웰에 첨가하였다. 4시간 후, 루시퍼라아제 활성을 결정하였다; 배지를 제거하고 100 마이크로리터 1×PBS를 각 웰에 첨가한 다음 100 마이크로리터 루실리트 기질(PerkinElmer)을 첨가하였다. 플레이트를 30분 동안 배양하였다. 발광을 Topcount NXT(PerkinElmer)에 의해 검출하였다. 본 발명에서 사용한 IL20은 E. coli에서 재조합적으로 생산되거나, Biosource, #PMC0201에서 구입한 설치류 IL20 또는 HEK293 6E 세포에서 일시적인 발현에 의해 생산하고 정제한 사이노몰구스 IL20 중 하나이다.

결과

설치류 IL20의 중화. 설치류 IL20 수용체를 클로닝하고, 일시적인 루시퍼라아제 분석을 BHK 세포에서 셋업하였다. 두 개의 인간 수용체 복합체 및 두 개의 설치류 수용체 복합체 모두를 1 nM 설치류 IL20으로 자극시켰다. 설치류 IL20은 인간 및 설치류 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체 모두로 활성화시킬 수 있다. 15D2에 의한 중화를 수용체 복합체 중 하나에서 시험하였다. 설치류 IL20R2/IL22R1 복합체를 STAT3 리포터 컨스트럭트와 함께 BHK 세포로 형질도입시켰다. 수용체 복합체를 1 nM 설치류 IL20으로 자극시켰고, 1, 10 및 50 마이크로그램/ml 투여량의 15D2 항체에 노출시켰다(도 9). 가장 낮은 투여량, 1 마이크로그램/ml에서 거의 대부분 효과를 중화시켰다.

사이노몰구스 IL20의 중화. 사이노몰구스 IL20 수용체 서열 IL20R1, IL20R2 및 IL22R1을 인간 서열에 기반을 둔 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 사이노몰구스 피부 조직 cDNA로부터 클로닝하였다. 사이노몰구스 및 인간 수용체 사이의 예측되는 서열 동일성은 IL20R1에 대하여 96.8%, IL20R2에 대하여 98.9%, IL22R1에 대하여 95.5%였다. BHK 세포를 두 개의 수용체 복합체, IL20R1/IL20R2 또는 IL22R1/IL20R2를 KZ136(STAT3 루시퍼라아제 리포터) 플라스미드와 함께 형질도입하였다. 사이노몰구스 IL20R2/IL22R1 복합체는 1 nM cynoIL20을 사용하여 3-4배 유도하였다. 사이노몰구스로부터 나온 IL20R1/IL20R2 복합체는 대략 2-배 자극시켰다. 15D2의 양의 증가는 IL20 활성을 감소시켰고, 이것은 15D2가 사이노몰구스 IL20을 중화시킬 수 있음을 보여준다(도 10).

hIL20의 중화. 인간 IL20 수용체 IL20R1, IL20R2 및 IL22R1을 NHEK(정상 인간 상피 케라티노사이트) cDNA로부터 클로닝하였다. IL20 수용체를 암호화하는 발현 플라스미드를 BHK 세포에 루시퍼라아제 리포터 벡터, KZ136과 함께 일시적으로 형질도입시켰다. 자극을 1 nM hIL20을 사용하여 행하였고, 대략 3 배의 유도를 보였다. 15D2 항체의 양의 증가는 IL20 활성을 감소시켰다(도 11).

실시예 10: hIL20-유도 증식의 억제

이 실시예는 IL20R1 및 IL20R2(본 발명에서 "hIL20R"로 지칭)를 발현하는 BaF-3 세포의 IL20-유도 증식에서 15D2 및 래트 항-hIL20 mAb의 억제 효과 및, 15D2가 결합한 IL20의 형태를 평가한다.

재료 & 방법

세 번의 독립적인 실험("148", "149" 및 "150")은 네 개의 실험된 흡광도의 EC50 값을 비교하였다. 첫 번째로, 항체를 배지에서 50 μl/웰로 3-배의 일련의 희석으로 첨가하였다. 동시에, 세포-부유물의 40 μl에 있는 10 μl hIL20을 모든 웰에 첨가하였다. 항체를 20 μg/ml에서의 분석에서 첫 번째 희석으로 3-배 일련의 희석(100+200)으로 희석하였다. hIL20 표본을 10^-8 M에 대한 분석에서의 희석으로 10^-7 M로 희석하였다. 대조군으로서, 하기 자극 곡선을 만들었다: hIL20을 이 10-배 희석 줄로부터 10^-6 M로 희석하였다. 분석에서 첫 번째 희석은 10^-7 M이었다.

인간 IL20R1/IL20R2를 재조합적으로 발현하는 BaF-3 세포를 원심분리하였고, IL3 없이 배지에 재현탁시키고, 세었다. 이후 그들을 IL3없이 배지에서 2회 세척하였고, 96-웰 편평-바닥 시각 플레이트에 10⁴c/웰 및 40 μl로 첨가하였다. 세포의 희석: 10⁴c/40 μl, 2.5×10⁶c/10 ml(2 플레이트면 충분). CO₂ 배양기(5% CO₂, 37℃)에서 3일 동안 플레이트의 배양. AlamarBlue 10 μl/w을 첨가하였고, 6시간 배양 후, 플레이트를 여기 550-12 nm 및 방사 590 nm에서 Polarstar 형광계에서 측정하였다.

15D2가 IL20의 가용성 형태 또는 IL20의 수용체-결합 형태에 결합하는지 여부를 조사하기 위하여, 15D2를 3-배 일련의 희석에 첨가한 것에서 실험적 셋업을 설계하였다. 동시에, 10 hIL20, 그 후에 40 μl의 BaF3(hIL20R = hIL20R1 및 hIL20R2) 세포-부유물을 웰에 첨가하였다. 마지막으로, hIL19를 동시에(t=0) 또는 1분 후(t=1)에 첨가하였다.

결과

증식을 실험하는 초기 실험으로부터 hIL20의 농도의 함수로서 보여주었고, 그것은 10^-8 M hIL20에서의 항체의 EC50값을 측정하기 위해 선택되었다.

