CN1997394B - 含有用于调节血管发育的egfl7拮抗剂的组合物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了使用EGFL7拮抗剂调节血管发育的方法。本申请还提供了筛选EGFL7活性调节物的方法。另外，还提供了使用EGFL7拮抗剂的治疗方法。

Description

含有用于调节血管发育的EGFL7拮抗剂的组合物及方法

相关申请 

本申请为按照37CFR§1.53(b)提交的非临时申请，它要求于2004年4月14日按照35 USC§119(e)提交的美国临时申请60/562,054的权益。 

发明领域

本发明通常涉及用于调节血管发育的组合物和方法。具体而言，本发明涉及EGF-样结构域7(EGFL7)，一种新型内皮细胞-衍生的分泌因子。本发明还涉及与血管生成有关的病症及疾病的诊断和治疗。 

发明背景 

血管供给的发育是许多生理和病理过程的基本需要。活跃的生长组织例如胚胎和肿瘤需要足够的血液供给。它们通过生成促血管生成因子满足这种需要，该因子通过一种称为血管生成的过程促进新血管形成。血管形成是一个复杂但有顺序的生物学事件，包括所有或多种下列步骤：a)内皮细胞(EC)从现有EC增殖或从祖细胞分化而来；b)EC迁移并聚结(coalesce)成索(cord)-样结构；c)然后血管索经过血管生成(tubulogenesis)形成具有中央腔的管；d)现存的血管索或血管出芽(sprout)形成次级管；e)初级(primitive)血管丛经过进一步重塑和整形(reshaping)；以及f)募集(recruited)内皮周细胞(peri-endothelialcell)包裹内皮管，为该管提供保护和调节作用；这类细胞包括小毛细血管的外膜细胞、较大血管的平滑肌细胞、以及心脏中的心肌细胞。Hanahan，D.Science 277：48-50(1997)；Hogan，B.L.&′Kolodziej，P.A.Nature ReviewsGenetics.3：513-23(2002)；Lubarsky，B.&Krasnow，M.A.Cell.112：19-28(2003)。 

现在已经很清楚血管生成与多种病症的发病机理有关。这些病症包括实体肿瘤和转移、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生(retrolentalfibroplasias)、血管瘤、慢性炎症、眼内新生血管性疾病例如增生性视网膜疾病，例如糖尿病性视网膜疾病、年龄-有关的黄斑变性(AMD)、新生血管性 青光眼(neovascular glaucoma)、移植角膜及其他组织的免疫排斥、类风湿性关节炎和牛皮癣。Folkman et al.，J. Biol.Chem.，267：10931-10934(1992)；Klagsbrunet al.，Annu.Rev.Physiol.53：217-239 (1991)；和Garner A.，″Vasculardiseases″，In： Pathobiology of Ocular Disease.A Dynamic Approach，Garner A.，Klintworth GK，eds.，2nd Edition(Marcel Dekker，NY，1994)，pp1625-1710。 

就肿瘤生长而言，血管生成对于从增生到肿瘤形成的转变起着决定性作用，并为肿瘤的生长和转移提供营养。Folkman et al.，Nature 339：58(1989)。新血管形成能使肿瘤细胞与正常细胞相比获得生长优势及增殖自主性。肿瘤通常由单个异常细胞开始，其与可利用的毛细血管床的距离决定该细胞只能增殖至几立方毫米大小，并且其能保持“休眠”，而长时间不再生长和扩散。然后一些肿瘤细胞转变成血管生成表型来活化内皮细胞，所述内皮细胞增殖并成熟为新的毛细血管。这些新生成血管不仅可以使原发肿瘤继续生长，而且还可使转移性肿瘤细胞扩散和重建群(recolonization)。因此，现已发现肿瘤切面中的微血管密度与乳腺癌及其他几种肿瘤的患者的存活率相关。Weidner et al.，N.Engl.J. Med 324：1-6(1991)；Horak et al.，Lancet340：1120-1124(1992)；Macchiarini et al.，Lancet 340：145-146(1992)。控制血管生成开关的精确机制还没有研究透彻，但是人们认为肿瘤团块(mass)的新生血管形成源自大量血管生成激活剂和抑制剂的净差平衡(net balance)(Folkman，1995，Nat Medl(1)：27-31)。 

血管发育过程受到严密调节。迄今为止已发现许多分子，其中主要是周围细胞产生的分泌因子，参与调节EC分化、增殖、迁移和聚结成为索-样结构。例如，已经认定血管内皮生长因子(VEGF)是参与刺激血管生成和诱导血管通透性的关键因子。Ferrara et al.，Endocr.Rev.18：4-25(1997)。甚至单个VEGF等位基因的损失都会引发胚胎死亡，这一发现表明该因子在血管系统的发育和分化过程中发挥着不可替代的作用。另外还发现VEGF是肿瘤及眼内病症有关的新血管生成的关键介质。Ferrara et al.，Endocr.Rev.同上文。VEGF mRNA在大多数被检查的人肿瘤中过表达。Berkman et al.，J.Clin.Invest.91：153-159(1993)；Brown et al.，Human Pathol.26：86-91(1995)；Brown et al.，Cancer Res.53：4727-4735(1993)；Mattern et al.，Brit.J. Cancer73：931-934 (1996)；Dvorak et al.，Am.J.Pathol.146：1029-1039(1995)。 

另外，VEGF在房水中的浓度与在患糖尿病和其它缺血一相关性视网膜疾病的患者中存在的血管活性增生是高度相关的。Aiello et al.，N.Engl.J. Med.331：1480-1487(1994)。另外，研究证明VEGF在患AMD的患者中脉络丛新血管形成膜中的定位。Lopez et al.，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.37：855-868(1996)。 

抗-VEGF中和抗体可抑制裸鼠体内各种人肿瘤细胞系的生长(Kimet al，Nature 362：841-844(1993)；Warrenet aL，J. Clin.Invest.95：1789-1797(1995)；Borgstr

m et al.，Cancer Res.56：4032-4039(1996)；Melnyk et al.，Cancer Res.56：921-924 (1996))，还能抑制缺血性视网膜病症模型中的眼内血管生成。Adamis et al.，Arch.Ophthalmol.114：66-71(1996)。因此，抗-VEGF单克隆抗体或其他VEGF作用的抑制物是治疗肿瘤及各种眼内新生血管性病症的有效候选物。这类抗体的描述见，例如，1998年1月14日公开的EP 817,648；以及1998年10月15日公开的WO98/45331和WO98/45332。一种抗-VEGF抗体bevacizumab已经被FDA批准与化疗方案联合用于治疗转移性结肠直肠癌(CRC)。许多进行中的临床试验中正在研究用bevacizumab治疗各种癌症适应症。 

大家都知道细胞外基质(ECM)在血管生成过程中起着重要作用。Madri，Transpl.Immunol.5：179-83(1997)。在其迁移过程中ECs被临时的ECM包围，并在生成腔管后吸附至新合成的血管基质膜。除了在毛细血管形态发生中充当骨架之外，ECM还对ECs功能发挥复杂的局部控制作用。例如，ECM能调节ECs对可溶性血管生成介质的获取，并将与整联蛋白和细胞粘附分子的相互作用的特性及类型特化。另外还发现通过生长因子受体与整联蛋白之间的协作调节EC存活，反过来它们受局部ECM的组成所调控。Stupack andCheresh，Oncogene 22：9022-29(2003)。 

尽管血管生成领域取得了很多进展，但是脉管形成过程中的一些步骤还知之甚少。具体而言，对下列事件几乎一无所知：如何调节血管生成(tubulogenesis)，血管索如何发展成为血管，以及什么因子调节这种转换。鉴于血管生成在许多疾病和病症中的作用，因此期望有一种方法可减少或抑制导致这些过程的一种或多种生物学作用。另外还期望有一种方法来测定正常和患病尤其是癌症情况下致病性多肽是否存在。另外还需要鉴定靶标从而开发出能提高现有抗-血管生成疗法效力的方法。 

发明概述 

本发明是基于对一种新的EC-衍生的分泌因子(EGFL7)的鉴定和表征。EGFL7在与组织增殖相关的脉管系统中以高水平表达，在正常成熟组织的大部分成熟血管中表达下调。EGFL7功能的丧失导致动物胚胎明显的血管缺乏并抑制肿瘤生长。EGFL7根据其结构、表达和活性被认为是一种新的ECM分子。此外，还发现EGFL7支持EC粘附和迁移，对肿瘤血管生成中的血管生成因子起配合作用。另一方面，发现EGFL7拮抗剂能有效阻断EGFL7-相关的EC粘附和迁移。因此，本发明提供了新的组合物及其用于调节(例如，促进或抑制)与血管生成有关的过程的用途。 

在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其中含有与可药用载体混合的EGFL7拮抗剂。一方面，该组合物含有治疗有效量的所述拮抗剂。另一方面，该组合物还含有另一种活性成分，例如，抗-血管生成药剂。优选地，该组合物是无菌的。所述EGFL7拮抗剂可以用液体药物配制剂的形式施用，以此形式保存可具有更高的储藏稳定性。保存型液体药物配制剂可以包含多剂量的EGFL7拮抗剂，因此适于重复使用。在一个优选实施方案中，所述组合物含有一种抗体，该抗体是单克隆抗体、抗体片段、人源化抗体、或单-链抗体。 

在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备用于治疗血管生成相关性病症的组合物的方法，该方法包括将可药用载体与治疗有效量的EGFL7拮抗剂混合。 

另一方面，本发明提供了一种制品，其中含有：(a)含EGFL7拮抗剂的组合物；(b)容纳所述组合物的容器；和(c)附着于所述容器的标签，或所述容器内包括的包装插页，其表明所述EGFL7拮抗剂在治疗血管生成相关的病症中的用途，所述拮抗剂可以是结合EGFL7并阻断其活性的抗体。所述组合物可以包含治疗有效量的所述EGFL7拮抗剂。 

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于鉴定可抑制EGFL7多肽活性的化合物的方法，该方法包括：让待测化合物与EGFL7多肽接触，在一定条件作用足够长的时间，来使所述测试化合物与多肽相互作用，然后测定所述EGFL7多肽的活性是否受到抑制。在一个具体优选的方面，所述被测化合物或所述EGFL7多肽固定于固相支持物上。在另一个优选的方面，所述非-固定成分带有可检测标记物。在一个优选的方面，这种方法包括下列步骤： 

(a)在有EGFL7多肽存在并适于诱导通常由EGFL7多肽诱导的细胞应答的条件下，让细胞和待筛选的待测化合物接触；以及 

(b)通过测定所述细胞应答的诱导情况从而确定所述待测化合物是否是一种有效拮抗剂。 

另一个优选方面，该方法还包括下列步骤： 

(a)在有EGFL7多肽存在并适于EGFL7多肽刺激细胞增殖的条件下，让细胞和待筛选的被测化合物接触；以及 

(b)通过测量细胞增殖情况从而确定所述待测化合物是否是一种有效拮抗剂。 

能抑制EGFL7一种或多种功能或活性的EGFL7多肽拮抗剂的一种类型是抗体。因此，另一方面，本发明还提供了一种结合EGFL7多肽的分离的抗体。一个优选的方面，所述抗体是单克隆抗体，优选具有非-人互补决定区(CDR)残基和人骨架区(FR)残基。所述抗体可以是经过标记的，并且可以被固定在固相支持物上。另一方面，所述抗体是抗体片段、单链抗体、人源化抗体、或人抗体。优选地，所述抗体特异性地结合所述多肽。 

另一方面，本发明提供了一种诊断哺乳动物的心血管、内皮或血管生成病症的方法，该方法包括，分析在(a)获自所述哺乳动物的组织细胞待测样本和(b)已知同种细胞类型的正常组织细胞的对照样本中的EGFL7多肽编码基因的表达水平，其中与对照样本相比待测样本中表达水平较高或较低表明所述哺乳动物患有心血管、内皮或血管生成病症。可选择地，可以任选通过测量与对照样本相比待测样本中的mRNA或多肽水平来测定EGFL7多肽编码基因的表达。 

