TW201022288A

TW201022288A - Anti-human interleukin-20 antibodies

Info

Publication number: TW201022288A
Application number: TW098121982A
Authority: TW
Inventors: Jesper Pass; Soeren Oestergaard; Jes Thorn Clausen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 2008-06-30
Filing date: 2009-06-30
Publication date: 2010-06-16
Also published as: MX2010013565A; AU2009265808A1; IL209717A0; JP2011526591A; CN102137871A; EP2297203A1; WO2010000721A1; BRPI0914916A2; US20110091475A1; AU2009265808B2; KR20110039218A; US20140141001A1; US8287861B2; CA2728685A1; ZA201008993B; RU2011101969A; US20130039923A1; US20140194599A1

Description

201022288 六、發明說明：發明領域本發明係關於針對人類介白素-20 ( IL20)之抗體，包括人類單株抗IL20抗體，以及其產生方法、組成物及用途。發明背景介白素(1L1幻、IL20及介白棄，24 ( IL24 )秦素-10 ( IL10 )細胞激素家族之成員。.所有三種介白素結合 IL20R1/IL20R2雜二聚受體且經由該受體進行信號轉導。 IL20及IL24 (而非IL19)亦為由IL20R2及IL22R1組成之受體複合物的配位體（Parrish-Novak等人，j Biol Chem 2002; 277: 47517-47523 ; Dumoutier 等人，j immun〇i 2001;167:3545-3549 )。已提出 IL19 及 IL20 以及其他 IL10 家族成員形成螺旋細胞激素之不同子族，其中至少IL1 9及 IL20具有類似三維結構（Chang等人，J chem 2003; 278: 3308-13)。 IL20及其受體以高含量存在於牛皮癬性病變（Wei等人，Clin Immunol (2005) 1 17: 65-72 ; R0mer 等人，J Invest Dermatol 2003; 121, 1306 - 1311 ; Wang 等人，J Invest Dermatol 2006; 126: 1590-1599 ; Otkjaer 等人，Br J Dermatol 2005; 153: 911-918)及類風濕性關節炎患者之滑液（Hsu 等人，Arthritis Rheum 2006; 54: 2722-2733; Kragstrup 等人， Cytokine 2008; 41: 16-2)中。因此，使用受體片段或單株抗體來拮抗IL20活性已被描述為治療各種發炎性病狀之有希望方法（例如，WO9927103 、 WO0146261 、 201022288 W02003051384、W02004085475 及 W02006086396)。舉例而言，發現多株抗IL20抗體在牛皮癖之異種移植模型中治療性有效（Stenderup 等人，Br J Dermatol 2006; 154: 11-35, 第 12 頁摘要；Stenderup 等人 Br J Dermatol 2009;160(2): 284-96 ) ° 人類IL20 ( hIL20 )之抗原性抗原決定基以及結合 huIL20之大鼠或鼠類單株抗體亦已得到描述（例如， W02005052000、US20060142550 及 W02007081465 )。然 Φ 而，迄今為止尚未提供適合於患者治療之抗體。本發明解決此項技術中之此等及其他需求。發明摘要本發明提供可減少一或多種包括人類之物種體内 IL20R1/IL20R2 及 IL22R1/IL20R2 受體複合物之 IL20 介導之活化的抗hIL20單株抗體。典型地，該等抗體為全人類或人類化抗體以當向患者投予時使針對抗體之免疫反應的風險最小。本發明亦提供具有改良之溶解度性質的抗hIL20 ® 抗體，該等性質使其能夠以高濃度調配。如本文中所述，諸如抗原結合抗體片段、抗體衍生物及多特異性分子之其他抗原結合分子可自該等抗體設計或衍生。亦提供結合hIL20分子之對應於IL19中之螺旋E的特異性區段之抗體。在一具體實例中，抗體之抗原決定基包含對應於成熟hIL20 ( SEQ ID NO: 1 )中之D78-L93 (視情況不包括D78 )之區段中的一或多個胺基酸殘基，例如 H79、R83、S85、N90、F92、L93 或其任何組合。 201022288 本發明之某些抗hIL20抗體亦可與hIL20上與本文所述之特異性人類抗hIL20抗體（包括15D2及5B7)中之一或多者相同的抗原決定基競爭及/或結合於該抗原決定基或具有相同結合界面。舉例而言，在一具體實例中，與已知抗 hIL20抗體相比，本發明之抗體更有能力與15D2及/或5B7 競爭。在另一態樣中，本發明之抗體包含自與15D2或5B7相同之人類V、D或J區段中之一或多者衍生的抗原結合序列。該等抗體可例如包含一或多種與本文所述之丨51>2及/ 或5 B 7抗原結合序列一致或實質上一致的抗原結合序列。在其他態樣中’本發明提供編碼本發明之抗體的核酸’包含該等核酸之表現載體’包含該等核酸之宿主細胞，產生本發明之抗體的宿主細胞，及藉由於合適條件下培養該等宿主細胞來產生抗hiL20抗體之方法。亦提供該等抗體之抗體結合片段及包含該等抗體或抗原結合片段之分子，包括工程改造抗體片段、抗體衍生物、雙特異性抗體及其他多特異性分子。亦可製備包含該等抗體或分子之醫藥組合物及套組或其他物品。進一步提供使用該等抗體減少或抑制 IL20R1/IL20R2 及 IL22R1/IL2〇R2 受體複合物之 il2〇 "導之活化的方法，及使用該等抗體治療或預防自體免疫或發炎性疾病或病症之方法，該等疾病或病症包括（但不限於）類風濕性關節炎、青少年類風濕性關節炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、強直性脊椎炎、休格連氏症候群（

Sjogren's 全身性紅斑狼瘡、 syndrome)、多發性硬化症、發炎性腸病 201022288 、狼瘡腎炎或其組合。圖式說明圖1展示成熟hIL20之胺基酸序列（A) ( SEQ ID ΝΟ:1 ) 及（B ) hIL20 ( SEQ ID NO:2 )、人類 IL19 ( SEQ ID NO:3 )、鼠類 IL20 ( SEQ ID NO:4 )及獼猴 IL20 ( SEQ ID NO:5 )之前驅體形式的比對。在（A)中，有編號之殘基對應於IL19 中之螺旋E，其中粗體殘基表示15D2及5B7之關鍵抗原決定基區段。粗體下劃線之殘基為對於15D2及5B7結合最重 Φ 要之殘基，而發現粗體雙下劃線之殘基對1 5D2及/或5B7 結合較為關鍵。在（B )中，hIL20中之下劃線區段為信號序列，且其他標記與（A)中相同。圖2展示hIL20之模型（使用IL19命名法），其使用

Chemical Computing Group 之分子操作環境（Molecular

Operating Environment，MOE )軟體自 hIL19 之模板 INIF.pdb構建。使用hIL19/hIL20序列比對及iNIF.pdb中之螺旋分配’使用Corel Draw ( Corel公司）製出該圖。 ❿ 圖3展示15D2重鏈可變（VH)區（SEQ ID NO:6) ( A)、 5B7 VH 區（SEQ ID NO:7) ( B)及 15D2/5B7 輕鏈可變（VL) 區（SEQ ID NO:9)(C)之分析，及15D2及5B7 VH區與一致序列（SEQ ID NO:8 )之比對（D )。將各抗體序列與相應生殖系序列比對’展示各胺基酸位置之相應Kabat編號。在各序列中，根據Kabat方案之相應互補決定區（CDR )序列以粗體、下劃線文字顯示。VH1—03、D3-10及JH6分別對應於 SEQ ID NO:10、12 及 14，且 VKI_L18/JK4 分別對 201022288 應於SEQ ID NO:15及17。D3-10、JH6及JK4之編碼序列分別以SEQ ID NO: 11、13及16提供。圖4展示具有各胺基酸位置之相應Kabat編號的IgG4

同型之若干人類抗IL20抗體VH ( A )及VL ( B )區序列之比對。在各序列中，根據Kabat方案之相應CDR序列以粗體、下劃r鍊咬參顳示。（A ) 2F6 ( SEQ仰嫩>>18 )、C3 4 S純贷 ID NO:20)> F18( SEQ ID NO:22>' ¥56 A F56/F1 8 ( SEQ ID N〇:23)、5B7 ( SEQ ID NO:7)及 15D2 ( SEQ ID NO:6)之重鏈可變序列，（B ) 2F6 ( SEQ ID NO: 19 )、C3 ( SEQ ID NO:21 )、F56—1 型、i5D2 及 5B7 ( SEq ID n〇:9)及 f56_2 型（SEQ ID NO:24 )之輕鏈可變序列。圖5展示15D2抑制經三種不同細胞激素濃度之 hIL20Rl/hIL20R2 轉染之 BaF_3 細胞的 hIL20 ( A)、hIL19 (B )及hIL24 ( C )誘發之增殖之能力。（A )偵測抓2〇誘發之增殖之抑制的劑量_依賴性反應。在所用之〗濃度範圍内（直至66 nM)未觀察到hIL19 ( B)或hIL24 ( C) 誘發之增殖的抑制。圖6展示針對】r 了 5D2 ( A)或 5B7 ( B)之 hIL20 之一級肽陣列的結果4軸指示光學密度（〇d，螢光強度之度量）。應^意到並非所有肽均存在於囷中’因為-些QD值低於積測極限。在（A )中，風-此t十 τ展不對應於SEQ ID ΝΟ:1之殘基69-86 (85)、73-90 ( 86 )、77 94 ( 87 )、81-98 ( 88 )及 85-102 ( 89 ) 的肽。肽87顯露出來，问馮該肽具有最咼結合活性。在（B ) 中’展示對應於殘基49 66( 19)、53-70(20)、57-74 (21)、 201022288 69-86 ( 24 )、73-90 ( 25 )及 77-94 ( 26 )之肽。圓7展示針對！ 5D2 ( a )或5B7 ( b )之hIL20的二級狀陣列分析。針對自c及N末端截短之構築體測試抗體β 該等肽全部均經醯化以避免自Ν末端產生正電荷。在（Α ) 中’左攔展示對應於SEQ m ΝΟ:1之Y74至K96—S86及 K84的肽（分別為肽丨_12)，且右攔展示對應於seq 之Q75 185至K96的肽（分別為肽13-24，其中肽22與 23 一致在（B)中’左攔展示對應於SEQ ID ΝΟ:1之Y74 ©至K96—S86及K84的肽（分別為肽卜⑴，且右欄展示對應於Q75— S84至K96的肽（分別為肽13-24，其甲肽22 與23 —致）。 8展示針對（A) 15D2及（B) 5B7之對應於SEQ m 之殘基Y74至K96的長抗原決定基圖 ΝΟ:1 YQTPDHYTLRKISSLANSFLTIK 之 Ala 掃描。在（A)中，

所不肽對應於位置78_96處具有丙胺酸取代之seq ι〇之殘基78-96’分別為肽4〇_61。在（B)中，所示狀對應於位置78-96處具有丙胺酸取代之SEQ m Ν〇;ι之殘基 78-96 ’分別為肽丨_22。圖9展示如藉由螢光素酶檢定所揭示 —體之鼠一化的叫和鼠將^ 叉體複合物mIL20Rl/miL22Rl轉染至BHK細胞中且用1〇 nM鼠類IL20進行刺激。使用}微克/毫升、1〇微克/毫升或 5〇微克/毫升之15D2研究刺激之中和。圖ίο展示如藉由螢光素酶檢定所揭示之人類 9 201022288 · IL20R2 及 IL22R1/IL20R2 受體（A)或獼猴 IL20R1/IL20R2 及IL22R1/IL20R2 ( B )之獼猴IL20活化的15D2中和。圖11展示如藉由螢光素酶檢定所揭示之人類IL20R1 /IL20R2及IL22R1/IL20R2之人類IL20介導之活化的15D2 中和。圖12展示IL19回復IL20謗發之增殖之15D2阻斷，此揭示15D2結合IL20之可溶性形式而非受體結合形式，否則其將阻斷IL 1 9接近受體。圖13展示在醯胺氫/氘交換（hydrogen/deuterium 〇 exchange，HX)-質譜法（MS )研究中用於判定15D2結合界面之hIL20的一級序列。在經HX分析之肽（如水平條塊所示）上方顯示一級hIL20序列（使用成熟Met-Ι編號，由此使+ 1不同於SEQ ID ΝΟ:1中之相應殘基）。在15D2存在及不存在下顯示類似交換模式之肽由灰色條塊指示，而顯示在1 5D2結合後氘併入減少之肽由黑色條塊指示。圖14展示來自ΗΧ-MS研究中之個別肽之氘標記的亞定位。（A ) IL20 —級結構之區60-93的特寫。在15D2存在 Ο 及不存在下顯示類似交換模式之肽為灰色，而顯示在15D2 結合後氘併入減少之肽為黑色。數字指示在1 5D2結合後在個別IL20區中觀察到之氘含量的差異。（B)假定N末端及第一肽鍵醯胺完全不交換，已藉由簡單減法將來自該等肽之資訊亞定位於較小殘基延伸段。接著校正僅含有9 1 %氘之標記反應的氘含量且以總殘基之百分數報導。定義 10 201022288 % 除非另有規定或同上下文矛盾，否則術語「IL20」或「IL-20」指人類介白素-20 (hIL20)，亦稱為ZcytolO，包括其未加工之前驅體（UniProt Q9NYY1 ; SEQ ID NO:2 )、成熟形式（SEQ ID ΝΟ:1，UniProt Q9NYY1，無殘基 i_24 信號序列）及/或天然存在之變異體或其直系同源物，諸如鼠類 IL20 ( miL20 )前驅體（UniProt Q9JKV9 ; SEQ ID NO:4 ) 或獼猴IL20 ( cIL20)前驅體（SEQ ID NO:5)或其缺乏對應於前驅體hIL20(SEQIDNO:2)中之殘基1-24之信號序 • 列的成熟形式。本文中之術語「抗體（antibody )」以最廣泛意義使用且特定地包括全長單株抗體、多株抗體且除非另有規定或同上下文矛盾’否則包括其抗原結合片段、抗體變異體及多特異性分子，只要其展現所需特異性及/或生物活性即可。一般，全長抗體為包含由二硫鍵相互連接之至少兩個重（H)鏈及兩個輕（L)鏈之醣蛋白或其抗原結合部分。 I*鍵包含重鏈可變區（太女中饍宜蛊舌

輪鍵可變區（本文中簡寫為VL )及輕鏈恒定區。該輕鍵怪定區包含一個域，〇^。乂11及¥[區可進一步再分為稱為互

鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相區’其間散布有更

rk region，FR)之區。各 VH FR ’按以下順序自胺基末端至、FR2、CDR2、FR3、CDR3、相互作用之結合域。 11 201022288 與產生抗體有關之各種技術提供於例如Harlow及Lane， ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring

Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988) 中o 抗體之「抗原結合片段（antigen-binding fragment )」為包含全長抗趙之能夠可该測n地結合於抗原之r-部分的分子。抗原結合片段包括包含抗體之一偭、兩個、三値或更多抗原結合部分之多價分子及單鏈構築體，其中VL及VH 區或其所選部分藉由合成連接子或藉由重組方法接合以形 0 成功能性抗原結合分子。術§吾「抗體衍生物（antibody derivative )」及「免疫結合物（immunoconjugate)」在本文中可互換使用以表示包含全長抗體或其抗原結合片段之分子，其中一或多個胺基酸經化學修飾’例如藉由烷基化、聚乙二醇化（PEGyiati〇n )、醯化' S旨形成或醯胺形成或其類似方法，例如使抗體連接於第二分子而進行。例示性修飾包括聚乙二醇化、半胱胺酸-聚乙二醇化、生物素化、放射性標記及與第二藥劑（諸 u 如細胞毒性劑）結合。夕特異性分子（multiSpecific molecule)」包含抗體或其抗原結合片段，其與至少另一個功能分子（例如另一肽或蛋白質，諸如受體之另一抗體或配位體）締合或連接以產生結合於至少兩個不同結合位點或目標分子之分子。例示性多特異性分子包括雙特異性抗體及連接於可溶性受體片段或配位體之抗體。 12 201022288 如本文中所使用，術語「 * ,,, 類抗體（human antibody) !

意欲包括具有可變區之抗體 ^ y；J r w 该等可變區中的構架區盥 CDR區皆源自人類生殖系免一辦…… t— 免疫球蛋白序列。此外，若該抗體3有恒疋區，則該怪定區亦 T自人類生殖系免疫球蛋白序列衍生。人類生殖系序列之隼人呆口可在例如NCBI網站上得到。本發明之人類抗體可包括匕牯不由人類生殖系免疫球蛋白 « 序列編碼之胺基酸殘基（例如，||由試管内無規或定點突變誘發或藉由活體内體細胞突變所引人之突變）。然而，如本文所使用，術語「人類抗體 _ /ίΛ . . ^ 蜗机镀」不欲包括自另一哺乳動物物種（諸如小鼠）之生瘦系衍生之u a2 丁生之CDR序列已接枝於人類構架序列上的抗體。人類化（humanized)」抗體為含有自非人類免疫球蛋白衍生之最小序列的人類/非人類嵌合抗體。一般而言，人類化抗體為人類免疫球蛋白（接受者抗體），其中來自接受者之高變區之殘基經來自諸如小鼠、大鼠、兔子或非人2 靈長類動物之非人類物種（供給者抗體）之高變區中具有 ® 所需特異性、親和力及功能之殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之FR殘基經相應非人類殘基置換（「回復突變（back-mutation)」）。此外，人類化抗體可包含接受者抗體或供給者抗體中未見之殘基。進行此等修飾以進一步改進抗體效能。一般而言，人類化抗體將包含實質上全部至少一個且典型地兩個可變域，其中所有或實質上所有 CDR高變環對應於非人類免疫球蛋白之彼等者且所有或實質上所有FR殘基為人類免疫球蛋白序列之彼等者。人類化 13 201022288 抗體亦可視情況包含免疫球蛋白恆定區（Fc )之至少一部分’典型地為人類免疫球蛋白之至少一部分。欲知詳情，例如參見 Jones 等人，Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 等人，Nature 332:323-329 (1988);及？代81&，〇1〇·· Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)、W0 92/02190、美國專利申請案 20060073137 及美國專利 6,750,325、6,632,927、 6,639,05 5 ' 6^548,640 > 6,407,213 ' 6,180,370 ' 6,054,297 > 5,929,212 ' 5,895,205 ' 5,886,152 ' 5,877,293 ' 5,869,619 ' 5,821,337 > 5,821,123 ' 5,770,196 ' 5,777,085 ' 5,766,886 > 5,714,350、5,693,762、5,693,761、5,530,101、5,585,089 及 5,225,539 ° 當在本文中使用時，術語「高變區（hypervariable region )」指抗體中負責抗原結合之胺基酸殘基。高變區一般包含來自「互補決定區」或r CDR」之胺基酸殘基（輕鏈可變域中之殘基 24-34 ( L1 )、50-56 ( L2 )及 89-97 ( L3 ) 及重鏈可變域中之 31-3 5(H1)、50-65( H2)及 95-102( H3 ); Kabat 人（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案第91_3242號）及/或來自「高變環」之彼等殘基（輕鏈可變域中之殘基26_32 ( Li )、50-52 ( L2 ) 及 91-96 ( L3 )及重鏈可變域中之 26-32 ( H1 )、53-55 ( H2 ) 及 96-101 ( H3 ); Chothia 及 Lesk，J. Mol· Biol 1987; 196:901-917 )及/或特異性判定殘基（81)以以力_(^如111丨1^11§ residue ’ SDR ) ’其為抗體-抗原相互作用中最關鍵之殘基 201022288 (Kashmiri 等人，Methods 2005;36:25-34 )。該等 SDR 可使用例如對抗體-抗原相互作用之3D結構分析或藉由使用已知技術進行突變分析來判定。典型地，此區内之胺基酸殘基的編號藉由Kabat等人（見上）中所述之方法來執行。諸如

Kabat位置（Kabat position)」、「如Kabat中之可變域殘基編號（variable domain residue numbering as in Kabat)」及「根據Kabat ( according to Kabat )」之詞在本文中指用於重鏈可變域或輕鏈可變域之此編號系統。使用Kabat編號系 ® 統，肽之實際線性胺基酸序列可含有對應於可變域之FR或 CDR之縮短或插入可變域之FR或cdr中的較少或其他胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括CDR H2之殘基52後的單一胺基酸插入（根據Kabat之殘基52a)及重鏈FR殘基82後之插入殘基（例如根據Kabat之殘基82a、82b及 82c等）。可藉由於抗體序列之同源區處與「標準」編號序列進行比對（參見圖3及4)來對特定抗體判定殘基之Kabat編號。 ® 多肽「變異體（variant )」指具有實質上與參考多肽（典型地為天然或「親本」多肽）一致之胺基酸序列的多肽。多肽變異體在天然胺基酸序列中之某些位置處可具有一戋多個胺基酸取代、缺失及/或插入，但在至少一個方面不同於親本多肽。術s吾抗體之「抗原決定基（epit〇pe )」或「抗原性決定子（antigenic determinant)」為結合抗體之預定抗原之一部分且通常由胺基酸或糖鏈之化學活性表面分組組成。定義 15 201022288 蛋白質抗原決定基之特異性胺基酸的數目可能相對較少，且典型地包含直接與抗體結合有關之胺基酸，但當抗體結一夺仍了阻斷不直接與抗體結合有關之其他胺基酸。蛋白質抗原決定基中之胺基酸可相互接近或沿抗原之長度廣泛分散，從而使得經由摺疊達到正確的抗原決定基構形。構形柷原決定基（;confermational. epit〇pe)」指視正確播養之預定抗原而定之抗原決定基，而「線性抗原決定基（linear epitope)」未正確搢疊（例如呈變性形式或呈包含抗原決定基之片段形式）時亦可由抗體識別。如本文中所使用’「特異性結合（specificbinding)」指抗體結合預定抗原（諸如IL2〇)之能力。典型地，抗體以 W8或更小之解離常數（Kd )結合，且以比其結合於除預定抗原外之非特異性抗原（例如，B s A )或密切相關分子（例如，直系同源物）之Kd值小至少2倍的Kd值結合於預定抗原。在兩個胺基酸序列之情況下，術語「實質上一致 (substantially identical )」意謂該等序列在最佳比對（諸如藉由程式GAP或BEST-FIT使用預設空隙重量）時共有至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80q/()、至少約90%、至少約95%、至少約98%或至少約99%序列一致性。兩個實質上一致胺基酸序列中之「相康 (corresponding )」胺基酸位置為藉由本文中所提及之任何蛋白質分析軟體、典型地使用預設參數所比對之彼等者。 201022288 摔作於與另—核酸序列之功能關係㈣，其經「可 ==“_yIinked)」。舉例而言泌性別導子之DNA表現為來 ^次刀其可摔作性i拿桩μ夕多肽刀泌之前蛋白質，使則

卉j徕作性連接於多肽之DN 碼序列之轉錄，則使其子或㈣子影響編體結八位—、、’、連接於該序列；或若核糖編：：歹j ’ “位以有助於轉譯，則使其可操作性連接於

:碼：列。一般，「可操作性連接」意謂所連接之職序 :相鄰，且在分泌性前導子之情況下其相鄰並處於閱讀相 I。…、而’增強子不必相鄰。藉由於習知限制性位點處接 &來：成連接。若該等位點不存在，則根據習知慣例使用合成养核苷酸接附子（adaptor)或連接子。經分離（isolated)」之分子為作為組成物中之主要種類的分子，其t發現其與其所屬之分子類別㈣（亦即，其佔組成物中某分子類型之至少，約5〇%且典型地將佔組成物中某分子種類（例如’肽）之至少約7〇%、至少約8〇%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更多）。通常，在組成物中所有存在之肽種類的情況下或在所提出用途之情況下至少關於實質上活性肽種類，抗體分子之組成物將展現抗體分子之98%、98%或99%均質性。在本發明之内容中’除非同上下文矛盾，否則「治療 (tireatinent/ueating)」指預防、緩解、控制、治癒或減少疾病或病症之一或多個症狀或臨床相關表現。舉例而言，未鑑別出疾病或病症之症狀或臨床相關表現之患者的「治療為預防性治療’而已鑑別出疾病或病症之症狀或臨床相關 17 201022288 表現之患者的「治療」一般不構成預防性治療。除非另外明確指出或明顯同上下文矛盾，否則本文中之術語「或（or)」以「及/或（and/or)」之包涵意義使用。〇受體或受體複合物之「活化（activation )」意謂於正常生理或病理生理條件下，在配位體結合於該受體或受體複合物徵”與對照敏祖比，與聲艨禽受體複合物相,關' 之任姆或所有細胞内信號轉導元件:之活性增加或降低。在 IL20R1/IL20R2及IL22R1/IL20R2受體複合物之情況下，受體活化可使用例如類似於實施例9中所述者之螢光素酶 (lucnferase )檢定來分析。受體或受體複合物之「活化減少 (reducmg activation)」意謂與對照組（例如，在抗體不存在下活化之程度）相比，受體之活化減少至少約丨〇%、較佳至少約20%、更佳至少約3〇%、最佳至少約5〇%或更多。一些評估本文所述之抗體或其他抗原結合分子的檢定 J用或多_照组」。「對照組（c〇ntr〇1)」可為取自教科書之標準值；藉由在配位體（例如，IL2G)'受體（例如，㈣R1/IL20R2及/或IL22R1/IL肅2 )或抗體不存 = 如’非特異性抗體)存在下操作相= 測試例如抗體減少受在活化能力之受體活化檢定之。適之對照值可藉由在性結合於配位體、^ ^ 仔*下或在非特異又體複S物或與受體活化有關之1 伤之抗體存在下接柞兮仏6 Α Θ之其他組你卜裸作该檢定來獲得。發明敘述 18 201022288 本發明提供適合於醫藥調配物、診斷性用途及治療性用途之人類抗IL20抗體。如實施例中所述，鑑別稱為15D2 及5B7之兩種人類抗IL2〇抗體的新穎抗原決定基。關鍵抗原決定基殘基定位於hIL20中對應於hIL19中之螺旋E之區（Chang 等人，j Biol Chem 2003; 278: 3308-13 )。使用 hIL19命名之hIL20之預計模型展示於圖1中，其中螺旋e 對應於成熟hIL20序列（SEQ ID ΝΟ:1 )中之殘基D78至 Η 1 03。發現在增殖檢定中結合於新穎hIL20抗原決定基之 ® 抗體減少 IL20R1/IL20R2 與 IL22RWIL20R2 受體之 hIL20 介導之活化，且減少IL20介導而非IL19或IL24介導之受體活化。進一步發現抗原決定基存在於hIL20抗原之天然與變性形式中，以及鼠類與獼猴IL20中。15D2與5B7兩者在至少約80 mg/ml之濃度下亦為可溶性的，且發現自同一組人類生殖系基因衍生（實施例3及圖3)。因此，本發明提供組合一或多種功能性質、一或多種結構性質之抗體及/或組合隨後章節及實施例中所述之一或 ® 多種功能性質與一或多種結構性質之抗體。在一態樣中，本發明提供一種特異性結合於hIL20、視情況亦結合於一或多種hIL20直系同源物、特異性減少 hIL20Rl/hIL20R2 與 hIL22Rl/hIL20R2 受體複合物及/或其直系同源物之hi L20介導之活化及/或具有高溶解度的抗體 (諸如單株人類或人類化抗體）或其抗原結合片段。在一具體實例中’抗體之重鏈或輕鏈可變區序列自15D2及5B7生殖系及/或V、D或J區段中之一或多者衍生。在一具體實 19 201022288 例中’本發明之抗體的CDR及/或可變序列實質上與15D2 及/或5B7之一或多個抗原結合序列一致。在一具體實例中’該抗體與hIL20序列（SEQ ID NO: 1 )中之區段H79至 Η103中之一或多個殘基相互作用，且可例如結合於H79、 R83、S85、Ν90、F91、L92或其組合。抗體可呈適合於治療性應甩之任何形式’例如全長抗體或其片段^ 在一態樣中，本發明提供一種經分離之抗hIL20抗體或其抗原結合片段，其包含自包含viil_〇3、D3-10及JH6基因之一組人類基因衍生之重鏈可變區。在一具體實例中，該重鏈可變區包含分別對應於SEQ ID N0:8之Kabat殘基 50-65、95-102及31-35之CDR2及CDR3序列及視情況存在之CDR1序列。在一具體實例中，輕鏈可變區包含自包含 VKI_L18及JK4基因之一組人類基因衍生之序列。在一特定具體實例中，輕鏈可變區包含SEQ ID NO :9之序列且重鏈可變區包含SEQ ID ΝΟ··6或SEQ ID NO:7之序列。在另一特定具體實例中，抗體具有IgG4同型。在一態樣中，本發明提供一種結合於hIL20且具有一或多種選自以下之功能性質之人類抗體或其抗原結合片段： (a)減少 IL20R1/IL20R2 及 IL22R1/IL20R2 受體複合物之 IL20介導之活化；（b )減少重組表現IL20R1/IL20R2之BaF-3 細胞的IL20介導之增殖；（c )不減少重組表現 IL20R1/IL20R2之BaF-3細胞的IL19或IL24介導之增殖； (d )以約1 nM或更小之KD值結合於hIL20 ;及（e )在視情況包含1 50 mM NaCl之約pH 7.4之水性緩衝溶液中具有 20 201022288 至少約80 mg/rnl之溶解度。在一具體實例中，抗體具有性質（a )至（d )。在一具體實例中，抗體具有所有性質（& ) 至（e )。在一具體實例中，抗體或抗原結合片段與包含含有 SEQ ID NO:9之輕鏈可變區及含有SEQ ID N〇:6或SEQ⑴ NO:7之重鏈可變區的抗體競爭結合於hIL2(^在一具體實例中抗體或抗原結合片段結合於包含至少一個選自成熟 hIL20 ( SEQ ID ΝΟ:1)之H79-H103之殘基的抗原決定基。在具體實例中，该抗原決定基包含至少一個選自JJ79-L93