세 번의 독립적인 실험에서 IL20 유도된 증식에서 항체의 억제 효과를 시험하였다. EC50 값을 정상과 바닥을 정의하거나 정의하지 않은 경우 모두에서 계산하였다. 후자가 세 번의 독립적인 실험 사이의 가장 좋은 상관관계를 주었고, 억제 효과의 비교를 위해 사용하였다(Prism에서 "가변 경사를 가진 S자형 투여량-반응"에 의해 곡선을 맞추었음). 표 4의 아래는 IL20R1 및 IL20R2를 발현하는 BaF-3 세포의 IL20-유도 증식의 억제에 대한 세 번의 실험의 EC50값을 보여준다.

BaF-3(hIL20R1/hIL20R2) 세포의 hIL20-유도 증식의 억제

*항-IL20 ab*	*EC50(nM)*
15D2	6.5, 6.7, 6.8*	6.6	13.07
262.4.1.2.2.1	3.4	4.0	2.77
262.5.1.6.4.4	17.0	25.6	14.53
262.7.1.3.2.4	4.3	4.2	4.16

* 세 개의 플레이트에서 포함됨

EC50 값을 터키 사후 검정을 사용한 원-웨이 ANOVA에 의해 분석하였다. 15D2, 262.4.1.2.2.1 및 262.7.1.3.2.4의 모두는 IL20R 형질도입된 BaF-3 세포에서 IL20 유도된 증식을 262.5.1.6.4.4보다 더 유의하게 억제하였다. 262.4.1.2.2.1 및 262.7.1.3.2.4의 평균 EC50 값이 15D2의 그것보다 더 낮았으나, 차이는 통계학적으로 유의하지 않았다(P<0.05). 15D2가 IL20의 가용성 또는 수용체-결합 형태에 결합하는지 여부를 조사하는 분석에 대하여, 결과는 IL19의 첨가가 IL20-유도 증식의 15D2 차단을 복귀시킨 것을 보여주었다(도 12). 이것은 15D2가 hIL20R에 대한 IL20의 결합을 막지만, 15D2가 수용체에 대한 IL19의 결합을 막지는 않는 것을 의미한다. 따라서 15D2는 IL20의 가용성 형태에는 결합하지만, 수용체에 대한 IL19의 접근을 달리 막을 것인 수용체-결합 형태에는 결합하지 않는다.

실시예 11: IL22R1/IL20R2의 IL20 활성화의 중화

이 실시예는 루시퍼라아제 리포터 분석에서 인간 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체를 통한 Il20-유도 신호전달경로에서 인간 항체 15D2 및 래트 항-hIL20 mAb의 억제 효과를 보여준다.

재료 및 방법

인간 IL20 리포터 세포주의 세대. pcDNA3,1+(hygro) 플라스미드에 있는 인간 IL20R2, pcDNA3,1+(제오신)플라스미드에 있는 IL22R1 및 STAT3 리포터 플라스미드 KZ136(네오마이신)을 BHK 세포로 형질도입시켰고, 200 μg/ml 하이그로마이신, 400 μg/ml 제오신 및 600 μg/ml 제네티신으로 선별하였다. 클론을 뜯었고, 대부분의 IL20 반응 클론, "BHK 1-B4"를 선별하였다. BHK 1-B4 세포주는 기저 수준(자극 없음)에 비해 10 nM IL20에 대해 읽힌 루시퍼라아제에서 대략 10-배 반응한다.

안정 BHK 1-B4 세포에서 루시퍼라아제 분석. BHK 1-B4를 96 웰 플레이트에 20,000 세포/웰로 시드하였다. 시드한지 16시간 후, 세포를 10 nM IL20 또는 10 nM IL20 및 항체의 혼합물 또는, 단순 배지로 자극하였다. 세포를 4시간 동안 자극시켰고, 배지를 제거하였고, 100 μl PBS(Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺를 포함) 및 100 μl 루시퍼라아제 기질(Steady-GLO)을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 30분 동안 배양하였다. 발광을 Topcount NXT(PerkinElmer)에 의해 검출하였다.

결과

항-IL20 항체에 의한 hIL20의 중화. 안정 세포주 BHK 1-B4를 IL20R2 및 IL22R 및 STAT3 루시퍼라아제 리포터 플라스미드, KZ136을 발현하는 플라스미드의 안정된 형질도입에 의해 생성하였다. 항체를 IL20을 세포에 첨가하기 전에 혼합하였다. 항체를 3-배 희석에서 133 nM 내지 0.19 nM의 범위에서 첨가하는 것에 반하여, IL20 농도를 10 nM로 유지하였다. 투여량-반응 곡선을 4 가지 항체에 대하여 얻었고, EC50 값을 GraphPad Prism에서 "가변 경사를 가진 S자형 투여량-반응"에 의해 맞춘 곡선에 기반을 두고 계산하였다(표 4). 15D2는 262.4.1.2.2.1만큼 능률적이고, 262.5.1.6.4.4 및 262.7.1.3.2.4보다 좋게 hIL22R1/hIL20R2를 통한 신호전달과정을 중화시켰다.

IL22R1/IL20R2의 IL20 활성화의 중화 수용체 복합체

*항-IL20 항체*	*EC50(nM)*
15D2(NN)	4.98
262.4.1.2.2.1(ZGI)	4.92
262.5.1.6.4.4(ZGI)	18.33
262.7.1.3.2.4(ZGI)	11.17

실시예 12: 역학 매개 변수의 결정

단백질 상호작용은 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 사용하여 실시간으로 관찰할 수 있다. 이 실시예는 재조합 hIL20에 대한 친화도에 대하여 하이브리도마-생산된 및/또는 재조합적으로 발현된 인간 항-IL20 항체 15D2 및 5B7을 특징짓기 위한 Biacore 3000 및 Biacore T100 기계에서의 SPR 분석을 기술한다.