另一方面，本发明还提供了一种诊断哺乳动物的心血管、内皮或血管生成病症的方法，其中包括：检测获自所述哺乳动物的组织细胞待测样本中是否存在EGFL7多肽，其中所述待测样本中EGFL7多肽是否存在表明所述哺乳动物患有心血管、内皮或血管生成病症。 

在另一实施方案中，本发明提供了一种诊断哺乳动物的心血管、内皮或血管生成病症的方法，该方法包括：(a)让抗-EGFL7抗体与获自所述哺乳动物的组织细胞待测样本接触，和(b)检测所述抗体与待测样本中EGFL7多肽之间的复合体形成，其中所述复合体的形成表明所述哺乳动物患有心血管、内皮或血管生成病症。所述检测可以是定性的或定量的，通过与细胞类型相 同的已知正常组织细胞对照样本中复合体形成监测情况进行对比来进行。待测样本中复合体形成数量的较多或较少表明获取所述组织细胞的哺乳动物患有心血管、内皮或血管生成机能障碍。所述抗体优选带有可检测的标记物。复合物形成的监测，例如，可以通过光学显微镜，流式细胞术，荧光测定法，或者其他本领域已知技术。待测样本通常获自怀疑患有心血管、内皮或血管生成病症的个体。 

另一个实施方案中，本发明提供了一种测定样本中EGFL7多肽存在的方法，该方法包括：将怀疑含有EGFL7多肽的样本暴露于抗-EGFL7抗体，然后测定所述抗体与所述样本成分间的结合。在一具体方面，所述样本含有疑似含有EGFL7多肽的细胞，且所述抗体结合所述细胞。所述抗体优选是可检测标记的和/或结合于固相支持物。 

另一方面，本发明提供了一种心血管、内皮或血管生成病症的诊断试剂盒，其中包括合适包装的抗-EGFL7抗体和载体。优选地，这类试剂盒还包含使用所述抗体检测EGFL7多肽存在的说明书。优选地，所述载体诸如为缓冲液。优选地，所述心血管、内皮或血管生成病症是癌症。 

另一实施方案中，本发明提供了一种减少或抑制具有血管生成相关性病理状况的受试者的血管生成的方法，该方法包括：向所述受试者施用能干扰EGFL7-诱导的内皮细胞迁移的EGFL7拮抗剂，从而减少或抑制所述受试者的血管生成。优选地所述EGFL7拮抗剂是抗-EGFL7抗体。所述拮抗剂的干扰EGFL7-诱导的EC迁移的能力可以通过例如体外细胞迁移试验进行检测。 

在一个优选的实施方案中，所述血管生成相关性病理状况是癌症。在另一个优选的实施方案中，所述血管生成相关性病理状况是眼内新生血管性疾病。在另一优选的实施方案中，所述EGFL7拮抗剂与另一抗-血管生成药剂如抗-VEGF抗体(包括bevacizumab)共同施用。另外，本发明还提供了一种增强抗-血管生成药剂治疗对具有血管生成相关性病理状况的受试者的效力的方法，该方法包括向所述受试者联合施用EGFL7拮抗剂和抗-血管生成药剂。所述方法可用于治疗癌症或眼内新生血管性疾病，特别是那些对单用抗-血管生成药剂治疗反应不佳的疾病或疾病阶段。所述抗-血管生成药剂可以是能够减少或抑制血管生成的任一药剂，包括VEGF拮抗剂例如抗-VEGF抗体。在治疗肿瘤时，单独使用或与抗-血管生成药剂联用的EGFL7拮抗剂可以进一步与包括一种或多种化疗剂的化疗方案联合。另外还可联合放射性治疗以增强效力。

另一实施方案中，本发明提供了一种用于促进哺乳动物血管形成的方法，该方法包括向哺乳动物施用EGFL7多肽或EGFL7多肽激动剂，其中所述哺乳动物中血管形成受到激发。优选地，所述哺乳动物是人。 

另一实施方案中，本发明提供了一种用于刺激哺乳动物血管生成的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的EGFL7多肽或其激动剂。优选地，所述哺乳动物是人，并且更优选血管生成能有效促进组织再生或伤口愈合。 

另一实施方案中，本发明提供了一种用于调控(例如，抑制或刺激)哺乳动物血管形成的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用含有EGFL7多肽、其激动剂或其拮抗剂的组合物。 

另一实施方案中，本发明提供了一种通过调控(例如，诱导或减少)内皮细胞迁移从而调控(例如，诱导或减少)哺乳动物血管生成的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用EGFL7多肽、其激动剂或其拮抗剂，其中所述哺乳动物的内皮细胞迁移受到调控。 

附图说明

图1a和1b显示EGFL7在脊椎动物进化过程中是保守的。a：人、小鼠、爪蟾(Xenopus)和斑马鱼EGFL7s的氨基酸比对。所述EGFL7基因编码一种推定的～30kD的分泌型蛋白质。人(人(Homo sapiens))与小鼠(小鼠(Musmusculus))、蛙(非洲蟾蜍(Xenopus laevis))、斑马鱼(斑马 

(Danio rerio))的氨基酸序列的同源性分别为77.45％、47.14％和42.96％。使用多种算法作结构分析预测EGFL7蛋白质含有下列结构域(在阅读框内从N′-末端开始)：信号序列、EMI结构域a、位于中部的两个EGF-样结构域，后接富含亮氨酸和缬氨酸的C-末端区域。b：斑马鱼EGFL7 cDNA，氨基酸，和内含子序列。标有箭头的线条指示的为两个反义寡聚物AS_-47(SEQ ID NO：6)和AS₁₉₅(SEQ IDNO：7)，以及用于检测内含子保留的PCR引物。 

图2a-2n图示的是EGFL7表达图谱。小鼠(a-b)和斑马鱼(j-n)胚胎的EGFL7整装(whole mount)原位杂交。b：用核坚牢红(nuclear-fast-red)染色的横切片。RBC＝红细胞。j-m：亮箭状物＝侧板(lateral plate)中胚层，暗箭状物＝背主动脉，暗箭头＝ISVs。嵌入图(inset)：躯干的特写。n：cloche突变体。so＝ 体节。c：对EGFL7和PECAM染色的怀孕小鼠子宫。方框(bracket)＝蜕膜。d-i：人肺切片的放射性原位杂交(g-i)和H&E(d-f)。标尺：0.45mm(a，m，n)，0.07mm(b)，0.38mm(c-i)，0.25mm(j，l)，0.15mm(k)，0.26mm(m嵌入图)，和0.04mm(c嵌入图)。 

图3a-3d显示EGFL7基因敲除导致斑马鱼胚胎的血管生成缺陷。用对照(Con-₄₇或Con₁₉₅)或EGFL7反义(AS_-47或AS₁₉₅)寡聚物注射斑马鱼胚胎。a：48hpf时的整体形态学。箭状物标明心包水肿，箭头标明出血。b-d：flil在23hpf(b)和30hpf(c-d)时的表达。d：c的方框中中段躯干脉管系统的特写图。白色箭头：背主动脉的管腔，黑色箭头：后主静脉的管腔，黑色箭状物：节间血管。标尺：0.6mm(a)，0.23mm(d)和0.5mm(b，c)。 

图4a-4h显示EGFL7 KDs中EC数目未改变。在22-体节(a-d)或30hpf(e-h)时，对注射了对照(a，c，e，g)或反义(b，d，f，h)寡聚物的flkl：GFP转基因鱼进行分析。a，b：背视图。e，f：侧视图。c，d，g，h：是在a-b中白线标明的水平上制作的横向切片，e-f用鬼笔毒环肽和DAPI复染。PD：原肾管，So：体节，N：脊索，白色箭状物：动脉ECs，白色箭头＝静脉ECs，DA＝背主动脉，PCV＝后主静脉。标尺：0.33mm(a，b)，0.03mm(c，d，g，h)，0.47mm(e，f)。 

图5a-5g显示EGFL7促进EC的粘附。人脐带血管内皮细胞(HUVEC)的粘着斑蛋白染色显示：纤连蛋白(b)、I型胶原蛋白(c)和EGFL7(d)上形成粘着斑，而BSA(a)上没有。对EGFL7的粘附强度弱于对胶原蛋白或纤连蛋白的粘附强度，因为于46g离心后粘附在EGFL7基质上的细胞较少(e)。抗-EGFL7抗体以剂量-依赖性方式封闭HUVEC对EGFL7的粘附，而不是对纤连蛋白的粘附，这验证了基质的特异性。对照抗体(抗-B7x)对任一基质都没有影响(f)。g：在不同基质上HUVEC粘附的动力学。标尺：0.03mm(a-d)。 

图6图示的是EGFL7^-/-纯合(n＝11)和EGFL7^+/-杂合(n＝11)敲除小鼠中B16黑素瘤肿瘤的生长速率比较。 

图7a-7b图示的是对EGFL7^-/-纯合敲除小鼠(n＝10)与其野生型同窝动物(littermate)(n＝13)中B16黑素瘤肿瘤的发病率和生长速率的比较。7b中不包括无肿瘤小鼠。 

发明详述 

定义 

除另有说明外，本申请中的科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。参见，例如，Singleton et al.， Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology 2nd ed.，J.Wiley&Sons(New York，NY1994)；Sambrook et al.， Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringsHarbor Press (Cold Springs Harbor，NY 1989)。为了本发明，下列术语定义如下。 

在本文中，术语“EGFL7”和“EGFL7多肽”交互使用，是指天然序列EGFL7、EGFL7变体和嵌合EGFL7，这些术语在本申请中都有定义。任选地，所述EGFL7与天然糖基化无关。“天然糖基化”是指当EGFL7在哺乳动物细胞中生成，特别是在自然生成EGFL7的细胞中时，糖部分共价连接于EGFL7。因此，用非-人细胞制备的人EGFL7可以是“与天然糖基化无关”的EGFL7的实例。有时所述EGFL7可以完全未糖基化，例如当在原核细胞例如大肠杆菌中生成时。 

EGFL7核酸是编码上述EGFL7多肽的RNA或DNA，或者能与所述DNA或RNA杂交且在严谨杂交条件下稳定结合的的RNA或DNA，其长度大于约10个核苷酸。严谨条件是指：(1)使用低离子强度和高温洗涤，例如，0.15MNaCl/0.015 M柠檬酸钠/0.1％NaDodSO₄，50℃，或(2)在杂交过程中使用变性剂例如甲酰胺，例如50％(vol/vol)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)，和750 mM NaCl，75mM柠檬酸钠，42℃。 

当与另一核酸序列发生功能关联时，核酸与其可操作地连接。EGFL7核酸可以在载体中与另一核酸序列可操作地连接，从而可以表达于具体宿主生物体中。这些都可以使用本领域熟知方法实现。例如，如果表达为参与多肽分泌的前蛋白，前序列或分泌性前导序列的DNA会可操作地连接该多肽的DNA；如果影响编码序列的转录，那么启动子或增强子会可操作地连接该序列；或如果位于利于翻译的位置，那么核糖体结合位点会可操作地连接编码序列。通常，“可操作地连接”意指被连接的DNA序列是毗邻的，并且如果是分泌性前导序列，应是相邻的并且处于阅读框中。然而，增强子不一定是毗邻的。通过在方便的限制位点接合可实现连接。如果此种位点不存在，那么按照常规作法使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。 

“天然序列EGFL7”包括具有与自然界衍生的EGFL7相同氨基酸序列的 多肽，与其制备方式或来源物种无关。因此，天然序列EGFL7可以具有天然出现的下列种类EGFL7的氨基酸序列：人EGFL7、鼠EGFL7、爪蟾EGFL7、斑马鱼EGFL7或来自任一其他物种的EGFL7。例如，优选的全长天然序列人EGFL7氨基酸序列如图1A所示(SEQ ID NO：1)。例如，天然序列小鼠EGFL7氨基酸序列如图1A所示(SEQ ID NO：2)。所述天然序列EGFL7可以从自然界分离或者可以通过重组或和/或合成手段制备。该术语“天然序列EGFL7”具体包括天然出现的EGFL7的前原、原和成熟形式以及截短的形式，天然出现的变体形式以及天然出现的等位变体。 