❹ 之殘基。在一具體實例中’抗體或抗原結合片段包含含有 SEQ m服6或SEQ ID N0:7之分別包含Kabat殘基 31-35、50-65 及 95_102 之 CDR1、CDR2 及 CDr3 序列的重鏈可變區。在一具體實例中，抗體進一步包含含有SEQID NO:9之分別包含Kabat殘基24_34、5〇 56及89 97之 CDR1、CDR2及CDR3序列的輕鏈可變區。在一具體實例中，抗體重鏈及輕鏈可變序列實質上與15D2及/或π?之各別重鏈及輕鏈可變序列一致，例如具有至少約8〇%、至少約90%或至少約95%之序列一致性中’抗體具有Ig〇4同型。在一特定具體實例在一態樣中，本發明提供該等充分可溶以用於醫藥组合物中之人類抗ML20抗體。在一具體實例中，本發明提供藥組合物’其包含有效量（例如濃度為至少約8〇 mg/ml或至少約1〇〇mg/ml)之本發明之抗體及醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。在—具體實例中，該抗體具有_同型且包含自包含VH1-03、D3_1(^jh6基因 21 201022288 之一組人類基因衍生之重鏈可變區及/或包含自包含 VK!_L18及胞基因之—組人類基因衍生之序列的輕鍵可變區。在—特定具體實財，該輕鏈可變區包| SEQ ID NO:9之序列且該重鏈可變區包含卿ι〇 n〇:6之序列。在 -特定具體實例中’輕鏈可變區包含SEq①N⑽之序列愈重鏈可變區包含s_卿侧:7之序列。在一態樣申’本發明提供一種用作藥物之本發明之抗體、抗原結合片段或醫藥.組合物。〇在一態樣中，本發明提供一種用於治療發炎性或自體免疫病症之本發明之抗體、抗原結合片段或醫藥組合物。在-態樣中，本發明提供一種本發明之抗體、抗原結合片段或醫藥組合物用於製備供治療發炎性或自體免疫病症之藥物的用途。在一態樣中，本發明提供一種藉由投予本發明之抗體、抗原結合片段或醫藥組合物來治療羅患發炎性或自體

免疫病症或處於發炎性或自體免疫病症之風險中之個體的方法。適合於該等用途之發炎性或自體免疫病症包括類風濕 ^關節炎、青少年類風濕性關節《、牛皮癬、牛皮癖性關節炎' 強直性脊椎炎、休格連氏症候群、多發性硬化症、發炎性腸病、全身性紅斑狼瘡或狼瘡腎炎或其任何組合，，及與此等疾病相關之共存疾病（c〇_m〇rbidity )，其中心血管疾病為該等共存疾病之非限制性實例。在一態樣中，本發明提供—種重組產生抗IL2〇抗體或 22 201022288 4 抗原結合片段之方法，其包含於合適條件下培養產生本發明之抗體或抗原結合片段的宿主細胞及回收該抗體或抗原結合片段。該宿主細胞典型地包含含有編碼本發明之抗體或抗原結合片段之重鏈及/或輕鏈序列的核酸之表現載體。特異性結合hIL2〇且具有一些或所有此等性質之抗體、抗原結合片段或其他分子之產生、特性化及用途在以下章節中更詳細地加以描述。抗IL20抗艘 ® 本發明之抗體藉由抗體之特定功能及/或結構特徵或性質來特性化。在單獨章節及實施例中詳細地描述用以評估抗IL20抗體之功能活性的檢定，且以下描述諸如胺基酸序列之結構性質。功能性質本發明之抗體特異性結合於hIL20。抗體較佳以高親和力結合於hIL20，例如1〇_7 Μ或更小之KD值、1〇_8 Μ或更響小之KD值、1 ηΜ或更小之KD值、約0.3 ηΜ或更小之KD 值、或約0.2 ηΜ或更小之KD值、或約0.1 ηΜ或更小之值。在Biacore檢定中，存於乙酸鈉緩衝液中之重組產生之抗IL20抗體可例如以約〇. 1 nM或更小之親和力、視情 /兄以約0.01-0.05 ηΜ之親和力結合於重組hIL20(例如參見實施例12 )。另外，抗體可可偵測地結合於來自一或多種包括小鼠（例如，小家鼠（Mus musculus ))及/或獼猴（食蟹鞭（Afacaca ))之非人類哺乳動物之IL20 (例如參見實施例2 )。此外，本發明之抗體能夠在試管内及/或 23 201022288 ， w 活體内減少IL20R1/IL20R2及IL22R1/IL20R2受體複合物之IL20介導之活化。此可在本文所述（例如參見實施例1、 2及9-11 )或此項技術令已知之一或多種檢定中進行測試。使用合適之檢定，與對照組（例如，在任何抗hIL20抗體不存在下）相比，本發明之抗體可使人類IL20R1/IL20R2及 I122R1 /IL20R2受體複会物之hIL20介導之活化減少至少约 10%、更佳至少20%、甚至更佳至少30%、至少40%、至少 50%或至少60%。使用相應配位體及耷體複合物直系同源物，抗體可進一步能夠減少其他物種（諸如小鼠及獼猴） ❹ 體内 IL20R1/IL20R2 及 IL22R1/IL20R2 受體複合物之 IL20 介導之活化（參見實施例9 )。本發明之抗體減少重組表現 IL20R1/IL20R2及 IL22R1/IL20R2之BaF-3細胞的IL20介導之增殖，但典型地對IL19及/或IL24誘發之增殖無顯著作用（例如參見實施例2 )。在該等檢定申，本發明之抗體典型地以約50 /i Μ 或更小、約5 # Μ或更小、約1 // Μ或更小、約0.5 # Μ或更小、約0.1 β Μ或更小、約〇.〇5 // Μ或更小或約0.02 " Μ 〇或更小之EC50減少增殖。舉例而言，在實施例1〇中所述之增殖檢定中，重組產生之人類抗體15D2具有小於0.02 # Μ 之 EC5 0 ° 本發明之抗IL20抗體可藉由任何機制或藉由不同機制之組合來抑制hIL20介導之受體複合物活化。典型地，抗 hIL20抗體可減少或防止hIL20結合於細胞相關hIL20受體或完全形成之受體複合物。另外或其他，本發明之抗體可 24 201022288 結合於細胞相關hIL20單鏈受體分子，但防止形成受體複合物。另外或其他’本發明之抗體可結合於細胞相關hIL20 單鏈受體分子及完全形成之受體複合物，但減少或抑制受體複合物活化所必需之結構變化。涉及何種或更多種機制可藉由例如測試抗體是否與在hIL20存在下表現人類 IL20R1、IL20R2、IL22R1 受體分子或 IL2〇R1/IL2〇R2 及/ 或IL22R1/IL20R2受體複合物之細胞相關來鑑別。在一特定具體實例尹，抗體減少hIL20與hIL20R2之結合。在另 ® 一特定具體實例中’抗體並不減少hIL20與人類 IL20R1/IL20R2及IL22R1/IL20R2受體複合物中之至少·—者之結合。本發明之特定抗體結合至少部分重疊對應於IL19 中之螺旋E之區段（視情況不包括D78 )或包括該區段中之至少一個殘基之hIL20抗原決定基。在不受理論限制之情況下，此區段可包含IL20中與結合於IL20R1/IL20R2及 IL22R1/IL20R2 及 /或活化 IL20R1/IL20R2 及 IL22R1/IL20R2 有關之螺旋結構或為該螺旋結構之一部分。關於使用 ❹ hIL20-hIL19序列對比及結構IL19資訊構建之hIL20的模型，參見圖2。在hIL20序列中，此區段包含成熟hIL20( SEQ ID ΝΟ:1 )之殘基D78-H103。在一具體實例中，本發明之抗體或抗原結合片段因此結合於包含至少一個選自成熟 hIL20 ( SEQ ID ΝΟ:1)之D78-H103之殘基的抗原決定基。在其他特定及獨立具體實例中，該抗原決定基包括 D78-H103區段中之2、3、4、5、6、7個或更多個殘基。在另一態樣中，本發明提供之抗體結合包含對應於成 25 201022288 - 熟hIL20中之殘基D78-K96或H79-K96之區段中的1、2、 3' 4、5、6、7個或更多個殘基之抗原決定基。此區段含有提供抗IL20抗體5B7之較高親和力的抗原決定基《抗體或者可結合包含對應於殘基D78-L93或H79-L93之區段中之 1、2、3、4、5、6、7個或更多個殘基的抗原決定基，該區段:含有15D2抗；原決定基之齡趣殘基' β舉例雨言，抗體可結合包含至少^個選自H79-L93之殘基的抗原決定基。抗體或者可結合包含對應於殘基Η79-Ν90之區段中之1、2、3、 4、5、6、7個或更多個殘基的抗原決定基，該區段含有5Β7 0 抗原決定基之關鍵殘基。在特定及獨立具體實例中，抗原決定基之所有關鍵殘基均在對應於殘基D78-H103、 D78-K96、D78-L93或D78 Ν90 (視情況不包括D78 )之區段中。在另一態樣中，抗體結合包含成熟IL20之殘基Η79、 R83、S85、Ν90、F91及L92中之至少一者的抗原決定基。在獨立及特定具體實例中，抗體結合D78、Η79、R83、S85、 N90、F91及L92中之2、3、4、5、6個或全部。在另一具 ❹ 體實例中，抗原決定基包含至少殘基Η79及Ν90。在另一具體實例中’抗原決定基進一步包含殘基R83。在又一具體實例中，抗原決定基進一步包含D78、S85、F91及L92中之1、2、3個或全部。在另一態樣中，本發明提供與hIL20 上與如下所述包含5B7或15D2中任一者之VH及VL序列的抗體相同之抗原決定基競爭及/或結合於該抗原決定基之抗體。因此’該等抗體與包含含有SEQ ID NO :9之輕鏈可 26 201022288 'j 變區及含有SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7之重鏈可變區的抗體競爭結合於hIL20。在如本文中所述之標準hIL20結合檢定中，該等抗體可基於其與15D2及/或5B7競爭之能力來鑑別（例如參見實施例4或以下稱為「結合檢定」之章節）。測試抗體減少或抑制15D2及/或5B7與hIL20之結合之能力說明該測試抗體可與15D2及/或5B7競爭結合於 hIL20且因此可結合於與5B7及/或15D2相同之hIL20區段或抗原決定基。在一較佳具體實例中，結合於hIL20中與 Ο 5B7及/或15D2相同之區段或抗原決定基的抗體為人類單株抗體。如本文中所述，該等人類單株抗體可根據此項技術中之已知方法來製備及分離。在一特定具體實例中，抗體結合於與W02005052000 (262.4.1.2.2.1、262.5.1.6.4.4 及 262.7.1.3.2.4)中所述之任何大鼠抗體及/或US20060142550及W02007081465中所述之鼠類抗體（7E)所結合者不同之hIL20區段或抗原決定基，且就結合於hIL20而言，與15D2及/或5B7之競爭力 ® 強於與所列小鼠或大鼠抗體中任一者之競爭力。在另一特定具體實例中，抗體為不結合於對應於IL20前驅體（SEQ ID NO:2)之殘基42-102之區段的人類抗體。上述功能特徵、實施例中所述之其他功能特徵及/或下一節中描述之結構特徵之任何組合可由本發明之抗體來展現。結構性質在一態樣中，本發明提供具有合適穩定性及/或溶解度 27 201022288 特徵之人類抗IL20抗體，其用於以至少約50 mg/m卜至少約60 mg/ml、至少約70 mg/ml、至少約80 mg/ml、至少約 90 mg/ml或至少約100 mg/ml之濃度調配於水性調配物中，該水性調配物可進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑，且典型地具有接近中性或生理pH值之 pH值。在—具體實例申，抗IL20抗體在視情況包含20 ιηΜ 磷酸鈉緩衝液及150 mM NaCl且具有約7.4之pH值的水性調配物中具有至少80 mg/ml之溶解度。在一具體實例中，抗IL20抗體在視情況包含20 mM磷酸鈉緩衝液及150 mM 〇 NaCl且具有約7.4之pH值的水性調配物中具有至少100 mg/ml之溶解度。現已發現自某些生殖系序列衍生之人類抗 IL20抗體比其他抗體更可溶，從而在水性溶液中達成較高濃度（例如參見實施例3 )。以下更詳細地描述該等具體實例。本發明之較佳抗體包括如本文中所述特性化之人類單株抗體15D2或5B7。下文及圖3中提供此等抗體之重鏈及輕鏈可變域及CDR序列。 © 15D2 ( SEQ ID NO:6 )之重鏈可變域含有分別對應於 SEQ ID NO:6 之 Kabat 殘基 31-35 ( CDR1 )、50-65 ( CDR2) 及 95-102 ( CDR3 )之以下 CDR : VH CDR1 : NDIIH， VH CDR2 : WINAGYGNTQYSQNFQD， VH CDR3 : EPLWFGESSPHDYYGMDV。

5B7( SEQ ID NO:7 )之重鏈可變域含有分別對應於SEQ 28 201022288 ID NO:7 之 Kabat 殘基 31-35 ( CDRl )、50-65 ( CDR2)及 95-102 ( CDR3 )之以下 CDR : VH CDR1 : SHIMH， VH CDR2 : WINAGYGNTKYSQNFQD， VH CDR3 : EPLWFGELSPHDYYGMDV。 15D2及5B7( SEQ ID NO:9)之輕鏈可變域含有分別對應於 SEQ ID NO:9 之 Kabat 殘基 24-34 ( CDR1 )、50-56 (CDR2)及 89-97 ( CDR3 )之以下 CDR : 〇 VL CDR1 : RASQGISSALA， VL CDR2 : DASSLES， VL CDR3 : QQFNSYPLT。假定15D2與5B7兩者皆結合IL20，則可「混合及匹配」VH CDR序列以形成本發明之其他抗hIL20結合分子。該等「經混合及匹配」抗體之hIL20結合可使用本文所述之結合檢定（例如流式細胞儀、Biacore、ELISA )及/或使用如本文中所述之受體活化檢定來測試。因此，本發明提供 ® 包含15D2或5B7之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及/或CDR3 或其組合之抗體。使用Kabat系統描述CDR區（圖3 )。假定此等抗體中之每一者均可結合於具有實質上重疊抗原決定基之hIL20且主要由CDR1、2及3區提供抗原結合特異性，則可「混合及匹配」VH CDR1、2及3序列（亦即，可混合及匹配來自不同抗體之VH CDR，儘管各抗體可含有 VH CDR1、2及3及VL CDR1、2及3 )以形成本發明之其他抗hIL20結合分子。15D2及5B7 VH CDR共有實質上結 29 201022288 構相似性且因此能夠得以混合及匹配。因此，在一態樣中，本發明提供一種經分離之單株抗體，其包含視情況與包含SEQ ID NO:9之VL CDR之VL序列組合的：（a)來自5B7或15D2之VH CDR1 ; ( b)來自 5B7 或 15D2 之 VH CDR2 ;及（c)來自 5B7 或 15D2 之 VH CDR3。此亦可根據卞文使用一致VH CE)R來說明。 5B7/15D2之一致可變重域含有分別對應於SEQ ID NO:8 之 Kabat 殘基 31-35( CDIL1)、50-65( CDR2)及 95-102 (CDR3 )之以下CDR，其中X表示任何胺基酸，較佳為以 © 下所列之彼等者或其保守性取代： VH CDR1 : X2X3IX4H ( X2 : N 或 S ; X3 : D 或 Η ; X4 : I或Μ，或其任一者之保守性取代）， VH CDR2 : WINAGYGNTX5YSQNFQD ( Χ5 為 Κ、Q 或其任一者之保守性取代）， VH CDR3 : EPLWFGEX7SPHDYYGMDV ( Χ7 為 S、L 或其任一者之保守性取代），其中Χ2-Χ5及Χ7分別對應於SEQ ID ΝΟ:8中之殘基 © 31 、 32 、 34 、 59 及 106 °

因此，在另一態樣中，本發明提供一種包含SEQ ID NO:8之視情況與重鏈可變區CDR1組合之CDR2及CDR3 的抗體。在一具體實例中，該抗體包含SEQ ID NO:8之序列。在一態樣中，抗體包含SEQ ID ΝΟ··6之視情況與重鏈可變區CDR1組合之CDR2及CDR3。在一具體實例中，抗體包含SEQ ID ΝΟ:6之序列。在一態樣中，抗體包含SEQ ID 30 201022288 i ΝΟ··7之視情況與重鏈可變區CDR1組合之CDR2及CDR3。在一具體實例中，抗體包含SEQ ID NO:7之序列。在任何此等態樣或具體實例中，抗體可視情況進一步包含SEQ ID NO:9之輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3或全序列。在某些具體實例中，本發明之抗體包含來自特定生殖系Η鏈免疫球蛋白基因或特定生殖系Η鏈免疫球蛋白基因之組合的VH區；及/或來自特定生殖系L鏈免疫球蛋白基因或特定生殖系L鏈免疫球蛋白基因之組合的VL區。 Φ 舉例而言，在一具體實例中，本發明提供一種經分離之抗hIL20抗體，其包含自包含VH1_03、D3-10及JH6基因之一組人類基因衍生之重鏈可變區。該重鏈可變區可例如包含SEQIDNO:8之分別對應於Kabat殘基 50-65、95-102 及31-35之CDR2及CDR3序列及視情況存在之CDR1序列。在另一具體實例中，抗體進一步包含自包含VKI_L 1 8 及JK4基因之一組人類基因衍生之輕鏈可變區。輕鏈可變區可例如包含SEQ ID NO:9之CDR1-CDR3序列。 ® 在一具體實例中，本發明提供一種經分離之抗hIL20 單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體：（a )包含自用人類D3-10基因及JH6基因重組之人類VH1_03基因衍生之 VH域；（b)包含自用人類JK4基因重組之人類VKI_L18 基因衍生之VL域；及（c )特異性結合於hIL20之抗體。舉例而言，抗體可包含SEQ ID NO:9之輕鏈可變序列及SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7之重鏈可變序列。如本文中所使用，若人類抗體之可變區自使用人類生殖系免疫球蛋白基 31 201022288 因之系統獲得，則抗體包含Γ具有」特定生殖系序列之重4 鏈或㈣可變區或「衍生自」特定生殖系序列之重鍵或輕鍵可變(I或特定生殖系序列「之產物」。該等系統包括用所關注之抗原使帶有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠免疫或用㈣注之抗原篩選制體上所i現之人類免疫球蛋奢基跞龙庫。Γ鼻有J人類生殖系免疫球蛋自序列或「街生自」人類生瘴系免疫球蛋白序列或為人類生殖系免疫球蛋白序列「之產物」的人類抗體可照此藉由比較人類抗體之胺基酸序列與人類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列且選擇序列最接近（亦即，最大一致性％)於人類抗體之序列之人類生殖系免疫球蛋白序列來鑑別。由於例如天然存在之體細胞突變或有意引入定點突變，故與生殖系序列相比，「具有」特定人類生殖系免疫球蛋白序列或「衍生自」特定人類生殖系免疫球蛋白序列或為特定人類生殖系免疫球蛋白序列「之產物」的人類抗體可含有胺基酸差異。然而，所選人類抗體之胺基酸序列典型地與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少90〇/〇一致且含 ❹ 有當與其他物種之生殖系免疫球蛋白胺基酸序列（例如，鼠類生殖系序列）相比時將人類抗體鑑別為人類之胺基酸殘基。在某些情況下’人類抗體可變序列之胺基酸序列可與由重组生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少 95%、或甚至至少96%、97%、98%或99%—致。典型地’自特定人類生殖系序列衍生之人類抗體將顯示與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列有至 32 201022288

J 多ίο個胺基酸差異。在某些情況下，人類抗體可顯示與由重組生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列有至多8、至多5、或甚至至多4、3、2或1個胺基酸差異或無胺基酸差異。在另一態樣中’本發明之抗體包含含有與本文所述之較佳1 5D2及5B7抗體之胺基酸序列同源或一致的胺基酸序列之重鏈及輕鏈可變區’且其中該等抗體保留本發明之抗 ML20抗體之所需功能性質。舉例而言，本發明提供一種包 ® 含重鏈可變域及輕鍵可變域之經分離之單株抗體，其中：（a) 該VH域包含與選自由SEQ ID NO: 6、7及8組成之群的胺基酸序列至少80%—致之胺基酸序列；（b )該VL區包含與 SEQ ID NO:9至少80%—致之胺基酸序列；且（^)該抗體特異性結合於hIL20且展現至少一種本文所述之功能性質’較佳若干種本文所述之功能性質。在其他具體實例中，VH及/或VL胺基酸序列可與上文所述之序列 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 1〇〇〇/0 ® 一致。具有與上文所述之序列之VH及VL區具有高（亦即， 8〇%或更大）一致性的VH及VL區之抗體可藉由編碼SEQ ID NO:6-9之核酸分子之突變誘發（例如，定點或pCR介導之突變誘發）’隨後使用本文所述之功能檢定測試所編碼之經改變抗體之保留功能（例如’ hIL20結合親和力或減少其受體複合物之hIL20介導之活化）來獲得。兩個序列之間的一致性百分數隨該等序列所共有之一致位置之數目而變（亦即，一致性％ =一致位置之數目/總位 33 201022288 置數目xlOO)’需要考慮空隙之數目及各空隙之長度，需要引入空隙以用於兩個序列之最佳比對。比較序列及測定兩個序列之間的一致性百分數可使用序列分析軟體中之數學算法來完成。蛋白質分析軟體使用歸因於各種取代、缺失及其他修飾（包括保守性胺基酸取代）之相似性之度量來匹配類似摩列。兩個胺基酸序列之間的一致性百分數可例如使用

NeecUeman 及 Wunsch ( J, Mol. Biol. 48:444-453 (1970))算法來測定，該算法已使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣及16' 14、12、10、8、6或4之空隙重量及1、2、3、4、 5或6之長度重量併入GCG套裝軟體（可在http:// www.gcg.com得到）中之GAP程式中。多肽序列亦可使用FASTA應用預設或推薦參數來比較。GCG 6.1 ·版中之程式 ’ FASTA(例如，FASTA2 及 FASTA3 ) 提供查詢與搜尋序列之間的最佳重疊區之比對及序列一致性百分數（Pearson，Methods Enzymol. 1990;183:63-98 ; Pearson, Methods Mol· Biol. 2000;132:185-219)。兩個胺基酸序列之間的序列一致性亦可使用E. Meyers 及 W. Miller ( Comput. Appl. Biosci.，1988;11-17)之算法來測定，該算法已使用PAM 120重量殘基表、12之空隙長度處罰及4之空隙處罰併入ALIGN程式（2.0版）中。另一用於比較資料庫中所包含之序列與另一序列之算法為使用預設參數之電腦程式BLAST，尤其blastp。例如參見 Altschul 等人，J. Mol. Biol. 1990;215:403-410 ; 34 201022288

Altschul 等人，Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402 (1997);各自以引用的方式併入本文中。本發明之蛋白質序列可用作「查詢序列」以針對公開資料庫執行搜尋從而例如鑑別相關序列。該等搜尋可使用Altschul等人1990 (見上）之XBLAST程式（2.0版）執行。BLAST蛋白質搜尋可用XBLAST程式、計分=50、字長=3執行以獲得與本發明之抗體分子同源的胺基酸序列。為獲得間隙比對以用於比較目的，可如Altschul等人，1997 (見上）中所述利用間 φ 隙BLAST。當利用BLAST及間隙BLAST程式時，可使用各別程式之預設參數（例如，XBLAST及NBLAST )。參見 http://www· ncbi.nlm.nih.gov 〇在某些具體實例中，本發明之抗體包含含有CDR1、 CDR2及CDR3序列之VH區及含有CDR1、CDR2及CDR3 序列之VL區，其中此等CDR序列中之一或多者包含基於本文所述之較佳抗體1 5D2及5B7的指定胺基酸序列或其保守性修飾，且其中該等抗體保留本發明之抗hIL20抗體的所 ® 需功能性質。因此，本發明提供一種經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其包含含有CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及含有CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區，其中：（a) VH區CDR3序列包含選自由SEQ ID NO:6 及7之CDR3組成之群的胺基酸序列及其保守性修飾；（b ) VL區CDR3序列包含SEQ ID NO:9之CDR3之胺基酸序列或其保守性修飾；且（c )該抗體特異性結合於hIL20且展現至少一種本文所述之功能性質，更佳若干種本文所述之 35 201022288 功能性質。在另一具體實例中，VH區CDR2序列包含選自由SEQ ID NO: 6或7之CDR2組成之群的胺基酸序列及其保守性修飾；且VL區CDR2序列包含SEQ ID NO:9之CDR2或其保守性修飾。在在另一:具體實例中，VH區CDR1序列包含還自由SEq ΙΕ) ΝΘ: 6或7之C®R1組成之群的胺基酸序列及其保守性修飾；且VL區CDR1序列包含SEQ ID NO:9之CDR1或其保守_性修飾。 0 如本文中所使用’術§吾「保守性序列修飾（c〇nservative sequence modifications)」欲指不顯著影響或改變含有胺基酸序列之抗體之結合特徵的胺基酸修飾。該等保守性修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。修飾可藉由此項技術中已知之標準技術（諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發）引入本發明之抗體中。「保守性」胺基酸取代典型地為其中胺基酸殘基經具有具類似物理化學性質之側鏈之胺基酸殘基置換的彼等者。◎ 具有類似側鏈之胺基酸殘基家族已在此項技術中定義。此等家族包括具有鹼性侧鏈（例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸）、酸性側鏈（例如，天冬胺酸、麩胺酸）、不帶電極性側鏈（例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、絡胺酸、半胱胺酸、色胺酸）、非極性側鏈（例如，丙胺酸、缚胺酸、白胺酸、異白胺酸、捕胺酸、笨丙胺酸、甲硫胺酸）、/3 -分枝侧鏈（例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺 36 201022288 酸）及芳族側鏈（例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）之胺基酸。因此’本發明之抗體之CDR區中的一或多種胺基酸殘基可經來自同一側鏈家族之其他胺基酸殘基置換且可使用本文所述之功能檢定測試改變之抗體的保留功能（亦即，以上（c )、（ d )及（e )中所述之功能。抗原結合片段如本文中所述之本發明之抗hIL20抗體可以全長抗體參或其抗原結合片段形式製備。全長抗體可為任何合適之類別’包括例如IgG及IgN^可根據所欲治療性用途選擇抗體之特定類別及/或同型。舉例而言，IgCH、IgG2、IgG3及IgG4 同型對表現於例如白血球上之Fc受體具有不同親和力，其中IgG4及IgG2之親和力低於igGl及IgG3。抗原結合片段之實例包括Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，）2、 F(ab)3、Fv (典型地為抗體之單臂的VL及VH域）、單鏈 Fv ( scfv ;例如參見 Bird 等人，Science 1988;242:423-426 ; ® 及 Huston 等人 PNAS 1988;85:5879-5883 )、dsFv、Fd (典型地為VH及CHI域）及dAb (典型地為VH域）片段； VH、VL、VhH及V-NAR域；包含VH單鏈及VL單鏈之單價分子；微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及《:體（kappa body)(例如參見 111 等人，pr〇tein Eng 1997;10:949-57 );駱駝IgG ; IgNAR ;以及一或多種經分離之CDR或功能互補位，其中經分離之CDR或抗原結合殘基或多肽可締合或連接在一起以形成功能性抗體片段。各種 37 201022288 ' w 類型之抗體片段已描述或回顧於例如Holliger及Hudson,

Nat Biotechnol 2005;23:1126-1136，W02005040219 及公開美國專利申請案20050238646及20020161201中。抗體片段可使用習知重組或蛋白質工程改造技術來獲得，且可以與完整抗體相同之方式針對抗原結合或其他功能筛.遷片段已發展用於產生抗體片段之各種技術。傳統上，經由全長抗體之蛋白水解消化來衍生此等片段（例如參見

Morimoto 等人，Journal of Biochemical and Biophysical ©

Methods，24:107-117 (1992);及 Brennan 等人，Science, 229:81 (1985))。然而’現在可直接藉由重組宿主細胞產生此等片段。或者’可直接自大腸桿菌（E. coli)回收Fab，-SH 片段且進行化學偶合以形成F(ab，）2片段（Carter等人，

Bio/Technology，10:163-167 (1992))。根據另一方法，可直接自重組宿主細胞培養物分離F(ab，）2片段。在其他具體實例中’所選抗體為早鍵Fv片段（scFv)。參見'\γ〇 1993/16185，美國專利第5,571，894號；及美國專利第 © 5,587,458號。抗體片段亦可為「線性抗體」，例如如美國專利第5,641，870號中所述。該等線性抗體片段可為單特異性或雙特異性片段。多特異性分子在另一態樣中，本發明係關於包含本發明之抗hIL2〇抗體或其抗原片段的多特異性分子。該等多特異性分子包括包含至少一個對於hIL2〇之第一結合特異性及對於第二 38 201022288 目標抗原決定基之第二結合特異性的雙特異性分子。 -類雙特異性分子為雙特異性抗體。雙特異性抗體為對於至少兩種不同抗原&定基具有結合特異隹之抗體。產生雙特異性抗體之方法為此項技術所已知，且全長雙特異性抗體之傳統產生通常基於兩個免疫球蛋白重鏈.輕鍵對之共表現’ #中該兩條鏈具有不同特異性（MiUstein等人，

Nature，3G5:537-539 (1983))。雙特異性抗體可以本文所述之全長抗體或抗體片段（例如F(ab，)2雙特異性抗體）或任何其他抗原結合片段形式製備。其他多特異性分子包括由hIL20結合抗體部分與一或多種其他非抗體蛋白之融合所產生之彼等者。該等多特異性蛋白及如何對其進行構建已在此項技術中描述。例如參見 Dreier 等人（Bioc〇njug Chem 9(4):似-彻…⑽；美國專利6,046,310 ’美國專利公開案第細3gig3984號；歐洲專利申請案i 413 316;美國專利公開案第侧㈣號；von Strandmann 等人，B1〇〇d (2〇〇6;ι〇7:ΐ955 ΐ962 )，及 WO 2004056873。亦涵蓋大於2價之多特異性分子。舉例而言，可製備二特異性抗體。Tutt等人，“職咖丨⑷：㈣陳）。本發明之多特異性分子可藉由使用此項技術中已知之 I法使組份結合特異性結合來製備。舉例而言，多特異性刀子之各結合特異性可分p弓# 4 〇 + 開產生且接耆相互結合。當結合寻異性為蛋白質或肽時，久社 ’各種偶合劑或交聯劑可用於共價 …交聯劑之實例包括蛋白質A、碳化二亞胺、N_ 丁二酿 39 201022288 ，拳亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯（SATA)、5,5，-二硫雙（2-硝基苯曱酸）（DTNB )、鄰伸笨基二順丁烯二醯亞胺（〇pdm )、 N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基）丙酸酯（SpDP)及磺基丁二醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基曱基）環己烷·][-甲酸酯（績基-SMCC)(例如參見Karpovsky等人（1984) J.