친화도 연구는 센서 칩 표면에 카르복시메틸화된 덱스트란 막(CM5)에 자유 아민 그룹을 통해 공유적으로 결합시킨 단일클론 항체와, 직접적인 결합 절차를 사용하여 수행하였다. 재조합 hIL20을 다양한 농도로 주입한 다음, 센서 칩 표면 계속하여 흐르는 버퍼로 해리 기간이 이어졌다. 이 실험적 설계를 사용하여, 고정된 단일클론 항체에 대한 hIL20의 결합은 하나의 항체 결합 부위에 결합하는 하나의 hIL20 분자로, 1:1 결합으로서 여길 수 있다. 상호작용에 대한 역학 매개변수를 1:1 상호작용 랭뮤어 피팅 모델(Langmuir fitting model)을 사용하여 계산할 수 있다.

재료 & 방법

하이브리도마 세포에 의해 발현된 15D2 야생형(wt), HEK293 세포에서 발현된 15D2-wt, HEK293 세포에서 발현된 S241P 돌연변이가 있는 15D2, CHO 세포에서 발현된 15D2-S241P, 및 하이브리도마 세포에 의해 발현된 5B7-wt을 분석하였다. 정제한 단일클론 항체를 CM5 타입 센서 칩 위의 개별 유동 세포에서 고정시켰다. 고정화는 1000 Resonance Units(RU)의 고정화 수준을 목표로, 표준 아민 커플링 절차를 사용하여 수행하였다. 항체를 10 mM NaAc pH 5.0에서 5 μg/ml으로 희석하였다. HPS-EP pH 7.4(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% 폴리소르베이트 P20)를 재조합 hIL20에 대한 러닝 버퍼 및 희석제로 사용하였다. 재조합 정제 hIL20을 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 3.125 nM로 희석하였다. 회합(주사)은 3분, 이후 3분의 해리(세척) 기간이 이어졌다. 유속은 30 μl/분이었다. 실험은 25℃에서 수행하였다. 각 사이클 이후의 표면의 재생은 30 μl/min의 유속으로 10 mM 글리신-HCl pH 1.8의 30초의 펄스의 주사에 의해 성취하였다. 모든 유동 세포에서 동시에 검출하였다. No.1 유동 세포는 고정화되지 않은 항체를 함유하였고, 기저수준 및 부피의 뺄셈에 사용하였다. 역학 매개변수를 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여 주어진 항체-항원 결합에 대한 데이터의 국소적인 맞춤에 의해 계산하였다. 데이터를 역학 매개 변수의 계산 전에 대량-수송 한계에 대하여 면밀하게 살폈다. 실험을 Biacore 3000 및 T100 기계에서 수행하였다. 데이터를 Biaeval 4.1 및 Biacore T100 평가 소프트웨어를 사용하여 평가하였다.

결과.

개별 항-IL20 단일클론 항체의 속도 상수 및 친화성을 보여주는, 개별 항체에 대한 재조합 hIL20의 결합에 대하여 계산된 친화도를 하기 표 6에서 나열한다. 친화도는 몰라 단위(M), (1/Ms)의 결합률 및 (1/s)의 해리율로 나열한다. 속도 상수는 친화도 아래의 괄호 안에 (결합률/해리율)로서 나열한다.

사용된 버퍼에 대하여 유효한, 항원의 재조합 형태와의 친화도 결정은 낮은 pM 범위에서 15D2-wt HEK293 및 15D2-S241P CHO 모두의 KD값을 증명하였다. 더욱이 항체를 발현하는 하이브리도마의 친화도는 15D2-wt 및 5B7-wt의 대략 0.5 nM KD의 친화도를 증명하였다.

재조합 hIL20와의 15D2 및 5B7 상호작용에 대한 역학 매개변수

항체	KD(M) 하이브리도마	KD(M) HEK293	KD(M) CHO
15D2-wt	5.5E-10 (1.9E+05/1.1E-04)	3.2E-11 (1.9E+06/6.3E-05)	-
15D2-S241P	-	3.6E-11 (1.7E+06/6.8E-05)	3.1E-11 (2.3E+06/7.1E-05)
5B7	7.5E-10 (1.4E+05/1.0E-04)	-	-

실시예 13: IL20의 15D2 결합 경계면

이 실시예는 HX-MS 기술을 사용하여 hIL20의 15D2 결합 경계면을 확인한다. 달리 가리키지 않는 한, 이 실시예에서 hIL20 아미노산 잔기의 넘버링은 N-말단 Met(M) 잔기가 있는 서열번호 1을 지칭한다(즉, 이 실시예의 잔기 Y67은 서열번호 1에서 잔기 Y66에 상응한다).

HXMS은 생체 내 조건을 미믹하는 것에 대한 가능성을 제공한다(예를 들어, Wales and Engen, Mass Spectrom. Rev. 25, 158(2006), 및 Coales et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 23, 639(2009)를 참조하라). 본 발명에서 사용한 HX-MS 기술은 15D2 항체 결합에서 용매와의 교환으로부터 보호되고, 그것에 의해 결합 경계면의 매핑을 촉진하는 표면의 IL20의 아미드 수소를 노출하는 것에 대한 정보를 제공한다. 더욱이, 또한 방법론이 Il20에서 더 간접적인 구조적 효과를 나타낼 수 있다. 여기서 일부 부위에서 보인 것과 같이 15D2 결합에서 구조의 근소한 안정으로서 관찰하였다.

아미드 수소/중수소 교환(HX)은 상응하는 중수소화 버퍼(즉 25 mM MES, 80 mM NaCl, 96% D₂O, pH 6.4(정정되지 않은 값))에서의 15D2(Fab 단편)의 존재 또는 부재에서 IL20의 23-배 희석에 의해 시작하였다. 비-중수소화된 대조군을 동일한 프로테이티드(protaited) 버퍼로 희석하는 것에 의해 제조하였다. 모든 HX 반응은 20℃에서 수행되었고, 5 μM 15D2의 IL20의 존재 또는 부재에서 4 μM IL20을 함유하였다. 예비시험 데이터는 이들 단백질 농도에서 IL20 결합의 완전한 포화를 증명하였다.