“EGFL7变体”是生物学活性的EGFL7多肽，具有不同于EGFL7多肽天然序列的氨基酸序列，例如图1A分别列出的人、鼠、爪蟾和斑马鱼EGFL7(SEQID NO：1-4)，由于在所述天然序列中插入、缺失、修饰和/或取代一个或多个氨基酸残基。EGFL7变体与EGFL7天然序列例如SEQ ID NO：1所示的人EGFL7之间通常具有小于100％的序列同一性。但是，通常，一种生物学活性的EGFL7变体与天然出现的EGFL7的氨基酸序列例如SEQ ID NO：1之间具有至少约70％的氨基酸序列同一性，优选至少约75％，更优选至少约80％，更优选至少约85％，甚至更优选至少约90％，以1％递增优选从至少约95％至至少约99％的氨基酸序列同一性。所述EGFL7变体包括至少约5个氨基酸且仍保留相应天然序列EGFL7多肽生物活性的肽片段。EGFL7变体另外还包括在天然EGFL7序列N-或C-末端或者内部添加了一个或多个氨基酸残基的EGFL7多肽。EGFL7变体另外还包括其中有多个氨基酸残基缺失，以及任选被一个或多个氨基酸残基取代的EGFL7多肽。EGFL7变体还可以是经过共价修饰的，例如用除天然出现的氨基酸之外的部分取代，或者修饰氨基酸残基得到一种非天然出现的氨基酸。EGFL7变体可以包含肝素结合结构域。 

在本文申请中就EGFL7序列而言的“氨基酸序列同一性百分比”是指，在经过序列比对后，与EGFL7序列中的残基相同的氨基酸残基在候选序列中的百分比，如有必要的话，引入缺口来实现最大百分比序列同一性，而不将任一保守取代当作序列同一性的一部分。候选EGFL7序列的N-末端、C-末端或内部的延伸，缺失或插入都不被认为会影响序列同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序已为本领域所熟知。一种这样的电脑程序是Genentech编制的“ALIGN-2”，该程序和用户文件已经提交地处Washington，D.C.20559的美国版权局，其美国版权登记号为TXU510087。 

“嵌合的EGFL7”分子是一种多肽，其中含有融合于或键合于异源多肽的全长EGFL7或其一或多个结构域。所述嵌合的EGFL7分子通常具有至少一种与天然出现的EGFL7共同的生物学特性。嵌合的EGFL7分子的实例是为纯化而加了标签的表位。另一种嵌合的EGFL7分子是免疫粘合素。 

“分离的EGFL7”是指已经从EGFL7来源纯化的或者通过重组或合成方法制备然后再纯化的EGFL7。纯化的EGFL7基本上不含其他多肽或肽。本申请中的“基本上不含”是指污染的其他来源蛋白质的量少于约5％，优选少于约2％，更优选少于约1％，更优选少于约0.5％，最优选少于约0.1％。 

“基本上纯的”蛋白质是指，根据组合物总重量计组合物中含有至少约90％重量百分比，优选至少约95％重量百分比，更优选至少约90％重量百分比，更优选至少约95％重量百分比的所述蛋白质。“基本上同质的”蛋白质是指以组合物总重量计，组合物中含有至少约99％重量百分比的蛋白质。 

所述术语“拮抗剂”取其广义使用，包括能部分地或完全地封闭、抑制或中和天然EGFL7多肽生物活性的任一分子。合适的拮抗剂分子具体地包括拮抗剂抗体或抗体片段，天然的EGFL7多肽的片段或氨基酸序列变体，肽，EGFL7受体的可溶性片段，有机小分子，等。用于鉴定EGFL7多肽的激动剂或拮抗剂的方法包括：上EGFL7多肽与候选的激动剂或拮抗剂分子接触，测量通常与所述EGFL7多肽相关的一种或多种生物学活性的可检测变化。 

“活性的”或“活性”在本文中是指EGFL7的形式，其保留了天然的或天然出现的EGFL7的生物学和/或免疫学活性，其中“生物学”活性是指，除诱导产生针对天然的或天然出现的EGFL7所具有的抗原表位的抗体之外，天然的或天然出现的EGFL7所带来的生物学功能(抑制或刺激)，“免疫学”活性是指诱导产生针对天然的或天然出现的EGFL7所具有的抗原表位的抗体。 

因此，“生物学活性”当与“EGFL7”或“分离的EGFL7”或EGFL7激动剂连用时，意指具有或部分具有天然序列EGFL7的效应功能的EGFL7多肽。EGFL7的首要效应功能是其促进血管形成的能力。更优选地，所述生物活性是调控血管生成的能力。 

“EGFL7受体”是能与EGFL7结合并能介导EGFL7生物学特性的分子。 

本文中的术语“抗体”使用取其广义，具体包括人的、非-人(例如鼠)的和人源化的单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它们体现了理想的生物活性。 

“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同结构特性的糖蛋白。尽管抗体体现了针对具体抗原的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体及其他无抗原特异性的抗体-样分子。后一种类型的多肽是，例如，由淋巴系统低水平制备的以及由骨髓瘤高水平制备的。 

“天然的抗体”和“天然的免疫球蛋白”通常是约150,000道尔顿的杂合四聚糖蛋白，由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。每一轻链通过一个共价的二硫键连接于一个重链，但不同的同种型免疫球蛋白重链中二硫键数目各不相同。每条重链和轻链都具有间隔规律的链内二硫键。每条重链的一端具有一个可变区(V_H)，后接多个恒定区。每条轻链的一端具有一个可变区(V_L)，另一端具有一个恒定区；轻链的恒定区和重链的第一恒定区连接在一起，轻链可变区与重链可变区排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链可变区和重链可变区之间形成一个界面。 

术语“可变”是指下述事实：在抗体序列的可变区的某些部分有很大差异，且它们在每一具体抗体针对其具体抗原的结合和特异性方面发挥作用。然而，所述可变性并非均匀分布于抗体的整个可变区。而是集中于轻链和重链的可变区中被称为高变区的3个节段内。可变区中高度保守的区域称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各包括4个FR(分别为FR1、FR2、FR3和FR4)，大都采取β-折叠构型，被3个形成连接环的高变区连接在一起，在一些情况下形成所述β-折叠结构的一部分。每条链的高变区通过FR紧密相靠，并且与另一条链的高变区一起形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat etal.， Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)，pages647-669)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用。 

本文中术语“高变区”是指负责结合抗原的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变区中的第24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)位残基和重链可变区中的第31-35(H1)，50-65(H2)及95-102(H3)位残基；Kabat et al.， Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))，和/或来自“高变环”的氨基酸残基(即，轻链可变区中的第26-32(L1)，50-52(L2)及91-96(L3)位残基和重链可变区中的第 26-32(H1)，53-55(H2)及96-101(H3)位残基；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。在本申请中“骨架”或“FR”残基是指可变区中除高变区残基之外的残基。 

木瓜蛋白酶消化抗体得到两个相同的抗原结合片段，各带一个抗原结合位点，称为“Fab”片段，和剩余的“Fc”片段，该名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理得到F(ab′)₂片段，该片段具有两个抗原-结合位点，仍能交联抗原。 

“Fv”是最小的含有完整抗原-识别和-结合位点的抗体片段。该区域是由一个重链可变区和一个轻链可变区紧密、非-共价结合的二聚体组成。该结构中每一可变区中的3个高变区相互作用形成V_H-V_L二聚体表面上的抗原结合位点。总之，所述6个高变区赋予抗体抗原-结合特异性。但是，即使是单个可变区(或仅含有3个抗原特异性高变区的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，但与完整的结合位点相比其亲和力较低。 

Fab片段还含有轻链恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab′片段不同于Fab片段，因为在重链CH1区羧基末端添加了数个残基，包括来自抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸。本申请中的Fab′-SH为其恒定区的半胱氨酸残基带有游离巯基的Fab′。F(ab′)₂抗体片段最初由之间具有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段制备而成。其他抗体片段的化学偶联也已知。 

根据其恒定区氨基酸序列，任一脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”都可以被划分为两种不同的型，称为kappa(κ)和lambda(λ)。 

根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。免疫球蛋白不同类的重链恒定区分别称为α，δ，ε，γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构象已经熟知。 

“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab′，F(ab′)₂，和Fv片段；二价抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多-特异性抗体。 

本文所用术语“单克隆抗体”指来自基本均一的抗体群的抗体，即，除了可能少量存在的天然突变以外，该抗体群中的各个抗体均相同。单克隆抗体具有高度特异性，仅针对单个抗原位点。而且，与通常包括针对不同决定簇 (表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表示来自基本均一的抗体群的抗体的性质，它不是为了要求通过任何具体方法来产生该抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可用Kohler et al.，Nature 256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法来产生，或用重组DNA方法(见例如美国专利4,816,567)来产生。“单克隆抗体”也可用例如Clackson et al.，Nature 352：624-628 (1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)描述的技术从噬菌体抗体文库分离。 

本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自具体物种或属于具体的抗体分类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，而该链的其它部分与源自另一物种或属于另一抗体分类或亚类的抗体(以及此抗体的片段，只要它们显示所需的生物学活性)的对应序列相同或同源(美国专利4,816,567；和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855(1984))。 

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体大部分是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者高变区的残基被来自非人物种(如具有理想的特异性，亲合力和能力的小鼠，大鼠，兔子，或非人灵长类动物)(供者抗体)的高变区的残基取代。在有些情况，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。而且，人源化抗体可包含在受者抗体或供者抗体中未发现的残基。这些修饰旨在进一步改善抗体的性能。通常，人源化抗体基本包含至少一个(通常包含两个)可变区的全部，其中所有或基本上所有的高变区对应于非人免疫球蛋白的相应部分，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的相应部分。人源化抗体也可选包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白。更多细节见Jones et al.Nature 321：522-525(1986)；Reichmann et al.Nature332：323-329(1988)；和Presta Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。 

“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。通常，Fv多肽还包含V_H和V_L结构域之间的多肽接头，该接头使sFv形成结合抗原的理想结构。对sFv的综述见Pluckthun in  ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。 

术语“二价抗体”指带两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在相 同的多肽链(V_H-V_L)中相连的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)。通过使用太短从而不能在相同链的两个结构域间配对的接头，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。对二价抗体的描述更多见例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448(1993)。 

本申请中使用的表述“线性抗体”是指Zapata et al.Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)描述的抗体。简而言之，这些抗体包含形成成对的抗原结合区的成对串联Fd节段(V_H-C_Hl-V_H-C_Hl)。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。 

术语“表位”是指蛋白质抗原上结合(单克隆或多克隆)抗体的位点。 

“激动剂抗体”指一种抗体，其为EGFL7激动剂因此具有天然序列EGFL7的一种或多种生物学特性。 

术语“EGFL7免疫粘附素”与术语“EGFL7-免疫球蛋白嵌合体”交互使用，是指一种由至少一部分EGFL7分子(天然的或变体)与免疫球蛋白序列组合而成的嵌合分子。所述免疫球蛋白序列优选地，但非必需，是免疫球蛋白恒定区。免疫粘附素可以具有人抗体的多种有价值的化学及生物学特性。由于免疫粘附素可以通过将具有理想特异性的人蛋白质序列连接于合适的人免疫球蛋白铰链及恒定区(Fc)序列构建而成，所以目的结合特异性可以使用完整的人源成分实现。所述免疫粘附素对于所述患者而言具有最低的免疫原性，可以安全地长期或重复使用。 

已经公开了治疗用途的同源多聚免疫粘附素实例包括用于阻断HIV与细胞-表面CD4结合的CD4-IgG免疫粘附素。向临产孕妇施用CD4-IgG的I期临床试验获得的数据表明：该免疫粘附素可用于预防HIV的母亲-胎儿传播(Ashkenazi et al.，Intern.Rev.Immunol.10：219-227(1993))。能结合肿瘤坏死因子(TNF)的免疫粘附素也已开发。TNF是已证明为脓毒性休克的主要介质的促炎症反应细胞因子。基于脓毒性休克的小鼠模型显示，TNF受体免疫粘附素是治疗脓毒性休克的临床应用的可靠侯选物(Ashkenazi，A.et al.PNASUSA 88：10535-10539(1991))。ENBREL