Exp. Med, 160:1686； Liu, MA # A (1985) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 82:8648)。

Ins. Mitt. No. 78，118-132, Brennan 等人（1985) Science 229:81-83)及 Glennie 等人（1987) j_ Immun〇1 139: 2367_ ❹ 23 75)中所述者。較佳結合劑為sATA及磺基_SMCC，兩者皆得自 Pierce Chemical 公司（Rockford，IL)。 ΐ»結合特異性為抗體時，其可經由兩條重鏈之C末端鉸鏈區的酼基鍵結來結合。在一尤其較佳具體實例中，在結合之前’對鉸鏈區進行修飾以含有奇數個巯基殘基（較佳一個）。

或者’兩種結合特異性皆可在同一載體中編碼且在同一宿主細胞中表現並組裝。當雙特異性分子為mAbxmAb ' Q mAbxFab、FabxF(ab’）2或配位體XFab融合蛋白時，此方法尤其適用。本發明之雙特異性分子可為包含一個單鏈抗體及、纟。&決疋子之單鍵分子或包含兩個結合決定子之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。製備雙特異性分子之方法描述或回顧於例如以下中：美國專利第5,260,203冑；美國專利第5,455,03〇號；美國專利第 4,881，175號；美國專利第5，132,4G5號；美國專利第5,〇91， 40 201022288 5 13號；美國專利第5,476,786號；美國專利第5,013,653 號；美國專利第5,258,498號；美國專利第5,482,858號；美國專利申請公開案20030078385，Kontermann等人，（2005) Acta Pharmacological Sinica 26(1):1-9 ; Kostelny 等人， (1992) J. Immunol· 148(5):1 547,15 53; Hollinger 等人，（1993) PNAS (USA) 90:6444-6448 ;及 Gruber 等人（1994) J· Immunol. 152: 5368。抗體變異體

® 本發明之抗體進一步可使用具有本文中所揭示之VH 及/或VL序列中之一或多者的抗體作為起始物質來製備以工程改造經修飾之抗體或抗體「變異體」，該經修飾之抗體可具有相對於親本抗體有變化之性質。可藉由修飾一或兩個可變區（亦即，VH及/或VL)中（例如，一或多個CDR 區中及/或—或多個構架區中）之一或多個殘基來工程改造抗體。另外或其他，可藉由修飾恆定區中之殘基來工程改造抗體，從而例如改變抗體之效應功能。另外，由抗體之 ⑩抗原結合部分可製備諸如抗原結合片段、抗體衍生物、免疫結合物及多特異性分子之其他構築體。可使用標準分子生物學技術製備及表現改變之抗體序列0 虽然抗體變異體或衍生物典型地與「親本」抗體相比具有至少—種改變之性質，但抗體變異體本文所述之抗一體之功能性質中之一者、一咏= 分’力能性質包括（但不限於）：（〇減少人類 41 201022288 IL20R1/IL20R2 及 IL22R1/IL20R2 受體複合物之 hIL20 介導之活化’·（ b )較佳以實質上類似功效或親和力結合於鼠類及獼猴IL20直系同源物；（c )與15D2及5B7中之一或多者競爭結合於hIL20 ;及（d )結合於對應於螺旋E之區段中的抗原決定基（圖2 )。上述功能特徵及/或如實施例中所述之功能特徵之任:何組合可'.由本發明之杭餘展現抗體變異體及衍生物之功能性質可使用此項技術中可得到及/或本文所述之標準檢定來評估。舉例而言，抗體結合hIL20之能力可使用諸如實施例中所述之彼等者（例如， 0 Biacore、流式細胞儀或ELISA )之標準結合檢定來測定。可夔匾修询可執行之一類可變區工程改造為CDR接枝。抗體主要經由位於6個重鏈及輕鏈互補決定區（cdr)中之胺基酸殘基與目標抗原相互作用。為此’ CDR中之胺基酸序列在個別抗體之間比在CDR外之序列之間更不同。因為CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用，所以有可能表現藉由構建表現載體來模擬特定天然存在之抗體之性質的重組抗體，〇該等表現載體包括自具有不同性質之不同抗體接枝於構架序列上的來自特定天然存在之抗體之CDR序列（例如參見

Riechmann，L.等人（1998) Nature 332:323-327 ; Jones，P_ 等人（1986) Nature 321:522-525; Queen，C·等人（1989)Pr〇c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033; Winter 之美國專利第5,225,539號及Queen等人之美國專利第5，530,號、第 5,585,089 號、第 5,693,762 號及第 6，180,370 號）。因此， 42 201022288 ♦ 本發明之另一具體實例係關於一種經分離之單株抗體或其抗原結合部分，其包含單株抗體15D2或5B7之VH及/或 VL CDR序列，但構架序列不同於此等抗體。構架序列可自包括生殖系抗體基因序列之公開DNa資料庫或公開參考文獻獲得。舉例而言，人類重鏈及輕键可變區基因之生殖系DNA序列可見於「dBase」人類生殖系序列-貝料庫（可在網際網路www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase 上得到），以及 Kabat，Ε· A.等人（1991) Sequences of ® Proteins of Immunological Interest,第 5 版，u.S_

Department of Health and Human Services, NIH 公開案第 91-3242 號；Tomlinson，Ι· M.等人（1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty

Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776-798;及 Cox, J. P· L.等人 (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments ©Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836中；其中每一者之内容均明確地以引用的方式併入本文中。用於本發明之抗體的較佳構架序列為結構上類似於由本發明之所選抗體所使用之構架序列，例如類似於15D2或 5B7 之 VH1_03、D3-10、JH6、VKI_L18 及/或 JK4 序列的彼等者。15D2或5B7之VH CDR1、2及3序列可接枝於具有與衍生構架序列之生殖系免疫球蛋白基因中所見相同之序列的構架區上’或CDR序列可接枝於與生殖系序列相比 43 201022288 3有或多個突變之構架區上。舉例而言，已發現在某些 it /兄下’使構架區中之殘基突變來維持或增強抗體之抗原結合能力較為有益（例如參見等人之美國專利第 5’53〇，1〇1號、第 5,585,〇89號'第 5,693,762 號及第6，180,370 號）。在本發明之另十態樣中’利用本發明之抗h:IL20抗體 (例如1502及5B7 )之結構特徵形成保留本發明之抗體之至少一種功能性質（諸如結合於hIL20 )的結構上相關之抗 hIL20抗體。舉例而言，5B7或15〇2或其變異體中之一或❹ 多個CDR區可與已知構架區及/或其他CDR重組組合以形成本發明之其他經重組工程改造之抗11扎2〇抗體。用於工程改故方法之起始物質為本文所提供之VH及/或vl序列中之一或多者或其一或多個CDR區。為形成工程改造抗體，無需實際製備（亦即’表現為蛋白質）具有本文所提供之· 及/或VL序列中之一或多者或其一或多個cDR區的抗體。更確切地’使用序列中所含之f訊作為起始物質以形成自原始序列何生之「第二代」序列且接著製備該（等）「第二 ◎ 代」序列並表現為蛋白質。因此，在另一具體實例中，本發明提供一種製備抗 hIL20抗體之方法，其包含：（a)提供：⑴含有來自卿 ID N〇:6或7之CDR1、CDR2及CDR3序列之重鍵可變區抗體序列，及（ii )含有來自SEQ ID n〇:9之cdr序列之輕鏈可變區抗體序列：⑴改變第一抗體序列及/或第二抗體序列中之至少一個胺基酸殘基以形成至少一個改變之抗 44 201022288 體序列；及（〇製備改變之抗體序列；A (d)使該改變之抗體序列表現為蛋白質。另一類可變區修飾在於使VH及/或VL CDR1、cDR2 及/或CDR3區中之胺基酸殘基突變，從而改良所關注之抗體的-或多種結合性質（例如，親和力）。可執行定點突變誘發或PCR介導之突變誘發以引入突變且對抗體結合或所關注之其他功能性質之作用可在如本文中所述及實施例中所提供之試管内或活體内檢定中進行評估。較佳引入保守 ®性修飾（如上文所討論）。突變可為胺基酸取代、添加或缺失。此外，改變單一 CDR區中之典型地至多8個、更典型地至多5個殘基。因此，在另一具體實例中，本發明提供經分離之抗 hIL20單株抗體或其抗原結合片段，其包含含有seq ι〇 N0:6或7之VH CDR1、CDR2及CDR3序列或在一或多個此等CDR中具有1、2、3、4、5、6、7或8個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列的重鏈可變區；及含有來自SEq ® ID N0:9之VL CDR1、CDR2及CDR3序列或在一或多個此等CDR中具有1、2、3、4、5、6、7或8個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列的輕鏈可變區。本發明之工程改造抗體包括已對VH及/或VL中之構架殘基進行修飾例如以改良抗體之性質的彼等者。典型地，進行该等構架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方法在於使一或多個構架殘基「回復突變」為相應生瘦系序列。更特定言之’進行體細胞突變之抗體可含有不同 45 201022288 於衍生該抗體之生殖系序列之構架殘基。該等殘基可藉由 . 比較抗體構架序列與衍生抗體之生殖系序列來鑑別。舉例而言，對於15D2及5B7而言，不同於相應生殖系序列之VH殘基在圖3中由 ' 指示。$ 了使例如構架區序

列恢復為其生殖系構型，可藉由例如定點突變誘發或pcR 介導之突變誘像使CD取外之體細胞突，變「回.復突'變』為生殖系序列(例如，可使15D2 VH域之殘基13、68及/或82八或5B7 VH域之殘基13、30及/或82A自VH胺基酸「回復突變」為生殖系胺基酸）。該等「回復突變」之抗體亦欲由 ❹ 本發明涵蓋。另一類構架修飾包括使構架區中或甚至一或多個cDR 區中之一或多個殘基突變以移除τ細胞抗原決定基，從而降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫作用 (deimmunization)」且更詳細地描述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號中。

Fc修飾 ❿ 除構架或CDR區中進行之修飾之外或作為構架或cdr 區中進行之修飾的替代，本發明之抗體可經工程改造以包括Fc區中之修飾，從而典型地改變抗體之一或多種功能性質，諸如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合、蛋白^穩定性及/或抗原依賴性細胞細胞毒性或缺乏該或該等性質 (例如，可將一或多個改變其糖基化，再次改此等具體實例均更詳細此外’本發明之抗體可經化學修飾化學部分連接於抗體）或經修飾以變抗體之一或多種功能性質。每一 46 201022288 地描述於下文中。根據Kabat對Fe區中之殘基進行編號。

需要時，抗體之類別可藉由已知技術「轉換」。該等技術包括例如使用直接重組技術（例如參見美國專利 4’8 16,397 )及細胞_細胞融合技術（例如參見美國專利 5,916,771 )。舉例而言，最初以IgM分子形式產生之抗體的類別可轉換成IgG抗體。類別轉換技術亦可用於使一個亞類轉化為另一亞類’例如自IgG1轉化為igG2。因此，本發月之抗體之效應功能可藉由同型轉換成以⑴、igG2、 g IgG4、IgD、IgA、或IgM抗體來改變以供各種 ⑺療！生用途《恆定區之例示性cDNA序列為經由例如 GenBank獲得，每一者均以全文引用的方式併入，如同下述：人類IgGl恒定重鏈區：GenBank寄存編號：J〇〇228 ; 人類IgG2恆定重鏈區：GenBank寄存編號：J〇〇23〇 ; 人類IgG3恆定重鏈區：GenBank寄存編號：χ〇4646 ; 人類IgG4恆定重鏈區：GenBank寄存編號：κ〇ΐ3ΐ6 ; 及人類/C輕鏈恆定區：GenBank寄存編號：j〇〇24i。。在-具體實例中，對cm之欽鍵區進行修飾以致錢鍵區中半胱胺酸殘基之數目發生改變，例如增加或降低。此 :法進—步描述於等人之美國專利第5,677,425號。改變CH1之錢鏈區中半胱胺酸殘基之數目，從而例如於紅鏈及重鏈之組裝或增加或降低抗體之穩定性。在ϋ體實财，使抗體之Fe鉸鏈區突變以縮短抗之生物半衰期。更特定言之’將一或多個胺基酸突變弓丨 47 201022288 入Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區中以致抗體之葡萄球. 菌蛋白 A ( Staphyl〇COCCyl protein a，SpA )結合相對於天然Fc-鉸鏈區之SpA結合有所減弱。此方法更詳細地描述於 Ward等人之美國專利第6，165,745號中。在另一具體實例中’對抗體進行修飾以增加其生物半衰期。可能存在各種方法。舉例而言，如Ward之美國專利第6,277,375號中所述’可引入以下突變中之—或多者：725紅、T254S、T256f。或者，如Presta等人之美國專利第5,869,〇46號及第 6,121，022號中所述’為了增加生物半衰期，可改變抗體之 ❾ CH1或CL區以含有取自lgG之Fc區CH2域的兩個環之補救受體結合抗原決定基。在其他具體實例中，藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變Fc區以改變抗體之效應功能。舉例而言，選自胺基酸殘基234、235、236、 237、297、318、320及322之一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基置換以致抗體對效應配位體具有改變之親和力，但保留親本抗體之抗原結合能力。效應配位體（對其之親和力發生改變）可例如為Fc受體或補體之C1組份。此方〇法更詳細地描述於Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。在另一實施例中，一或多個選自胺基酸殘基329、331及322之胺基酸可經不同胺基酸殘基置換以致抗體具有改變之C1 q結合及/或減少或消除之補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC ) ° 此方法更詳細地描述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551 號中。在另一實施例中，改變胺基酸位置23 1及239處之 48 201022288 一或多個胺基酸殘基，從而改變抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351 中。在另一實施例中，藉由修飾以下位置處之一或多個胺基酸對Fc區進行修飾以增加抗體介導抗體依賴性細胞細胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity > ADCC )之能力及/或增加抗體對Fey受體之親和力：238、239、248、 249 、 252 、 254 、 255 、 256 、 258 、 265 、 267 、 268 、 269 、 270 、 272 、 276 、 278 、 280 、 283 、 285 、 286 、 289 、 290 、 Q 292 、 293 、 294 、 295 、 296 、 298 、 301 、 303 、 305 、 307 、 309 、 312 、 315 、 320 、 322 、 324 、 326 、 327 、 329 、 330 、 331 、 333 ' 334 、 335 、 337 ' 338 、 340 、 360 、 373 、 376 、 378 、 382 、 388 、 389 、 398 、 414 、 416 、 419 、 430 、 434 、 435、437、438或43 9。此方法進一步描述於Presta之PCT 公開案W0 00/42072中。此外’人類IgGl上對FcylU、 FcyRII、FcyRIII及FcRn之結合位點已得到定位且具有改良之結合的變異體已予以描述（參見Shields，R.L.等人 ® (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604)。顯示位置 256、290、 298、333、334及339處之特定突變會改良與FcRIII之結合。另外，顯示以下組合突變會改良FcyRIII結合：T256A/ S298A、S298A/E333A、S298A/K224A 及 S298A/E333A/ K334A。可進一步對恆定區進行修飾以使抗體穩定，例如降低二價抗體分離為2個單價VH-VL片段之風險。舉例而言，在IgG4恆定區中，根據Kabat編號系統之位置241處之絲 49 201022288 胺酸（S、Ser)殘基可突變為脯胺酸（p、Pr〇 )殘基以使得在鉸鏈處完全形成二硫橋（例如參見Angal等人，Mol

Immunol. 1993;30:105-8 )。根據 EU 指數編號系統，Kabat 殘基241對應於殘基228。糖基化修飾在又一具Γ體:實例中，對抗體之糖基他進行修飾。舉例而言’可製備去糖基化抗體（亦即，抗體缺乏糖基化）。可改變糖基化以例如增加抗體對抗原之親和力j該等碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列中之一或多個糖基化位 0 點來完成。舉例而言’可進行一或多個使得消除一或多個可變區構架糖基化位點之胺基酸取代，從而消除彼位點處之糖基化。該等去糖基化可增加抗體對抗原之親和力。該方法更詳細地描述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,3 5 0,861號中。另外或其他，可製備糖基化類型改變之抗體，諸如岩藻糖基殘基之量減少之低岩讓糖基化抗體或等分GlcNac結構增加之抗體。已說明該等改變之糖基化模式會增加抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉由 ◎ 例如使抗體表現於糖基化機構改變之宿主細胞中來完成。糖基化機構改變之細胞已描述於此項技術中且可用作表現本發明之重組抗體從而產生糖基化改變之抗體之宿主細胞。舉例而言，Hanai等人之EP1176195描述一種具有功能受損之FUT8基因（編碼岩藻糖基轉移酶）的細胞系，如此以致表現於該細胞系中之抗體展現低岩藻糖基化。presta之 PCT公開案WO 03/035835描述一種海藻糖連接於Asn 50 201022288 (297 )連接之碳水化合物之能力降低的變異cH〇細胞系， Lecl3細胞，亦導致表現於彼宿主細胞中之抗體之低岩薄糖基化（亦參見 Shields，R.L·等人（2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740)。Umana 等人之 PCT 公開案 w〇 99/54342 描述經工程改造以表現醣蛋白修飾糖基轉移酶（例如，万 (1，4)-N-乙醯葡糖胺轉移酶ΠΙ (GnTIII))之細胞系，如此以致表現於工程改造細胞系中之抗體展現增加之等分 GlcNac結構，從而使得抗體之ADCC活性增加（亦參見 ® Umana 等人（1999) Nat. Biotech. 7:176 180 )。在工程改造本發明之抗體之方法的某些具體實例中，可沿抗h IL 2 0抗體編碼序列（例如，15 D 2或5 B 7編碼序列）之全部或部分隨機或選擇性引入突變且可針對如本文中所述之結合活性及/或其他功能性質篩選所得經修飾之抗體。突變方法已描述於此項技術中。舉例而言，Short之PCT公開案WO 02/092780描述使用飽和突變誘發、合成接合組裝或其組合來形成及篩選抗體突變之方法。 w 或者，Lazar等人之PCT公開案WO 03/074679描述使用電腦筛選方法優化抗體之生理化學性質之方法。抗體衍生物本發明之範疇内的抗體衍生物（或免疫結合物）包括與第二藥劑結合或共價鍵結之抗hIL20抗體。舉例而言’在一態樣中’本發明提供包含與細胞毒性劑結合或共價鍵結之抗體之免疫結合物。如本文中所使用’術語「細胞毒性劑（cytotoxic agent)」為能夠殺死細胞 51 201022288 之分子，該分子例如經由IL20結合於細胞表面hiL2〇受體· 而與該細胞相關》具有細胞毒性或細胞抑制效應之任何類型之部分可與本發明之抗體結合以形成本發明之細胞毒性結合物’其包括治療性放射性同位素、毒性蛋白質 '毒性小分子（諸如藥物）、毒素、免疫調節劑、激素、激素拮抗劑:、酶、募核苷酸、酶抑制劑:、治療性放射性核素、血管生成抑制劑、化療藥物、長春花生物鹼、蒽環黴素 Unthracycline )、鬼臼毒素（epid〇phyll〇t〇xin )、紫杉炫 (taxane )、抗代謝物、烷基化劑、抗生素、c〇x_2抑制劑、 ❿ SN-3 8、抗有絲分裂劑、抗血管生成劑及細胞凋亡劑，尤其阿黴素（doxorubicin)、甲胺喋呤（methotrexate)、紫杉酚 (taxol )、CPT-11、喜樹驗（camptothecans )、氮芬類（nitrogen mustards )、吉西他濱（gemcitabine )、烧基續酸鹽、亞石肖基脲、三氮烯、葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物、鉑配位錯合物、綠腺桿菌外毒素（Pseudomonas exotoxin )、慈麻毒素（ricin )、相思豆毒素（abrin )、5 -氟尿苷、核糖核酸酶（RNase )、DNase I、葡萄球菌腸毒素-A( Staphylococcal Ο enterotoxin-A)'美洲商陸（pokeweed)抗病毒蛋白、介樂寧（gelonin )、白喉毒素（diphtherin toxin )、綠腺桿菌外毒素及綠膿桿菌内毒素（Pseudomonas endotoxin )及其他物質 (例如參見 Remington’ s Pharmaceutical Sciences,第 19 版 (Mack Publishing Co. 1995) ; Goodman 及 Gilman 之 The

Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001) ; Pastan 等人（1986) Cell 47:641 ; Goldenberg (1994) 52 201022288 參

Cancer Journal for Clinicians 44:43 ；美國專利第 6,077,499 號；其整體揭示内容以引用的方式併入本文中）。應瞭解毒素可為動物、植物、真菌或微生物來源，或可藉由化學合成從頭形成。在另一具體實例中’用諸如治療性放射性核素或適合於伯測目的之放射性核素的放射性同位素衍生抗體。可使用許多合適之放射性同位素中之任一者，其包括（但不限於）1-131、銦-111、錆 _171、鉍 _212、鉍-213、砹-211、銅 © -62、銅-64、銅-67、釔-90、碘·125、碘-131、磷-32、磷-33、銳-47、銀-111、鎵-67、镨-142、# -153、越-161、銷-166、鈥-166、銖-186、銖-188、銖-189、錯-212、錯-223、荆-225、鐵-59、硒-75、砷-77、勰-89、鉬 _、铑_105、鈀_1〇9、镨_143、鉅-149、餌-169、銥·194、金-198、金 _199 及鉛 _211。一般而吕，放射性核素較佳對於歐傑（Auger )發射體而言具有

在20 keV至6,000 keV之範圍内、較佳在6〇 keV至2〇〇 keV 之範圍内的衰變能量，對於点發射體而言為1〇〇_2,5〇〇 keV

，其中本發明之抗體結合物可用於改變特定生物反應，其 Μ 4^1 AR yV T -re» A* 、，

緊A、綠膿桿菌外毒素或白喉毒素 ;蛋白質，諸如腫瘤壞死因子或干擾素 53 201022288 -y ;或生物反應修飾劑，諸如淋巴激素、介白素_丨（r IL丨」）、介白素-2 (「IL2」）' 介白素-6 (「IL-6」）、顆粒球巨嗟細胞群落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor’「GM-CSF」）、顆粒球細胞群落刺激因子（granul〇cyte colony stimulating factor ’「G-CSF」）或其他生長因子。

，可使:用許多:可用方法‘—之备今者使第二藥;辦直接或，間接連接於抗體。舉例而言，可使用諸如3-(2-吡咬基二硫基）丙酸N- 丁二醯酯（ SPDP )冬交聯劑經由二硫鍵形成或經由抗體之Fc區中的碳水化合物部分使藥劑連接於減少之抗體組份的鉸鏈區（例如參見Yu等人（1994) Int. J. Cancer 56: 244 ； Wong, Chemistry of Protein Conjugation and

Cross-linking (CRC Press 1991) ； Upeslacis 等人，

"Modification of Antibodies by Chemical Methods," Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch 等人（編），第 187-230 頁（Wiley-Liss，Inc. 1995) ； Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter 等人（編），第 60-84 頁（Cambridge University Press 1995)，Cattel 等人 (1989) Chemistry today 7:51-58，Delprino 等人（1993) J. Pharm. Sci 82:699-704 ; Arpicco 等人（1997) Bioconjugate Chemistry 8:3 ; Reisfeld 等人（1989) Antihody，Immunicon. Radiopharm. 2:217，其中每一者之整體揭示内容均以引用的方式併入本文中）。亦例如參見Arnon等人，"Monoclonal 54 201022288

Antibodies For Immuno targeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 等人（編），第 243-56 頁（Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom 等人，"Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (第 2 版），Robinson 等人（編），第 623-53 頁 (Marcel Dekker, Inc. 1987) ； Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical 〇 Applications，Pinchera 等人（編），第 475-506 頁（1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The

Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin 等人（編），第 303-16 頁（Academic Press 1985)，及 Thorpe 等人，"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)。關於細胞毒素之類型、連接子及使治療劑與抗體結合之方法的進一步論述，亦參見Saito, G.等人（2003)人心· Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail，P.A.等人（2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337 ； Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212 ； Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763 ; Pastan，I.及 Kreitman，R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091 ; Senter, P.D.及 Springer，C.J. (2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264。 55 201022288 在其他具體實例中，第二藥劑為可檢測部分，其可為可疋里或疋性觀察或量測之任何分子。適用於本發明之結合抗體之可偵測標記的實例為放射性同位素、螢光染料或互補結合對之成員，諸如以下任一者之成員：抗原/抗體（除 IL20之抗體外）、凝集素/碳水化合物；抗生物素蛋白/生物素；受體/配翁體1或分手印記聚合物/印刷分子系統。第為藥劑亦可為或者可為意欲例如增加抗體或其抗原結合片段冬猶環半衰期的聚合物。例示性聚合物及使該等聚合物連接於肽之方法說明於例如美國專利第4,766,丨〇6 ❹ 號、第 4，179,337 號、第 4,495,285 號及第 4,609,546 號中。其他說明性聚合物包括聚氧乙烯化多元醇 (polyoxyethyUted polyol )及聚乙二醇（ glycoi，PEG)部分。如本文中所使用，術語「聚乙二酵 (polyethylene glycol)」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白質之 peg之任何形式，諸如單（Ci_Cig)烷氧基-聚乙二醇或芳氧基 -聚乙二醇或聚乙二醇-順丁稀二醯亞胺。舉例而言，全長抗體或抗體片段可與一或多個分子量介於約〗，〇〇〇與約 φ 40,000之間（諸如介於約2〇〇〇與約2〇，_之間，例如約 3一’_-12，_ )的PEG分子結合。為了使抗體或其片段聚乙 -醇化’典型地在一或多個pEG基團連接於該抗體或抗體片段之條件下使抗體或片段與聚乙二醇（pEG)(諸如MG 之活性S曰或搭衍生物）反應。較佳地，經由與活性Μ。分子（或類似活性水溶性聚合物）進行酿化反應或烧基化反應來進行該聚乙二醇化。在某些具體實例中，欲聚乙二醇 56 201022288 化之抗體為糖基化抗體。使蛋白質聚乙二醇化之方法為此項技術所知且可應用於本發明之抗體。例如參見 W02004099231、W02003031464、EP154316 ( Nishimura 等人）及 EP401384 ( Ishikawa 等人）。核酸

本發明之另一態樣係關於編碼本發明之抗體的核酸分子。該等核酸可存在於全細胞、細胞溶解物或部分純化或實質上純形式中。當藉由包括驗性/SDS處理、CsCI條帶、管柱層析法、瓊脂糠凝膠電泳及此項技術中熟知之其他技術的標準技術自其他細胞組份或其他污染物（例如，其他細胞核酸或蛋白質）中純化出核酸時，其被「分離」或「使仟實質上純」。參見F. Ausubel等人編（1987) Current

Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本發明之核酸可為例如DNA 或RNA且可能會或不會含有内含子序列。在一較佳具體實例中’核酸為cDNa分子。一本發明之核酸可使用標準分子生物學技術獲得。對於由嘁口瘤（例士。’如下文進一步所述自帶有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠製備之融合瘤）表現之抗體而言， 5瘤製備之抗體之輕鏈及重鏈的cDNA可藉由標 =CR擴增或_人選殖技術來獲得。對於自免疫球蛋白可自唁幻如，使用噬菌體呈現技術）獲得之抗體而言， L始^庫回收編碼抗體之核酸。本發明之較佳核酸分子為編碼 IgG：? +、τ。， s gG4同型（更佳為IgG4)之15D2或5Β7 57 201022288 單株抗體之重鏈及輕鏈序列的彼等者。 * 一旦獲得編碼VH及VL區段之DNA片段，此等Dna 片段可進—步藉由標準重組DNA技術來操作，例如使可變區基因轉化為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在此等操作中，使VL或VH編碼DNA片段操作性連接於編碼另一蛋白質(諸如採髅管定區或邓撓性速接子)之另一 DNA片段。如本文中所使用，術語「操作性連接 (operatively linked)」欲意謂接合2假DNA片段以致由該2 個DNA片段編碼之胺基酸序列保持同框（in_frame)。 _ 可藉由使VH編碼DNA操作性連接於編碼重鏈恆定區 (CHI、CH2及CH3 )之另-DNA分子來使,經分離之編碼 VH區之DNA轉化為全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為此項技術所知（例如參見Kabat，E. A.等人（1991)

Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版 U.S. Department of Health and Human Services, NIH 公開案第91-3242號）且涵蓋此等區域之DNA片段可藉由標準pcR 擴增來獲得。重鏈恆定區可為IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、〇 IgA、Ig.E、IgM或IgD恆定區，但最佳為IgG4恆定區。對於Fab片段重鏈基因而言，可使VH編碼DNA可操作性連接於僅編碼重鏈CH1恆定區之另一 DNA分子。可藉由使VL編碼DNA操作性連接於編碼輕鏈恆定區 CL之另一 DnA分子來使經分離之編碼VL區之DNa轉化為全長輕鏈基因（以及Fab輕鏈基因）。人類輕鏈恆定區基因之序列為此項技術所知（例如參見Kabat，E A等人 58 201022288 餮 (1991) Sequences of pr〇teins 〇f Immun〇1〇gical Interest，第