적당한 시간 간격에서, HX 반응의 분획을 최종 pH가 2.6(교정되지 않은 값)인 동일한 부피의 차가운 켄칭 버퍼(NaOH를 사용하여 pH 2.5로 조정한, 1.35 M 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드)에 의해 켄치(Quench)화하였다. 켄치화된 표본은 즉시 펩신 효소적분해, 신속한 탈염 및 대량 분석을 위해 차가운 초고압 액체 크로마토그래피(UPLC)-질량 분석 시스템(하기에서 상세히 기술함)으로 주입하였다.

모든 표본 준비, 취급 및 주사는 HD-x PAL 자동-샘플러(LEAP Technologies Inc.)에 의해 수행하였다. 단백질 및 켄치 용액을 2℃에 두었고, 중수소화 버퍼 및 표지 반응을 20℃에서 유지하였다. 1.5℃의 온도로 조절된 냉각 박스는 수사 및 교환 밸브, 튜브, 연관류 및 컬럼을 함유하였다. 펩신 컬럼(Applied Biosystems), VanGuard C18 trapping 컬럼(Waters) 및 Acquity UPLC BEH C18 1.7 μm, 2.1×100 mm 분석 컬럼(Waters Inc)을 사용하였다. LC 유동은 아세토니트릴에서 H₂O 및 0.1% 포름산을 사용한 Acquity UPLC 펌프로부터 전달되었다. Q-ToF 프리미어를 대량 분석을 위해 사용하였다(Waters Inc).

펩틱 펩티드를 표준 MS/MS 방법을 사용한 분리된 실험에서 확인하였다. 동위원소로 둘러싼 펩티드의 평균 크기는 소프트웨어 HXExpress(Weis et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 1700(2006))를 사용한 lockmass-보정 중심 데이터(MassLynx Software, Waters Inc.를 사용하여 가공된)로부터 결정하였다.

IL20의 일차 서열의 93%를 포함하는 22개 펩티드의 HX 시간-코스를 15D2의 존재 및 부재에서 조사하였다(도 13). 관찰된 IL20 교환 패턴은 두 개의 다른 그룹으로 분할할 수 있다. 펩티드의 하나의 그룹은 15D2의 결합에 의해 크게 영향을 받지 않은 교환 패턴을 보였다. 예를 들면, 펩티드 127-145는 15D2 결합에 의해 영향을 받지 않은 IL20의 부위를 나타내었다. 일부, 그러나 15D2 결합에서 단백질 구조의 근소한 안정에 기인하는 30 초에서의 교환에서 근소한 감소를 보였다. 예를 들면, 펩티드 17-38, 60-66 및 146-153은 바깥쪽의 결합 에피토프인 IL20의 부위를 나타내었으나 15D2 결합에서 근소한 구조적 안정을 보여줄 수 있었다. 반대로, IL20 펩티드의 다른 그룹은 15D2 결합에서의 교환으로부터 4개 중양자보다 많은 강력한 보호를 보여준다. 펩티드 67-83, 67-93, 69-89, 69-93 및 84-93은 15D2의 결합 에피토프의 일부인 펩티드를 나타낸다. 그래서 15D2 결합에서의 보호를 표시하는 부위는 잔기 67-93으로부터 나온 펩티드를 포괄한다. 예를 들면, D₂O와의 13초 교환에서, 대략 10개 아미드가 15D2 결합에서 부위 69-93에서의 교환으로부터 보호되었다. D2O에서 30초 교환 이후 얻은 정보가 소수 잔기에 대하여 국소적일 때, 15D2 결합에서 교환으로부터 보호된 특정 펩티드 및 중양자의 수를 도 14에 묘사하였다.

15D2 결합 경계면은 따라서 서열번호 1의 잔기 70-92에 상응하는 서열 VFKNYQTPDHYTLRKISSLANSF를 함유하는 잔기 71-93에 위치할 수 있다. 그러나, 잔기 71-83을 함유하는 부위는 15D2 결합에서 중수소 교환으로부터 보다 적은 범위로 보호되었다. 이것은 이 부위에서의 전체적인 15D2 결합이 덜 단단하고, 가장 있음직한 것은 오직 이들 잔기의 분획이 15D2 결합에서 포함된다는 것이다. 잔기 84-85는 15D2 결합에서의 교환으로부터 완벽한 보호를 보여주었고, 부위 86-93은 또한 서열번호 1의 잔기 83-92와 상응하는 것과 함께 15D2 결합에 의해 높은 영향을 받았다.

본 발명에서 인용된 출판물, 특허출원 및 특허를 포함하는 모든 참고 문헌은 각 참고 문헌이 참조로서 포함하는 것을 개별적으로, 그리고 구체적으로 나타낸 정도까지, 그리고 전문으로 제시된 정도까지 본원에 참고자료로서 포함된다.

모든 표제와 부제는 본 발명에서 편의를 위해서 사용되며, 어떤 방법으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않는다.

상술한 요소들에서 그것의 모든 가능한 변형의 임의의 조합도 본 발명에서 달리 지칭하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는다면 본 발명에 포함된다.

본 발명을 설명하는 문맥에서 사용된 단수형은 본원에 달리 지시되거나 문맥상 분명히 모순되지 않는다면 단수 및 복수를 모두 포함한다.

본 발명에서 달리 지시되지 않는다면 본 발명의 수치 범위의 서술은 단순히 범위에 들어가는 각 개별 값을 개별적으로 언급하는 것의 약칭된 방법으로서만 소용되도록 의도되며, 각 개별 값은 그것이 본 발명에 개별적으로 인용된 것과 마찬가지로 본 명세서에 포함된다. 달리 말하지 않는다면, 본 발명에서 제공된 모든 정확한 값들은 상응하는 대략적인 값을 표시한다(예를 들어, 특정 인자 또는 측정과 관련하여 제공된 모든 정확한 예시적인 값들은 적합한 경우, "대략"이라는 수식어와 함께 상응하는 대략적인 측정치도 제공하도록 고려될 수 있다).