(依那西普(etanercept))，一种含融合于IgG Fc区的TNF受体序列的免疫粘附素，已于1998年11月2日被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于类风湿性关节炎的治疗。FDA于2000年6月6日批准了ENBREL在治疗类风湿性关节炎方面的新的扩展用途。TNF阻断剂的最 新资料，包括ENBREL

，参见Lovell et al.，N.Engl.J. Med.342：763-169(2000)，和p810-811上的编辑评论；以及Weinblatt et al.，N.Engl.J.Med.340：253-259(1999)；综述见Maini and Taylor，Annu.Rev.Med.51：207-229(2000)。 

如果免疫粘附素结构的双臂具有不同的特异性，由双特异性抗体类推，那么所述免疫粘附素被称作“双特异性免疫粘附素”。Dietsch et al.，J.Immunol.Methods 162：123(1993)描述了组合了粘附分子胞外结构域、E-选择蛋白和 P-选择蛋白的双特异性免疫粘附素，在自然界中这些选择蛋白表达于不同的细胞类型。结合试验显示：与其起源的单特异性免疫粘附素相比，这样形成的双特异性免疫球蛋白融合蛋白与髓样细胞系结合力增强。 

术语“杂合粘附素”与“嵌合杂合多聚粘附素”交互使用是指嵌合分子(氨基酸序列)的复合体，其中每个嵌合分子将生物学活性部分，例如每个杂合多聚受体单体的胞外结构域与多聚化结构域组合。所述“多聚化结构域”能促进杂合多聚复合体内嵌合分子的稳定的相互作用。所述多聚化结构域可通过免疫球蛋白序列、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区或者游离的硫醇在所述嵌合杂合多聚体的嵌合分子之间形成分子间二硫键来相互作用。所述多聚化结构域可以包含免疫球蛋白恒定区。此外，可以构建多聚化区域，从而使空间相互作用不仅能促进稳定的相互作用，而且还能促进单体混合物形成异源二聚体超过同源二聚体。“突起”可以通过下述方式构建：用较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)取代第一多肽界面的较小的氨基酸侧链。通过用较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代较大的氨基酸侧链，可任选地在第二多肽的界面上构建与所述突起大小相同或近似的互补“腔”。所述免疫球蛋白序列优选地，但非必需，是免疫球蛋白恒定区。本发明嵌合体中的免疫球蛋白部分可获自IgG₁，IgG₂，IgG₃或IgG₄亚型，IgA，IgE，IgD或IgM，但优选IgG₁或IgG₃。 

在本申请中，“治疗”是为获得有益或期望的临床结果而采取的措施。对于本发明而言，有益的或期望的临床结果包括，但不限于，症状减轻，疾病范围减小，疾病状态稳定(即，未恶化)，病程延缓或减慢，病情改善或缓，以及症状减退(部分或全部)，不论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可用于指与不接受治疗时预期存活相比存活的延长。“治疗”是为了预防病症发展或改变病症病理而实行的干预手段。因此，“治疗”既可以是治疗性治疗也可以是预防性治疗。需要治疗的对象包括已经患病的以及预防发病的对象。 特异性地，所述治疗可以直接预防、减慢或减少细胞变性或损伤的病理，例如癌症治疗中肿瘤细胞的病理，或者使得所述细胞对其他治疗剂的治疗更敏感。 

“长期”施用是指以与短期模式不同的连续方式施用药剂，从而使初始疗效(活性)保持更长的时间。“间歇”施用是不中断的非连续治疗，其实质是周期性的。 

为了治疗目的的“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人，其他高等灵长类，家畜及农畜，观赏动物，竞技动物或宠物，例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔，等。优选地，所述哺乳动物是人。 

本文中“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长及增殖，不管是恶性的还是良性的，以及所有的原癌及癌的细胞和组织。 

术语“癌症”和“癌性”是指或者描述哺乳动物中通常特征在于不受调控的细胞生长的生理状态。癌症的例子包括但不限于，癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病。癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌以及肺鳞状癌)、腹膜癌，肝细胞癌，胃或肠的癌症(包括胃肠癌)、胰腺癌，恶性胶质瘤(glioblastoma)，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌(endometrial carcinoma)或子宫癌，唾液腺癌，肾或肾的癌，肝癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝的癌以及各种类型的头颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级扩散性NHL；高级成免疫细胞NHL；高级成淋巴细胞NHL；高级小无裂细胞(small non-cleaved cell)NHL；巨块病(bulky disease)NHL；套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；AIDS-相关性淋巴瘤；以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’s Macroglobulinemia))；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性成淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；以及移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病(phakomatoses)有关的异常血管增殖，水肿(例如与脑瘤有关的)，以及梅热综合征(Meigs’ssyndrome)。 

“化疗剂”是在癌症治疗中使用的化学化合物。化疗剂实例包括烷化剂，如噻替哌(thiotepa)和CYTOXAN环膦酰胺(cyclosphamide)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类 (aziridines)如苄替哌(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，关妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；乙烯亚胺(ethylenimine)和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenins)(具体是bullatacin和bullatacinone)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括它的阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；cryptophycins(具体是cryptophycin l和cryptophycin 8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CBl-TMl)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥； 美法仑(melphalan)，新氮芥(novembichin)，胆甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)，松龙苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素诸如enediyne抗生素(例如calicheamicin，具体是calicheamicin gammalI和calicheamicin omegaIl(见，例如，Agnew， Chem Intl.Ed.Engl.， 33：183-186(1994))；dynemicin，包括dynemicin A；二膦酸盐(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；esperamicin；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色素蛋白enediyne抗生素生色团)，aclacinomysins，放射菌素(actinomycin)，authramycin，氮丝氨酸(azaserine)，博莱霉素(bleomycin)，放线菌素C(cactinomycin)，carabicin，去甲柔红霉素(carminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，chromomycinis，更生霉素(dactinomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星，氰基吗啉代-多柔比星，2-吡咯啉(pyrrolino)-多柔比星和去氧多柔比星)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，发波霉素(marcellomycin)，丝裂霉素诸如丝裂霉素C，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三 铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素(streptonigrin)；链脲霉素(streptozocin)，杀结核菌素(tubercidin)，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)，氨甲蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，doxifluridine，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷；雄激素类如卡普睾酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)，环硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类如氨鲁米特(aminoglutethimide)，邻氯苯对氯苯二氯乙烷(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂如frolinic acid；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；醋酸羟哔咔唑(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登素类(maytansinoids)诸如美登素(maytansine)和柄型菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼树酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK

多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；单端孢霉烯(trichothecene)(具体是T-2毒素，verracurin A，杆孢菌素(roridin)A和anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春碱酰胺；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；溴丙哌嗪(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa)；紫杉烷(taxoid)，如TAXOL

紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)，ABRAXANE^TM无克列莫佛(Cremophor-free)，紫杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒配制剂(albumin-engineered nanoparticle formulation of paclitaxel)(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)，和TAXOTERE

多西紫杉醇(Rhne-Poulenc Rorer，Antony，France)；chloranbucil；GEMZAR吉西他滨(gemcitabine)；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂配位复合物(platinumcoordinate complex)如顺铂、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春花碱；铂；鬼臼乙叉甙(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱；NAVELBINE长春瑞宾(vinorelbine)；二羟蒽二酮(novantrone)二替尼泊甙(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；卡培他滨(xeloda)；伊拜膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸(leucovorin)的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluorometlhylormithine，DMFO)；维甲酸类(retinoids)诸如维甲酸；希罗达(capecitabine)；以及上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物。 

此定义还包括能调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素制剂，如抗雌激素制剂和选择性雌激素受体调节物(SERM)，包括，例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX

他莫昔芬)，雷洛昔芬(raloxifene)，屈洛昔芬(droloxifene)，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LYl17018，奥那司酮(onapristone)，和FARESTON·托瑞米芬(FARESTON·toremifene)；芳香酶抑制物(aromatase inhibitor)，其抑制芳香酶，该酶调节肾上腺中的雌激素生成，诸如，例如4(5)-咪唑，氨鲁米特(aminoglutethimide)，MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)，AROMASIN

依西美坦(exemestane)，福美司坦(formestanie)，法倔唑(fadrozole)，RIVISOR伏氯唑(vorozole)，FEMARA 来曲唑(letrozole)，和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole)；和抗雄激素制剂如氟他氨(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)，比卡鲁胺(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，具体是抑制异常细胞增生所涉及的信号途径中的基因表达的那些反义寡核苷酸，诸如，例如，PKC-α，Ralf和H-Ras；核糖酶诸如VEGF表达抑制剂(例如，ANGIOZYME核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗诸如基因治疗疫苗，例如，ALLOVECTIN疫苗，LEUVECTIN

 疫苗，和VAXID疫苗；PROLEUKINrIL-2；LURTOTECAN

拓扑异构酶1抑制物；ABARELIX

rmRH，和上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物。 

“眼内新生血管性疾病”是一种以眼睛新生血管形成为特征的疾病。眼内 新血管疾病的实例包括，但不限于，增生性视网膜病，脉络膜的新生血管生成(CNV)，年龄-相关的黄斑变性(AMD)，糖尿病及其他缺血-相关的视网膜病，糖尿性黄斑水肿，病理的近视，病理性近视，希林二氏病(von Hippel-Lindau disease)，眼睛的组织胞浆菌病，视网膜中央静脉闭塞(CRVO)，角膜新生血管生成，视网膜新生血管形成，等。 

疾病的“病理”包括损害患者健康的全部现象。对于癌症而言，这些包括，但不限于，异常的或无法控制的细胞生长，转移，干扰邻近细胞的正常功能，细胞因子或其他分泌产物的异常水平释放，炎性或免疫学反应的抑制或加重，等。 

与一种或多种其他治疗剂“联合”施用包括同时(一起)以及按任何顺序连续施用。 

本申请中使用的“载体”包括可药用载体、赋形剂或稳定剂，它们以使用剂量和浓度施用时对所接触的细胞或哺乳动物是无毒的。通常可生理接受的载体是一种含水的pH缓冲溶液。可生理接受的载体包括缓冲液例如磷酸盐，柠檬酸盐及其他有机酸缓冲液；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，例如血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其他碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨醇；成盐平衡离子例如钠；和/或非离子型表面活性剂例如TWEEN^TM，聚乙二醇(PEG)，和PLURONICS^TM。 

“脂质体”是一种由各种脂类、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，可用于递送药物(例如EGFL7多肽或其抗体)至哺乳动物。脂质体的组分通常以类似于生物膜脂质排列的双层结构来排列。 

本文所述的“小分子”是指分子量小于约500道尔顿。 

本文中的术语“血管内皮生长因子”、“VEGF”、“VEGF多肽”和“VEGF蛋白质”包括了天然序列VEGF和VEGF变体(本文将进一步定义)。所述VEGF多肽可以分离自多种来源，例如来自人组织类型或来自其他来源，或者通过重组和/或合成方法制备。 

“天然序列VEGF”包括具有与自然界衍生的VEGF相同氨基酸序列的多肽。所述天然序列VEGF可以从自然界分离或者可以通过重组或和/或合成手段制备。术语“天然序列VEGF”具体包括VEGF的天然出现的截短型或分泌 型的形式(例如，胞外结构域序列)，天然出现的变体形式(例如，可选剪接形式)以及天然出现的等位变体。本发明的一个实施方案中，所述天然序列VEGF是5种已知同工型其中之一，这5种同工型分别由121、145、165、189和206个氨基酸残基组成，描述见例如，美国专利5,332,671和5,240,848；PCT公开号WO 98/10071的专利文献；Leung et al.，Science 246：1306-1309(1989)；和Keck et al.，Science 246：1309-1312(1989)。 