5 版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 公開案第91-3242號）且涵蓋此等區域之dnA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區，但最佳為κ怪定區。為了形成scFv基因，使VH編碼DNA片段及VL編碼 DNA片段可操作性連接於編碼可撓性連接子（例如，編碼胺基酸序列（Gly4-Ser)3 )之另一片段，以致VH及VL序列 ❹可表現為相鄰單鏈蛋白質，其中VL區及VH區藉由可撓性連接子接合（例如參見Bird等人（1988) Science 242:423-426; Huston 等人（1988) Proc. Natl Acad. Sci. USA 85:5879-5883 ; McCafferty 等人，（1990) Nature 348:552-554 ) ° 抗體產生本發明之單株抗體（mAb )可藉由包括習知單株抗體方 ❹法（例如，Kohler 及 Milstein (1975) Nature 256: 495 中之標準體細胞雜交技術）之各種技術來產生。儘管原則上體細胞雜交程序為較佳，但可使用產生單株抗體之其他技術，例如B淋巴細胞之病毒或致癌轉化。 —種製備融合瘤之較佳動物系統為鼠類系統。分離用於融=之經免疫脾細胞之免疫方案及技術為此項技術所知融合搭配物（例如，鼠類骨髓瘤細胞）及融合程序亦為此項技術所知。本發明之嵌合或人類化抗體亦可使用已建立之技術基於鼠類單株抗體之序列來製備。舉例而言， 59 201022288 編碼重鏈及輕鍵免疫 · 瘤獲得且使用产進八：了自所關，之鼠類融合

鼠類（例如，人類）免疫球蛋白序列。舉例而言 J 成嵌合抗體，馬了形 ’ 使用此項技術中已知之方法使鼠類可變區連接於人類.4區（例如參i⑽川y等人之美國專利第 ’816,567號）9為f形減人類化抗體，可使用此項技術中已知之方法將鼠類CDR區插人人類構架中（例如參見心如美國專利第5,225,539號，及㈣加等人之美國專利第 ’ 〇，1〇1 號、第 5,585,089 號、第 5,693,762 號及第 6,180 3 70 〇號）。 ^ 在一較佳具體實例中，本發明之抗體為人類單株抗體。該等針對hIL2G之人類單株抗體可使用帶有_部分人類免疫系統而非小鼠系統之轉殖基因或轉染色體小鼠來產生。此等轉殖基因及轉染色體小鼠包括本文中分別稱為 HuMAb小鼠及KM小鼠之小鼠，且本文中共同稱為「人類 Ig小鼠」。HuMAb小鼠（Medarex公司）含有編碼未重排之人類重（P及y)及K輕鏈免疫球蛋白序列的人類免疫球蛋〇白基因小基因座，以及使内源性u及κ鏈基因座失活之靶向突變（例如參見L〇nberg等人（1994) Nature 368: 856-859 )。因此，該等小鼠展現小鼠“河或κ之表現減少，且響應於免疫作用，引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因經受類別轉換及體細胞突變以產生高親和力人類IgGK單株 (Lonberg’N.等人（1994)，見上；回顧於 L〇nbergN (1994) Handbook of Experimental Pharmacology ΐι3;49_ι〇ΐ ; 60 201022288

Lonberg，Ν·及 Huszar，D. (1995) Intern. Rev. Immunol, 13: 65-93’ 及 Harding，F.&Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad. Sci. 764:536-546中）。HuMAb小鼠之製備與使用及該等小鼠所帶有之基因組修飾進一步描述於Taylor, L.等人（1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295 ; Chen，J.等人 (1993)International Immunology 5: 647-656 ； Tuaillon 等人 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724 ; Choi 等人 (1993) Nature Genetics 4: 117-123 ; Chen，J.等人（1993) ❹ EMBO J. 12: 821-830，Tuaillon 等人（1994) J. Immunol. 152:2912 2920，Taylor, L.等人（1994) international immunology 6: 579-591 ;及 Fishwild，D.等人（1996) Nature

Biotechnology 14: 845-851中，其全部内容特定地以全文引用的方式併入本文中。進一步參見，美國專利第5,545,8〇6 號、第 5,569,825 號、第 5,625，12ό 號、第 5,633,425 號、第 5,789,650 號、第 5,877,397 號、第 5,661，016 號、第 5,814,318 號、第5,874,299號及第5,770,429號，作者均為Lonberg ® 及Kay ; Surani等人之美國專利第5,545,8〇7號；pCT公開案第 WO 92/03918 號、第 WO 93/12227 號、第 WO 94/25585 號、第 WO 97/13852 號、第 w〇 98/24884 號及第 WO 99/45962號’作者均為Lonberg及Kay ;及Korman等人之 PCT公開案第WO 01/14424號。在另一具體實例中，本發明之人類抗體可使用轉殖基因及轉染色體上帶有人類免疫球蛋白序列之小鼠（諸如帶有人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠）來產生。該等本文中稱為「KM小鼠」 61 201022288 之小鼠詳細描述於Ishida等人之PCT公開案w〇 02/4347 8 中。此外’表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉殖基因動物系統可在此項技術中得到且可用於產生本發明之抗 hIL20抗體。舉例而言’可使用稱為Xenomouse ( Abgenix 公司）之替代性轉殖基因系統；該等小鼠描述於例如

KucheTlapati等人之美國專利第5339398號、第6,075，181 號、第 6，114,598 號、第 6，150,584 號及第 6，162,963 號中。此外，表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉染色體動物系統可在此項技術中得到且可用於產生本發明之抗hIL20抗 ® 體。舉例而&，可使用稱為「T C小鼠」之帶有人類重鏈轉染色體與人類輕鏈轉染色體之小鼠；該等小鼠描述於

Tomizuka 等人（2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727 中。此外，帶有人類重鏈及輕鏈轉染色體之母牛已描述於此項技術中（Kuroiwa 等人（2002) Nature Bi〇techn〇1〇gy 20:8 89-894 )且可用於產生本發明之抗hIL2〇抗體。本發明之人類單株抗體亦可使用噬菌體呈現方法篩選人類免疫球蛋白基因文庫來製備。該等分離人類抗體之噬 ❹ 菌體呈現方法已在此項技術中建立。參見例如：Ladner等人之美國專利第5,223,409號、第5, 4〇3,484號及第 5,571，698號·’ Dower等人之美國專利第5, 427,9〇8號及第 5, 580,7mCafferty等人之美國專利第5,969，1〇8號及第6, 172,197號；及Griffiths等人之美國專利第5,885,793 號、第 6,521’404 號、第 6,544,731 號、第 6,555,3 13 號、第 6,582,915號及第6,593,081號。本發明之人類單株抗體亦可 62 201022288 使用已在其中重新構建人類免疫細胞以致可在免疫作用後產生人類抗體反應之SCID小鼠來製備。該等小鼠描述於例如Wilson等人之美國專利第5,476,996號及第5,698,767號中。當使用人類Ig小鼠產生本發明之人類抗體時，可用 hIL20抗原之純化或富集製劑使該等小鼠免疫，如藉由

Lonberg，N.等人（1994) Nature 368(6474): 856-859, Fishwild， D.專人（1996) NatureBiotechnol〇，gy 14: 845-85 1 及 PCT 公 © 開案WO 98/24884及WO 01/14424所述。較佳地，在第一輸注之後，小鼠將為6-16週齡《舉例而言，可使用hlL20 抗原之純化或虽集製劑（5-50 y g )經腹膜内使人類Ig小鼠免疫。典型地根據此項技術中已建立之方法對各抗原_小鼠系統優化所投予之抗原（例如，hIL2〇多肽）之形式及量以及投藥時程及諸如完全弗氏佐劑（c〇mplete Freund,s adjuvant) 或不元王弗氏佐劑（incomplete Freund's adjuvant)之佐劑 ®的可能使用。可在利用藉由眼窩後血液獲得之血漿樣品進行的免疫方案之過程中監測免疫反應，且可藉由eusa (如下文所述）篩選血漿或血清，且具有抗hIL2〇人類免疫球蛋白之足夠力價的小鼠可用於融合。可用抗原經靜脈内加強小鼠反應，3天後處死且移出脾。預期對於每次免疫作用可能需要執行2-3次融合。為形成產生本發明之人類單株抗體的融合瘤，可分離 63 201022288 ，來自經免疫小鼠之脾細胞及/或淋巴結細胞且舆適當永生化細胞系（諸如小鼠骨趙瘤細胞系）融合。可針對抗原特異性抗體之產生篩選所產生之融合瘤。舉例而言，可使來自經免疫小鼠之脾淋巴細胞之單細胞懸浮液與六分之一數目

之P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤細胞（atcc，CRL 1580 )及50¾ PEG融合。或者，可籍由電融合（eleCtr〇fusi〇n ) 使該等細胞融合。將細胞以釣2 X105個塗於平底微量滴定板上’隨後在含有20%胎兒純系血清、丨8〇/〇「653」改良性培養基' 5% origen ( IGEN )、4 mM L-麩胺醯胺、1 丙酮 ❿ 酸鈉、5 mM HEPES、0.055 mM 2-巯基乙醇、50單位/毫升青黴素（penicillin)、50 mg/ml 鏈黴素（strept〇mycin)、5〇 mg/ml 慶大黴素（gentamycin)及 ΙχΗΑΤ ( Sigma ;在融合後24小時添加HAT )之選擇性培養基中培育兩週。約2週後，可將細胞培養於HAT經HT置換之培養基中。接著可藉由ELISA針對人類單株IgM及IgG抗體篩選個別孔。一旦進行廣泛融合瘤生長’通常可在10_14天後觀察培養基。可再塗佈分泌抗體之融合瘤，再次篩選，且若對於人類IgG Q 仍為陽性，則可藉由限制稀釋法將單株抗體次選殖至少兩人。接著可在試管内培養穩定次純系以在組織培養基中產生少量抗體以供特性化。為了純化人類單株抗體，可使所選融合瘤生長於2公升旋轉燒瓶中以供單株抗體純化。可過濾及濃縮上清液，隨後用蛋白質A_瓊脂糖（pharmacia， Piscataway，N_ J.)進行親和層析。可藉由凝膠電泳及高效液相層析法檢驗經洗提之IgG以確保純度。可將緩衝溶液交 64 201022288 換為PBS，J_可藉自光譜法測定漠度。彳將單株抗體等分且儲存於-80°C下。亦可使用例如此項技術中所熟知之重組DNA技術與基轉染方法之組合在伤主細胞轉染瘤中產生本發明之抗體 (例如 ’ M〇rrison，S. (1985) SCience 229:1202)。八舉例而5，為了表現抗體或其抗體片段，編碼部分或玉長紅鏈及重鏈之DNA可藉由標準分子生物學技術（例 CR擴增或使用表現所關注之抗體的融合瘤進行選殖）來獲知且可將該等DNA插入表現載體中以致基因可操作性連接於轉錄及轉譯控制序列。在本文中，術語「操作性連接」欲意謂使抗體基因接合至載體中以致該載體十之轉錄及轉譯控制序列發揮其調控抗體基因之轉錄及轉譯的所欲功能。選擇與所用表現宿主細胞相容之表現載體及表現控制序歹i可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入獨立載體魯中《更典型地將兩個基因插入同一表現載體中。藉由標準方法（例如，使互補限制性位點接合至抗體基因片段及載體上，或若不存在限制性位點，則進行純端接合）將抗體基因插入表現載體中。本文所述之抗體之輕鍵及重鏈可變區可用於藉由將其插入已編碼所需同型之重鍵怪定區及輕鏈怪定區之表現載體中以致VH區段可操作性連接於載體中之CH區段且VL區段可操作性連接於载體中之cl區段而形成任何抗體同型之全長抗體基因。另外或其他，重組表現載體可編碼有助於抗體鏈自宿主細胞分泌之信號 65 201022288 肽。可將抗體鏈基因選殖至載體中以致信號肽同框連接於抗體鏈基因之胺基末端。該信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源性信號肽（亦即’來自非免疫球蛋白之信號肽）。除抗體鏈基因外’本發明之重組表現載體帶有控制抗體鏈基因在宿主細胞中表現之調控序列。術語「調控序列 (fe群sequencr)」意欲包括控制抗體鏈基勝之轉錄或轉譯之啟動爭、增強子及其他表現控制元件（例如，聚腺苦酸化彳§ .號)。s亥專調控序列例如描_述於、Goedd.el ( Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 135 Academic Press, San Diego, CA (1990))中 ° 熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計（包括調控序列之選擇）可視諸如欲轉化之宿主細胞之選擇、所需蛋白質之表現量等因素而定。用於v甫乳動物宿主細胞表現之較佳調控序列包括引導哺乳動物細胞中之高蛋白質表現量的病毒元件’諸如自細胞巨大病毒（cytomegalovirus， CMV )、猿猴病毒 40 ( Simian Virus 40，SV40 )、腺病毒（例如’腺病毒主要晚期啟動子（adenovirus major late promoter，AdMLP)及多形瘤衍生之啟動子及/或增強子。或者’可使用非病毒調控序列，諸如泛素啟動子或p_球蛋白啟動子。此外，調控元件由不同來源之序列構成，諸如 SRa啟動子系統，其含有來自SV40早期啟動子之序列及i 型人類T細胞白血病病毒之長末端重複序列（Takebe，Y.等人(1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472) 〇除抗體鍵基因及調控序列外，本發明之重組表現載體 201022288 可帶有其他序列，諸如調控載體在宿主細胞中之複製（例如複製起點）的序列及可選擇標記基因。可選擇標記基因有助於選擇已引入載體之宿主細胞（參見例如美國專利第 4’399,216號、第4,634,665號及第5，179,017號，作者均為

Axel等人）。舉例而言，典型地可選擇標記基因賦予已引入載體之宿主細胞抗藥性，諸如G41 8、潮黴素（hygromycin ) 或曱胺喋呤》較佳可選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶 (dihydrofolate reductase，DHFR)基因（在 dhf卜宿主細胞 ® 中用於甲胺喋呤選擇/擴增）及新基因（用於G418選擇）。對於輕鏈及重鏈之表現而言’藉由標準技術將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染至宿主細胞中。各種形式之術語「轉染（transfection)」意欲涵蓋各種常用於將外源性DNA 引入原核或真核宿主細胞中之技術，例如電穿孔、磷酸妈沈澱、DEAE-葡聚糖轉染及其類似技術。儘管理論上有可能在原核或者真核宿主細胞中表現本發明之抗體，但抗體在真核細胞及最佳哺乳動物宿主細胞中之表現為最佳，因為該等真核細胞及尤其哺乳動物細胞比原核細胞更可能組裝且分泌經適當摺疊之免疫活性抗體。已報導抗體基因之原核表現對於產生高產率之活性抗體無效（Boss，M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13) °

用於表現本發明之重組抗體之較佳哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary，CHO )細胞（包括 Urlaub 及 Chasin, (1980) Proc. Nail. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中所述之使用DHFR可選擇標記之dhfr-CHO 67 201022288 細胞，例如如 R. J. Kaufman 及 p. a. Sharp (1982) Mol. Bi〇l. 159:601-621中所述）、NSO骨髓瘤細胞、c〇s細胞及SP2 細胞。尤其，為用於NSO骨髓瘤細胞，另一較佳表現系統為 WO 87/04462、WO 89/01036 及 EP 338,841 中所揭示之 GS基因表現系統。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細臉申5時’藉由將宿主細胞.培.養足以使得，抗體'在..伯'.主...細.胞...中表現::或..更佳地將抗體分泌.至宿..主細胞生長之培養基中之時段來產生抗體。可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體。抗體特性化產生或純化後’或作為筛選或選擇程序之一部分，可研究本發明之抗hIL20抗體之功能特徵。所關注之功能性質包括例如抗體對hIL20之結合特異性、抗體與hIL2〇直系同源物之結合 '抗體與參考抗體（諸如5B7及15D2)之競爭、抗體結合之抗原決定基、抗體_抗原相互作用之親和力、抗體之拮抗性質及溶解度。

以下為用於抗體特性化之例示性檢定的簡短描述。一些情況進一步描述於其他章節及/或實施例中。結合檢定本發明提供結合hIL2〇之抗體及其抗原結合片段、變體及免疫結合物。各種檢定中之任一者可用於評估抗體 hIL2〇之結合。基於ELISA、放射免疫檢定、西方墨點 (Western b〗otting)' biac〇re及其他競爭檢定之方案適使用且為此項技術所熟知。此外’包括競爭檢定之若干 68 201022288 結合檢定描述於實施例中。舉例而σ，可使用簡單結合檢定，其中在目標蛋白質或抗原決定基（例如，職或其—部分）存在下培育測試抗體’洗去未結合之抗體’且使用例如放射性標記、諸如質譜法之物理方法或使用例如細胞螢光分析（例如 FACScan )偵測之直接或間接螢光標記來評估結合抗體之存在。該等方法為熟習此項技術者所熟知。高於在對昭组、非特異性抗體下所見之量的任何結合量指示抗體特異性結響合於目標。在該等檢定中，可將測試抗體結合於目標細胞或蛋白質^能力與（陰性）對照蛋白質（例如，針對結構上無關之抗原所產生的抗體）或非Ig肽或蛋白質結合於相同目標之能力作比較。使用任何合適之檢定以相對於對照組蛋白質增加25%、50%、100%、2〇〇%、1〇〇〇%或更高之親和力結合於目標細胞或IL20之抗體或片段被稱為「特異性結合 ❹於」目標或與目標「特異性相互作用」，且較佳用於如下：述之治療方法中。亦可評估測試抗體影響針對IL2〇之（陽座）對照組抗體（例如15D2或5B7)之結合的能力。在一態樣中’本發明提供與15D2或5B7共有生物特徵及/或實質上VH及/或VL·序列一致性之抗hIL2〇抗體。一例示性生物特徵為結合於15D2或5B7抗原決定基，或i5D2 或5B7抗體所結合之hIL20之細胞外域中的各別區域。為了篩選結合於1502或5B7抗原決定基之抗體，可執行常規父又阻斷檢定，諸如 Antibodies，A Laboratory Manual，c〇ld 69 201022288 .

Spring Harbor Laboratory，HarlOW 及 David Lane 編（1988) . 中所述之檢定。在一例示性交叉阻斷或競爭檢定中，混合（或預吸附） 1 5D2或5B7 (對照組）抗體及測試抗體且施用於含有IL2〇之樣品上。在某些具體實例中’吾人將對照組抗體與不同量态測儒梅髏預混合（她知，1:10或1:1〇〇)f段時間，隨後施用於含有IL20之樣品上《在其他具體實例中，可在暴露於抗原/目標樣品期間簡單地將對照組及不同量之測試抗體混合。只要吾人可區別結合抗體與自由抗體（例如，藉 ❹ 由使用分離或洗滌技術以消除未結合之抗體）及區別對照組抗體與測試抗體（例如，藉由使用種類或同型特異性二級抗體，藉由用可偵測標記特異性標記對照組抗體，或藉由使用諸如質譜法之物理方法來區分不同化合物），吾人將能夠判定測試抗體是否會減少對照組抗體與抗原之結合，此才曰示測式抗體硪別實質上與對照組相同之抗原決定基。在此檢定中，在完全無關抗體存在下（經標記）對照組抗體之結合為對照高值。對照低值藉由將經標記（陽性）對 © 照組抗體與未標記對照組抗體一起培育來獲得，其中將發生競爭且減少經標記抗體之結合。在測試檢定中，在測試抗體存在下經標記抗體活性之顯著降低指示測試抗體與肖對照組抗體相同之抗原決定基爭或實質上結合於該抗原決定基。在介於約1:1 〇與約之間的對照組：測試抗體或化合物之任何比率下使經標己對，.¾組與抗原/目標之結合減少至少5〇%或更佳的 70 201022288 任何測試抗體或化合物被視為與與對照組相同之抗原決定基或決定子競爭或實質上結合於該抗原決定基或決定子之抗體或化合物。較佳地，該等測試抗體或化合物將使對照組與抗原/目標之結合減少至少90%。然而，使對照組抗體或化合物之結合減少至任何可量測程度之任何化合物或抗體可用於本發明中。在一具體實例中，可藉由流式細胞儀測試來評估競爭。首先將帶有hIL20之細胞與已知特異性結合於hiL2〇 β 受體之對照組抗體一起培育且接著與可經例如螢光染料或生物素標記之測試抗體一起培育。若由與飽和量之對照組 k體一起預培育所獲得之結合為由未與對照組一起預培育之抗體所獲得之結合（螢光方法）的8〇%、較佳5〇〇/。、4〇% 或更小，則認為該測試抗體與對照組競爭。或者，若由與飽和量之測試抗體一起預培育之細胞上的經標記對昭組 (藉由螢光染料或生物素）所獲得之結合為未與該抗體一起預肖育所獲得之結合的80%、較佳5〇%、4〇%或更小，則認為該測試抗體與對照組競爭。關於例示性抗體競爭檢定，參見實施例4。功能檢定本發明之抗體能夠減少試管内及/或活體内 IL2〇R1/IL20R2 及 IL22R1/IL2〇R2 受體複合物之 il2〇介導之活化。各種合適之檢定為此項技術所已知。舉例而言，實施例描述基於以下原理债測受體複合物活化之螢光素酶檢定。簡言之，IL2〇結合及受體複合物形 71 201022288 成後，相關JAK激酶經自體磷酸化且可使STAT3蛋白磷酸化。磷酸化STAT3可進入核且結合鄰接於編碼螢光素酶之基因之啟動子的特異性DNA元件。接著使螢光素酶表現，且可使受質螢光素（luciferin )轉化為光，其接著可加以偵測及量化。. 測試IL20R1/IL20R2及IL22R1/IL20R2受體活化之另一類型的試管内檢定基於例如經來自人類或其他物種之 IL2Q受體複合物轉染之B往F-3細胞的增殖。該檢定可測試經例如 hIL20Rl/hIL20R2 或 hIL22Rl/hIL20R2 轉染之 BaF-3 ❹ 細胞的IL20誘發之增瘦之中和效應。BaF-3細胞依賴於 IL3，且在其生長培養基申添加IL3後在試管内增殖。若不能得到IL3，則細胞將在數天内死亡，在IL3不足數小時後已顯示細胞凋亡之徵象。當經轉染之BaF-3細胞經由其IL20 受體複合物刺激時，其將開始分裂且不需要IL3。實施例中描述抑制增殖之特異性檢定。溶解度檢定測試溶解度（亦即，可在溶液中達成之抗體濃度）之 © 合適檢定描述於實施例3及Harris，E.L.V. (1989) Harris， m 反 AngaA，S.(編、，Protein Purification Methods. A Practical Approach. IRL Press, New York,參見例如，第 131-133 頁中。醫藥調配物在一具體實例中，本發明提供包含如本文中所述之抗 hIL20抗體以及一或多種載劑之醫藥組合物。本發明之人類 72 201022288 抗體（包括15D2及5B7)適用於高濃度通常為有利或必需 (例如，當用於皮下投藥時）之醫藥調配物。 W02006003179 (以全文引用的方式併入本文中）中所述之醫藥調配物及投藥模式亦可用於本發明之抗體及應用。本發明之一目的在於提供一種典型地呈水性或凍乾調配物（用於復水）形式之包含本發明之抗體的醫藥調配物，該抗體以 1 mg/ml 至 150 mg/ird、1 mg/ml 至 200 mg/ml 或 1 ® mg/ml至500 mg/ml之濃度存在，且其中該調配物具有2 〇至10.0、典型地約中性pH值之pH值。較佳地，在水性調配物中’抗體以最少約50 mg/ml、至少約60 mg/ml、至少約70 mg/m卜至少約80 mg/m卜至少約90 mg/ml或至少約 100 mg/ml之濃度以可溶形式存在。調配物可進一步包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑。此等物質可包括例如緩衝系統以及一或多種防腐劑、張力劑、螯合劑、穩定劑及/或界面活性劑。合適之載劑為此項技術所已知且描述於例如Remingt〇n: 尸 o/P/iarwac少，第 19 版，1995 中。合適之抗體調配物亦可藉由剖析其他已開發之治療性單株抗體之經驗來判定。已顯示若干種單株抗體在臨床情形中有效’諸如Rituxan (利妥昔單抗（Rituximab ))、 Herceptin (曲妥珠單抗（Trastuzumab )、x〇lair (奥瑪利珠單抗（Omalizumab ) )、Bexxar (托西莫單抗 (Tositumomab ))、Campath (阿來組單抗（Alemtuzumab ))、 73 201022288

Zevalin、〇nc〇lym、Humira及類似調配物可與本發明之抗 -體一起使用。舉例而言’單株抗體可以於1〇〇mg(i〇m^ 或500 mg(50mL) 一次性使用小瓶中1〇mg/mL<濃度供應，在9.0 mg/mL氣化鈉、7.35 mg/mL檸檬酸鈉二水合二二 0.7 mg/mL聚山梨醇酯8〇及無菌注射水中調配用於靜脈内 (輕）殺藥。將，僚調整立或者，抗體可在餘含磷酸鹽緩衝液或組胺酸、蔗糖及聚山梨醇酯8〇之溶液中進行調配〇 ...

診斷性應用 I 本發明之hIL20抗體亦具有非治療性應用。舉例而言，抗hIL20抗體亦可適用於IL2〇蛋白質之診斷性檢定，例如偵測其在特異性組織 '組織樣品（例如，滑液）或企清中之存在。對於診斷性應用而言，抗體典型地將經可偵測部分標 β己。可利用許多標記’其一般可分成以下類別： (a )放射性同位素，諸如35s ' 14C、125j、3Η及131J。抗體可使用例如Current Protocols in Immun〇1〇gy,第i及❹ 第 2 卷，Coligen 等人編，Wiley-lnterscience，New Y〇rk，Ν γ，

Pubs. (1991)中所述之技術經放射性同位素標記，且放射活性可使用閃爍計數來量測。 (b)可利用螢光標記，諸如稀土金屬螯合物（銪螯合物）或螢光素（fluorescein )及其衍生物、若丹明（rh〇damine ) 及其衍生物、丹醯（dansyl)、麗絲胺（Ussamine )、藻紅素 (phyCoerythrin)及德克薩斯紅（Texas Red)。可使用例如 74 201022288 <d.