본 발명에서 설명하는 모든 방법은 달리 지칭하거나, 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적절한 순서대로 수행될 수 있다.

본 발명에서 제공된 임의의 및 모든 예들, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "와 같은")의 사용은 단순히 본 발명을 더 잘 예시하려는 의도이며, 달리 언급되지 않는다면 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서의 언어는 훨씬 명백히 서술되지 않는다면 어떤 요소가 본 발명의 실시에 필수적임을 나타내는 것으로서 구성되지는 않는다.

본 발명에서 특허 문헌의 인용이나 포함은 편의를 위한 것일 뿐이며, 이들의 유효성, 특허성 및/또는 실시가능성을 어떤 측면으로도 반영하지 않는다.

요소 또는 요소들과 관련하여 "포함하는", "가지는", "비롯한" 또는 "함유하는"과 같은 용어들을 사용하여 본 발명의 임의의 측면 또는 구체예를 설명한 것은 달리 언급하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는다면 그 특정 요소 또는 요소들"로 구성되는", "로 본질적으로 구성되는" 또는 "실질적으로 포함하는" 본 발명의 유사한 측면이나 구체예에 대한 뒷받침을 제공하도록 의도된다(예를 들어, 본 발명에서 특정 요소를 포함한다고 설명된 조성물은 달리 언급되거나 문맥상 분명히 모순되지 않는다면 또한 그 요소로 구성되는 조성물을 설명한다고 이해되어야 한다).

본 발명은 이용가능한 법에 의해 허용되는 최대 범위까지 본 발명에 제시된 측면 또는 청구항들에 인용된 대상의 모든 변형 및 등가물을 포함한다.

대표적인 구체예

하기는 본 발명의 대표적이고 비-제한적인 구체예이다.

1. IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 IL20 매개화 활성화를 감소시키는, 분리된 항-인간 IL20 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.

2. 구체예 1에 있어서, 인간 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 인간 IL20 매개 활성화를 감소시키는, 항체 또는 항원-결합 단편.

3. 구체예 1 또는 2에 있어서, 사이노몰구스 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 사이노몰구스 IL20 매개 활성화를 감소시키는 항체 또는 항원-결합 단편.

4. 구체예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 설치류 IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 설치류 IL20 매개 활성화를 감소시키는, 항체 또는 항원-결합 단편.

5. 구체예 1 내지 4 중 어느 하나 에 있어서, IL20 to IL20R1/IL20R2 및/또는 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체에 대한 IL20의 결합을 감소시키는, 항체 또는 항원-결합 단편.

6. 구체예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, IL20R2에 대한 IL20의 결합을 감소시키는, 항체 또는 항원-결합 단편.

7. 구체예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, IL20R1/IL20R2 또는 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체에 대한 IL19 또는 Il24의 결합을 감소시키지 않는, 항체 또는 항원-결합 단편.

8. 구체예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 성숙한 인간 IL20(서열번호 1)의 D78-H103으로부터 선택적으로 D78을 제외하고, 선별하는 적어도 하나, 항체 또는 항원-결합 단편.

9. 에피토프가 D78-K96으로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기를 포함하는, 구체예 8의 항체 또는 항원-결합 단편.

10. 에피토프가 D78-L93 또는 R83-F92에서 선택되는 적어도 하나의 잔기를 포함하는, 구체예 9의 항체 또는 항원-결합 단편.

11. 에피토프가 H79-N90에서 선택되는 적어도 하나의 잔기를 포함하는, 구체예 10의 항체 또는 항원-결합 단편.

12. 에피토프가 D78-H103에서 선택되는 적어도 3개 잔기를 포함하는, 구체예 8의 항체 또는 항원-결합 단편.

13. 에피토프가 D78-K96에서 선택되는 적어도 3개 잔기를 포함하는, 구체예 12의 항체 또는 항원-결합 단편.

14. 에피토프가 D78-L93 또는 R83-F92에서 선택되는 적어도 3개 잔기를 포함하는, 구체예 13의 항체 또는 항원-결합 단편.

15. 에피토프가 H79-N90에서 선택되는 적어도 3개 잔기를 포함하는, 구체예 14의 항체 또는 항원-결합 단편.

16. 에피토프가 D78-H103에서 선택되는 적어도 5개 잔기를 포함하는, 구체예 8의 항체 또는 항원-결합 단편.

17. 에피토프가 D78-K96 또는 R83-F92에서 선택되는 적어도 5개 잔기를 포함하는, 구체예 8의 항체 또는 항원-결합 단편.

18. 에피토프가 D78-L93에서 선택되는 적어도 5개 잔기를 포함하는, 구체예 17의 항체 또는 항원-결합 단편.

19. 에피토프가 H79-N90에서 선택되는 적어도 5개 잔기를 포함하는, 구체예 18의 항체 또는 항원-결합 단편.

20. 에피토프가 잔기 D78-H103에 상응하는 조각에 있는, 구체예 8의 항체 또는 항원-결합 단편.

21. 에피토프가 잔기 D78-K96에 상응하는 조각에 있는, 구체예 20의 항체 또는 항원-결합 단편.

22. 에피토프가 잔기 D78-L93에 상응하는 조각에 있는, 구체예 21의 항체 또는 항원-결합 단편.

23. 에피토프가 잔기 D78-N90에 상응하는 조각에 있는, 구체예 22의 항체 또는 항원-결합 단편.

24. 에피토프가 잔기 H79 및 N90을 포함하는, 구체예 8의 항체 또는 항원-결합 단편.

25. 에피토프가 잔기 R83을 추가로 포함하는, 구체예 24의 항체 또는 항원-결합 단편.

26. S85, F91, 및 L92 중 하나 이상을 추가로 포함하는 구체예 25의 항체 또는 항원-결합 단편.

27. 인간 또는 인간화 항체인, 구체예 1 내지 26 중 어느 하나의 항체.

28. 구체예 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, VH1_03, D3-10, 및 JH6 유전자를 포함하는 인간 유전자의 세트로부터 생산되거나 유래한 중쇄 가변 부위를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.