“VEGF变体多肽”是指下文定义的活性VEGF多肽，其与天然序列VEGF的氨基酸序列具有至少约80％，优选至少约85％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％，最优选至少约98％的氨基酸序列同一性。所述VEGF变体多肽包括，例如，在天然序列的N-和/或C-末端以及一个或多个内部结构域中添加或缺失一个或多个氨基酸残基得到的VEGF多肽。 

VEGF的序列同一性(氨基酸或核酸)是用与针对EGFL7具体描述的方法相同的方法测定的。类似地，EGFL7的激动剂和拮抗剂的定义，包括但不限于抗体，同样适合于VEGF激动剂和拮抗剂。 

本发明的实施方式 

EGFL7 

所述EGFL7基因编码一种分泌型、进化上保守的、～30kD的ECM相关蛋白。人氨基酸序列(SEQ ID NO：1)与小鼠(小鼠；SEQ ID NO：2)、蛙(非洲蟾蜍；SEQ ID NO：3)和斑马鱼(斑马

SEQ ID NO：4)之间分别具有约77％、47％和43％的同源性。所述EGFL7蛋白在N-末端含有信号序列EMI结构域(EMI结构域存在于许多参与调节细胞粘附的胞外基质相关蛋白中)，后接两个EGF-样结构域和一个富含亮氨酸和缬氨酸的C-末端区。 

核酸和多肽分子在本发明中使用。所述人、小鼠、爪蟾和斑马鱼EGFL7氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：1-4所示(参见图lA)。斑马鱼cDNA(含部分基因组内含子序列)如SEQ ID NO：5所示(参见图1B)。用于本发明的多核苷酸可以使用本领域技术人员熟知的标准技术，例如杂交筛选和PCR方法获得。 

EGFL7的登录号为：NM_016215(人EGFL7/VE-抑制素)，NM_178444(小鼠EGFL7)，AFl84973(小鼠Notch4-样)，P_AAZ37135(小鼠TANGO125)，BC044267(非洲蟾蜍NEU1)。AY542170(斑马

EGFL7)。Egfl8登录号是：NM_030652(人)，NM_152922(小鼠)。 

EGFL7活性调节因子的制备和鉴定 

本发明还提供了筛选化合物来鉴定那些模拟或增强EGFL7的一种或多种生物活性(激动剂)或者抑制或减少EGFL7的效力(拮抗剂)的化合物的方法。EGFL7激动剂和拮抗剂又称EGFL7调节因子。设计筛选拮抗剂药物候选物的试验来鉴定与EGFL7多肽结合或复合、或者干扰EGFL7与其它细胞蛋白质相互作用的化合物。 

小分子筛选

小分子可以具有EGFL7激动剂或拮抗剂的能力，因此具有治疗用途。所述小分子可以包括天然出现的小分子，合成的有机或无机化合物和肽。但是，本发明中的小分子不局限于这些形式。小分子的大规模文库(Extensivelibraries)可从市场上买到，并且本领域熟知筛选具有理想活性的这些分子的多种试验。 

侯选的EGFL7激动剂或拮抗剂小分子优选首先在能快速鉴定潜在的EGFL7活性调节因子的试验中鉴定。这类试验的一个实例是蛋白质-蛋白结合测定试验，其中对候选分子与EGFL7受体结合的能力进行测量。另一实例中，测量候选分子干扰EGFL7与EGFL7受体结合的能力。 

一个优选实施方案中，小分子EGFL7激动剂通过它们模拟一种或多种EGFL7生物学活性的能力来鉴定。例如，筛选小分子如下的能力：诱导内皮细胞增殖，促进内皮细胞存活，如下文实施例2和3中所述，或者诱导血管生成，如下文实施例4中所述。 

另一个实施方案中，小分子EGFL7拮抗剂通过它们抑制一种或多种EGFL7生物学活性的能力来鉴定。因此，让候选化合物与EGFL7接触。然后测定EGFL7的生物活性。一个实施方案中，测定EGFL7刺激内皮细胞增殖的能力，例如，如实施例2所述。另一个实施方案中，测定EGFL7促进内皮细胞存活的能力，例如，如实施例3中所述。当EGFL7的生物活性受抑制，一种化合物被鉴定为拮抗剂。 

鉴定为EGFL7激动剂或拮抗剂的化合物可以用于本发明所述方法。例如，EGFL7拮抗剂可用于治疗癌症。 

筛选与EGFL7相互作用的蛋白质的试验 

适合检测蛋白质-蛋白质相互作用的任何方法可用于鉴定可与EGFL7相互作用的蛋白质或其他分子，包括但不限于跨膜或胞内的蛋白质。可以使用的常规方法有共免疫沉淀法、交联及通过梯度或层析柱共纯化，来鉴定与EGFL7相互作用的蛋白质。就所述试验而言，所述EGFL7成分可以是全长的蛋白质，其可溶性衍生物，对应于目的结构域的肽，或者含EGFL7一些区域的融合蛋白。 

可以使用能同时鉴定编码与EGFL7相互作用的蛋白质的基因的方法。这些方法包括，例如，使用经过标记的EGFL7或其变体，以与熟知的抗体探测8gtll文库技术类似的方式探测表达文库。 

体内检测蛋白质相互作用的方法，双杂交系统，其详细描述仅供说明之用决不应构成限制。该系统的一个版本已被描述(Chien et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9578-9582(1991))并可购自Clontech(Palo Alto，CA)。 

简而言之，使用所述系统，构建编码两种杂合蛋白的质粒：其中一种质粒由编码转录活化蛋白的DNA-结合结构域的核苷酸和编码EGFL7、或其多肽、肽或融合蛋白的核苷酸序列融合组成，另一质粒由编码转录活化蛋白的活化结构域的核苷酸和与编码未知蛋白且已作为cDNA文库一部分重组入该质粒的cDNA融合组成。将DNA-结合结构域融合质粒和cDNA文库转化入含报道基因(例如，HBS或lacZ)的酿酒酵母菌株，其调控区中含有转录活化子的结合位点。两种杂合蛋白中的任何一种都不能单独活化报道基因的转录：DNA-结合结构域杂合体不能活化是由于其无法提供活化功能，而活化结构域杂合体不能活化则是由于其无法定位至活化子的结合位点。两种杂合蛋白的相互作用重构了功能活化蛋白质，因而导致报道基因的表达，这一点可以通过报道基因产物的试验来检测。 

所述双杂交系统或相关方法可用于筛选活化结构域文库，筛出能与“饵”基因产物相互作用的蛋白质。例如，但不限于，可以使用EGFL7作为饵基因产物。可以将整个基因组或cDNA序列融合于活化结构域的编码DNA。将此文库和编码饵EGFL7基因产物与DNA-结合结构域融合的杂合体的质粒共转化入酵母报道菌株，从所得转化子中筛选出那些能表达报道基因的转化子。例如，但不限于，可以将饵EGFL7基因序列例如基因开放阅读框克隆入载体，从而使其可翻译地与编码GAL4蛋白的DNA-结合结构域的DNA融合。纯化这些菌落，分离出负责报道基因表达的文库质粒。然后用DNA 测序鉴定出所述文库质粒编码的蛋白质。 

可检测出与饵EGFL7基因产物相互作用的蛋白质的细胞系的cDNA文库，可使用本领域常规方法制备。根据本文所述的具体系统，例如，可以将cDNA片段插入载体，从而使其可翻译地与GAL4的转录因活化结构域融合。可以将该文库与所述饵EGFL7基因-GAL4融合质粒共-转化入含有由启动子驱动的lacZ基因的酵母菌株，所述启动子中含有GAL4活化序列。与GAL4转录活化结构域融合的cDNA编码蛋白质与所述饵EGFL7基因产物相互作用可重构成活性GAL4蛋白质，从而驱动表达。驱动表达的菌落可以通过本领域常规方法检测。然后使用本领域常规技术，从这些菌株纯化出cDNA，用于制备和分离所述饵EGFL7基因-相互作用蛋白。 

针对调控EGFL7表达或活性的化合物的试验 

设计下列试验鉴定：与EGFL7相互作用(例如，结合)的化合物，干扰EGFL7与其结合配偶体、关联物(cognate)或受体相互作用的化合物，以及调节EGFL7基因表达活性(即，调节EGFL7基因表达水平)或调节体内EGFL7水平的化合物。此外还可以用试验鉴定结合EGFL7基因调控序列(例如，启动子序列)从而可调节EGFL7基因表达的化合物。参见，例如，Platt，K.A.，J.Biol.Chem.269：28558-28562(1994)，在此全文引入作为参考。 

可根据本发明筛选的化合物包括但不限于肽、抗体及其片段、及其他有机化合物(例如，肽模拟物)，所述有机化合物与EGFL7或EGFL7受体结合，且能模拟由天然配体触发的活性(即，激动剂)或抑制由天然配体触发的活性(即，拮抗剂)。 

所述化合物包括，但不限于，肽，例如可溶性的肽，包括但不限于随机肽文库的成员；(参见，例如，Lam，K.S.et al.，Nature 354：82-84(1991)；Houghten，R.et al.，Nature 354：84-86(1991))，和组合化学-衍生的由D-和/或L-构型氨基酸构成的分子文库，磷酸肽(包括但不限于随机或部分简并的、指导的磷酸肽文库的成员；参见，例如，Songyang，Z.et al.，Cell 72：767-778(1993))，抗体(包括但不限于，多克隆、单克隆、人源化、抗-独特型嵌合的或单链的抗体，和FAb，F(ab’)₂及FAb表达文库片段，及其表位-结合片段)，以及有机或无机小分子。 

可以根据本发明筛选的其他化合物包括，但不限于，能进入合适细胞(例如内皮细胞)并影响EGFL7基因或其他参与EGFL7介导途径的基因表达的 有机小分子(例如通过与参与基因表达的调控区或转录因子相互作用)；或者是能影响或代替EGFL7活性或一些其他参与EGFL7信号传导、分解代谢、或新陈代谢途径的胞内因子的活性的化合物。 

计算机模拟及搜索技术能够鉴定可调控EGFL7表达或活性的化合物，或者对已经鉴定的这类化合物作改良。如果已经鉴定出这类化合物或组合物，那么就可以鉴定活性部位或区域。所述活性部位通常可以是配体结合位点。可以使用本领域已知的方法，例如，从肽的氨基酸序列，从核酸的核苷酸序列，或者在有关化合物或组合物与其天然配体的复合体的试验中鉴定活性部位。后一种情况，可以使用化学或X射线结晶方法通过从因子上找到复合后配体所处的位置来发现所述活性部位。 

其次，测定所述活性部位的三维几何结构。这可以用已知方法，包括能测定完整分子结构的X-射线晶体衍射得到。另一方面，可使用固相或液相NMR测定某些分子内距离。任何其他测定结构的实验法都可用于获得部分或完全的几何结构。所述几何结构可以用天然或人工复合的配体进行测量，其可提高所测活性部位结构的准确度。 

如果测得了不完全或不足够精确的结构，那么可以使用计算机的数值模拟方法来使结构完全或提高其准确度。任何公认的建模方法都可以使用，包括对具体生物多聚合物例如蛋白质或核酸特异的参数化模型，在计算分子运动基础上的分子动力学模型，在热集团(thermal ensembles)基础上的统计力学模型，或者联合模型。对于大多数的模型类型来说，表示构成原子及基团之间力的标准分子力场是必需的，可以从物理化学已知的力场中筛选出来。所述不完全的或准确度较低的试验结构可以作为对用这些建模方法计算出的完全的且更准确的结构的约束。 

最后，通过试验、建模或二者结合测定了活性部位(或结合位点)的结构后，就可以通过搜索含化合物及其分子结构信息的数据库鉴定出候选的调控化合物。所述搜索寻找具有与所测活性部位结构匹配的且与限定活性部位的基团相互作用的结构的化合物。所述搜索可以是人工的，但优选是计算机辅助的。经上述搜索发现的化合物是潜在的EGFL7活性调节因子。 