Current ProtocoIs in Immun〇1〇gy (見上）中所揭示之技術使螢光標記與抗體結合。螢光可使用螢光計進行量化。 (c)可利用各種酶-受質標記且美國專利第4,275,149 號提供一些此等標記的評述。酶一般催化可使用各種技術量測之產色受質之化學改變。舉例而言，酶可催化受質之顏色變化’其可用分光光度法量測。或者，酶可改變受質之螢光或化學發光。酶標記之實例包括螢光素酶（例如，螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶；美國專利第4,737,456 © 號）、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮 '蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase )、脲酶（urease )、過氧化酶（per〇xidase ) (諸如辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRPO ))、驗性鱗酸酶（alkaline phosphatase )、yg _半乳糖苷酶 (beta-galactosidase)、葡糖澱粉酶（giucoamylase)、溶菌酶 (lysozyme )、膽氧化酶（saccharide oxidase )(例如，葡萄糖氧化酶（glucose oxidase )、半乳糖氧化酶（gaiactose oxidase )及葡萄糖-6-填酸脫氫酶（giucose_6-phosphate ® dehydrogenase))、雜環氧化酶（heterocyclic oxidase)(諸如尿酸酶（uricase)及黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase))、乳過氧化酶（lactoperoxidase )、微過氧化酶 (microperoxidase )及其類似酶《使酶與抗體結合之技術描述於 O’Sullivan 等人，"Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay," Methods in Enzymology (J. Langone 及 H. Van Vunakis 編）， Academic Press, New York, 73:147-166 (1981)中。 75 201022288 . 抗體亦可用於活體内診斷性檢定。一般，藉由例如核、磁共振或此項技術中已知之其他方法用可偵測之放射性核素或非放射性指示劑標記抗體》較佳地，該標記為放射性標記，諸如1251、⑴卜67Cu、心化或llljn。向宿主較佳經由血流投予經標記抗體’且檢定宿主中經標記抗體之存在及位置。此成像故術適合用於奢由'觀測滑液及滑韻中之 IL20而偵硎、分期或治療所討論的疾病或病症，例如類風濕性關節炎、青少年類風濕性關節炎、牛皮癖、牛皮癬性關節炎、強直性脊椎炎、休格連氏症候群、多發性硬化症、❹ 發炎性腸病 '全身性紅斑狼瘡及/或狼瘡腎炎。藉由任何方法使放射性同位素與蛋白質結合，包括用於碘化之金屬螯合化合物峨精（iodogen)技術。為了方便起見，本發明之抗體可提供於套組，亦即預定量之試劑與關於執行診斷性檢定之說明書的包裝組合中。當抗體經酶標記時，該套組將包括酶所需之受質及辅因子（例如，提供可偵測發色團或螢光團之受質前驅體）。另外’可包括其他添加劑，諸如穩定劑、緩衝液（例如，⑬ 阻斷緩衝液或溶解緩衝液）及其類似物。各種試劑之相對量可廣泛不同以提供在試劑溶液中之實質上優化檢定靈敏度之濃度。尤其，試劑可以溶解後將提供具有適當濃户之試劑溶液之乾粉形式（通常經綠，包括賦形劑）提供又。治療性應用本發明亦提供使用如本文中所述之人類或人類化抗 hIL20抗體來治療患者之方法。在一具體實例中本發明提 76 201022288 供如本文中所述之人類或人類化抗體用於製備向人類落者投予之醫藥組合物的用途《典型地，該患者遭受自體免疫或發炎性疾病或病症或處於該疾病或病症之風險中。

在一態樣中，欲用本發明之抗體及其他化合物治療之病狀或病症為類風濕性關節炎、青少年類風濕性關^炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、強直性脊椎炎、休格連氏症候群、多發性硬化症、發炎性腸疾病（諸如潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病（Crohn's disease))、全身性紅斑狼瘡或狼瘡腎炎及其任何組合，以及與此等疾病相關之共存疾病，其中心血管疾病為該等共存疾病之非限制性實例。在另一態樣中’其他例示性病狀包括（但不限於）青少年慢性關節炎、骨關節炎、除強直性脊椎炎外之其他脊椎關節病、全身性硬化症（硬皮病）、特發性發炎性肌病（皮肌炎、多發性肌炎）、血管炎、全身性血管炎、顳動脈炎、動脈粥樣硬化、肉狀瘤病、重症肌無力、自體免疫溶血性貧血（免疫性全部血球減少症、陣發性睡眠性血紅素尿）、惡性貧血、自體免疫血小板減少症（特發性血小板減少性紫癜、免疫介導性血小板減少症）、甲狀腺炎（格雷氏病（Grave,s )、橋本氏甲狀腺炎（Hashim〇t〇，s thyroiditis )、青少年淋巴細胞性甲狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎）、糖尿病、2型糖尿病、免疫介導性腎病（絲球體腎炎、小管間質腎炎、自體免疫卵巢炎）、胰腺炎、自體免疫睾丸炎、自體免疫葡萄膜炎、抗破脂症候群、除多發性硬化症外之中槌及周邊神經系統之脫髓鞠疾病、特發性脫髓鞘多發性神經病或袼-巴二氏症 77 201022288 候群（Guillain-Barre syndrome)及慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病、肝膽疾病（諸如傳染性肝炎（A、b、c、D、E 型肝炎及其他非親肝病毒）、自體免疫慢性活動性肝炎、病毒性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎、韋格納氏肉芽腫病（Wegener's granulomatosis )、貝西氏病（Behcet's 游峨se)身硬化性膾管炎）、發炎性腸疾病（諸如乳康缚、麵質敏感性腸病、.及惠普'爾.氏'病（W.hippl.e.'s. disease).)、自體免疫或免疫介導性皮膚病（包括大皰性皮膚病、多形紅斑及接觸性皮炎' 異位性皮膚炎、疱疹樣皮炎、尋常天疱 0 瘡、白斑症（白斑病））、過敏性疾病（諸如哮喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、食物過敏症及蓴麻疹）、敗血症、内毒素企症、免疫性肺病（諸如嗜酸性球性肺炎、特發性肺纖維化及過敏性肺炎）' 慢性阻塞性肺病及器官或骨髓移植相關疾病（包括移植排斥及移植物抗宿主疾病）。舉例而言，在一態樣中，抗IL20抗體與一或多種其他消炎劑組合使用，該等消炎劑包括（但不限於）止痛劑、免疫抑制劑（例如’ B或T細胞拮抗劑，諸如B細胞消耗 © 劑及T細胞抑制劑；補體抑制劑）、皮質類固酵 (corticosteroid)及抗TNFa藥劑或其他抗細胞激素或抗細胞激素受體藥劑及抗血管生成劑。特定實例包括曱胺嗓吟 (methotrexate )、TSG-6、Rituxan® 或其他 B 細胞療法、抗 IL12抗體、CTLA4-FC融合蛋白、IL1-受體拮抗劑、ILi抗體、IL15抗體、IL18抗體及抗IL6R抗體。下文提供組合療法之其他實例。 78 201022288 田一或多種其他藥劑或方法與本發明之療法組合使用夺並不要求組合之結果為分開進行各治療時所觀察到之

效應之累加。儘管一般至少需要累加效應，但優於單一療法之之1L2〇活性的任何降低或其他有益效應將為有益的。亦不特別要求組合治療展現協同效應，雖然此肯定有可此·且為有利的。基於IL2〇之治療可以例如範圍為數分鐘至數週及數月之時間間隔在其他治療之前或在其他治療之，。亦預想將利用抗IL20組成物或其他藥劑之多於一次投樂。該等藥劑可隔日或隔週可交換地投予；或可進行抗iL2〇 /0療之週期，隨後進行其他藥劑療法之週期。在任何情況下’只需要傳遞有效發揮治療性有益效果之組合量的兩種藥劑’而無需考慮投藥時間。類風濕性關節炎類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA)為主要與多個關節之滑膜有μ、會對關節軟骨產生損傷之慢性全i !·生自體免疫發炎性疾病。發病機制依賴於T淋巴細胞且與 Ί、因針對自纟IgG之自體抗體之產生相關，從而形成在滑液及血液中達到高含量之免疫複合物。關節中之此等複合物可誘發淋巴細胞及單核細 ,隨後顯著滑液變化;在添加許多嗜中性白血球下= 、、田胞次潤關郎間隙，響之組織主要為關節，通常呈對稱模式 '然而’關節外疾病亦以兩種主要形式發生。一種 =為發展關節相變，伴有進行性關“及肺纖維化、官炎及皮膚潰叙典型病變。關節外疾病之第二種形式 79 201022288 為所謂費爾提氏症候群（Felty’s syndrome )，其在ra疾病過程之末發生’有時在關節病已被遏制後發生，且與嗜中性白血球減少症、血小板減少症及脾腫大之存在有關◊此可伴有多種器官之血管炎’從而形成梗塞、皮膚潰瘍及壞症。患者通常亦在覆蓋受影響關節之皮下組織中發展類風廣結酴，諸S卩晚期具有由混合型發炎_胞浸濟潤.包^圍.之壞死中心9可在R:A中發生之其他表現包括：心包炎、胸膜炎、冠狀動脈炎、間質性肺炎併發肺纖維化、乾燥性角膜結膜炎及類風濕結節。已證實IL20存在於類風濕性關節炎滑液中（Hsu 等人（2006) Arthritis Rheum. 54, 2722-2733 ; Kragstrup 等人，（2008) Cytokine 41，16-23)，且已證實 il20 受體表現於類風濕性關節炎滑膜中（Hsu等人，（2006)

Arthritis Rheum. 54, 2722-2733 ; Sakurai 等人，（2〇08)

Rheumatology (Oxford) 47, 815-820) 〇因此，在一態樣中，本發明提供一種治療及/或預防類風濕性關節炎（RA )之方法。該方法包含向患有RA或鐘別/診斷為實質上處於發展RA之風險中之患者傳遞有效量之抗hIL20抗體，以致RA得到治療或預防。在另一態樣中，該抗體能夠可偵測地減少IL20R1/IL20R2及IL22R1/IL20R2 受體複合物之IL20介導之活化。在一態樣中，該方法使得一或多種生物標記以與治療或預防（如有適用）RA —致之方式得到調節（例如，血清IL-6、TNF-a、IL1、VEGF、TIFF R、IL2R、shedCD4、shed CD8及/或C活性蛋白）。可視情況測試本發明之抗體的RA之活體内模型描述於美國專利 201022288 第6,414,218號及美國專利公開案第20030005469號中（相關原理及模型描述於例如Wooley，P. H.，Animal Models of Arthritis, J· H. Klippel 及 P. A· Dieppe 編，Mosby Publishers (London)，1998 ; Erning 等人，Arthritis Res，4 增刊 3:S 133-40, 2002; Holmdahl 等人，Ageing Res Rev，1(1): 135-47, 2002 ; Anthony 等人，Clin Exp Rheumatol，17(2):240-4，1999; Durie 等人，Clin Immunol Immunopathol，73(1):11-8, 1994 ;及 Muller-Ladner 等人，Drugs Today (Bare), 35(4-5): © 379-88, 1999 中）。在另一態樣中’實踐該方法使得患者/宿主之周邊關節中之滑液炎症得到可偵測的降低。在一態樣中，如藉由例如患者或宿主之放射學進展（radiographic progression )減少、腫脹及觸痛關節（如藉由可接受之分析標準所判定）減少及/或生活品質顯著改良（例如，如藉由rA健康評估問卷上之失能計分減小所判定）所展現，該方法導致預防患者或宿主之放射學退化且改善身體機能。抗體可單獨使用或與一或多種其他抗RA藥劑組合使用，該藥劑諸如非類固醇 /肖炎樂（non-steroidal anti-inflammatory drug， NSAID )、COX-2抑制劑、止痛劑、皮質類固醇（例如，潑尼权（prednisone)、氣皮質闕（hydrocortisone))、金劑、免疫抑制劑（例如，甲胺喋呤）、B細胞消耗劑（例如， RitUXan®)、B細胞促效劑（例如，LymphoStat-B®)及抗 ™F α 藥劑（例如，Embrel®、Humira®及 Remicade® )、抗 IL1爻體拮抗劑（例如，Kineret(g))、抗江15抗體或改變病 81 201022288 情抗風濕藥物（disease-modifying anti-rheumatic drug， DMARD)〇脫髓鞘疾病咸信中樞及周邊神經系統之脫髓鞘疾病具有與自體免疫有關之病因且由於對募樹突神經膠質細胞或直接對髓鞘質引餐損傷而造成神，經脒猶翁，該等脫錄鞘疾病包括多發性硬化症（Multiple Sclerosis，MS )、特發性脫猶勒多發性神經病或格-巴二氏症候群及慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病。在MS中’有證據表明疾病誘發及進展視τ淋巴細胞而 © 疋° MS為依賴於τ淋巴細胞之脫髓鞘疾病且具有復發缓解過程或慢性進行性過程。病因尚不明了；然而，病毒感染、遺傳傾向性 '環境及自體免疫性均有影響。病變含有要T淋巴細胞介導之小神經膠質細胞及浸潤巨噬細胞之浸潤；CD4 + T淋巴細胞為病變處之主要細胞類型。因此’在另一態樣中，本發明提供一種治療及/或預防之方法。該方法包含向患有Ms或鑑別/診斷為實質上處於發展MS t風險十之人類患者傳遞有效量之抗hIL2〇抗〇體，以致該患者或宿主之Ms得到治療或預防。該抗體可單獨使用或與其他抗MS藥劑（諸如Tyzabri(g))組合使用。發炎性腸病在另一態樣中’本發明提供一種治療及/或預防發炎性腸病（發炎性腸病’ IBD 諸如克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎）之方法。該治療發炎性腸病之方法包含向患有IBD或鑑別/診斷 82 201022288 為實質上處於發展IBD之風險中之人類患者傳遞有效量之抗IL20抗體’以致该患者之ibd得到治療或預防。該抗體可單獨使用或與其他抗IBD藥劑組合使用，該等抗ibd藥劑諸如含有美沙胺（mesalamine )(包括柳氮磺胺吡啶 (sulfasalazine)及其他含有 5_胺基水揚酸（5_amin〇salicylic acid，5-ASA)之藥劑，諸如奥色拉秦（〇lsalazine)及巴柳氮（balsalazide ))之藥物、非類固醇消炎藥（NSAID )、止痛劑、皮質類固醇（例如，潑尼松、氩皮質酮）、TNF抑制 ❹ 劑（包括阿達木單抗（adalimumab ) ( Humira® )、依那西普 (etanercept ) ( Enbrel® )及英利昔單抗（infHximab ) (Remicade®))、抗IL12抗體、免疫抑制劑（諸如6_巯基嘌唾 °示呤（azathioprine )及環孢黴素 a( cyclosporine A ) 及抗生素。牛皮癣牛皮癬為T淋巴細胞介導之發炎性疾病。病變含有τ 淋巴細胞、巨噬細胞及抗原呈遞細胞及一些嗜中性白血球 ® 之浸潤。IL20及其受體以高含量存在於牛皮癬性病變中 (Wei 等人，Clin Immunol (2005) 117: 65-72 ; R0mer 等人，j Invest Dermatol 2003; 121，1306 - 131Π Wang 等人，j Invest Dermatol 2006; 126: 1590-1599; Otkj®r 等人，Br j Dermat〇1 2005; 153: 911-918)。因此，在另一態樣中，本發明提供一種治療及/或預防牛皮癖之方法。该方法包含向患有牛皮癣或鑑別/診斷為實質上處於發展牛皮癬之風險中之人類患者傳遞有效量之抗 83 201022288 hIL20抗體，以致該患者之牛由.愈埋客丨"由々十反癬得到治療或預防。該抗體可單獨使用或與一或多種其他扞止+A,*/ Α 丹他抗牛皮癖治療組合使用，該等治療諸如光照療法、局部療法（例#，焦油、局部糖皮質激素）《全身療法（例如，f胺嗓呤、合成類視色素、環抱黴素）、抗™Fa藥劑（例如，⑧、Humira⑧、 R_Ca_)、T細聦抑制劑㈣如，R_va· 〇類似物、p38 有絲分裂；5、、工y ρ π τ刀褽原活化之蛋白激酶（p38 nxitogen-activated pr州in kinase，ΜΑρκ )抑制劑以及生物

藥劑（諸如Rituxan® )。牛皮癬性關節炎牛皮癖性關節炎為影響皮膚、關節、腱、勒帶及筋膜之插入部位之慢性發炎性關節炎病狀，且通常與牛皮癬相關。（約7%之牛皮癬患者發展牛皮癖性關節炎）。报多證據表明T細胞介導之過程推動牛皮癬性關節炎之病理生理子單核細胞亦在牛皮癖性關節炎申起作用且負責基質金

屬蛋白酶之產纟’此可能介導牛皮癖性關節炎患者之關節的破壞性變化。因此，在另一態樣中，本發明提供一種治療及/或預防 ,皮癬陡關節炎之方法。該方法包含向患有牛皮癬性關節炎或鐘別/診斷為實質上處於發展牛皮癖性關節炎之風險中類患者傳遞有效量之抗hIL2〇抗體，以致該患者之牛皮癬f關節炎得到治療或預防。該抗體可單獨使用或與一或夕種V、他抗牛皮癬性關節炎治療組合使用，該等治療諸如非類固醇消炎藥（阿司匹林（aspirin)、布洛芬（ibuprofen))' 84 201022288 Λ 甲胺喋呤、合成類視色素、環孢黴素、皮質類固醇、抗TNF α 藥劑（例如，Embrel®、Humira®、Remicade®)。全身性紅斑狼瘡在全身性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus， SLE )中’疾病之中心介體為自身蛋白質/組織之自體活性抗體之產生及隨後免疫介導性炎症之產生。抗體直接或間接介導組織損傷》雖然尚未顯示T淋巴細胞直接與組織損傷有關，但T淋巴細胞為自體活性抗體之發展所需。因此， ® 該疾病之成因依賴於T淋巴細胞。在臨床上多個器官及系統受到影響，包括腎、肺、肌肉骨骼系統、黏膜皮膚、眼睛、中樞神經系統、心血管系統、胃腸道、骨髓及血液。因此，在另一態樣中，本發明提供一種治療及/或預防 SLE之方法。該方法包含向患有SLE或鑑別/診斷為實質上處於發展SLE之風險中之人類患者傳遞有效量之抗UL2〇抗體，以致该患者之SLE得到治療或預防。該抗體可單獨使用或與其他抗SLE藥劑組合使用，該等藥劑諸如非類固 ® 醇消炎藥（NS AID )、止痛劑、皮質類固醇（例如，潑尼松、氫皮質酮）、免疫抑制劑（諸如環磷醯胺 (cyclophosphamide )、硫唑嘌呤及甲胺喋呤）、抗癔疾藥（諸如羥氣喹（hydroxychloroquine))及抑制心〇1^抗體產生之生物藥物（例如LIP 3 94 )。糖尿病 I型糖尿病或胰島素依賴性糖尿病為胰島B細胞之自體免疫破壞；此破壞由自體抗體及自體活性T細胞介導。騰 85 201022288 島素之抗體或胰島素受體亦可產生胰島素無反應性之表型。因此’在另一態樣中，在足以治療或預防罹患I型糖尿病或實質上處於發展I型糖尿病之風險中之患者之病狀的條件下向該患者傳遞足以治療或預防該患者病狀之量的抗 IL· 20抗體1該抗體可單獨使用或與其他抗糖尿病藥劑組合使用，該等藥劑諸如胰島素、或沒細胞生長或存活因子、或免疫調節抗體（諸如抗CD3抗體）。移植 © 包括移植排斥及移植物抗宿主疾病（Graft-Versus-Hcm-Disease’GVHD)之移植相關疾病依賴於τ淋巴細胞；抑制T淋巴細胞功能為改善性的。因此，在另一態樣中，本發明提供降低移植排斥之可能性（或降低移植排斥相關病狀之嚴重程度或延長其發作時間，亦即延長同種異體移植存活期）之方法。該方法包含向將要為、為或近來為組織/器官移植之接受者之人類患者傳遞有效量之抗hIL20抗體，以致可偵測地降低排斥之可 © 能性（例如，與對照組相比）。可治療之組織移植之實例包括（但不限於）肝、肺、腎、心臟、小腸及姨島細胞，以及在骨髓移植及治療移植物抗宿主疾病（GVHD )中。該抗體可單獨使用或與其他抑制移植排斥之藥劑組合使用，該等藥劑諸如免疫抑制劑（例如環孢黴素、硫唑嘌呤 '曱潑尼龍（methylprednisolone)、潑尼龍（prednis〇i〇ne)、潑尼权 '黴酚酸嗎啉乙酯（myC〇phen〇late m〇fetil )、西羅莫司 86 201022288 Λ. (sirolimus )、雷帕黴素（rapamycin )、他克莫司 (tacrolimus ))、抗感染劑（例如，阿昔洛韋（acyclovir )、克黴°坐（clotrimazole )、更昔洛韋（ganciclovir )、制黴菌素 (nystatin )、甲氧苄啶磺胺甲基異噁唾 (trimethoprimsulfamethoxazole)) ' 利尿劑（例如，布美他尼（bumetanide )、呋喃苯胺酸（furoseinide )、美托拉宗 (metolazone))及潰瘍藥物（例如，曱腈咪胍（ciinetidine)、法莫替丁（ famotidine )、蘭索拉唑（iansopraz〇le )、奥美拉 © 唑（〇mePraz〇le )、雷尼替丁（ ranitidine )、硫糖鋁 (sucralfate))。對於造血移植而言，造血生長因子（例如，紅血球生成素（erythrop〇ietin )、g-CSF、GM-CSF、IL3、 IL11、血小板生成素（thr〇mb〇p〇ietin)等）或抗微生物劑 (例如，抗生素、抗病毒劑、抗真菌劑）可作為輔助療法投予0 具他自體免疫或發炎性疾病 ^ 在其他獨立態樣中，本發明提供治療或預防其他自體免疫或發炎性疾病或病症之方法， -X. . 匕3向患有疾病或病症或鑑別/診斷為實質上處於之人類串者值、涛女u 或病症之風險中 I、者傳遞有效量之抗hIL20抗體，以致 :或病；到治療或預防’其中該疾病或病症為如下= 之—。该抗體可單獨使用或與一所迖症之其他治療劑組合使用。/豸用於治療疾病或病青少年慢性關節炎為慢性特發性年齡通常小於16歲。其表型與 f疾病，其發病、具有一些相似性；一些 87 201022288

型。關節态"5Γ 類風濕性關節炎。該型、多關節型及全身臾可為嚴重的且典型地具破壞性並導致關節僵直及生長阻滞。其他表現可包括慢性前葡萄膜炎及系統性澱粉樣變性病。脊椎勝節病為t類具有—些常見臨床特徵且通常與 HLA B27基因產物之表現相關之病n等病症包括:強直陳脊椎炎、萊特爾氏症候群（Reiter's syndrome )(活性關節炎）與發炎性腸病相關之關節炎、與牛皮癖相關之脊❹ 椎炎、青少年發病型脊椎關節病及未分化性脊椎關節病。區别特徵包括艇黯:關節炎併發或未併發脊椎炎；發炎性不對稱關節炎；與HLA·B27(I型 MHCi hla_b基因座之血清學定義的對偶基因）相關；眼睛炎症及不存在與其他類風濕病相關之自體抗體。最指示為誘發疾病之關鍵之細胞為CD8 + T淋巴細胞，其為靶向由j型MHC分子呈遞之抗原的細胞。CD8+ T細胞可如同其為由I型MHC分子表現之外來肽一般針對I型MHC對偶基因HLA B27起反應。已假設〇 HLA-B27之抗原決定基可模擬細菌或其他微生物抗原性抗原決定基且因此誘發CD8+T細胞反應。系統性硬化症（硬皮病）具有未知病因。該疾病之特點為皮膚硬化；此可能由活性發炎過程誘發。硬皮病可為侷限性或全身性的；常見為血管病變且微血管系統之内皮細胞損傷為發展系統性硬化症之早期且重大事件；血管損傷可為免疫介導性的》免疫學基礎暗含皮膚病變中存在單 88 201022288 核、’’胞/閏且許多患者體内存在抗核抗體。ICam_ 1通常在皮膚病變中之纖維母細胞之細胞表面上不受調控，此表明Τ 細胞與此等細胞之相互作肖可在疾病之發病機制中起作用其他有關之器官包括：胃腸道：平滑肌萎縮及纖維化，導致蠕動/活動性異常；腎：腎皮層血流量減少之影響小弓狀動脈及小葉間動脈之同心内皮下内膜增生，導致蛋白尿、氮血及高血壓；骨骼肌：萎縮、間質性纖維化；炎症；肺：間質性肺炎及間質性纖維化；及心臟：收縮帶壞死、 ® 瘢痕/纖維化。 L括皮肌炎'多發性肌炎及其他肌病之特發性發炎性肌病為病因不明之慢性肌肉發炎之病症，其會導致肌肉虛弱。肌肉損傷/發炎通常為對稱且進行性的。自體抗體與大邛刀形式相關。此等肌炎特異性自體抗體針對與蛋白質合成有關之組份、蛋白質及RNA的功能且抑制該功能。休格連氏症候群歸因於免疫介導性發炎及隨後淚腺及唾液腺之功忐破壞。該疾病可能與發炎性結締組織疾病相關或伴有該等疾病。該疾病與針對Ro及La抗原之自體抗體產生相關’該兩種抗原皆為小RNA_蛋白質複合物。病變會導致乾燥性角膜結膜炎、口腔乾燥，其他表現或相關包括膽汁性肝硬化、周邊或感覺神經病及可觸知紫癜。全身性血官炎為如下疾病：原發性病變為發炎且隨後損傷血管，此導致由受影響血管供應之組織缺血/壞死/惡化且在一些情況下為最終末端器官功能異常。血管炎亦可以 /、他免疫發炎性介導之疾病（諸如類風濕性關節炎、系統 89 201022288 性硬化症等）的繼發性病變或續發症形式存在，尤其在亦、與免疫複合物之形成相關之疾病中。原發性全身性血管炎組中之疾病包括：全身性壞死性脈管炎：結節性多動脈炎' 過敏〖生血s炎及肉芽腫病、多丘管炎；韋格納氏肉牙腫病；淋巴瘤樣肉芽腫病；及巨細胞性動脈炎。其他血管炎包括：處廣黏膜淋. '心給、症，候群取ph...:..⑽如 syndrome ’ Μ随$ 或州崎氏病（Kawasaki,s disease))、獨立性CNS血管炎、貝氏病（Behet's disease)、閉塞性血栓血管炎（伯格氏病（Buerger’s disease ))及皮膚壞死性靜脈炎。❹ 咸所列血管炎之大部分類型之發病機制主要歸因於免疫球蛋白複合物沈積於血管壁中且隨後經由ADCC、補體活化或者兩者誘發發炎性反應。肉狀瘤病為病因不明之病狀，其特徵為體内幾乎任何組織中均存在上皮樣肉芽腫；最通常與肺有關。發病機制涉及疾病部位處之活化巨噬細胞及淋巴樣細胞之持久性，隨後由釋放由此等細胞類型釋放之局部及全身㈣性產物導致慢性續發症。 ❹ 包括自體免疫溶血性貧血、免疫性全部血球減少症及陣發性睡眠性血紅素尿之自體免疫溶血性貧血為產生與表現於紅血球（及在一些情況下亦為包括血小板之其他血細胞）之表面上之抗原反應的抗體之結果且為經由補體介之溶解及/或ADCC/Fc-受體介導之機制除去彼等抗體包被細胞的反映。在包括血小板減少性紫癜及免疫介導性血小板減少症 90 201022288 (在/、他6>σ床環境！|ϊ )之自體免疫血小板減少症中，金小板破壞/除去由於抗體或補體附著於血小板及隨後藉由補體溶解、ADCC或者fc受體介導之機制除去而發生。

包括格雷氏病、橋本氏甲狀腺炎、青少年淋巴細胞性甲狀腺炎及萎縮性甲狀腺炎之甲狀腺炎為針對甲狀腺抗原產生自身免疫反應，從而產生與P狀腺中存在且通常對於甲狀腺具特異性之蛋白f反應的抗體之結果。存在包括以下之實驗性模型··自發性模里：大鼠（BUF及bb大鼠）及雞（肥胖雞品系）；誘導性模型：以甲狀腺球蛋白、甲狀腺微粒體抗原（甲狀腺過氧化酶）使動物免疫。包括絲球體腎炎及小管間質腎炎之免疫介導性腎病為直接由於產生針對腎抗原之自體活性抗體& 了細胞或間接由於針對其他料抗原具活性之抗體及/或免疫複合物沈積於腎中而對腎組織產生抗體《τ淋巴細胞介導之損傷之結果。因此’其他導致形成免疫複合物之免疫介導性疾病亦可誘發作為間接續發症之免疫介導性腎病。直接與間接免疫機制皆導致產生/誘發腎組織中之病變發展、從而引起器官功能損傷及在一些情況下進展為腎衰竭的發炎性反應。體液與細胞免疫機制皆可能與病變之發病機制有關。包括嗜酸性球性肺炎、特發性肺纖維化及過敏性肺炎 :發=:纖：變性肺病可能與失調之免疫發炎性反應有關。该反應之抑制將具有治療益處。炎之自體免因依賴於Τ 包括大皰性皮膚病、多形紅斑及接觸性疫或免疫介導性皮膚以自體抗體介導，其 91 201022288 淋巴細胞》包括哮喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎'食物過敏症及蓴麻疹之過敏性疾病依賴於τ淋巴細胞。此等疾病主要由τ淋巴細胞誘發之炎症、IgE介導之炎症或其級合介導。應瞭解，有效量之IL2〇抗體以及總給藥方案可根據疾癆應惠者之臨床情澉雨改勢，其又可反映在—或多種臨床參軚（諸如臨床上接受之疾病計分）中。舉例而言，對於類風濃性關節炎而t u之嚴重程度及/或治療結果可藉由監測艘脹關節之數目、疼痛、活動性及/或官方疾病計分 ACR 20/50或70來評估。不》古對於1型糖尿病而言，疾病之嚴重程度及/或治療結果可藉由量測血糖含量或其變化形式、

HblC含量、所需胰島素之量及其類似情況來評估。對於多發陡硬化症而吕，大腦炎症可經由掃描大腦來評估。對於造血移植排斥而言，疾病之嚴重程度（無法移植）及/或治療結果可藉由用證據證明已經受骨髓清除性調節之患者之長期嘻中H白A球減少症、血小板減少症及紅血球輸注依 ❹ 賴性及藉由無法觀察到已經受非骨髓清除性調節之患者體内之後合狀態來評估。一般而言，對使用本發明之方法及組成物之治療結果的可摘測作用包括對其他治療之需要減少（包括例如其他藥物或治療之量及/或持續時間減少）、住 =次數及/或持續時間減少、由生病引起之工作損失天數 ~ k情況ϋ應瞭解’有效量可由一般熟習 1 匕項技術者根據常規實驗、藉由構建值矩陣及測試該矩陣中之不同點來判定。 92 201022288 劑量參對於投予抗體而言，劑量範圍為約0 0001爪““至1〇〇 mg/kg且更通常0.01 mg/kg至5 mg/kg宿主體重。舉例而言’劑量可為約0.3 mg/kg體重、約！ mg/kg體重、約3 mg/kg 體重、約5 mg/kg體重或約10 ^/“體重或在l l〇 mg/kg 之範圍内。例示性治療方案需要每週投藥再次、每週投藥一次、每2週投藥一次、每3週投藥一次、每4週投藥一次、一月投藥一次、每3個月投藥—次或每3至6個月投藥一次。本發明之抗hIL20抗體的例示性給藥靜脈内投藥或皮下注射投予一g、3mg/^^^^ 體重，其中使用以下給藥時程之一來給與抗體：（〇每i 3 週給與負荷劑量歷時2-4個劑量，接著每2個月；（π)每4 週；（iii)每週’或任何其他最佳給藥。在一些方法中，同時投予具有不同結合特異性之兩種或兩種以上單株抗體，在該情況下所投予之各抗體之劑量在指定範圍内。通常分多次投予抗體。單次劑量之間的時間間隔每月、…月或每年。時間間隔亦可如藉：量:::體内目標抗原之抗體的血液含量所指示而無規律。在一些方法中，調整劑量以達成約且在一些方法；約 ⑸0(^g/ml之㈣抗體漢度。抗體可或者以持續釋放調配物形式投予’在該情況下需要較小投藥頻率。劑量及頻率視抗體在患者體内之半衰期而變化。—山 _ 取叫έ，人類抗體』不最長半衰期，隨後為人類化抗體、嵌合抗體及非人類抗體。投藥之劑量及頻率可視治療為預防性治療抑或治 93 201022288 療性治療而變化。在預防性應用巾，經很長—段時間以相對較長時間間隔投予相對低劑量。—些患者在其餘生中持續接受：療。在治療性應用巾，有時需要相對短時間間隔之相對间劑量直至減緩或終止疾病之進展，且較佳地直至患者顯示部分或完全改善疾病症狀。此後，可向患者預膝性求案。如—般熟習此項技術者應瞭解，抗癌劑之適當劑量將接近其中該等抗癌劑單獨投予或與其他藥劑組合投予之臨

床療法中已使用之彼等劑量。視所治療之病狀而定，將可能出現劑量之變化。投予治療之醫師將能夠判定用於個別個體之適當劑量。製品在本發明之另-具體實财，提供—種含有適用於療如上所述之病症之物質的製品。舉