29. 구체예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, VKI_L18 및 JK4 유전자를 포함하는 인간 유전자의 세트로부터 생산되거나 유래한 경쇄 가변 부위를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.

30. 구체예 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 전장 항체인, 항체 또는 항원-결합 단편.

31. 구체예 30에 있어서, IgG1, IgG2, 또는 IgG3 아이소타입의 인간 항체인 항체.

32. 구체예 30에 있어서, IgG4 아이소타입인 항체.

33. 구체예 30에 있어서, S241P 돌연변이를 포함하는 항체.

34. 구체예 1 내지 33 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는, 항체 유도체 또는 다중 특이성 항체 분자.

35. 서열번호 8의 중쇄 가변 부위 CDR2 및 CDR3을 포함하는, 분리된 항-hIL20 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.

36. 구체예 35에 있어서, 서열번호 8의 중쇄 가변 부위 CDR1을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.

37. 구체예 36에 있어서, 서열번호 8의 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.

38. 구체예 35에 있어서, 서열번호 6의 중쇄 가변 부위 CDR2 및 CDR3을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.

39. 구체예 38에 있어서, 서열번호 6의 중쇄 가변 부위 CDR1을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.

40. 구체예 39에 있어서, 서열번호 6의 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.

41. 구체예 35에 있어서, 서열번호 7의 중쇄 가변 부위 CDR2 및 CDR3을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.

42. 구체예 41에 있어서, 서열번호 7의 중쇄 가변 부위 CDR1을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.

43. 구체예 42에 있어서, 서열번호 7의 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.

44. 구체예 35 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 9의 경쇄 가변 부위 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.

45. 구체예 44에 있어서, 서열번호 9의 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.

46. 성숙한 인간 IL20(서열번호 1)에 대한 결합에서, 서열번호 6 및/또는 7을 포함하는 VH 부위 및 서열번호 9를 포함하는 VL 부위를 포함하는 항체와 경쟁하는, 분리된 인간 항-IL20 항체.

47. 구체예 46에 있어서, mIL20(서열번호 4), cIL20(서열번호 5), 또는 둘 다에 대한 결합에서, 서열번호 6 및/또는 7을 포함하는 VH 부위 및 서열번호 9를 포함하는 VL 부위를 포함하는 항체와 추가로 경쟁하는 항체.

48. 구체예 46에 있어서, 선택적으로 D78은 제외한, 성숙한 인간 IL20(서열번호 1)의 잔기 D78-H103에 상응하는 조각에서 적어도 하나의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체.

49. 구체예 48에 있어서, 잔기 H79, R83, S85, N90, F91 및/또는 L92를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체.

50. 구체예 46에서, hIL20(서열번호 1)에서 서열번호 6 및/또는 7을 포함하는 VH 부위 및 서열번호 9를 포함하는 VL 부위를 포함하는 항체로서, 동일한 에피토프에 결합하는 항체.

51. 구체예 46 내지 50 중 어느 하나의 항체의 항원-결합 단편.

52. 구체예 1 내지 51 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 상기 항체 또는 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항-IL20 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 방법.

53. 구체예 1 내지 52 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.

54. 구체예 53에 있어서, 이차 항-염증 제제를 추가로 포함하는 조성물.

55. 구체예 54에 있어서, 이차 항-염증 제제는 면역억제제, 진통제, 항-신생혈관 제제, 코르티코스테로이드, B 세포 고갈 제제, B 세포 길항제 , T 세포 길항제 , 보체-억제 제제, 항-사이토카인 제제, 및 항-사이토카인 수용체 제제, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 조성물.

56. 인간 IL20R1/hIL20R2 및 IL22R1/hIL20R2 수용체 복합체의 인간 IL20 매개 활성화를 감소시키는 항체 또는 항원-결합 단편인 항-IL20 항체 또는 이들의 항원-결합 단편의 효과량을 투여하는 단계를 포함하는, 염증 또는 자가 면역 장애를 치료하는 방법.

57. 구체예 55에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 조성물과 동시에 또는 투여하기 전 또는 후에 이차 항-염증 제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.

58. 구체예 57에 있어서, 이차 항-염증 제제는 면역억제제, 진통제, 항-신생혈관 제제, 코르티코스테로이드, B 세포 고갈 제제, B 세포 길항제 , T 세포 길항제 , 보체-억제 제제, 항-사이토카인 제제, 및 항-사이토카인 수용체 제제, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 방법.

59. 구체예 58에 있어서, 이차 항-염증 제제는 메토트렉사트인 방법.

60. 구체예 56 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 염증 또는 자가 면역 장애는 류마티스성 관절염, 청소년 류마티스성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 또는 이들의 임의의 조합인 방법.

61. 구체예 60에 있어서, 염증 또는 자가 면역 장애는 류마티스성 관절염인 방법.

62. 구체예 60에 있어서, 염증 또는 자가 면역 장애는 건선인 방법.

63. 구체예 60에 있어서, 염증 또는 자가 면역 장애는 건선성 관절염인 방법.

64. 구체예 60에 있어서, 염증 또는 자가 면역 장애는 다발성 경화증인 방법.

65. 구체예 60에 있어서, 염증 또는 자가 면역 장애는 염증성 장 질환인 방법.

66. 구체예 60에 있어서, 염증 또는 자가 면역 장애는 전신성 홍반성 루푸스인 방법.

67. 구체예 60에 있어서, 염증 또는 자가 면역 장애는 루푸스 신염인 방법.

68. 염증 또는 자가 면역 장애의 치료에서 사용하기 위한 구체예 1 내지 51 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편.

69. 구체예 1 내지 51 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편에 있어서, 이차 항-염증 제제와 함께, 염증 또는 자가 면역 장애의 치료에서 사용하기 위한 조합.

70. 구체예 69에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편과 동시에 또는, 투여 전 또는 후에 이차 항-염증 제제를 투여하는 조합.

71. 구체예 70에 있어서, 이차 항-염증 제제는 메토트렉사트인 조합.

72. 염증 또는 자가 면역 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에서, 구체예 1 내지 51 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편의 용도.