可选地，可以使用这些方法从已知的调控化合物或配体中鉴定出具有更强调控作用的化合物。可以对已知化合物的组合物进行修饰，修饰的结构效果可以使用上述应用于新组合物的试验及计算机建模方法来测定。然后，将 改变后的结构与化合物的活性部位结构进行对比，从而测定适合度或相互作用结果是否提高。用这样的方式，可以很快地评价例如由于侧基变化而导致的组合物的系统误差，以获得经修饰的特异性或活性提高的调控化合物或配体。 

以鉴定EGFL7的活性部位(或结合位点)及相关的转导及转录因子为基础的、用于鉴定调控化合物的更多试验及计算机建模方法，对本领域技术人员来说是显而易见的。 

分子建模系统的实例有CHARMm和QUANTA程序(Polygen Corporation，Waltham，MA)。CHARMm可具有能量最低化及分子动力学的功能。QUANTA能进行分子结构的构建、图形建模及分析。QUANTA可实现分子相互间行为的相互构建(interactive construction)、修饰、可视和分析。 

大量文献综述了药物与特异性蛋白质相互作用的计算机建模，例如Rotivinen，et al.，Acta Pharmaceutical Fennica 97：159-166(1988)；Ripka，NewScientist 54-57(June 16，1988)；McKinaly and Rossmann，Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol. 29：111-122 (1989)；Perry and Davies，OSAR：QuantitativeStructure-Activity Relationships in Drug Design pp.189-193(Alan R.Liss，Inc.1989)；Lewis and Dean，Proc.R.Soc.Lond.236：125-140(1989)和141-162；有关核酸成分的模型受体的综述参见，Askew，et al.，J.Am.Chem.Soc.111：1082-1090(1989)。筛选及图绘化学物质的其他计算机程序可从公司购买，例如BioDesign，Inc.(Pasadena，CA.)，Allelix，Inc.(Mississauga，Ontario，Canada)，和Hypercube，Inc.(Cambridge，Ontario)。虽然这些程序主要设计为针对特异于具体蛋白质的药物的应用软件，一旦鉴定了DNA或RNA区域，所述程序就适合于设计针对所述区域特异的药物。 

尽管上文描述了设计及制备能改变结合的化合物的方法，但是但是本领域技术人员还可以从已知化合物(包括天然产物或合成的化学物质，以及生物学活性物质，包括蛋白质)的文库中筛选用作抑制剂或活化剂的化合物。 

通过例如本文所述试验鉴定的化合物，可用于例如，阐明EGFL7基因产物的生物学功能。可以治疗有效剂量将所述化合物施用给患者来治疗任一种生理学上所称的病症(physiological disorder)。治疗有效剂量是指足以使任何生物学症状发生改善、延缓、预防或改变的化合物的量。 

针对结合EGFL7的化合物的试验 

可以设计鉴定如下化合物的体系，所述化合物能与EGFL7相互作用(例如，结合)或模拟EGFL7，或者能干扰EGFL7与关连(cognate)受体、结合配偶体或基质结合。鉴定得到的化合物可用于，例如，调控野生型和/或突变体EGFL7基因产物的活性；可用于说明EGFL7的生物学功能；可用于鉴定破坏正常EGFL7相互作用的化合物的筛选；或者自身破坏或活化所述相互作用的化合物。 

用于鉴定能结合EGFL7或EGFL7关连受体或基质的化合物的试验原理，涉及在足以使EGFL7与待测化合物相互作用并结合的条件和时间内，制备这两种成分的混合反应物，从而得到能从所述反应混合物中移取和/或检测的复合物。所使用EGFL7的种类可随筛选试验的目标而定。例如，当希望得到天然受体的激动剂时，可以使用全长EGFL7、或可溶性的截短的EGFL7、肽、或包含融合于能赋予试验体系(例如，将得到的复合物标记，分离等)优势的蛋白质或多肽的一个或多个EGFL7结构域的融合蛋白。当寻找可直接与EGFL7相互作用的化合物时，可以使用对应于EGFL7的肽以及含EGFL7的融合蛋白。 

所述筛选试验可以采用多种方式。例如，实施所述试验的一种方法涉及将EGFL7、多肽、肽或其融合蛋白、或待测物质锚定于固相基质上，然后在反应结束时检测锚定于所述固相基质上的EGFL7/待测化合物的复合物。在所述方法的一个实施方案中，可将EGFL7反应物锚定在固体表面上，并对未锚定的待测化合物进行直接或间接标记。 

实际中，可以方便地采用微量滴定板作为固体基质。所述锚定成分可以通过非共价或共价连接来固定。非共价连接可通过简单地用蛋白质溶液包被固体表面后干燥来完成。可选地，可以使用对待固定蛋白质特异的固定抗体，优选单克隆抗体，来将所述蛋白质锚定至固体表面。所述表面可以提前制备并保存起来。 

为了进行所述试验，将非固定成分加至含有锚定成分的包被表面。在反应结束后，在使形成的任何复合物仍保持固定于所述固体表面的条件下，除去(例如，通过洗涤)未反应的成分。检测锚定在固体表面上的复合物可以通过多种方式完成。在对之前非固定的成分作了预-标记的情况下，在表面上检测到固定标记物表明有复合物形成。在未对之前非固定的成分作预-标记情况下，可以使用间接标记物检测锚定于表面上的复合物；例如，使用对之 前未固定的成分特异的已标记抗体(反之，可以用标记的抗-Ig抗体直接或间接地标记所述抗体)。 

可选地，反应可以在液相中进行，将反应产物与未反应成分及所检测复合物分开；例如，使用特异性针对EGFL7蛋白质、多肽、肽或融合蛋白或待测化合物的固定抗体，将溶液中形成的任何复合物锚定，然后用特异性针对可能复合物的其他成分的标记抗体来检测所锚定的复合物。 

针对干扰EGFL7相互作用的化合物的试验 

为便于讨论，将与EGFL7相互作用的大分子称为“结合配偶体”。这些结合配偶体可能参与EGFL7介导的生物学途径。因此，期望鉴定出干扰或破坏所述结合配偶体相互作用的化合物，将其用于调控或增强体内EGFL7活性和/或控制与该活性(或其不足)有关的病症。 

用于鉴定干扰EGFL7与一或多个结合配偶体相互作用的化合物的试验体系，其基本原理涉及制备含EGFL7或其一些变体与结合配偶体的反应混合物，在其中两者相互作用并结合的条件作用足够长的时间，从而形成复合物。为了检测化合物的抑制活性，在有及无待测化合物存在的条件下制备反应混合物。待测化合物可以起初包含在反应混合物中，或者可以在加入EGFL7及其结合配偶体之后加入。不加待测化合物或加入安慰剂温育对照反应混合物。然后检测EGFL7和结合配偶体之间形成的任何复合物。在对照反应中而不在含待测化合物的反应混合物中形成复合物，这表明该待测化合物干扰EGFL7与其可相互作用的结合配偶体间的相互作用。另外，还可以将含待测化合物和正常EGFL7蛋白质的反应混合物中的复合物形成情况与含待测化合物和突变EGFL7的反应混合物中复合物形成进行比较。此比较对于期望鉴定特异性地破坏与突变体或突变EGFL7的相互作用但不破坏与正常蛋白质的相互作用的化合物的那些情况是重要的。 

对于干扰EGFL7和结合配偶体之间相互作用的化合物的试验可以多相或同相方式实施。多相试验(heterogeneous assay)包括将EGFL7或结合配偶体锚定在固体基质上，然后在反应结束时检测锚定在所述固体基质上的复合物。同相试验(homogeneous assay)中，整个反应都在液相中进行。在这两种方法中，为了获得与待测化合物有关的不同信息，可以改变反应物的加入顺序。例如，鉴定竞争干扰所述相互作用的待测化合物，可以通过在待测物质存在下进行反应，即，通过在EGFL7和可相互作用的结合配偶体之前或同 时向反应混合物加入试验物质。可选地，破坏已形成的复合物的待测化合物，例如具有较高结合常数、可将复合物中成分之一置换的化合物，可以通过在复合物形成后将待测化合物加入反应混合物来检测。不同方式简述如下。 

多相试验体系中，将EGFL7或可相互作用的结合配偶体锚定到固体表面上，而对非-锚定物质(species)进行直接或间接标记。实际上，可方便地利用微量滴定板。锚定物质可以用非共价或共价连接来固定。非共价连接通常通过简单用EGFL7或结合配偶体的溶液包被固体表面后干燥来完成。可选地，可以使用特异性针对待锚定物质的已固定抗体来将该物质锚定至固体表面。所述表面可以提前制备并保存起来。 

为了进行所述试验，将固定物质的配偶体暴露于有无被待测化合物的包被表面。反应完成后，除去(例如，洗涤)未反应的成分，而形成的任何复合物仍保持固定于所述固体表面上。对锚定在固体表面上的复合物的检测可以通过多种方式完成。当对非固定成分作了预-标记的情况下，在表面上检测到固定标记物表明有复合物形成。在未对非固定成分作预-标记情况下，可以使用间接标记物检测锚定于表面上的复合物；例如，使用特异性针对起初非固定物质的标记抗体(反之，可以用标记的抗-Ig抗体直接或间接地标记所述抗体)。根据反应成分的加入顺序，可以对抑制复合物形成或破坏已形成的复合物的待测化合物进行检测。 

可选地，反应可以在有无待测化合物的液相中进行，将反应产物与未反应成分及所检测复合物分开；例如，使用特异性针对结合成分之一的固定抗体锚定溶液中形成的任何复合物，而用特异性针对另一配偶体的标记抗体检测锚定复合物。此外，根据反应物加入所述液相的顺序，可以对抑制复合物形成或破坏已形成的复合物的待测化合物进行鉴定。 

本发明的可选实施方案中，可以进行同相试验。该方法中，制备EGFL7和可相互作用的结合配偶体的已形成复合物，其中所述EGFL7或其结合配偶体被标记，但是所述标记物产生的信号由于复合物的形成被淬灭(参见，例如Rubenstein的美国专利4,109,496，其中使用了免疫测定方法)。能竞争并置换已形成复合物中一种成分的待测物质的加入可产生强于背景的信号。这样，可以鉴定出破坏相互作用的待测物质。 

具体的实施方案中，可以制备用于固定的EGFL7融合物。例如，可用融合载体例如pGEX-5X-1将EGFL7或其肽片段融合于谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)基因，所用方式可使EGFL7或其肽片段的结合活性保留在所得融合蛋白中。用本领域常规方法及上述方法，可以纯化可相互作用的结合配偶体并用于制备单克隆抗体。例如，通过本领域常规方法用放射性同位素¹²⁵I标记该抗体。多相试验中，可以将所述融合蛋白锚定至谷胱甘肽-琼脂糖珠。然后在有或无待测化合物时以允许相互作用及结合发生的方式加入所述可相互作用的结合配偶体。反应结束时，可将未结合物质洗脱，向体系中加入标记的单克隆抗体并使其与复合成分结合。EGFL7与可相互作用的结合配偶体之间的相互作用可以通过测量仍与谷胱甘肽-琼脂糖珠结合的放射量来检测。待测化合物对所述相互作用的成功抑制可引起被测放射性的减少。 

可选地，可以在无固相谷胱甘肽-琼脂糖珠的情况下，将GST融合蛋白与可相互作用的结合配偶体混合于液体中。可以在物质相互作用过程中或之后加入待测化合物。然后，将混合物加至谷胱甘肽-琼脂糖珠，并将未结合物质洗脱。此外，抑制EGFL7与结合配偶体之间相互作用的程度可以通过添加标记抗体后测量与珠子结合的放射性来检测。 