含一含有如本文中所述之人類或人類化抗hIL2G=; 益以及指導使用者用有效量之該抗體治療人類之諸如自免疫或發炎性疾病或病症之病症的說明書。製品典型地含一容器及—位於該容器上或與該容器結合之標籤或包插頁。合適之容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等“亥容器可㈣如玻璃或塑膠之各種材料形成。容器容納有治療病狀之組成物且可具有無菌進入孔（例如，容器可靜脈注射溶液袋或具右可由由h 衣：¾具有J由皮下主射針刺穿之塞子的瓶）。該組成物中之至少一種活性劑為本文中之人類或人化抗hIL20抗體，或包含該抗體之抗原結合片段或抗體衍 94 201022288 Λ 物（例如，免疫結合物）。該標籤或包裝插頁指示組成物 ; '/α燎所選之病狀，諸如類風濕性關節炎、青少年類風濕關節炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、強直性脊椎炎、休格連氏症候群、多發性硬化症、發炎性腸病、全身性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎或其組合。外製σο可包含（a) —其中含有組成物之第一容器，其中該組成物包含本文中之人類或人類化抗體；及（b) 一其中3有組成物之第二容器，其中該組成物包含除人類或人類化抗體外之治療劑。在本發明之此具體實例中，製品可進一步包含一指示第一及第二組成物可組合用於治療自 2免疫或發炎性疾病或病症之包裝插頁。該等治療劑可為刖述早郎中所述之任何辅助療法。其他或另外，製品可進一步包含一包含醫藥學上可接受之緩衝液之第二（或第三）容器’該緩衝液諸如抑菌注射用水（—如〇_沁她r f〇r injection，BWFI)、璘酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液 (Ringer，SS〇luti〇n)及右旋糖溶液。其可進一步包括自市售及使用者觀點來看所需之其他物質，包括其他緩衝液、稀釋劑、過遽器、針及注射器。實施例本發明之其他細節藉由以下非限制性實施例來說明。實施例1 :藉由人類抗hIL20抗趙抑制江20誘發之增殖執行-系列測試以研究人類抗抓2〇單株抗體中和經 IL20R1 + hIL20R2(本文中稱為「机肅」）轉染之祕3 95 201022288 細胞的hIL20誘發之增殖效應的能力。材料與方法超#羞及.锾衝液。培養基：具有Glutamax、1 〇%熱滅活胎牛血清（foetal bovine serum，FBS)、1%青黴素/鏈黴素 (P/S) ( BioWhitaker 目錄號 DE17-602E)、1 mg/ml 遺傳黴素（Gene挝cin ) ( GIBCO 目錄號 10131-019 )、200 e g/ttil 博莱黴素（'Ze-ocin) (Invitro.gen 45-.0.430).:.' .1 n.g./-ml 鼠類.IL-3 (TriChem ApS 目錄號 213-13)、50/z Μ 2-酼基-乙醇（Gibco 目錄號 31350-01.0 )之 Roswell Park Memorial Institute ® (RPMI 1640 )。檢定培養基：具有Glutamax、10%熱滅活 FBS、1% P/S ( BioWhitaker 目錄號 DE17-602E) ' 1 mg/ml 遺傳黴素（GIBCO目錄號10131-019)、200 /z g/ml博萊黴素 (Invitrogen 45-0430 )、50/z Μ 2-酼基-乙醇（Gibco 目錄號 31350-010 )之 RPMI 1640。使用 AlamarBlue 染料 (BioScource，DalllOO )評估增殖。在光譜螢光計（bmg POLARstar+Galaxy)上於激發波長555-12 nm及發射波長 590 nm下量測螢光強度。 ◎ 成禮、細應及細龙激爹。藉由皮下注射於FCA中之20 "g人類IL-20、隨後注射2次於FIA中之20 " g hIL20來使小鼠免疫。用25 y g hIL20經靜脈内使高反應者小鼠加強反應且3天後收集脾。使脾細胞與骨髓瘤細胞系融合 (Kohler, G 及 Milstein C. (1976), European J. Immunology， 6:5U-19)。在間接hIL20特異性ELISA中針對人類IL 2〇抗體產生篩選上清液且加以純化。藉由用5〇以g 以 96 201022288 14天時間間隔使兔子免疫4次且用1〇以g/ml hIL2〇以每月一次使兔子免疫5次來產生兔子抗hIL2〇多株抗體 (polyclonal antibody，pAb )。純化企清（2313B )。BaF-3 (hIL20R)細胞來自經 hIL20Rl( Zcytor7 )及 hIL20R2( Dirsl ) 之基因及在k號轉導及轉錄蛋白（signal transducti〇n and transcription protein，STAT )-啟動子元件之控制下帶有螢光素酶之質粒KZ134轉染的BaF_3細胞系。藉由在嘌呤黴素（pur〇myCin)(ZCyt〇r7)及博萊黴素（Dirsl)中選擇來 ❿ 產生BaF-3細胞系且來源於Zymogenetics Institute。 W浚翁定。進行初始刺激檢定以評估欲用於抑制檢定之hIL20含量。在檢定培養基中充分洗滌BaF-3 ( hIL20R) 細胞以除去殘餘IL-3。接著將該等細胞以ι〇4·5Χι〇4個細胞 /孔接種至96孔微量滴定板（平坦孔檢視板，Packard，目錄號S00190 )中。將hIL20之連續稀釋液（1〇_7 μ至ίο·1〗 Μ )添加至該等孔中且有細胞但無hIL20之其他孔充當陰性對照組。將細胞於5% C〇2、37。(：下培養3天。對於培養期 ❿ 之最後6小時’將10 μ 1 alamarBlue添加至各孔中。在光譜螢光計（bmg POLARstar+ Galaxy )上於激發波長555-12 nm及發射波長590 nm下分析細胞之螢光強度。對於抑制分析而言，使用恒·定濃度之IL20刺激細胞。根據在增殖& 定中最大刺激之約90%選擇此濃度，該濃度在大部分檢定中對應於1 〇_9 M hIL20。撿定。將lxl〇4-5xl04個細胞/孔之經洗滌BaF-3 (hIL20R)細胞添加至微量滴定孔之檢定培養基中且將1〇-9 97 201022288 · M h IL 2 0 (最終濃度）添加至各孔中，除了用作陰性對啤組之僅含有細胞的孔外。此濃度對應於使用hIL20細胞激素達成之最大刺激的約90%。將抗體之連續稀釋液（亦即，丨〇〇 /zg及2倍稀釋液）添加至該等已含有細胞及細胞激素之孔 (除了僅含有細胞+hIL20之用於陽性對照組之孔外）中。將紐胞 '細胞激素及槐體之混合物於5% CXh、371下以100 微升/孔培育72小時《培育之最後6小時包括1〇微升/孔 alamarBlue。在光譜螢光計（bmg P〇LARstar+ Galaxy)上於激發波長555-12 nm及發射波長590 nm下分析該等板之 ❹ 螢光強度。緣製曲線且使用Prism 4 ( GraphPad PRISM軟體公司）計算效能（半最大抑制（IC5〇 ))。功效計算為1-(抗體之最大抑制/(細胞激素之初始刺激-細胞激素之無刺激）） X1 0 0 % 0 結果自劑量反應曲線選擇於10·9 M hIL20下之BaF-3 (hIL20R )之初始刺激。一系列抑制檢定之結果展示於表1 中。效能（IC50)在不同抑制抗體之間不同。15D2為最有 Θ 效抑制劑之一且具有最小檢定間變化。與多株兔子抗hIL20 抗體製劑相比，1 5D2亦具有高親和力。 98 201022288 表1 -hIL20誘發之增殖的抑制於le-9M hIL20下IL20誘發之增殖的抑制，IC50( #Μ) 抗 IL20 1 2 3 4 5 6 7 2F6 15.4 13.88 1.67 0.36 1.8 0.32 15.38 F56(LC: 1 型 F56;HC:F56) 0.04 0.73 F18(LC: 1 型 F56;HC:F18) 0.05 C3 - - - - 5B7 0.26 4.54 0.76 0.2 15D2 0.18 0.42 0.34 0.12 0.4358 Cll 0.26 2.0 0.37 0.1860 F18 (來自融合瘤） 0.12 0.09 F56 (來自融合瘤） 4.97 41A6 5.36 3.12 1.32 3.118 41F10 5 4.7 2.55 42A5 54F10 24 0.66 0.21 2.560 4.971

實施例2 : IL20、IL19或IL24誘發之增殖的比較抑制測試人類抗體15D2中和獼猴IL20及小鼠IL20之能 φ 力。小鼠與獼猴IL20皆能夠誘發BaF-3 ( hIL20R)細胞之增殖。亦關於由hIL19或hIL24誘發之BaF-3 ( hIL20R)增殖的抑制測試 15D2°hIL24與hIL19皆結合hIL20Rl + ML20R2 受體。材料與方法培#差i .缓衡放。參見實施例1。衣:禮、細應及細應激#。參見實施例1。在大腸桿菌中產生人類及獼猴 IL20。小鼠 IL20 來自 BioSource International 公司。人類 IL19 及 IL24 來自 R&D system。 99 201022288 « 檢定。使用與實施例1中所述相同之初始刺激檢、定進行初始刺激檢定以評估欲用於抑制檢定之hiL2〇'獼猴 IL20及小鼠IL2〇之初始濃度。藉由相同方法評估使用及UL24進行之初始刺激。決定在抑制檢定中使用3種不同初始濃度之IL19及hIL24。 #叙檢參。（1 )抗hIL2〇 mAb對獼猴IL2<)及小鼠iL2〇誘發夂增殖的作用：將1x104_5x1〇4個細胞/孔之經洗滌 BaF-3 ( hll^OR)細胞添加至微量滴定孔冬檢定培養基中且將10 9M hIL20、獼猴IL20或小鼠IL2〇 (最終濃度）添加❹ 至各孔中，除了用作陰性對照組之僅含有細胞的孔外。此濃度對應於使用細胞激素達成之最大刺激的約9〇%。將抗體1400-250-15D2之連續稀釋液（1〇〇 yg及2倍稀釋液）添加至s亥等已含有細胞及細胞激素之孔（除了用於陽性對照組之僅含有細胞+細胞激素之孔外）中。 (2 )抗hIL20 mAb對hIL19及hIL24誘發之增殖的作用：將lxl04-5xl〇4個細胞/孔之經洗滌BaF-3 ( hIL20R)細胞添加至微量滴定孔之檢定培養基中且將3種不同細胞激 ❹ 素濃度（ΙΟ·8 Μ、1〇-9 μ及1(T1G Μ最終濃度）之hIL20 ' hIL 19或hIL24添加至各孔中，除了用作陰性對照組且僅含有細胞之孔外。此濃度對應於使用細胞激素達成之最大刺激的約90%。將抗體15D2之連續稀釋液（1〇〇β g及2倍稀釋液）添加至該等已含有細胞及細胞激素之孔（除了用於陽性對照組之僅含有細胞+細胞激素之孔外）中。對於兩種檢定而言，將細胞、細胞激素及抗體之混合 100 201022288 物於5% C02、37°C下以100微升/孔培育72小時。培育之最後6小時包括1〇微升/孔alamarBlue。在光譜螢光計（bmg POLARstar+ Galaxy )上於激發波長555-12 nm及發射波長 590 nm下分析該等板之螢光強度。繪製曲線且使用Prism 4 (GraphPad PRISM軟體公司）計算效能（半最大抑制 (IC50))。功效（由抗體達成之抑制百分數）計算為1 -(抗體之最大抑制/(細胞激素之初始刺激-細胞激素之無刺激））x ❿ 100%。結果抗hIL20 mAb對獼猴IL20及小鼠IL20誘發之增殖的作居。當用人類、獼猴或小鼠IL20刺激BaF-3 ( hIL20R)細胞時’該等細胞增殖且此增殖可由抗hIL20 mAb 1 5D2以劑量依賴性方式抑制。對於所有3種細胞激素而言，於66 mM IL20下15D2之功效接近ι〇〇%β因為3種細胞激素對hIL20R 之親和力不同，所以不能直接比較抗體之效能。抗hIL20 mAb對hIL19及hIL24誘發之增殖的作用。兩 3 種不同濃度之 hIL20、hIL19 或 hIL24 刺激 BaF-3( hIL20R) 細胞（圖5 )。針對hIL2〇誘發之增殖的抑制偵測劑量依賴性反應（圖5A)。此實驗充當隨後ML19及hIL24實驗之陽性對照組。當起初用hIL19刺激BaF-3 ( hIL20R)細胞時，不官使用3種初始濃度之hIL19中之何種濃度，15D2均不能抑制增殖（圖5B )。當起初用ML24刺激細胞時，獲得相同結果（圖5C)。 101 201022288 因此，15D2抑制BaF-3 ( hIL20R)細胞之獼猴IL20誘發以及小鼠IL20誘發之增殖，而15D2不抑制BaF-3 (hIL20R)之hIL19或hIL24誘發之增殖。實施例3 :溶解度藉由使用截斷重量為50 kD之Amicon Ultra型離心過濾器（Millipore公司，MA)來比較HEK293細胞中產生且藉由相同過程純化之7種針對IL20之不同人類IgG4抗體以溶液形式達到高濃度之能力。所有樣品均根據製造商說明書離心1小時。抗體之初始漢度在0.5 mg/ml至1.8 mg/ml 之範圍内，且所有抗體均調配於20 mM磷酸鈉、150 mM NaCl ( pH 7.4)中。測試抗體之VH及VL序列分別展示於圖4A及4B中。表2展示使用Amicon Ultra 50 kD離心過渡器濃縮人類抗IL20 IgG4抗體後獲得之濃縮物及回收率。15D2達到最高濃度（高於1〇〇 mg/ml )，其次5B7為高於80mg/ml，其兩者皆亦具有高回收率。如動態光散射分析所見，除了顯示二聚化增加之跡象的2F6，所有抗體均保留其較高濃度之單體結構。表2-人類抗hIL20抗體之溶解度及回收率抗 IL20 濃度（mg/ml) 回收率（％) 2F6 50 80 F56 (HC : F56 ; LC : 1 型 F56) 14 48 F18 (HC : F18 ; LC : 1 型 F56) 31 64 F56/F18 (HC : F56/F18 ; LC : 1 型 F56) 24 42 C3 53 80 5B7 84 79 15D2 109 81 201022288 抗體重鏈及輕鏈可變區之可變區胺基酸及/或核酸序列之分析揭示表3中所示之生殖系序列。亦對另一抗體C 11 (參見實施例1 )進行測序，此揭示具有SEQ ID N025之序列之HC及與1型F56相同之VL。表3-人類抗IL20抗體之VL、VH及生殖系序列輕鏈生殖系 2F6 (SEQIDNO:19) VKI_L24/JK4 C3 (SEQIDNO:21) VKIII_L6/JK2 1 型 F56、15D2 及 5B7 (SEQ ID NO:9) VKI_L18/JK4 F56type2 ( SEQ ID NO:24 ) VKIII_A27/JK1 重鏈 2F6 (SEQ ID NO: 18) VH2_05/D3」0/JH4 C3 (SEQIDNO:20) VH4_39/D_/JH6 FI 8 (SEQIDNO:22) VH1_03/D_/JH4 F56 及 F56/F18 ( SEQ ID NO:23 ) VH1_03/D_/JH4 5B7 (SEQIDNO:7) VH1一03/D3_10/JH6 15D2 (SEQIDNO:6) VH1_03/D3_10/JH6 © 實施例4:抗體與hIL20之結合在BiacoreTlOO上執行表面電衆共振（Surface Plasmon Resonance，SPR)實驗，以判定個別人類抗hIL20抗體是否能夠同時結合於重組hIL20。為了作比較，包括稱為 262.4.1.2.2.1、262.5.1.6.4.4 及 262·7.1.3.2.4 且描述於 W02005/052000 中之 3 種 IL20R1/IL20R2 中和大鼠抗 hIL20 mAb。雖然諸如位阻及構形變化之因素可能有影響，但不能同時結合指示存在共用或重疊抗原決定基。 103 201022288 材料與方法 . 在具有經固定之抗hIL20抗體之CM5晶片上執行實驗。藉由標準胺偶合將各抗體固定於單獨晶片上至、約咖 RU之含量。所有樣品均稀釋於電泳緩衝液HBs_Ep 74 (1〇 mM HEPES、150 mM Naa、3 福耐a 及〇〇〇5% P〇lys〇rbatP20) υ_Μα20(ιο^/ηιΐ^々ΐ8〇 s’ 隨後注射 15M(l〇/zg/ml)歷時 18“。結果人類抗體15D2及5B7不能同時結合於重組hIL2〇，此 ❹ 指示存在共用或重疊抗原決定基。相反，15D2能夠與 262.4.1.2.2.1、262.5.1.6.4.4 或 262.7.1.3.2.4 mAb 中之每— 者同時結合，此指示15D2之抗原決定基不同於 262.4.1.2.2.卜 262.5.1.6.4.4 及 262.7.1.3.2.4 之抗原決定基。實施例5:抗體舆變性hIL20之結合進行本實驗以判定人類抗IL2〇抗體是否亦結合完全變性抗原。若彳貞測不到結合活性，則肽陣列將不適於抗原決定基定位（參見下文）。為了測試與變性抗原之結合，使天 ❹ 然及變性hIL20製劑經受SDS-PAGE，隨後使用15D2及5B7 進行西方墨點法（Western-blot )以用於偵測。材料與方法藉由在含有50 mM DTT之樣品緩衝液（NuPage,

Invitrogen)中沸騰1〇 min使重組hiL20變性。使樣品在 SDS-PAGE (20微升/孔，包括樣品緩衝液）中進行電泳且印至確化纖維素膜上。將該膜與一次mAb ( 10 V g/ml，於 104 201022288 轉印緩衝液（Novex, Invitrogen )中）一起培育，隨後與 HRP結合之兔子抗人類IgG多株Ab ( DAKO ) —起培育。使用TMB-受質（Kem-En-Tech)觀測條帶。結果 1 5D2與5B7皆識別抗原之天然及變性形式，此指示抗原決定基為連續（線性）的。實施例6:肽結合之表面電漿共振分析執行 SPR 實驗以判定抗 hIL20 抗體 15D2、 © 262.4.1.2.2.1、262.5.1.6.4.4 或 262.7.1.3.2.4 是否結合於對應於hIL20之未加工前驅體（SEQ ID NO:2)之殘基42-102、對應於成熟hIL20 ( SEQ ID ΝΟ:1)之殘基18-78的區域。顯示該等抗體識別hIL20之天然與變性形式（關於1 5D2，參見上文）。材料與方法合成5種具有10個殘基之讀框移位（frame shift )之 20mer 肽： ❹ 1 ) IRNGFSEIRGSVQAKDGNID ( SEQ ID ΝΟ:1 之殘基 18-37)； 2) SVQAKDGNIDIRILRRTESL(SEQ ID ΝΟ:1 之殘基 28-47 )； 3) IRILRRTESLQDTKPANRSS (SEQ ID NO.l 之殘基 38-57 )； 4) QDTKPANRSSLLRHLLRLYL ( SEQ ID NO.l 之殘基 48-67 )； 105 201022288 5) LLRHLLRLYLDRVFKNYQTPD ( SEQ ID ΝΟ:1 之殘基 58-78 )。將含有N末端生物素之肽固定（ 500 ru)於塗有抗生蛋白鏈菌素（streptavidin ) ( SA )之晶片上的個別流量槽中°將個別抗體（5 μ g/ml)注射穿過所有流量槽歷時120 s，隨後為180 s解離期6在Biacore3000及BiacoreTlOO儀器上執行實驗。使用 Scrubber2 軟體（BioLogic Software Pty 有限公司）評估結果。結果未偵測到結合於肽之15D2、262.5.1.6.4.4或 262.7.1.3.2.4。大鼠抗 hIL20 mAb 262.4.1.2.2.1 顯示結合於狀4及5’此指示結合於其共有之序列LLRHLLRLY。所有 mAb顯示結合於經固定之生物素標記的完整IL2〇。實施例7. —級肽陣列（「肽步移（peptide waik )」）產生由18merhIL20肽與4個殘基之讀框移位組成之肽陣列且針對螢光標記之抗hIL2〇抗體15D2或5β7進行篩選。材料與方法巍及決定差荦疗之合在陣列合成器（Muhipep Sp〇t, Intavis，Germany )上之纖維素薄片（Aims Scientific, =ern^ny)上基本上使用製造商所提供之方案來合成抗原決定基定位陣列。Fmoc-胺基酸購自N〇vabi〇chem ( Germany ) 且將其溶解於含有〇·3Μ羥基苯并三唑〔Hydr〇benzotriazole，H〇Bt )之 Ν 曱基吡咯啶酮 106 201022288 (N-methylpyrr〇lidinone，NMP )中至 0.3 Μ 之最終濃度。藉由用一異丙基碳化二亞胺（diisopropylcarbodiimide，DIC ) 活化來進行偶合，且藉由於NMP中之20%哌啶來進行Fm〇c 基團之去保護。個別序列由陣列合成器所附之軟體設計。合成後’藉由用含有三異丙基石夕烧（triisopropylsilane，TIPS ) 之95%二氣乙酸（trifluoroacetic acid，TFA )處理該等薄片 60 min來移除保護基。接著用二氣甲烧（dichl〇romethane， DCM )及N-甲基吡咯啶酮（NMP )洗滌且最後用水洗滌。 ⑩ 技禮之禮記。使用加螢光標記之抗體進行篩選。藉由根據製造商之手冊使用NAP5管柱（GE Healthcare )相對於 1 °/〇 NaHC〇3凝膠過遽抗體原料來進行標記。在此之後添加溶解於DMS0中之25莫耳當量5(6)-羧基螢光素N-羥基丁二醯亞胺酯（Sigma，C1609 )。使偶合繼續進行2小時，隨後相對於TRIS洗滌緩衝液（50 mM TRIS( pH = 7.4)、0.15M NaC卜0.1 M ArgHCl、0,05% Tween 20 )進行凝膠過濾以移除未偶合之螢光素。鏔選及分於摩藉由將1〇Α 1抗體添加至30 ml培育緩衝液（0.5% BSA、50 mM TRIS( pH = 7.4)、0.15 M NaCn、〇· 1 MArgHCl、0.05% Tween 20 )中來進行陣列之篩選。將薄片培育1 -2小時’隨後用洗滌緩衝液洗滌5次。接著使用雷射％描器（Typhoon 9410，GE Healthcare )掃描薄片且使用專用陣列軟體ArrayPro分析器（Media Cypernetics，USA) 分析影像播案（.gel格式）。量測螢光強度且將其轉化為數位’輸入 Prism 5 ( GraphPad Software, USA)中以作進一步 107 201022288 磉分析。 · 結果圖6中所示之來自一級肽陣列分析之結果清楚地鑑別出15D2與5B7兩者皆結合位於對應於成熟hIL2〇( ⑴ ΝΟ:1)之殘基73-96、對應於前驅體（SEQ ID N〇:2)之殘基9 7斗20之域中的線性抗原決定基。實施例8:二級肽陣列分析_末端缺失為了縮短抗原決定基之長度且評估何殘基對於抗化2〇抗體15D2及5B7之結合較重要，作出—系列各種截短。亦❹ 包括ala掃描（ala-scan)(第5節）。關於材料與方法，參見實施例7。結果 hIL20 C末端之截短揭示15D2結合自肽4至7逐漸減少（圖7A )。對於N末端截短看到結合活性突然下降更多，其中移除D ( Asp )及H ( His )顯著減少親和力。總體而言，結果顯示最小抗原決定基具有對應於SEQ ID N〇:丨之殘基 78 至 93 之序列 DHYTLRKISSLANSFL。 ◎ 對於5B7而言，截短揭示當自N末端缺失時結合突然減少（圖7B)。當移除D(Asp)時，對於N末端載短看到結合活性下降約50%，且移除H (His)顯著減少親和力至無可偵測之結合。自C末端移除導致親和力下降不太突然直至移除N ( Asn )。總體而言，結果指示最小5B7抗原決定基具有序列DHYTLRKISSLAN(SEQ ID N0:1之殘基

78-90)，但較長抗原決定基 dhytLRKISSLANSFLTIK( SEQ 108 201022288 ID ΝΟ:1之殘基78-96)的確呈現更高親和力。此指示存在一些結構需求，例如α -螺旋依賴性。

Ala掃描之結果清楚地指示，對於15D2而言，SEQ ID ΝΟ:1 之 3 個殘基 H79( His-79)、R83( Arg-83 )及 N90( Asn-90) 對於結合最為關鍵（圖8A )。殘基D78 ( Asp-78 )、S86 (Ser-86)、F92 ( Phe-92)及 L93 ( Leu-93 )亦為靈敏的，但程度較小。殘基H79及N90對於5B7結合亦最為關鍵，而 R83 ( Arg)似乎相當關鍵（圖8B)。〇總之，人類抗hIL20抗體15D2與5B7兩者皆結合圖1 中所示之具有類似長度及特異性之線性抗原決定基（功能）。發現成熟hIL20 ( SEQ ID NO: 1 )之對應於hIL20前驅體（SEQ ID NO:2)中之 H103、R107 及 N114 的殘基 H79、 R83及N90 (粗體及單下劃線）最為關鍵，其中殘基D78、 S86、F92及L93 (粗體及雙下劃線）為中等關鍵。兩種抗體之間的主要不同之處在於與15D2結合相比R83對於5B7 結合的關鍵性略小。 ® 使用同源蛋白IL19之晶體結構揭示15D2/5B7抗原決定基之位置及最關鍵殘基之位置（Chang等人 J Biol Chem 2003; 278: 3 308 )。發現抗原決定基的位置對應於IL19中之螺旋E且hIL20中之最關鍵殘基（SEQ ID ΝΟ:1之H79、 R83及N90)暴露於溶劑中。應注意到hIL20殘基H79在 hIL19中為脯胺酸。實施例 9 : IL20R1/IL20R2 及 IL22R1/IL20R2 受體複合物之IL20活化之中和 109 201022288 本實施例顯示人類抗體15D2能夠中和重組表現之 IL20R1/IL20R2及IL22R1/IL20R2受體複合物之鼠類、獼猴及hIL20活化。材料與方法 /120受邀之選瘇。使人類IL20受體IL22R1(EMBL BC029273 )、IL20R1 ( EMBL AF184971 )及 IL20R2 ( EMBL Α·Υ3 5·:83():5 ) '自.正.常.人.類.表皮角....質細胞 '(No.rmal Huma:n Epidermal Keratinocyte ’ _NHE:K) cDNA 進.行 PCR 擴增且選. 殖至 pcDNA3.1+(博來黴素（zeocin)) ( IL22R1 及 IL20R1 ) 〇及 pcDNA3_l+ (潮黴素（hygro)) ( IL20R2)中。藉由 PCR 分別使用小鼠肝、睾丸及皮膚cDNA作為模板來選殖小鼠 IL20 受體 mIL22Rl ( EMBL AY103454 )、mIL20Rl ( EMBL AK054215 )及 mIL20R2 (EMBL BC107264)。此等 IL20R 序列中之每一者均以全文引用的方式併入本文中。將 mIL22Rl 及 mIL20Rl PCR-產物選殖至 pcDNA3.1+ (博來黴素）且將mIL20R2選殖至pcDNA3.1+ (潮黴素）中。藉由 PCR使用獼猴皮膚cDNA來選殖獼猴IL20受體cynoIL22Rl ❹ (SEQ ID NO:28 ) ' cynoIL20Rl ( SEQ ID NO:26 )及 cynoIL20R2( SEQ ID NO:27)。將 cynoIL20Rl 及 cynoIL22Rl 受體插入pcDNA3.1+ (博來黴素）中且將cynoIL20R2插入 pcDNA3.1+ (新黴素）中。使用以下5'及3’引子進行編碼cDNA之PCR擴增。人類 IL22R1 : agaattccaccatgaggacgctgctgacca and gctcgagacagggaggaagcaccaag ( SEQ ID NO:29 及 30) 110 201022288 人類 IL20R1 : cgaattcccttggtttctggggaag and gctcgagcacaggaaacaaaaggcaaa ( SEQ ID NO:3 1 及 32) 人類 IL20R2 : agaattctggaaagaaacaatgttctaggtcaa and gctcgagcttcacctgggcccttcc ( SEQ ID NO:33 及 34)