73. 염증 또는 자가 면역 장애가 류마티스성 관절염인, 구체예 68 내지 72 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편, 조합 또는 용도.

74. 염증 또는 자가 면역 장애가 건선인, 구체예 68 내지 72 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편, 조합 또는 용도.

75. 염증 또는 자가 면역 장애가 건선성 관절염인, 구체예 68 내지 72 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편, 조합 또는 용도.

76. 염증 또는 자가 면역 장애가 다발성 경화증인, 구체예 68 내지 72 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편, 조합 또는 용도.

77. 염증 또는 자가 면역 장애가 염증성 장 질환인, 구체예 68 내지 72 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편, 조합 또는 용도.

78. 염증 또는 자가 면역 장애가 전신성 홍반성 루푸스인, 구체예 68 내지 72 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편, 조합 또는 용도.

79. 염증 또는 자가 면역 장애가 루푸스 신염인, 구체예 68 내지 72 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편, 조합 또는 용도.

80. 염증 또는 자가 면역 장애가 청소년 류마티스성 관절염인, 구체예 68 내지 72 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편, 조합 또는 용도.

81. 염증 또는 자가 면역 장애가 강직성 척추염인, 구체예 68 내지 72 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편, 조합 또는 용도.

82. 염증 또는 자가 면역 장애가 쇼그렌 증후군인, 구체예 68 내지 72 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편, 조합 또는 용도.

SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> ANTI-HUMAN INTERLEUKIN-20 ANTIBODIES <130> DK10P1201 <150> 61/079005 <151> 2008-06-30 <150> PCT/EP2009/058155 <151> 2009-06-30 <160> 46 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 152 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser Cys Val Ile Ala Thr Asn Leu Gln 1 5 10 15 Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Glu Ile Arg Gly Ser Val Gln Ala Lys 20 25 30 Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile Leu Arg Arg Thr Glu Ser Leu Gln 35 40 45 Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys Cys Leu Leu Arg His Leu Leu Arg 50 55 60 Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys Asn Tyr Gln Thr Pro Asp His Tyr 65 70 75 80 Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe Leu Thr Ile Lys 85 90 95 Lys Asp Leu Arg Leu Cys His Ala His Met Thr Cys His Cys Gly Glu 100 105 110 Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser Gln Ile Leu Ser His Phe Glu Lys Leu 115 120 125 Glu Pro Gln Ala Ala Val Val Lys Ala Leu Gly Glu Leu Asp Ile Leu 130 135 140 Leu Gln Trp Met Glu Glu Thr Glu 145 150 <210> 2 <211> 176 <212> PRT 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Tyr Gln Gly Glu Tyr Glu Ser Leu Tyr Thr Ser 65 70 75 80 His Ile Trp Ile Pro Ser Ser Trp Cys Ser Leu Thr Glu Gly Pro Glu 85 90 95 Cys Asp Val Thr Asp Asp Ile Thr Ala Thr Val Pro Tyr Asn Leu Arg 100 105 110 Val Arg Ala Thr Leu Gly Ser Gln Thr Ser Ala Trp Ser Ile Leu Lys 115 120 125 His Pro Phe Asn Arg Asn Ser Thr Ile Leu Thr Pro Pro Gly Met Glu 130 135 140 Ile Thr Lys Asp Gly Phe His Leu Val Ile Glu Leu Glu Asp Leu Gly 145 150 155 160 Pro Gln Phe Glu Phe Leu Val Ala Tyr Trp Arg Arg Glu Pro Gly Ala 165 170 175 Glu Glu His Val Lys Met Val Arg Ser Gly Gly Ile Pro Val His Leu 180 185 190 Glu Thr Met Glu Pro Gly Ala Ala Tyr Cys Val Lys Ala Gln Thr Phe 195 200 205 Val Lys Ala Ile Gly Arg Tyr Ser Ala Phe Ser Gln Thr Glu Cys Val 210 215 220 Glu Val Gln Gly Glu Ala Ile Pro Leu Val Leu Ala Leu Phe Ala Phe 225 230 235 240 Val Gly Phe Met Leu Ile Leu Val Val Val Pro Leu Phe Val Trp Lys 245 250 255 Met Gly Arg Leu Leu Gln Tyr Ser Cys Cys Pro Val Val Val Leu Pro 260 265 270 Asp Thr Leu Lys Ile Thr Asn Ser Pro Gln Lys Leu Ile Ser Cys Arg 275 280 285 Arg Glu Glu Val Asp Ala Cys Ala Thr Ala Val Met Ser Pro Glu Glu 290 295 300 Leu Leu Arg Ala Trp Ile Ser 305 310 <210> 28 <211> 574 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 28 Met Arg Thr Leu Leu Thr Ile Leu Ala Val Gly Ser Leu Ala Ala His 1 5 10 15 Ala Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser 20 25 30 Asn Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr 35 40 45 Pro Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp 50 55 60 Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn 65 70 75 80 Leu Thr Val Glu Thr Gly Asn His Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val 85 90 95 Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met Thr Asp Arg 100 105 110 Phe Asn Ser Leu Gln His Thr Ala Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys 115 120 125 Ile Pro Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe 145 150 155 160 His Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln 165 170 175 Met His Leu Gly Gly Glu Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr 180 185 190 Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys Val Pro Thr Trp 195 200 205 Ser Lys Lys Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Arg Thr Leu Pro Asp 210 215 220 Arg Thr Trp Thr Tyr Ser Phe Ser Gly Ala Phe Leu Phe Ser Met Gly 225 230 235 240 Phe Leu Val Ala Val Leu Cys Tyr Leu Ser Tyr Arg Tyr Val Thr Lys 245 250 255 Pro Pro Ala Pro Pro Asn Ser Leu Asn Val Gln Arg Val Leu Thr Phe 260 265 270 Gln Pro Leu Arg Phe Ile Gln Glu His Val Leu Ile Pro Ala Phe Asp 275 280 285 Leu Ser Gly Pro Ser Ser Leu Ala Gln Pro Val Gln Tyr Ser Gln Ile 290 295 300 Arg Val Ser Gly Pro Arg Glu Pro Ala Gly Pro Pro Gln Arg His Ser 305 310 315 320 Leu Ser Glu Ile Thr Tyr Leu Gly Gln Pro Asp Ile Ser Ile Leu Gln 325 330 335 Pro Ala Asn Val Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ser Pro Leu Ser Tyr Ala 340 345 350 Pro Asn Ala Ala Pro Glu Val Gly Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gln Val 355 360 365 Thr Pro Glu Ala Gln Leu Pro Phe Tyr Thr Pro Gln Ala Val Ser Lys 370 375 380 Val Gln Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gln Ala Thr Pro Asp Ser Trp Pro 385 390 395 400 Pro Ser Tyr Gly Val Cys Val Glu Gly Ser Gly Lys Asp Ser Pro Thr 405 410 415 Val Thr Leu Ser Ser Pro Lys His Leu Arg Pro Lys Gly Gln Leu Gln 420 425 430 Lys Glu Pro Pro Ala Gly Ser Cys Met Ser Gly Gly Leu Ser Leu Gln 435 440 445 Glu Val Thr Ser Leu Ala Met Glu Glu Ser Gln Glu Ala Lys Ser Leu 450 455 460 His Gln Pro Leu Gly Val Cys Thr Asp Arg Thr Ser Asp Leu Asn Val 465 470 475 480 Leu Asp Ser Gly Glu Glu Gly Thr Pro Gln Tyr Leu Lys Gly Gln Leu 485 490 495 Pro Leu Leu Ser Ser Val Gln Ile Glu Gly His Pro Met Ser Leu Pro 500 505 510 Leu His Pro Pro Ser Arg Pro Cys Ser Pro Ser Asp Gln Gly Pro Ser 515 520 525 Pro Trp Gly Leu Leu Glu Ser Leu Val Cys Pro Lys Asp Glu Ala Lys 530 535 540 Ser Leu Ala Pro Glu Thr Ser Asp Leu Glu Gln Pro Thr Glu Leu Asp 545 550 555 560 Ser Leu Phe Arg Gly Leu Ala Leu Thr Val Gln Trp Glu Ser 565 570 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 agaattccac catgaggacg ctgctgacca 30 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 gctcgagaca gggaggaagc accaag 26 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 cgaattccct tggtttctgg ggaag 25 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 gctcgagcac aggaaacaaa aggcaaa 27 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 agaattctgg aaagaaacaa tgttctaggt caa 33 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 gctcgagctt cacctgggcc cttcc 25 <210> 35 <211> 35 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 35 ccgaattcgc caccatgaag acactactga ccatc 35 <210> 36 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 36 cttgcggccg ctcaggattc ccactgcaca gtc 33 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 37 ttgaattcgc caccatgcac actcccggga 30 <210> 38 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 38 ttgcggccgc ctagctttcc atttgtacat gtaacc 36 <210> 39 <211> 34 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 39 ttggatccgc caccatgatt tcccagggag tctg 34 <210> 40 <211> 31 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 40 ttgcggccgc tcaagtctgt gagatccaga c 31 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 41 agaattccac catgaggacg ctgctgacca 30 <210> 42 <211> 26 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 42 gctcgagaca gggaggaagc accaag 26 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 43 gtgggactga gcagtctgct g 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 44 aggcaaaagg aagtgttggc a 21 <210> 45 <211> 33 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 45 agaattctgg aaagaaacaa tgttctaggt caa 33 <210> 46 <211> 25 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 46 gctcgagctt cacctgggcc cttcc 25