本发明的另一个实施方案中，可以使用相同技术将对应于EGFL7和/或可相互作用或结合的配偶体(此时结合配偶体是一种蛋白质)的结合结构域的肽片段取替一种或这两种全长蛋白质。许多本领域常规方法可用于鉴定和分离所述结合位点。这些方法包括，但不限于，编码所述蛋白质之一的基因诱变，和在共免疫沉淀试验中筛选结合的破坏。然后可选择进行编码复合物中第二种物质的基因的互补突变。对编码各个蛋白质的基因的序列分析可发现对应于参与可相互作用结合的蛋白质区域的突变。可选地，可以使用上述方法将一种蛋白质锚定至固体表面，使其与它的标记结合伴侣相互作用并结合，所述结合伴侣已经用蛋白水解酶，例如胰蛋白酶处理。洗涤后，含有所述结合结构域的相对较短的标记肽仍然与固体材料结合，该肽可以被分离并通过氨基酸测序鉴定。另外，一旦获得编码胞内结合配偶体的基因，那么就可以构建短基因节段表达所述蛋白质的肽片段，然后测试其结合活性并纯化或合成。 

例如，但不限于，可以如上所述，通过制备GST融合蛋白并让其与谷胱甘肽琼脂糖珠结合，将EGFL7锚定至固体材料。所述可相互作用的结合配偶体可以用放射性同位素，例如35S标记，并用蛋白水解酶例如胰蛋白酶切割。然后，将切割产物加至锚定的融合蛋白使其结合。洗脱未结合肽后， 可以将代表胞内结合配偶体结合结构域的已标记的结合物质洗脱出来，纯化并用熟知方法分析氨基酸序列。如此鉴定的肽可以使用DNA重组技术合成制备或者融合至合适的易化(facilitative)蛋白。 

EGFL7组合物的用途 

针对心血管、内皮和血管生成活性的试验

可以使用各种方法测试本申请所述多肽的心血管、内皮及血管生成活性。这类试验包括下文实施例部分提供的试验。 

组织生成活性试验包括，但不限于WO 95/16035(骨，软骨，肌腱)；WO95/05846(神经，神经元)，和WO 91/07491(皮肤，内皮)所述的方法。 

伤口-愈合活性的试验包括，例如下文描述的试验：Winter， EpidermalWound Healing，Maibach，HI and Rovee，DT，eds.(Year Book MedicalPublishers，Inc.，Chicago)，pp.71-112，其修改参见论文Eaglstein and Mertz，J.Invest.Dermatol.71：382-384(1978)。 

存在几种心脏肥大试验。体外试验包括诱导成熟大鼠的心肌细胞扩散。该试验中，基本上按照Piper et al.，“Adult ventricular rat heart muscle cells”in Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research，H.M.Piper，ed.(Berl in：Springer-Verlag，1990)，pp.36-60所述的改良方法，从单个(雄性Sprague-Dawley)大鼠分离心室肌细胞。这些方法可以实现成熟心室肌细胞的分离和这些细胞呈杆状表型的长期培养。已经发现苯肾上腺素和前列腺素F_2α(PGF_2α)诱导这些成熟细胞的扩散反应。然后，试验了各种潜在的心脏肥大抑制剂对PGF_2α或PGF_2α类似物(例如，氟前列腺烯醇(fluprostenol))和苯肾上腺素诱导的肌细胞扩散的抑制作用。 

对癌症而言，多种众所周知的动物模型可用于进一步理解EGFL7在肿瘤发展和发病机理中的作用和测试候选治疗剂的有效性，所述候选治疗剂包括天然EGFL7多肽的抗体及其他拮抗剂，例如小分子拮抗剂。这类模型的体内特性使其可专门预示人类患者的体内反应。肿瘤和癌症的动物模型(例如，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，肺癌，等)包括非重组的和重组的(转基因)动物。非重组动物模型包括，例如啮齿动物的模型，例如鼠模型。制备这类模型可以通过使用标准技术将肿瘤导入同系小鼠，所述技术例如，皮下注射、尾静脉注射、脾植入、腹膜内植入、在肾小囊下植入、或常位针植入(orthopin implantation)，例如将结肠癌细胞植入结肠组织。参见，例如，1997年9月18日公开的PCT公开文献WO 97/33551。可能肿瘤学研究中最常用的动物物种是免疫缺陷的小鼠，尤其是裸鼠。因为观察到胸腺发育不全的(thymichypo/aplasia)的裸鼠可成功作为人肿瘤异种移植物的宿主，所以它已经广泛用于此目的。常染色体隐性nu基因已经被引入很多独特的同类系(congenic)裸鼠品系，包括例如，ASW，A/He，AKR，BALB/c，B10.LP，C17，C3H，C57BL，C57，CBA，DBA，DDD，I/st，NC，NFR，NFS，NFS/N，NZB，NZC，NZW，P，RIII，和SJL。另外，除所述裸鼠外，现已饲养了多种具有遗传免疫缺陷的其他动物并将它们用作肿瘤异种移植物的接受者。更多细节见例如， The NudeMouse in Oncology Research，E.Boven and B.Winograd，eds.(CRC Press，Inc.，1991)。 

导入这类动物的细胞可以源自于已知的肿瘤/癌症细胞系，例如任何上列肿瘤系，以及，例如B104-1-1细胞系(经neu原癌基因转染的稳定NIH-3T3细胞系)；ras-转染的NIH-3T3细胞；Caco-2(ATCC HTB-37)；或者分化稍好的(moderately well-diffrentiated)II级人结肠腺癌细胞系，HT-29(ATCC HTB-38)；或者它来自肿瘤和癌症。肿瘤或癌症细胞样本可以得自手术病人，使用常规条件在液氮中冷冻及存储。Karmali et al.，Br.J.Cancer 48：689-696(1983)。 

可以通过多种方法将肿瘤细胞导入动物，例如裸鼠或EGFL7敲除小鼠。小鼠的皮下(s.c.)空间很适合肿瘤植入。肿瘤可作为固体块、借助于套针(trochar)的针状活组织检查物、或作为细胞悬浮液来进行皮下植入。在以固体块或用套针植入中，将合适尺寸的肿瘤组织碎块(fragment)引入皮下空间。细胞悬浮液是从原代肿瘤或稳定的肿瘤细胞系新鲜制备的，并且被皮下注射。也可通过注射真皮下植入物来植入肿瘤细胞。在这个位置，接种物在真皮结缔组织下部和皮下组织之间沉积(deposit)。 

乳腺癌的动物模型可以通过如下来制备，例如，将大鼠神经母细胞瘤细胞(从其最初分离了neu癌基因)，或neu-转化的NIH-3T3细胞植入裸鼠，基本如Drebin et al.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83：9129-9133(1986)所述。 

类似地，制备结肠癌的动物模型也可通过在动物(如裸鼠)中传代结肠癌细胞，导致在这些动物中出现肿瘤。裸鼠中人结肠癌的常位(orthotopic)移植物模型已于例如，Wang et al.，Cancer Research 54：4726-4728(1994)和Too etal.，Cancer Research 55：681-684(1995)中描述。该模型是基于AntiCancer，Inc.， (San Diego，California)出售的“METAMOUSE^TM”。 

出现于动物的肿瘤可被取出并于体外培养。然后可将来自体外培养物的细胞传代到动物。这些肿瘤可用作进一步试验或筛选药物的靶。或者，可分离来自传代物的肿瘤，并分析来自预传代的细胞和分离自一或多轮传代物的细胞的RNA的理想基因表达差异。可在任何已知的肿瘤或癌细胞系操作这些传代技术。 

例如，Meth A，CMS4，CMS5，CMS2l和WEHI-164是BALB/c母鼠的化学诱导型纤维肉瘤(DeLeo et al.，J.Exp.Med.146：720(1977))，它们为研究多种药剂的抗-肿瘤活性提供了一种可高度控制的制模系统。Palladino etal.，J.Immunol.138：4023-4032(1987)。简而言之，让肿瘤细胞在细胞培养物中体外增殖。在注射入动物前，在缓冲液中洗涤并悬浮所述细胞系，细胞密度达约10×10⁶到10×10⁷个/ml。然后用10-100μl细胞悬浮液感染动物，等待1-3周来让肿瘤出现。 

此外，小鼠的Lewis肺癌，用来进行实验的最广泛研究的肿瘤之一，可以用作被研究的肿瘤模型。该肿瘤模型的效力与治疗诊断患有小细胞肺癌(SCCL)的病人的有益效果相关。把来自患病(affected)小鼠的肿瘤碎块或保持在培养物中的细胞注射给正常小鼠，可以导入该肿瘤。Zupi et al.，Br.J.Cancer 41：suppl.4，30(1980)。证据表明，注射，甚至是一个细胞开始，并且有很高比例的感染肿瘤细胞存活。关于该肿瘤模型更多信息参见，Zacharski，Haemostasis 16：300-320(1986)。 

一种评价待测化合物在植入肿瘤的动物模型中的效力的方法是测量治疗前后的肿瘤尺寸。通常，用游标卡尺测量植入肿瘤的二维或三维尺寸。限于二维空间的测量数据不能精确地反映肿瘤的尺寸；因此，通常使用数学公式将它转变为相应的体积。但是，这样测量的肿瘤尺寸是非常不准确的。候选药物的治疗效果可以用治疗诱导型生长延迟以及特异性生长延缓更好地描述。描述肿瘤生长的另一个重要的变量是肿瘤体积倍增时间。用于计算和描述肿瘤生长的计算机程序可见，例如Rygaard and Spang-Thomsen， Proc.6thInt.Workshop on Immune-Deficient Animals，Wu and Sheng eds.(Basel，1989)，p.301报道的程序。但是，应注意到治疗后的坏死和炎症反应事实上导致肿瘤尺寸增加，至少在最初增加。因此，需要联合使用形态计量方法(morphometric method)和流式细胞分析法来小心监测这些变化。 

此外，重组的(转基因)动物模型可以通过，用制备转基因动物的标准技术将本文鉴定的EGFL7基因的编码区引入目标动物的基因组来制造。可以作为转基因操作的目标的动物包括，但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠(guineapig)、绵羊、山羊、猪、和非人灵长类(non-human primate)，例如，狒狒(baboon)，黑猩猩(chimpanzee)和猴子。本领域已知的将转基因引入所述动物的技术包括，原核显微注射(美国专利4,873,191))；通过逆转录病毒介导将基因转移到生殖系(germ line)中(例如，Van der Putten et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA82：6148-615 (1985))；将基因靶向胚胎干细胞(Thompson et al.，Cell56：313-321 (1989))；胚胎电穿孔(Lo，Mol.Cell.Biol.3：1803-1814(1983))；以及精子-介导的基因转移。Lavitrano et al.，Cell 57：717-73(1989)。综述，参见例如，美国专利4,736,866。 

为了本发明的目的，转基因动物包括，仅在其部分细胞中携带转基因的那些动物(“嵌合体动物(mosaic animal)”)。该转基因可以作为单个转基因或作为串联体(concatamer)，例如头-头或头-尾串联体而被整合。将转基因选择性引入具体细胞类型可用例如Lasko et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA89：6232-636(1992)的技术。例如，可以用Southern印迹分析或PCR扩增来验证转基因的整合。然后，可以利用诸如原位杂交、Northern印迹分析、PCR或免疫细胞化学等技术来分析mRNA表达的水平。还可以检查该动物是否有肿瘤或癌症发展的体征。 

可选地，可以构建“基因敲除”动物，其具有缺陷的或已改变的、编码本文鉴定的EGFL7的基因，该基因是编码EGFL7的内源基因与编码引入该动物胚细胞的相同多肽的经改变基因组DNA之间同源重组的结果。例如，可以根据已有的技术，用编码具体EGFL7多肽的cDNA来克隆编码该多肽的基因组DNA。可以将编码具体EGFL7多肽的基因组DNA的一部分缺失或用另一基因取代，所述另一基因为例如可用来监测整合的选择性标记的编码基因。通常，未改变的侧翼DNA(位于5’和3’末端)的数千碱基都包含在载体中。见例如Thomas and Capecchi，Cell 51：503(1987)关于同源重组载体的描述。将该载体引入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)，选出一些细胞，在这些细胞中，引入的DNA与内源DNA发生同源重组。见例如，Li et al.，Cell69：915(1992)。然后，将选出的细胞注射到动物(例如小鼠或大鼠)的囊胚中，以形成聚集嵌合体。见例如Bradley，in  Teratocarcinomas and Embryonic StemCells：A Practical Approach，E.J.Robertson，ed.(IRL：Oxford，1987)，pp.113-152。随后，将嵌合胚植入适宜的假孕雌性代养动物中，植入的胚胎将产生 “基因敲除”动物。那些在生殖细胞中携带同源重组DNA的后代可通过标准技术鉴定，并用来产生后代动物，使这些动物的所有细胞都包含同源重组DNA。基因敲除动物可以，例如，以它们抵抗一些病理疾病的能力和它们由于缺乏EGFL7而产生病理情况的特征来表征。 