鼠類 IL22R1 · ccgaattcgccaccatgaagacactactgaccatc and cttgcggccgctcaggattcccactgcacagtc ( SEQ ID NO:35 及 36) 鼠類 IL20R1 : ttgaattcgccaccatgcacactcccggga and ttgcggccgcctagctttccatttgtacatgtaacc ( SEQ ID NO:37 及 38) 鼠類 IL20R2 : ttggatccgccaccatgatttcccagggagtctg and ttgcggccgctcaagtctgtgagatccagac ( SEQ ID NO:39 及 30) 獼猴 IL22R1 : agaattccaccatgaggacgctgctgacca and gctcgagacagggaggaagcaccaag ( SEQ ID NO:41 及 42) 獼猴 IL20R1 : gtgggactgagcagtctgctg and aggcaaaaggaagtgttggca ( SEQ ID NO:43 及 44) 獼猴 IL20R2 : agaattctggaaagaaacaatgttctaggtcaa and gctcgagcttcacctgggcccttcc ( SEQ ID NO:45 及 46) STAT-報導子KZ136為含有STAT-元件及血清反應元件 (Serum Response Element，SRE )之螢光素酶報導子 (Poulsen-LK 等人 J Biol Chem 1998; 273:6228-6232 )。在瞬時轉染時之螢光素酶檢定。第Q天··將BUK細胞接種於T80燒瓶中至40%之匯合。第1天：根據製造商手冊使用 36 微升 FuGene ( Roche Applied Science )、2.5 微克受體鏈 1 ( IL20R1 或 IL22R1 )及 2.5 微克鏈 2 ( IL20R2) 及2.5微克螢光素酶報導子（KZ136)轉染7.5微克DNA。 111 201022288 第2天：使用Versene使細胞脫離且將每孔20,000個細胞接種於黑色檢視板中。細胞已再附著孔表面後，用無血清培養基交換培養基。第3天：將20微升10 mM IL20或20 微升無血清培養基添加至孔中。4小時後，測定螢光素酶活性；移除培養基且將100微升lxPBS添加至各孔中，隨後添加100微升Luclite受質(PerkiffiEimer ) β將該极培育30 分鐘 ^ 藉.由 Top..co:un:t，NXT (..:Perk.i.nElmer) ' 镇測發光。此處所用之IL20為大腸捍菌中所產生之重組產生之hIL20、購自 Biosource 之鼠類 IL20 ( #_PMC0201 )或藉由在 HEK293 6E細胞中瞬時表現所產生且經純化之獼猴IL20。結果歲癀/L20之尹和。選殖鼠類IL20受體且在BHK細胞中進行瞬時螢光素酶報導子檢定。用1 nM鼠類IL20刺激兩種人類受體複合物與兩種鼠類受體複合物。鼠類IL20可活化人類與鼠類IL20R1/IL20R2及IL22R1/IL20R2受體複合物。對一種受體複合物測試藉由1 5D2進行之中和。將鼠類IL20R2/IL22R1複合物與STAT3報導子構築體一起轉染至BHK細胞中。用1 nM鼠類IL20刺激受體複合物且使其暴露於1、1〇及50微克/毫升劑量之15D2抗體中（圖9)。最低劑量1微克/毫升幾乎完全中和效應。瓣猶/120之户和。使用基於人類序列之寡核苷酸引子自獼猴皮膚組織cDNA來選殖獼猴IL20受體序列IL20R1、 IL20R2及IL22R1。獼猴與人類受體序列之間的各別序列一致性對於IL20R1為96.8%，對於IL20R2為98.9%，且對於 201022288 IL22R1為95.5%。用兩種受體複合物IL20R1/IL20R2或 IL22R1/IL20R2以及KZ136 ( STAT3螢光素酶報導子）質粒轉染BHK細胞。使用1 nM cynoIL20誘發獼猴IL20R2/ IL22R1複合物3-4倍。刺激來自獼猴之IL20R1/IL20R2複合物約2倍。增加15D2之量使得IL20活性降低，此顯示 15D2可中和獼猴IL20 (圖10)。之户和。自正常人類表皮角質細胞（NHEK)cDNA 選殖人類IL20受體IL20IU、IL20R2及IL22R1。將編碼IL20 © 受體之表現質體與螢光素酶報導子載體KZ136 —起瞬時轉染至BHK細胞中。使用1 nM hIL20進行刺激且看到約3倍之誘發。增加15D2抗體之量使得IL2〇活性降低（圖11 )。實施例10: hIL20誘發之增殖之抑制本實施例評估15D2及大鼠抗hIL20 mAb對表現 IL20R1及IL20R2 (本文中稱為「hIL2〇R」）之BaF_3細胞的IL20誘發之增殖之抑制效應，及丨5d2所結合之IL20的形式。 ❹ #料舆方法

3個獨立實驗（「148」、「149」及「15〇」）比較4種測試抗體之EC50值。第一，將抗體以3倍連續稀釋液形式以 50微升/孔添加至培養基中。同時，將1〇 " i hIL2〇添加至每孔中且最後添加40 // 1細胞懸浮液。將抗體稀釋為3倍連續稀釋液（100+200 )，其中檢定中之第一稀釋液為2〇" g/ml。將hIL20製劑稀釋至1〇·7 M，在檢定中稀釋至1〇-8 M。作為對照組，作出以下刺激曲線：將hIL2〇稀釋至1〇-6 M 113 201022288 且由此形成10倍稀釋液列。檢定中之第一稀釋液為丨〇-7 Μβ 將重組表現人類IL20R1/IL20R2之BaF-3細胞離心，再懸浮於無IL3之培養基中且進行計數。接著以無IL3之培養基將其洗滌兩次且以1 04個細胞/孔之濃度及40〆1添加至 96孔平底檢視板中。細胞之稀釋液：1 〇4個細胞/4〇微升， 2.5x 10個細胞/1 〇毫升（.足夠用於2個.板在.C02恒溫·箱· (5%C〇2’ 37°C )中將板培育 3 天。添加 AlamarBlue 10 从 l/w，且培育6小時後，在p〇larstar螢光計上於激發波長55〇12 nm及發射波長590 nm下量測各板。為了研究1 5D2是結合IL20之可溶性形式抑或il2〇之受體結合形式’設計實驗安排，其中以3倍連續稀釋液形式添加15D2。同時’將10" i hIL2〇添加至孔中且隨後添加 40 " 1 BaF3 ( hIL20R = hIL20Rl 及 hIL20R2 )細胞懸浮液。最後’同時（t = 〇)或1分鐘後（t=丨）添加hIL19。結果自測s式隨所示hIL20之濃度而變之增殖的初始實驗可見’選擇於ΙΟ·8 M hIL20下量測抗體之EC50值。 3個獨立實驗測試抗體對IL20誘發之增殖的抑制效應。在具有且不具有定義之最高及最低值之情況下計算 EC50值。後者給出3個獨立實驗之間的最佳相關性且用於比較抑制效應（藉由Prism中之「具有可變斜率之s形劑量 -反應」擬合曲線）》以下表4展示3個實驗之EC5〇值，對抑制表現IL20R1及IL2〇R2之BaF-3細胞之IL20誘發之增殖的EC50值進行比較。 201022288 表 4 -BaF-3 ( hIL20Rl/hIL20R2 )細胞之 hIL20 誘發之增殖的抑制抗IL20抗趙 EC50 (nM) 15D2 6.5, 6.7, 6.8* 6.6 13.07 262.4.1.2.2.1 3.4 4.0 2.77 262.5.1.6.4.4 17.0 25.6 14.53 262.7.1.3.2.4 4.3 4.2 4.16 包括3個板 ❿ 通過單因子 ANOVA及杜凱式事後檢驗（Tukey post te.st)來分析 EC50 值。15D2、262.4.1.2.2.1 及 262.7.1.3.2.4 全部均比262.5.1.6.4.4顯著更好地抑制經IL20R轉染之 BaF-3細胞的 IL20誘發之增殖。雖然 262.4.1.2.2.1及 262.7.1.3.2.4之平均EC50值低於15D2之值，但差異並不統計顯著（P < 0.05)。關於研究15D2是結合IL20之可溶性形式抑或受體結合形式的檢定，結果顯示添加IL19回復 G IL20誘發之增殖之15D2阻斷（圖12)。此意謂15D2阻止 IL20與hIL20R結合，但15D2並不阻止IL19與受體結合。因此，1 5D2結合IL20之可溶性形式而非受體結合形式，否則其將阻斷IL19接近受體。實施例11 : IL22R1/IL20R2之IL20活化之中和本實施例顯示在螢光素酶報導子檢定中人類抗體1 5D2 及大鼠抗hIL20 mAb對IL20誘發之經由人類IL22R1/ IL20R2受體複合物之信號轉導的抑制效應。 115 201022288 材料與方法乂癖7X20截箏子細應系之差兰。將pcDNA3.1 + (潮黴素）質粒中之人類IL20R2、pcDNA3.1+ (博來黴素）質粒中之IL22R1及STAT3報導質粒KZ136(新黴素）轉染至 BHK細胞中且藉由200从g/ml潮黴素、400 μ g/mi博來黴素及60G仁g/ml遣傳黴素選擇。挑取純系且選擇IL2〇反應最大之純系「ΒΗΚ 1-B4」。與基礎水準（無刺激）相比，BHK 1-B4細胞系在1〇 nM IL20之螢光素酶讀數方面作出約1〇倍反應。· 0 以20,000個細胞/孔接種於96孔板中。接種後16小時，用 10 nM IL20或10 nM IL20與抗體或普通培養基之混合物刺激細胞。刺激細胞4小時，移除培養基，將1 〇〇从1 pbs (包括Ca++及Mg++ )及100#1螢光素酶受質（Steady_GL〇 ) 添加至孔中。將板培育30分鐘。藉由Topcount NXT (PerkinElmer)積測發光。結果 ❹ 磨治戎几20衣:餿户和几20。藉由穩定轉染表現IL20R2 及IL22R之質粒及STAT3螢光素酶報導質粒KZ136來產生穩定細胞系ΒΗΚ 1-B4。在添加至細胞中之前將抗體與IL2〇混合。使IL20濃度保持於10 nM，而以3倍稀釋液之形式在133 nM至0.19nM之範圍内添加抗體。獲得4種抗體之劑量-反應曲線’且基於藉由GraphPad Prism中之「具有可變斜率之s形劑量-反應」擬合之曲線來計算EC50值（表 116 201022288 4)。15D2 如 262.4.1.2.2.1 般有效地且比 262 5 j 6 4 4 及 262.7.1.3.2.4更好地中和經由hIL22R1/hIL2〇R2之信號轉導。表5 -IL22R1/IL20R2受體複合物之IL2〇活化之中和抗IL20抗想 EC50 (nM) 15D2 (NN) 4.98 262.4.1.2.2.1 (ZGI) 4.92 262.5.1.6.4.4 (ZGI) 18.33 262.7.1.3.2.4 (ZGI) 11.17 ❹ 實施例12:動力參數之測定蛋白質相互作用可使用表面電漿共振（SPR)分析來實時監測。本實施例描述在Biacore 3000及Biacore T100儀器上之SRP分析，以在對重組hIL20之親和力方面特性化融合瘤產生及/或重組表現之人類抗IL20抗體15D2及5B7。使用直接結合程序，用經由自由胺基團與感應晶片表面上之羧基甲基化葡聚糖膜（CM5 )共價偶合之單株抗體執行親和力研究。以各種濃度注射重組hIL20，隨後為怪定緩衝液流過感應晶片表面之解離期。使用本實驗設計，hIL20 與經固定之單株抗體之結合可視為1:1結合，其中一個 hIL20分子結合於一個抗體結合位點。相互作用之動力參數可使用1:1相互作用朗谬耳擬合模塑（Langmuir fitting model)來計算。 117 201022288 材料與方法分析由融合瘤細胞表現之1 5D2野生型（wt )、表現於 HEK293細胞中之15D2-wt、表現於HEK293細胞中之具有 S241P突變之15D2、表現於CHO細胞中之15D2-S241P及由融合瘤細胞表現之5B7-wt。將經純化之單株抗體固定於 CM5型感應晶片上之個別流量槽中。使用標準胺偶合程序執行固定’目標為100Q共振單位（RU )之固定含量。將抗體在 10 mM NaAc pH 5·0 中稀釋至 5 μ g/ml。使用 HPS-EP pH 7.4( 10 mM HEPES、1 50 mM NaCl' 3 mM EDTA 及 0.005% 〇聚山梨醇酯P20 )作為電泳緩衝液及用於重組hIL20之稀釋劑。將重組純化之hIL20稀釋至1〇〇 nM、50 nM、25 nM、 12.5 nM、6.25 nM 及 3· 125 nM » 締合（注射）3 min，隨後為30 min解離（洗液）期。流速為3〇// 1/niin。於25°c下執行實驗。在各週期後表面之再生藉由以30从1/min流速注射10 mM Glycin-HCl pH 1_8之30秒脈衝來完成。在所有流量槽中同時進行偵測。1號流量槽不含有經固定之抗體，且用於減去背景及本體。藉由使用1:1朗繆耳結合模型局部〇擬合特定抗體-抗原組合之資料來計算動力參數，在計算動力參數之前’針對質量-傳送限制檢查資料。在Biacore 3〇〇〇及T100儀器上執行實驗。使用Biaevai 4.1及Biacore T100 評估軟體評估資料。結果. 對於重組hIL20與個別抗體的結合計算出之親和力列於以下表6中，其展示個別抗IL2〇單株抗體之速率常數及 118 201022288 親和力。親和力以莫耳單位（Μ )列出，締合速率以（1 /Ms ) 計且解離速率以（1/s )計。速率常數以（締合速率/解離速率）形式在親和力下方之括號中列出。對所用緩衝液有效且在抗原之重組形式下的親和力測定說明 15D2-wt HEK293 與 15D2-S241P CHO 之 KD 值皆在較低pM範圍内。此外，融合瘤表現之抗體之親和力說明 15D2-wt及5B7-wt之親和力為約0.5nM KD。

表6 -15D2及5B7與重組hIL20相互作用之動力參數抗體 KD (Μ) 融合瘤 KD (Μ) HEK293 KD (Μ) CHO 1.5D2-wt 5.5Ε-10 (1.9Ε+05/ 1.1Ε-04) 3.2E-11 (1.9E+06/6.3E-05) - 15D2-S241P - 3.6E-11 (1.7E+06/6.8E-05) 3.1E-11 (2.3E+06/7.1E-05) 5B7 7.5E-10 (1.4E+05 / 1.0E-04) - 實施例13 : IL20上之15D2結合界面本實施例使用ΗΧ-MS技術鑑別hIL20上之15D2結合 ® 界面。除非另有指示，否則在本實施例中hIL20胺基酸殘基之編號指具有N末端Met( M)殘基之SEQ ID ΝΟ:1(亦即，在本實施例中殘基Y67對應於SEQ ID ΝΟ:1中之殘基 Y66 )。 HXMS提供模擬活體内條件之可能性（例如參見Wales 及 Engen，Mass Spectrom. Rev. 25，15 8 (2006)，及 Coales 等人，Rapid Commun. Mass Spectrom. 23, 639 (2009) ) ° 此處所用之HX-MS技術提供關於在15D2抗體結合後IL20中 119 201022288 之表面暴露之酿胺氫受到保護以防與溶劑交換、從而有助，於結合界面之定位的資訊。此外，方法亦可揭示il2〇中之更間接結構效應。此處觀察到如在一些區域中所見在i5D2 結合後結構之輕微穩定。醯胺氫/氣交換（HX)藉由在加以㈣片段）存在或不存在，將以23倍稀释於相應氘化缓衝液（亦即，25 mM MES、80 mM NaC1 ' 96% D2〇，pH 6 4 (未校正之值））中來起始。未氘化對照組藉由稀釋於相同氕化緩衝液中來製備。所有HX反應均於2(rc下進行且含有“ mil2〇,無❹ 5 " M 15D2或含有5 // M 15D2。初步資料已說明於此等蛋白質濃度下IL20結合完全飽和。在適當時間間隔下，藉由等體積之冰冷驟冷緩衝液 (1.35 Μ鹽酸參（2-羧基乙基）膦，使用Na〇H調整至ρΗ 2 5) 使ΗΧ反應物之等分試樣中止，產生最終2 6之值（未校正之值）。將經中止之樣品立即注射於經冷卻之超高壓液層析法（ultra high pressure liquid chromatography， UPLC)-質譜法系統（下文詳細描述）上以進行胃蛋白酶消 ❹ 化 '快速去鹽及質量分析。所有樣品製備 '處理及注射均由HD-x pal自動取樣器 (LEAP Technol〇gles公司）執行。使蛋白質及中止溶液保持於2 C下且使気化緩衝液及標記反應物保持於2〇i下。溫度控制於1.5°C下之冷卻箱含有喷射及開關闊、管道、管系 '柱"使用胃蛋白轉管柱（Applied Biosystems )、VanGuard C18 捕集管柱（Waters)及 Acquity UPLC BEH C18 1.7 // m、 120 201022288 2.1 x 100 mm分析管柱（Waters公司）。使用0.1 %曱酸水溶液及0.1%甲酸乙腈溶液自Acquity UPLC果傳遞LC流。使用Q-ToF premier進行質量分析（Waters公司）。在獨立實驗中使用標準MS/MS方法鑑別胃蛋白酶肽。使用軟體HXExpress自經鎖定質量（i〇ckmass )校正之質心資料（使用Waters公司之MassLynx軟體處理）測定肽同位素被膜之平均質量（Weis等人，J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 1700 (2006))。 ❹ 在15D2存在及不存在下監測涵蓋IL20之一級序列之 93。/。的22種肽之HX時程（圖13)。所觀察到之IL2〇交換模式可分為不同的2組。一組肽顯示基本上不受15D2結合影響之交換模式。舉例而言，肽127_145表示IL2〇之不受 15D2、’、a〇i響之區域。然而，一些顯示3〇秒時由於在bD2 結合後蛋白質結構之輕微穩定而交換略有減少。舉例而。肽17-38、6〇-66及146-153表示IL20之位於結合抗原藝決定基外但在15D2結合後可能顯示輕微結構穩定之區域。相比之下，另—組肽IL2〇顯示強保護（此處大於3個氘核）以防在 15D2 結合後交換。肽 67-83、67-93、69-89、69.93 及84-93表示作為15D2之結合抗原、衫基之部分的狀。因此在15D2結合後顯示保護之區域涵蓋殘基67-93之肽。舉例而s，與D2Q交換3G秒時，保護約w個醯胺以防在合後區域69_93中之交換。受到保護以防在咖 _ /父換之特疋肽及氘核之數目描繪於圖14中其中將於2〇中父換30秒後得到之資訊亞定位於少數殘基。 121 201022288 因此可將15 D 2結合界面定位於含有序列 . VFKNYQTPDHYTLRKISSLANSF 且對應於 SEq ID N〇: i 之殘基70-92的殘基71-93。然而，使含有殘基7Κ83之區域在較小程度上受到保護以防在15D2結合後氘交換。此指示此區域内之總15D2結合的緊密性較小且最可能僅一小部分此麥殘基與15D2結合:有册9殘基§4-85顯示脅以防在15D2結合後交換且對應於SEq ID N〇: i之殘基 83-92之區域86-93亦極受15D2結合影響。包括公開案、專利申請案及專利之本文中所引用的所有參考文獻均以引用的方式併入本文中，該引用的程度就如同已個別地及特定地將各參考文獻以引用的方式併入且以全文形式陳述於本文中一般。所有標題及副標題在本文中僅為了方便起見而使用且不應視為以任何方式限制本發明。除非本文另有指示或者明顯同上下文矛盾，否則本發明涵蓋呈所有可能變化形式之上述要素之任何組合。如描述本發明之内容中所使用，除非本文另有指示或 ❹ 者明顯同上下文矛盾，否則術語「一（a/ati)」/及「該（the)」及類似指示物應理解為涵蓋單數與複數。除非本文另有指示，否則本文中之值範圍之敍述僅欲充Ϊ個別地提及該範圍中之各獨立值之速記方法，且各獨立值如同其個別地在本文中敍述一般併入說明書中。除非另有規疋’否則本文所提供之所有精確值均代表相應近似僅(例如’關於特定因子或度量所提供之所有精確例示性 122 201022288 值均可視為亦提供之相應近似度量，適當時由「約」修飾）。、除非本文另有指示或者明顯同上下文矛盾，否則本文所述之所有方法均可以任何合適之順序執行。除非另有指示，否則使用本文所提供之任何及所有實例或例示性語言（例如，「諸如」）均僅欲較好地闡明本發月且並不對本發明之範_作出限制^除非明確規定，否則說明書中之語言不應視為指示任何要素為實踐本發明所必需的。僅為了方便起見將專利文獻引入及併入本文中且並不反映該等專利文獻之有效性、專利性及/或可執行性之任何觀〇除非另有規定或明顯同上下文矛盾，否則本文中關於要素使用諸如「包含（comprising)j、「具有（having)」、「包

括（including)」或「含有（containing)」之術語描述本發明之任何態樣或具體實例意欲對「由彼特定要素組成」、「美本上由彼特定要素組成」或「實質上包含」彼特定要素2 本發明之類似態樣或具體實例提供支持（例如，除非另有規定或明顯同上下文矛f，否則本文中描述為包含特定要素之組成物應理解為亦描述由彼要素組成之組成物）。本發明包括在適用法律所允許之最大程度上本文中呈現之態樣或申請專利範圍中所引用之標的物的所有佟改及等效物。例示性具體實例以下為本發明之例示性及非限制性具體實例 123 201022288 1. 一種經分離之抗人類IL20抗體或其抗原結合片段，其減少IL20R1/IL20R2及IL22R1/IL20R2受體複合物之 IL20介導之活化。 2. 如具體實例1之抗體或抗原結合片段，其減少人類 IL20R1/IL20R2 及 IL22R1/IL20R2 受體複合物之人類 IL20 介·導之活他。': 3 ·如前述具體實例中任一者之抗體或抗原結合片段，其減少獼猴IL20R1/IL20R2及IL22R1/IL20R2受體複合物之獼猴IL20介導之活化。 ❹ 4. 如前述具體實例t任一者之抗體或抗原結合片段，其減少鼠類IL20R1/IL20R2及IL22R1/IL20R2受體複合物之鼠類IL20介導之活化。 5. 如前述具體實例中任一者之抗體或抗原結合片段，其減少 IL20 與該等 IL20R1/IL20R2 及/或 IL22R1/IL20R2 受體複合物之結合。 6. 如前述具體實例中任一者之抗體或抗原結合片段，其減少IL20與IL20R2之結合。 ❹ 7. 如具體實例1至4中任一者之抗體或抗原結合片段，其並不減少 IL19 或 IL24 與 IL20R1/IL20R2 或 IL22R1/ IL20R2受體複合物之結合。 8. 如前述具體實例中任一者之抗體或抗原結合片段，其結合於包含至少一個選自成熟人類IL20 ( SEQ ID ΝΟ:1 )之 D78-H103 (視情況不包括D78)之殘基的抗原決定基。 9. 如具體實例8之抗體或抗原結合片段，其中該抗原決 124 201022288 定基包含至少一個選自D78-K96之殘基。 10. 如具體實例9之抗體或抗原結合片段，其中該抗原決定基包含至少一個選自D78-L93或R83-F92之殘基。 11. 如具體實例10之抗體或抗原結合片段，其中該抗原決定基包含至少一個選自H79-N90之殘基。 12. 如具體實例8之抗體或抗原結合片段，其中該抗原決定基包含至少3個選自D78-H103之殘基。 13. 如具體實例12之抗體或抗原結合片段，其中該抗原決定基包含至少3個選自D78-K96之殘基。 14. 如具體實例1 3之抗體或抗原結合片段，其中該抗原決定’基包含至少3個選自D78-L93或R83-F92之殘基。 15. 如具體實例14之抗體或抗原結合片段，其中該抗原決定基包含至少3個選自H79-N90之殘基。 16. 如具體實例8之抗體或抗原結合片段，其中該抗原決定基包含至少5個選自D78_H 103之殘基。 φ 17.如具體實例16之抗體或抗原結合片段，其中該抗原決定基包含至少5個選自D78-K96或R85-F92之殘基。 18. 如具體實例17之抗體或抗原結合片段，其中該抗原決定基包含至少5個選自D78-L93之殘基。 19. 如具體實例18之抗體或抗原結合片段，其中該抗原決定基包含至少5個選自H79-N90之殘基。 20. 如具體實例8之抗體或抗原結合片段，其中該抗原決定基在對應於殘基D78-H103之區段中。 21. 如具體實例20之抗體或抗原結合片段，其中該抗原 125 201022288 決定基在對應於殘基D78-K96之區段中。 22. 如具體實例21之抗體或抗原結合片段，其中該抗原決定基在對應於殘基D78-L93之區段中。 23. 如具體實例22之抗體或抗原結合片段，其中該抗原決定基在對應於殘基D78-N90之區段中。 24. 如異體實例8之抗:體减抗原結合片段’其中該抗原決定基包含殘基H79及N90。 25. 如具體實例24之抗體或抗原結合片段，其中該抗原決定基進一步包含殘基R83。 26. 如具體實例25之抗體或抗原結合片段，其進一步包含S85、F91及L92中之一或多者。 27. 如前述具體實例中任一者之抗體，其為人類或人類化抗體。 28. 如前述具體實例中任一者之抗體或抗原結合片段，其包含作為包含VH1 一03、D3-10及JH6基因之一組人類基因之產物或自該組人類基因衍生的重鏈可變區。 29. 如前述具體實例中任一者之抗體或抗原結合片段，其包含作為包含VKI_L 1 8及JK4基因之一組人類基因之產物或自該組人類基因衍生的輕鏈可變區。 30. 如前述具體實例中任一者之抗體或抗原結合片段，其為全長抗體。 31·如具體實例30之抗體，其為具有igGl、IgG2或IgG3 同型之人類抗體。 32.如具體實例30之抗體，其具有igG4同型。 201022288 33. 如具體實例32之抗體，其包含S241P突變。 34. —種抗體衍生物或多特異性抗體分子，其包含如具體實例1至33中任一者之抗體或抗原結合片段。 35. —種經分離之抗hIL20抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO:8之重鏈可變區CDR2及CDR3。 36. 如具體實例35之抗體或抗原結合片段，其包含SEQ 10>^0:8之重鏈可變區00111。 37. 如具體實例36之抗體或抗原結合片段，其包含含有 ® SEQ ID NO:8之序列之重鏈可變區。 38. 如具體實例35之抗體或抗原結合片段，其包含SEQ ID NO:6之重鏈可變區CDR2及CDR3。 39. 如具體實例38之抗體或抗原結合片段，其包含SEQ IDNO:6之重鏈可變區CDR1。 40. 如具體實例39之抗體或抗原結合片段，其包含含有 SEQIDNO:6之序列之重鏈可變區。 4 1.如具體實例3 5之抗體或抗原結合片段，其包含SEQ ® ID NO:7之重鏈可變區CDR2及CDR3。 42.如具體實例41之抗體或抗原結合片段，其包含SEQ 10 1^0:7之重鏈可變區00111。 43 .如具體實例42之抗體或抗原結合片段，其包含含有 SEQIDNO:7之序列之重鏈可變區。 44.如具體實例35至43中任一者之抗體或抗原結合片段，其包含SEQ ID N〇:9之輕鏈可變區CDR1、CDR2及 CDR3。 127 201022288 45 .如具體實例44之抗體或抗原結合片段，其包含含有 SEQ ID NO:9之序列之輕鏈可變區。 46. —種經分離之人類抗IL20抗體，其與包含含有SEQ IDNO:6及/或7之VH區及含有SEQIDNO:9之VL區的抗體競爭結合於成熟人類IL20 ( SEQ ID ΝΟ:1)。 47. 如具體實例46之抗體，其進一步與包含含有SEQ ID NO:6及/或7之VH區及含有SEQ ID NO:9之VL區的抗體競爭結合於 mIL20 ( SEQ ID NO:4)、cIL20 ( SEQ ID NO:5 ) 或兩者。 48 ·如具體實例46之抗體，其結合於包含對應於成熟人類IL20 ( SEQ ID ΝΟ:1)之殘基D78-H103 (視情況不包括 D78 )之區段的至少一個殘基之抗原決定基。 49. 如具體實例48之抗體，其結合於包含殘基H79、 R83、S85、N90、F91及/或L92之抗原決定基。 50. 如具體實例46之抗體，其結合於hIL20 ( SEQ ID ΝΟ:1 )中與包含含有SEQ IDNO:6及/或7之VH區及含有 SEQ ID NO:9之VL區的抗體相同之抗原決定基。 5 1. —種如具體實例46至50中任一者之抗體的抗原結合片段。 5 2.—種產生抗IL20抗體或抗原結合片段之方法，其包含於合適條件下培養產生如前述具體實例中任一者之抗體或抗原結合片段的宿主細胞及回收該抗體或抗原結合片段。 53.—種組成物，其包含如前述具體實例中任一者之抗 201022288 * 體或抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。 5 4.如具體實例5 3之組成物，其進一步包含第二消炎劑。 55.如具體實例54之組成物’其中該第二消炎劑選自免疫抑制劑、止痛劑、抗血管生成劑、皮質類固醇、B細胞消耗劑、B細胞拮抗劑、T細胞拮抗劑、補體抑制劑、抗細胞激素藥劑及抗細胞激素受體藥劑及其組合。 5 6. —種治療發炎性或自體免疫病症之方法，其包含投 ® 予有效量之抗IL20抗體或其抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段減少人類IL20Rl/hIL20R2及IL22Rl/hIL20R2受體複合物之人類IL20介導之活化。 57. 如具體實例56之方法，其包含在投予包含該抗體或抗原結合片段之組成物之前、同時或之後投予第二消炎劑。 58. 如具體實例57之方法’其中該第二消炎劑選自免疫抑制劑、止痛劑、抗血管生成劑、皮質類固醇、B細胞消耗 ❹劑、B細胞拮抗劑、T細胞拮抗劑、補體抑制劑、抗細胞激素藥劑及抗細胞激素受體藥劑及其組合。 59·如具體實例58之方法，其中該第二消炎劑為甲胺喋口令〇 6〇·如具體實例56至59中任一者之方法，其中該發炎 2或自體免疫病症為類風濕性關節炎、青少年類風濕性關卽炎牛皮癬、牛皮癣性關節炎、強直性脊椎炎、休格連氏症候群、多發性硬化症、發炎性腸病、全身性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎或其任何組合。 / 129 201022288 . 61·如具體實例6〇之方法’其中該發炎性或自體免疫病症為類風濕性關節炎。、62.如具體實例60之方法’其中該發炎性或自體免疫病症為牛皮癖。 63. 如具體實例6〇之方法’其中該發炎性或自體免疫病症為牛皮癖-關節炎。 64. 如具體實例6〇之方法，其中該發炎性或自體免疫病症為多發性硬化症。 65. 如具體實例60之方法，其中該發炎性或自體免疫病 © 症為發炎性腸病。 66. 如具體實例60之方法，其中該發炎性或自體免疫病症為全身性紅斑狼瘡。 67·如具體實例60之方法，其中該發炎性或自體免疫病症為狼瘡腎炎。 68.如具體實例丨至51中任一者之抗體或抗原結合片段其用於治療發炎性或自體免疫病症。 69· —種如具體實例t至5丨中任一者之抗體或抗原結合 ❹ “又與第一消炎劑之組合，其用於治療發炎性或自體免疫病症。 7〇·如具體實例69之組合’其中該第二消炎劑在該抗體或抗原結合片段之前、同時或之後投予。呤。&體實例7〇之組合，其中該第二消炎劑為甲胺喋 72. 一種如具體實例1至以中任一者之抗體或抗原結合 130 201022288 片段的用途，其用於製備供治療發炎性或自體免疫病症之藥物。 73. 如具體實例68至72中任一者之抗體或抗原結合片段、組合或用途，其中該發炎性或自體免疫病症為類風濕性關節炎。 74. 如具體實例68至72中任一者之抗體或抗原結合片段、組合或用途，其中該發炎性或自體免疫病症為牛皮癬。 ^ 75.如具體實例68至72中任—者之抗體或抗原結合片段、級合或用途，其中該發炎性或自體免疫病症為牛皮癬性關節炎。 76. 如具體實例68至72中任一者之抗體或抗原結合片段、版合或用途’其中該發炎性或自體免疫病症為多發性硬化症。 77. 如具體實例68至72中任一者之抗體或抗原結合片段、級合或用途，其中該發炎性或自體免疫病症為發炎性腸病。 78. 如具體實例68至72中任一者之抗體或抗原結合片段、級合或用途’其中該發炎性或自體免疫病症為全身性紅斑狼瘡。 79. 如具體實例68至72中任一者之抗體或抗原結合片段、叙合或用途，其中該發炎性或自體免疫病症為狼瘡腎炎。 80. 如具體實例68至72 t任一者之抗體或抗原結合片段、級合或用途，其中該發炎性或自體免疫病症為青少年 131 201022288 類風濕性關節炎。 8 1.如具體實例68至72中任一者之抗體或抗原結合片段、組合或用途’其中該發炎性或自體免疫病症為強直性脊椎炎。 82.如具體實例68至72中任—者之抗體或抗原結合片 & 鯉合或用途，其中該發炎性或自體免疫病症為休格連氏症候群。