Claims

VH1_03, D3-10, 및 JH6 유전자를 포함하는 인간 유전자의 세트로부터 유래한 중쇄 가변 부위를 포함하는 분리된 항-인간 IL20 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
제 1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 부위는 각각 카밧 잔기 50-65, 95-102, 및 31-35에 대응하는, CDR2 및 CDR3 서열, 및 선택적으로 서열번호 8의 CDR1 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, VKIL_18 및 JK4 유전자를 포함하는 인간 유전자의 세트로부터 유래한 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 9의 경쇄 가변 서열 및 서열번호 6 또는 서열번호 7의 중쇄 가변 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
인간 IL20에 결합하고,
(a) IL20R1/IL20R2 및 IL22R1/IL20R2 수용체 복합체의 IL20-매개 활성화를 감소시키고;
(b) 재조합적으로 IL20R1/IL20R2를 발현하는 BaF-3 세포의 IL20-매개 증식을 감소시키고;
(c) 재조합적으로 IL20R1/IL20R2를 발현하는 BaF-3 세포의 IL19- 또는 IL24-매개 증식을 감소시키지 않고;
(d) 대략 1 nM 또는 그 미만의 KD로 인간 IL20에 결합하고; 그리고
(e) 대략 pH 7.4의 수성 완충액에서 적어도 대략 80 mg/ml의 용해도를 갖는 것에서 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 인간 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
제 5항에 있어서, 서열번호 9를 포함하는 경쇄 가변 부위 및 서열번호 6 또는 서열번호 7을 포함하는 중쇄 가변 부위를 포함하는 항체와 인간 IL20에 대한 결합에서 경쟁하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
제 6항에 있어서, 성숙한 인간 IL20(서열번호 1)의 H79-H103으로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기를 포함하는 에피토프와 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
제 7항에 있어서, 에피토프는 H79-L93으로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
제 5항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 6 또는 서열번호 7의 카밧 잔기 31-35, 50-65, 및 95-102를 각각 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
제 9항에 있어서, 서열번호 9의 카밧 잔기 24-34, 50-56 및 89-97을 각각 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, IgG4 아이소타입인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 항체의 적어도 대략 80 mg/ml, 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 염증 또는 자가 면역 장애의 치료에 사용하기 위한, 항체, 항원-결합 단편 또는 약학적 조성물.
제 13항에 있어서, 류마티스성 관절염, 청소년 류마티스성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 또는 이들의 조합의 치료에 사용하기 위한, 항체, 항원-결합 단편, 또는 약학적 조성물.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 상기 항체 또는 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항-IL20 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 방법.