132 201022288 序列表 <11〇>諾佛儂迪克股份有限公司 <120>抗人類介白素_20抗體 <130> 7806.200-TW <160> 46 <170〉 Patentln 3.5 版 <210> 1 <211> 152 <212〉 PRT <213>智人 <400> 1

Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser Cys Val lie Ala Thr Asn Leu Gin 15 10 15

Glu lie Arg Asn Gly Phe Ser Glu lie Arg Gly Ser Val Gin Ala Lys 20 25 30 春

Asp Gly Asn lie Asp lie Arg lie Leu Arg Arg Thr Glu Ser Leu Gin 35 40 45

Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys Cys Leu Leu Arg His Leu Leu Arg 50 55 60

Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys Asn Tyr Gin Thr Pro Asp His Tyr 65. 70 75 80

Thr Leu Arg Lys lie Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe Leu Thr lie Lys 85 90 95

Lys Asp Leu Ar£ Leu Cys His Ala His Met Thr Cys His Cys Gly Glu 100 105 110

Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser Gin lie Leu Ser His Phe Glu Lys Leu 115 120 125

Glu Pro Gin Ala Ala Val Val Lys Ala Leu Gly Glu Leu Asp lie Leu 130 135 140

Leu Gin Trp Met Glu Glu Thr Glu 145 150 <210> 2 <211〉 176 <212〉 PRT <213>智人 <400> 2

Met Lys Ala Ser Ser Leu Ala Phe Ser Leu Leu Ser Aia Ala Phe Tyr 15 10 15

Leu Leu Trp Thr Pro Ser Thr Gly Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser 20 25 30

Cys Val lie Ala Thr Asn Leu Gin Glu lie Arg Asn Gly Phe Ser Glu 35 40 45 第1頁 201022288 lie Arg Gly Ser Val Gin Ala Lys Asp Gly Asn lie Asp lie Arg lie 50 55 60

Leu Arg Arg Thr Glu Ser Leu Gin Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys 65 70 75 80

Cys Leu Leu Arg His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys 85 90 95

Asn Tyr Gin Thr Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys lie Ser Ser Leu 100 105 110

Ala Asn Ser Phe Leu Thr lie Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys His Ala 115 120 125

His Met Thr Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser Gin 130 135 140 lie Leu Ser His Phe Glu Lys Leu Glu Pro Gin Ala Ala Val Val Lys 145 150 155 160

Ala Leu Gly Glu Leu Asp lie Leu Leu Gin Trp Met Glu Glu Thr Glu 165 170 175 <210> 3 <211> 177 <212> PRT <213>智人 <400> 3

Met Lys Leu Gin Cys Val Ser Leu Trp Leu Leu Gly Thr lie Leu lie 15 10 15

Leu Cys Ser Val Asp Asn His Gly Leu Arg Arg Cys Leu lie Ser Thr 20 25 30

Asp Met His His lie Glu Glu Ser Phe Gin Glu He Lys Arg Ala lie 35 40 45

Gin Ala Lys Asp Thr Phe Pro Asn Val Thr lie Leu Ser Thr Leu Glu 50 55 60

Thr Leu Gin He He Lys Pro Leu Asp Val Cys Cys Val Thr Lys Asn 65 70 75 80

Leu Leu Ala Phe Tyr Val Asp Arg Val Phe Lys Asp His Gin Glu Pro 85 90 95

Asn Pro Lys lie Leu Arg Lys lie Ser Ser lie Ala Asn Ser Phe Leu 100 105 110

Tyr Met Gin Lys Thr Leu Arg Gin Cys Gin Glu Gin Arg Gin Cys His 115 120 125

Cys Arg Gin Glu Ala Thr Asn Ala Thr Arg Val lie His Asp Asn Tyr 130 135 140 第2頁 201022288

Asp Gin Leu Glu Val His Ala Ala Ala lie Lys Ser Leu Gly Glu Leu 145 150 155 160

Asp Val Phe Leu Ala Trp He Asn Lys Asn His Glu Val Met Phe Ser 165 170 175

Ala <210> 4 <211> 176 <212〉 PRT <213>小家鼠 <400> 4

Met Lys Gly Phe Gly Leu Ala Phe Gly Leu Phe Ser Ala Val Gly Phe 15 10 15

Leu Leu Trp Thr Pro Leu Thr Gly Leu Lys Thr Leu His Leu Gly Ser

20 25 30

Cys Val lie Thr Ala Asn Leu Gin Ala lie Gin Lys Glu Phe Ser Glu 35 40 45 lie Arg Asp Ser Val Gin Ala Glu Asp Thr Asn lie Asp lie Arg lie 50 55 60

Leu Arg Thr Thr Glu Ser Leu Lys Asp lie Lys Ser Leu Asp Arg Cys 65 70 75 80

Cys Phe Leu Arg His Leu Val Arg Phe Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys 85 90 95

Val Tyr Gin Thr Pro Asp His His Thr Leu Arg Lys lie Ser Ser Leu -100 105 110

Ala Asn Ser Phe Leu lie lie Lys Lys Asp Leu Ser Val Cys His Ser 115 120 125

His Met Ala Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Glu Lys Tyr Asn Gin 130 135 140 lie Leu Ser His Phe lie Glu Leu Glu Leu Gin Ala Ala Val Val Lys 145 150 155 160

Ala Leu Gly Glu Leu Gly lie Leu Leu Arg Trp Met Glu Glu Met Leu 165 170 175

<210〉 5 <211> 176 <212> PRT <2Ϊ3> 猴（Macaca fascicularis) <400> 5

Met Lys Ala Ser Ser Leu Ala Phe Ser Leu Leu Ser Ala Ala Phe Tyr 15 10 15

Leu Leu Trp Thr Pro Ser Thr Gly Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser 第3頁 201022288 20 25 30

Cys Val lie Ala Thr Asn Leu Gin Glu lie Arg Asn Gly Phe Ser Glu 35 40 45 lie Arg Gly Ser Val Gin Ala Lys Asp Gly Asn lie Asp lie Arg lie 50 55 60

Leu Arg Arg Thr Glu Ser Leu Gin Asp Thr Lys Pro Ala Asp Gin Cys 65 70 75 80

Cys Leu Leu Arg His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys 85 90 95

Asn Tyr Gin Thr Leu Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys lie Ser Ser Leu 100 105 110

Ala Asn Ser Phe Leu Thr lie Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys His Ala 115 120 125

His Met Thr Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Lys Lys Tyr Gly Gin 130 135 140 lie Leu Ser His Phe Glu Glu Leu Glu Pro Gin Ala Ala Val Val Lys 145 150 155 160

Ala Leu Gly Glu Leu Asp lie Leu Leu Gin Trp Met Glu Glu Thr Glu 165 170 175 <210> 6 <211> 127 <212> PRT <213>智人 <400> 6

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Asp 20 25 30 lie He His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Asn Ala Gly Tyr Gly Asn Thr Gin Tyr Ser Gin Asn Phe 50 55 60

Gin Asp Arg Val Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu He Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Pro Leu Trp Phe Gly Glu Ser Ser Pro His Asp Tyr Tyr 100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 第4頁 201022288 <210> 7 <213> 127 <212> PRT <213>智人 <400〉 7

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 lie Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Asn Ala Gly Tyr Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gin Asn Phe 50 55 60 ©Gin Asp Arg Val Thr lie Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu lie Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Pro Leu Trp Phe Gly Glu Leu Ser Pro His Asp Tyr Tyr 100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 8 <211> 127 <212> PRT <213>智人 <220> <221> MISC_FEATURE <222〉（30),.(30)

<223> X〗爲T、S或其任何保守性取代 <220> <221> MISC.FEATURE <222> (31)7.(31) <223> X2爲N、S或其任i可保守性取代 <220> <221> MISC.FEATURE <222> (22) Π2) <223> X3爲ί)_、H或其任何保守性取代 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223〉X4il、M或其任何保守性取代 <220> <221> MISC.FEATURE <222> (59)7.(59) <223〉X5爲K、Q或其任何保守性取代 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69)..(69) <223> X6爲S、T或其任何保守性取代第5頁 201022288 <220> <22i> MISC一FEATURE <222> (106)..(106) <223> X7爲S、L或萁任何保守性取代 <400> 8

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Xaa Xaa Xaa 20 25 30 ile Xaa His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Ala Gly Tyr Gly Asn Thr Xaa Tyr Ser Gin Asn Phe 50 55 60

Gin Asp Arg Val Xaa Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ile Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Pro Leu Trp Phe Gly Glu Xaa Ser Pro His Asp Tyr Tyr 100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 9 <211〉 108 <212> PRT <213>智人 <400> 9

Ala Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 10 第6頁 201022288 <211> 98 <212> PRT <213>智人 <400> 10

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213>智人 <400> 11 31 gtattactat ggttcgggga gttattataa c <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213>智人 <400> 12

Val Leu Leu Trp Phe Gly Glu Leu Leu <210> 13 <211> 63 <212> DNA <213>智人 <400> 13 attactacta ctactacggt atggacgtct gggggcaagg gaccacggtc accgtctcct 60 cag <210> 14 <211> 20 <212〉 PRT <213>智人 <400> 14

Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 15 10 15 第7頁 63 201022288

Thr Val Ser Ser 20 <210> 15 <211> 96 <212> PRT <213>智人 <220〉 <221〉 <222> <223> misc_feature 可天然存在之胺基酸 <400> 15

Ala lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Xaa 85 90 95 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213>智人 <400〉 16 gctcactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaac 38 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213>智人 <400> 17

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 1 5 10 <210> 18 <211> 123 <212> PRT <213>智人 <400> 18

Gin lie Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gin 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Phe Ser Thr Asn 20 25 30 第8頁 201022288

Gly Val Gly Val Gly Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala Leu lie Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val 65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Leu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala His Ser Pro Phe lie Met Val Arg Gly Val lie lie Thr Phe 100 105 110

Phe Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 115 120

<210> 19 <211> 109 <212> PRT <213>智人 <400〉 19

Val lie Trp Met Thr Gin Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Thr Gly 10 15

Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Met Ser Gin Gly lie Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Cys Leu Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr Ser Phe Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg Thr 100 105 <210> 20 <211> 123 <212> PRT <213>智人 <400> 20

Gin Leu Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Asn 20 25 30

Asn Tyr Tyr Trp Ala Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Pro Glu 35 40 45 第9頁 201022288

Trp lie Gly Ser lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Ala Ala Val Tyr Phe 85 90 95

Cys Ala Gly Leu Val Val lie Pro Ala Ser Asp Tyr Ser Tyr Tyr Gly 100 105 110

Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr 115 120 <210> 21 <211> 110 <212> PRT <213>智人 <400> 21

Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 22 <211> 122 <212> PRT <213>智人 <400> 22

Gin Val Gin Val Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Arg Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Ala lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 第10頁 201022288

Gly Trp lie Asn Ala Gly Tyr Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr He Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Ala Leu Ser Trp Phe Gly Glu Ser Gin Gly Phe 100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 115 120 <210> 23 <211> 122 <212> PRT <213>智人

<400> 23

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Arg Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Asn Tyr 20 25 30

Ala lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Asn Ala Gly Tyr Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Val Leu Leu Trp Phe Gly Glu Ser Gin Gly Phe 100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 115 120 <210> 24 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 24

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 第11頁 201022288 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr 100 105 <210> 25 <211> 476 <212> PRT <213>智人 <400> 25

Met Asp Trp Thr Trp Arg lie Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 15 10 15

Ala His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

Thr Asn Asp lie lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu 50 55 60

Glu Trp Met Gly Trp lie Asn Ala Gly Tyr Gly Asn Thr Gin Tyr Ser 65 70 75 80

Gin Asn Phe Gin Asp Arg Val Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu lie Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Leu Trp Phe Gly Glu Ser Ser Pro His 115 120 125

Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val 130 135 140

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 145 150 155 160

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 165 170 175

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 180 185 190

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu 195 200 205 第12頁 201022288

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 210 215 220

Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 225 230 235 240

Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 245 250 255

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 260 265 270

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val 275 280 285

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 290 295 300 ®Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 305 310 315 320

Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 325 330 335

Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 340 345 350

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala 355 360 365

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 370 375 380

Glu Glu Met T-hr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 385 390 395 400

Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 405 410 415

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 420 425 430

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 435 440 445

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 450 455 460

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 26 <211> 552 <212〉PRT <213>食蟹猴 <400〉 26 第13頁 201022288

Met Arg Ala Pro Ser Ser Pro Ala Leu Arg Pro Leu Leu Pro Pro Leu 15 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Pro Trp Gly Leu Ala Val Pro Cys Val 20 25 30

Ser Gly Gly Leu Pro Lys Pro Ala Asn lie Thr Phe Leu Ser lie Asn 35 40 45

Met Lys Asn Val Leu Gin Trp Asn Pro Pro Glu Cys Leu Gin Gly Val 50 55 60

Lys Val Thr Tyr Thr Val Gin Tyr Phe lie Tyr Gly Gin Lys Lys Trp 65 70 75 80

Leu Asn Lys Ser Glu Cys Arg Asn lie Asn Arg Thr Tyr Cys Asp Leu 85 90 95

Ser Ala Glu Thr Ser Asp Tyr Glu His Gin Tyr Tyr Ala Lys Val Lys 100 105 110

Ala lie Trp Gly Thr Asn Cys Ser Lys Trp Ala Glu Ser Gly Arg Phe 115 120 125

Tyr Pro Phe Leu Glu Thr Gin lie Gly Pro Pro Glu Val Ala Leu Thr 130 135 140

Thr Asp Glu Lys Ser lie Ser Val Val Leu Thr Ala Pro Glu Lys Trp 145 150 155 160

Lys Arg Asn Pro Glu Asp Leu Pro Val Ser Met Arg Gin lie Tyr Ser 165 170 175

Asn Leu Lys Tyr Asn Val Ser Val Ser Asn Thr Lys Ser Asn Arg Thr 180 185 190

Trp Ser Gin Cys Val Thr Asn His Thr Leu Val Leu Thr Trp Leu Glu 195 200 205

Pro Asn Thr Leu Tyr Cys He His Val Glu Ser Phe Val Pro Gly Pro 210 215 220

Pro Arg Arg Ala Gin Pro Ser Glu Lys Gin Cys Ala Arg Thr Leu Lys 225 230 235 240

Asp Gin Ser Ser Glu Phe Lys Ala Lys lie lie Phe Trp Tyr Val Leu 245 250 255

Pro Val Ser Val Thr Val Phe Leu Phe Ser Val Met Gly Tyr Ser lie 260 265 270

Tyr Arg Tyr lie His Val Gly Lys Glu Lys His Pro Ala Asn Leu lie 275 280 285

Leu lie Tyr Gly Asn Glu Phe Asp Lys Arg Phe Phe Val Pro Ala Glu 290 295 300 第14頁 201022288

Lys lie Val lie Asn Phe lie Thr Leu Asn lie Ser Asp Asp Ser Lys 305 310 315 320 lie Ser His Gin Asp Met Ser Leu Leu Gly Lys Ser Ser Asp Val Ser 325 330 335

Ser Leu Asn Asp Fro Gin Pro Ser Gly Asn Leu Lys Pro Pro Gin Glu 340 345 350

Glu Glu Glu Val Lys His Leu Gly Tyr Ala Ser His Leu Met Glu lie 355 360 365

Val Cys Asp Ser Glu Glu Asn Ala Glu Gly Thr Ser Leu Thr Gin Gin 370 375 380

Ala Ser Leu Ser Arg Thr lie Pro Pro Asp Lys Thr Val lie Glu Tyr 385 390 395 400

Glu Cys Asp Val Arg Thr Thr Asp lie Cys Ala Gly Pro Glu Glu Gin 405 410 415

Glu Leu Arg Leu Gin Glu Glu Val Ser Thr Gin Gly Thr Leu Leu Glu 420 425 430

Ser Gin Ala Ala Leu Ala Leu Leu Gly Pro Gin Thr Leu Gin Tyr Ser 435 440 445

Tyr Thr Pro Gin Leu Gin Asp Leu Asp Pro Leu Thr Arg Glu His Thr 450 455 460

Asp Ser Glu Glu Gly Pro Glu Glu Glu Pro Ser Thr Thr Leu Val Asp 465 470 475 480

Trp Asp Pro Gin Thr Gly Arg Leu Cys lie Pro Ser Leu Ser Ser Phe 485 490 495

Asp Gin Asp Ser Glu Gly Cys Glu Pro Ser Glu Gly Asp Gly Leu Gly 500 505 510

Glu Glu Gly Leu Leu Ser Arg Leu Tyr Glu Glu Pro Ala Pro Asp Arg 515 520 525

Pro Pro Gly Glu Asn Glu Thr Tyr Leu Met Gin Phe Met Glu Glu Trp 530 535 540

Gly Leu Tyr Val Gin Met Glu Asn 545 550 <210> 27 <211> 311 <212> PRT <213>食蟹猴 <400> 27

Met Gin Thr Phe Thr Met Val Leu Gin Glu lie Trp Thr Ser Leu Phe 15 10 15

Met Trp Phe Phe Tyr Ala Leu lie Pro Cys Leu Leu Thr Asp Glu Val 第15頁 201022288 20 25 30

Ala He Leu Pro Ala Pro Gin Asn Leu Ser Val Leu Ser Thr Asn Met 35 40 45

Lys His Leu Leu Met Trp Ser Pro Val Thr Val Pro Gly Glu Thr Val 50 55 60

Tyr Tyr Ser Val Glu Tyr Gin Gly Glu Tyr Glu Ser Leu Tyr Thr Ser 65 70 75 80

His lie Trp lie Pro Ser Ser Trp Cys Ser Leu Thr Glu Gly Pro Glu 85 90 95

Cys Asp Val Thr Asp Asp lie Thr Ala Thr Val Pro Tyr Asn Leu Arg 100 105 110

Val Arg Ala Thr Leu Gly Ser Gin Thr Ser Ala Trp Ser lie Leu Lys 115 120 125

His Pro Phe Asn Arg Asn Ser Thr lie Leu Thr Pro Pro Gly Met Glu 130 135 140 lie Thr Lys Asp Gly Phe His Leu Val lie Glu Leu Glu Asp Leu Gly 145 150 155 160

Pro Gin Phe Glu Phe Leu Val Ala Tyr Trp Arg Arg Glu Pro Gly Ala 165 170 175

Glu Glu His Val Lys Met Val Arg Ser Gly Gly lie Pro Val His Leu 180 185 190

Glu Thr Met Glu Pro Gly Ala Ala Tyr Cys Val Lys Ala Gin Thr Phe 195 200 205

Val Lys Ala lie Gly Arg Tyr Ser Ala Phe Ser Gin Thr Glu Cys Val 210 215 220

Glu Val Gin Gly Glu Ala lie Pro Leu Val Leu Ala Leu Phe Ala Phe 225 230 235 240

Val Gly Phe Met Leu lie Leu Val Val Val Pro Leu Phe Val Trp Lys 245 250 255

Met Gly Arg Leu Leu Gin Tyr Ser Cys Cys Pro Val Val Val Leu Pro 260 265 270

Asp Thr Leu Lys lie Thr Asn Ser Pro Gin Lys Leu lie Ser Cys Arg 275 280 285

Arg Glu Glu Val Asp Ala Cys Ala Thr Ala Val Met Ser Pro Glu Glu 290 295 300

Leu Leu Arg Ala Trp lie Ser 305 310 <210> 28 第16頁 201022288 <211> 574 <212> PRT <213>食蟹猴 <400> 28

Met Arg Thr Leu Leu Thr lie Leu Ala Val Gly Ser Leu Ala Ala His 15 10 15

Ala Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gin His Val Lys Phe Gin Ser 20 25 30

Asn Asn Phe Glu Asn lie Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr 35 40 45

Pro Asp Thr Val Tyr Ser lie Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp 50 55 60

Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys Gin Arg lie Thr Arg Lys Ser Cys Asn 65 70 75 80

Leu Thr Val Glu Thr Gly Asn His Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val 85 90 95

Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met Thr Asp Arg 100 105 110

Phe Asn Ser Leu Gin His Thr Ala Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys 115 120 125

He Pro Lys Val Arg Ser lie Gin Met lie Val His Pro Thr Pro Thr 130 135 140

Pro lie kxg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp lie Phe 145 „ 150 155 160

His Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gin Val Asn Arg Thr Tyr Gin 165 170 175

Met His Leu Gly Gly Glu Gin Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr 180 185 190

Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr lie Met lie Cys Val Pro Thr Trp 195 200 205

Ser Lys Lys Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Arg Thr Leu Pro Asp 210 215 220

Arg Thr Trp Thr Tyr Ser Phe Ser Gly Ala Phe Leu Phe Ser Met Gly 225 230 235 240

Phe Leu Val Ala Val Leu Cys Tyr Leu Ser Tyr Arg Tyr Val Thr Lys 245 250 255

Pro Pro Ala Pro Pro Asn Ser Leu Asn Val Gin Arg Val Leu Thr Phe 260 265 270

Gin Pro Leu Arg Phe lie Gin Glu His Val Leu lie Pro Ala Phe Asp 275 280 285 第17頁 201022288

Leu Ser Gly Pro Ser Ser Leu Ala Gin Pro Val Gin Tyr Ser Gin lie 290 295 300

Arg Val Ser Gly Pro Arg Glu Pro Ala Gly Pro Pro Gin Arg His Ser 305 310 315 320

Leu Ser Glu lie Thr Tyr Leu Gly Gin Pro Asp He Ser lie Leu Gin 325 330 335

Pro Ala Asn Val Pro Pro Pro Gin lie Leu Ser Pro Leu Ser Tyr Ala 340 345 350

Pro Asn Ala Ala Pro Glu Val Gly Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gin Val 355 360 365

Thr Pro Glu Ala Gin Leu Pro Phe Tyr Thr Pro Gin Ala Val Ser Lys 370 375 380

Val Gin Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gin Ala Thr Pro Asp Ser Trp Pro 385 390 395 400

Pro Ser Tyr Gly Val Cys Val Glu Gly Ser Gly Lys Asp Ser Pro Thr 405 410 415

Val Thr Leu Ser Ser Pro Lys His Leu Arg Pro Lys Gly Gin Leu Gin 420 425 430

Lys Glu Pro Pro Ala Gly Ser Cys Met Ser Gly Gly Leu Ser Leu Gin 435 440 445

Glu Val Thr Ser Leu Ala Met Glu Glu Ser Gin Glu Ala Lys Ser Leu 450 455 460

His Gin Pro Leu Gly Val Cys Thr Asp Arg Thr Ser Asp Leu Asn Val 465 470 475 480

Leu Asp Ser Gly Glu Glu Gly Thr Pro Gin Tyr Leu Lys Gly Gin Leu 485 490 495

Pro Leu Leu Ser Ser Val Gin lie Glu Gly His Pro Met Ser Leu Pro 500 505 510

Leu His Pro Pro Ser Arg Pro Cys Ser Pro Ser Asp Gin Gly Pro Ser 515 520 525

Pro Trp Gly Leu Leu Glu Ser Leu Val Cys Pro Lys Asp Glu Ala Lys 530 535 540

Ser Leu Ala Pro Glu Thr Ser Asp Leu Glu Gin Pro Thr Glu Leu Asp 545 550 555 560

Ser Leu Phe Arg Gly Leu Ala Leu Thr Val Gin Trp Glu Ser 565 570 <210> 29 <211> 30 第18頁 201022288 <212> DNA <213>智人 <400> 29 agaattccac catgaggacg ctgctgacca <210〉 <211> <212> <213> 3026saa <400> 30 gctcgagaca gggaggaagc accaag 26 <210> 31 <211〉 25 <212> DNA <213>智人 <400> 31 cgaattccct tggtttctgg ggaag 25 ®<210> <211> <212〉 <213> 3227saa <400> 32 gctcgagcac aggaaacaaa aggcaaa 27 <210> <211> <212〉 <213> 3333¾ <400> 33 agaattctgg aaagaaacaa tgttctaggt caa 33 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213>智人 <400> 34 gctcgagctt cacctgggcc cttcc 25 ❿ <210> <211> <212> <213> 鼠 A家 5 5 N \ 3 3 od <400> 35 ccgaattcgc caccatgaag acactactga ccatc 35 <210> 36 <211> 33 <212〉 DNA <213>小家鼠 <400〉 36 cttgcggccg ctcaggattc ccactgcaca gtc <210> <211> <212〉 <213> 鼠 A家 70w-h 7 3 3 D wv 3 第19頁 33 <400> 201022288 ttgaattcgc caccatgcac actcccggga <210〉 <211> <212〉 <213> 鼠 A家 86 3 3 <400> 38 ttgcggccgc ctagctttcc atttgtacat gtaacc <210> <211> <212〉 <213> 鼠 A家 3934S 小 <400〉 39 ttggatccgc caccatgatt tcccagggag tctg <210> <21]> <212> <213> 鼠 A家 4031DN小 <400> 40 ttgcggccgc tcaagtctgt gagatccaga c <210> <211> <212> <213〉猴 A蟹 4130DN食 <400〉 41 agaattccac catgaggacg ctgctgacca <210> <211> <212> <213> 猴 A蟹 4226DN食 <400> 42 gctcgagaca gggaggaagc accaag <210> <211> <212> <213> 猴 A蟹 4321DN食 <400> 43 gtgggactga gcagtctgct g <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213〉食蟹猴 <400> 44 aggcaaaagg aagtgttggc a <210〉 <211〉 <212> <213> 猴 A蟹 4533DN食 <400> 45 agaattctgg aaagaaacaa tgttctaggt caa <210〉 46 201022288 <211> 25 <212> DNA <213〉食蟹猴 <400> 46 gctcgagctt cacctgggcc cttcc 25

第21頁

Claims

201022288 七、申請專利範圍： 1. 一種經分離之抗人類IL20抗體或其抗原結合片段，其包含自包含VH1_03、D3-10及JH6基因之一組人類基因衍生的重鍵可變區。 2. 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID ΝΟ··8之分別對應於Kabat殘基 5 0-65、95-102及31-3 5之CDR2及CDR3序列及視情況存在之CDR1序列。〇 3.如前述申請專利範圍中任一項之抗體或抗原結合片段，其包含自包含VKI_L18及JK4基因之一組人類基因衍生的輕鏈可變區。 4. 如前述申請專利範圍中任一項之抗體或抗原結合片段，其包含SEQ ID NO:9之輕鏈可變序列及SEQ ID NO:6 或SEQ ID NO:7之重鏈可變序列。 5. —種人類抗體或其抗原結合片段，其結合於人類IL20 且具有選自以下之一或多種性質： ® ( a)減少 IL20R1/IL20R2 及 IL22R1/IL20R2 受體複合物之IL20介導之活化； (b) 減少重組表現IL20R1/IL20R2之BaF-3細胞的 IL20介導之增殖； (c) 不減少重組表現IL20R1/IL20R2之BaF-3細胞之IL19或IL24介導之增殖； (d )以約1 nM或更小之KD值結合於人類IL20 ; 201022288 (e)在約pH 7 4之水性緩衝溶液中具有至少約8〇 mg/ml之溶解度。 6. 如申請專利範圍第5項之抗體或抗原結合片段，其與包含含有SEQ ID NO:9之輕鏈可變區及含有SEq ID n〇:6 或SEQ ID ΝΟ··7之重鏈可變區之抗體競爭結合於人類il2〇。 7. 如申請專利範圍第6項之抗體或抗原黠合片段，其結合於包含至少一個選自成熟人類IL2〇 ( SEQ m Ν〇 ι )之 H79-H103之殘基的抗原決定基。 8 ·如申請專利範圍第7項之抗體或抗原結合片段，其中該抗原決定基包含至少一個選自H79_L93之殘基。 9. 如申請專利範圍第5項至第8項中任一項之抗體或抗原結合片段’其包含含有CDR1、CDR2及CDR3序列之重鍵可變區，該等序列分別包含SEQ ID N0:6或SEq ID n〇:7 之 Kabat 殘基 31_35、5〇_65 及 95 i〇2。 10. 如申岬專利範圍帛9項之抗體或抗原結合片段，其〇 3 3有CDRl ' CDR2及COR3序列之輕鏈可變區，該等序列分別包含SEQ ID N〇:9之殘基Μ·”、I%及 89-97。丄1.如刖述申請專利同型。 12·一種醫藥組合物’其包含至少約80 mg/ml之如前申請專利範圍中任—首員之柷體及醫藥學上可接受之賦劑、稀釋劑或載劑。一項之抗體、抗原結合片 13.如前述申請專利範圍中 201022288 段或醫藥組合物’其用於治療發炎性或自體免疫病症。 14. 如申請專利範圍第13項之抗體、抗原結合片段或醫藥組合物，其用於治療類風濕性關節炎、青少年類風濕性關節炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、強直性脊椎炎、休格連氏症候群（Sj0gren’s Syndrome )、多發性硬化症、發炎性腸病、全身性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎或其組合。 15, 種產生抗1L2〇抗體或抗原結合片段之方法，其包 ❹適條件下培養產生如申請專利範圍第"員至第二或抗原結合片=或抗原、β 口片&的Μ細胞及回收該抗體八、圖式：如次頁。 3