也可以在治疗自发产生的动物肿瘤的过程中，检测特异性结合本文鉴定的EGFL7的抗体及其他候选药物的效力。对适于这些研究的靶是猫口腔鳞状细胞癌(feline oral squamous cell carcinoma)(SCC)。猫口腔SCC是高度侵袭性的恶性肿瘤，它是对于猫最常见的口腔恶性肿瘤，占在此物种所报道的口腔肿瘤的60％以上。该肿瘤极少转移到远处(distant site)，但此转移的低发生率可能仅由于患此肿瘤的猫的存活时间短造成。这些肿瘤通常不宜手术，主要因为猫口腔解剖学。现在没有对于此肿瘤的有效治疗。在作研究之前，每只猫均接受全身(complete)临床检查及活组织检查，并用计算机化断层显相(CT)扫描。诊断为患有舌下口腔鳞状细胞肿瘤的猫被排除在本研究之外。此肿瘤的结果是舌头渐渐麻痹，即使治疗能杀死肿瘤，所述动物可能仍不能自主进食。在较长时间段内重复治疗每只猫。在治疗过程中的每一天，以及在随后的每次复查中，给肿瘤拍照。治疗后，给每只猫再进行一次CT扫描。随后每8周作一次CT扫描及胸廓的放射照相(thoracic radiograms)来评价。用所述数据来评价相对于对照组的存活率(survival)、反应性(response)和毒性上的差异。反应性阳性会需要肿瘤退化(regression)、优选生活质量改善和/或寿命延长的证据。 

另外，也可检测其他自发性动物肿瘤，如狗、猫和狒狒的纤维腺瘤、腺癌、淋巴癌、软骨瘤、或平滑肌肉瘤。在这些肿瘤中，狗和猫的哺乳动物腺癌是优选的模型，因为其外形和表现(behavior)与在人出现的哺乳动物腺癌很类似。但是，由于此种肿瘤很少在动物出现，从而限制了此模型的应用。 

本领域已知的其他体外和体内的心血管、内皮和血管生成试验也适用于本申请。 

组织分布

本文所述心血管、内皮、和血管生成试验的结果可通过进一步试验，例 如通过测定不同人组织中的mRNA表达来验证。 

如上所述，测量不同组织中的基因扩增和/或基因表达可以通过常规Southern印迹，定量mRNA转录的Northern印迹(Thomas，Proc.Natl.AcadSci.USA 77：5201-5205(1980))，斑点印迹(DNA分析)，或原位杂交，使用适当标记的探针，根据本文提供的序列。可选地，可以使用能识别特异性双链体的抗体，所述特异性双链体包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。 

可选地，不同组织中的基因表达可以用免疫学方法例如组织切片的免疫组织化学染色以及细胞培养物或体液的试验来测量，直接定量基因产物的表达。可用于免疫组织化学染色和/或液体样本试验的抗体是单克隆或多克隆的，可用任何哺乳动物制备。方便地，可以制备抗天然序列EGFL7多肽的抗体、或抗根据本文提供的DNA序列合成的肽的抗体、或者抗融合于EGFL7DNA并编码特异抗体表位的外源序列的抗体。下文提供了用于制备抗体的常规技术和原位杂交的具体方法。 

对抗体结合的研究

心血管、内皮和血管生成试验的结果可以通过对抗体结合的研究进一步验证，其中测试了抗-EGFL7抗体的抑制能力，所述抑制是针对EGFL7对所述心血管、内皮和血管生成试验中使用的内皮细胞或其他细胞作用的抑制。举例的抗体包括多克隆、单克隆、人源化、双特异性及异源偶联抗体、及下文描述的其制剂。 

对抗体结合的研究可用于任何已知的测定方法，如竞争性结合测定，直接和间接夹心测定，和免疫沉淀测定。Zola， MonoclonalAntibodies：A Manualof Techniques(CRC Press，Inc.，1987)，pp.147-l58。 

竞争性结合测定取决于已标记标准品与待测样本分析物竞争结合有限量抗体的能力。待测样本中靶蛋白的量与结合到抗体的标准物的量成反比。为了利于标准物的结合量，优选所述抗体在竞争前或后是不溶的，从而可以方便地将那些结合到抗体的标准品和分析物同仍未结合的标准品和分析物分离开来。 

夹心测定包括使用两种抗体，每种能够结合待检测蛋白质的不同免疫原性部分或表位。夹心测定中待测样本分析物与固定到固相支持物上的第一抗体结合，之后第二抗体与所述分析物结合，于是形成不可溶的三-部分复合 物。见例如美国专利4,376,110。所述第二抗体自身可用可检测部分标记(直接夹心测定)或可用经可检测部分标记的抗-免疫球蛋白的抗体来测定(间接夹心测定)。例如，一种夹心测定是ELISA测定，其中可检测部分是酶。 

对于免疫组织化学法，组织样本可以是新鲜的或是冰冻的，或例如，可以包埋在石蜡中并用防腐剂如福尔马林来固定。 

基于细胞的肿瘤试验

用于心血管、内皮和血管生成病症例如肿瘤的基于细胞的试验和动物模型，可以用来检验本文所述心血管、内皮和血管生成试验的结果，以及用于理解本文鉴定的基因与心血管、内皮和血管生成细胞不良生长的发育和发病机理之间的相互关系。本文鉴定的基因产物在心血管、内皮和血管生成细胞不良生长中的作用，所述细胞例如肿瘤细胞，可以通过使用已鉴定为本文所述EGFL7可刺激或抑制的细胞或细胞系来进行测试。这类细胞包括，例如下文实施例部分列出的细胞。 

在不同的方法中，用本文所述cDNAs转染已知参与具体心血管、内皮和血管生成病症的细胞类型的细胞，然后分析这些cDNAs诱导过度生长或抑制生长的能力。如果所述心血管、内皮和血管生成病症是癌症，那么合适的肿瘤细胞包括，例如，稳定的肿瘤细胞系例如 B104-1-1细胞系(用neu原癌基因转染的稳定NIH-3T3细胞系)和ras-转染的NIH-3T3细胞，这些细胞可以用所需基因转染，并监测肿瘤(tumorigenic)生长。然后，经转染的细胞系可用于测试多克隆抗体或单克隆抗体或抗体组合物抑制肿瘤发生细胞生长的能力，所述抑制能力是通过向经转化细胞的生长施加抑制细胞的活性或细胞毒性活性、或者通过介导抗体-依赖性细胞介导的细胞毒活性(ADCC)而导致的。用本文鉴定的基因的编码序列转染的细胞可以进一步用于鉴定用于治疗心血管、内皮和血管生成病症例如癌症的侯选药物。 

此外，源自转基因动物肿瘤的原代培养物(如上所述)可用于本申请所述的基于细胞的试验，但仍优选稳定的细胞系。从转基因动物得到传代(continuous)细胞系的技术为本领域所熟知。参见，例如，Small et al.，Mol.Cell.Biol.5：642-648(1985)。 

基因的诊断用途

本发明还涉及EGFL7编码基因的诊断用途。检测到EGFL7的突变形式可诊断心血管、肉皮和血管生成疾病或对心血管、内皮和血管生成疾病的易感度，所述疾病例如肿瘤。 

携带人EGFL7多肽的编码基因突变的个体可以用多种技术在DNA水平上进行检测。诊断用核酸可以获自患者细胞，例如来自血液、尿液、唾液、活检组织和尸检材料。基因组DNA可以直接用于检测或者在分析前通过PCR酶促扩增(Saiki et al.，Nature 324：163-166(1986))。RNA或cDNA也可用于同样用途。例如，与EGFL7编码核酸互补的PCR引物可用于鉴定和分析EGFL7突变。例如，缺失和插入可以通过扩增产物相对于正常基因型的大小变化来检测。可以通过让扩增的DNA与放射标记的编码EGFL7的RNA或者与放射标记的编码EGFL7的反义DNA序列杂交，来鉴定点突变。可以通过RNase A消化或解链温度差异，将完全匹配的(perfectly matched)序列与错配双链体区分开来。 

以DNA序列变化为基础的遗传试验，可以通过检测DNA片段在存在或缺无变性剂的凝胶中的电泳迁移率改变来进行。小序列的缺失和插入可以通过高分辨率凝胶电泳来观察。不同序列的DNA片段可以在变性甲脒梯度凝胶上区分开，其中由于不同DNA片段的具体解链温度或局部解链温度，它们的迁移(mobility)被滞留在凝胶的不同位置。参见，例如，Myers et al.，Science 230：1242(1985)。 

具体位置的序列改变也可用核酸酶保护试验，如RNase和S1保护或化学断裂方法来显示，例如，Cotton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4397-4401(1985)。 

因此，对具体DNA序列的检测可以通过如下方法来实现，如杂交、RNA保护、化学切割、直接的DNA测序、或使用限制性内切酶，例如限制性片段长度多态性(RFLP)，和基因组DNA的Southem印迹。 

检测多肽表达水平的用途

除较常规的凝胶-电泳和DNA测序之外，还可以通过原位分析检测突变。 

EGFL7编码核酸的表达与肿瘤形成相关性血管病或新生血管生成有关。如果EGFL7具有信号序列，并且mRNA高度表达于内皮细胞，而在平滑肌细胞中表达程度较低，那么表明EGFL7存在于血清中。因此，抗-EGFL7多 肽的抗体可用于诊断肿瘤形成相关性血管病或新生血管生成，由为这种EGFL7多肽水平的变化是所述病症的指征。 

可以使用竞争试验，其中EGFL7特异性抗体附着于固相支持物，而标记的EGFL7多肽和来自宿主的样本通过该固相支持物，附着于所述固相支持物上的待测标记物的量与样本中EGFL7的量相关。 

染色体作图

另外，本发明的序列对于染色体鉴定很有价值。所述序列可以特异性地靶向并杂交于单个人染色体上的特定位点。此外，目前需要鉴定所述染色体上的特定位点。目前，没有几种以实际序列数据(重复多态性)为基础的染色体标记试剂可用于标记染色体位点。根据本发明将DNAs定位于染色体，是将与疾病有关的基因与这些序列相关的重要第一步。 

简而言之，可以通过从所述cDNA制备PCR引物(优选15-25 bp)将序列定位到染色体。对3′-非翻译区的计算机分析可用于快速筛选跨度不超过基因组DNA中一个外显子的引物，因而使扩增过程复杂化。然后，用这些引物经PCR筛选含单个人染色体的体细胞杂合体。只有那些含与所述引物相应的人基因的杂合体才产生扩增片段。 

对体细胞杂合体经PCR作图是一种用于将具体DNA定位至具体染色体的快速方法。根据本发明用相同的寡核苷酸引物，可以类似方式用来自具体染色体或较大基因组克隆库(pool)的若干组片段实现亚定位。可类似用于定位至其染色体的其他作图策略包括原位杂交、对已标记的流式分选的染色体作预先筛选、以及通过与构建的染色体-特异性cDNA文库杂交预筛选。 

cDNA克隆与分裂中期染色体分布的荧光原位杂交(FISH)可以一步提供精确的染色体定位。该技术可使用短至500或600碱基的cDNA；但是大于2,000bp的克隆比较可能以足够的信号强度结合至独特的染色体位点来作简单检测。FISH需要使用获得编码EGFL7基因的克隆，而且越长越好。例如，2,000bp是好的，4,000bp更好，4,000以上可能并不是得到好结果合理的时间百分比所必需的。该技术的综述，参见，Verma et al.， Human Chromosomes：a Manual of Basic Techniques(Pergamon Press，New York，1988)。 

一旦序列已经定位至准确的染色体位置，那么该序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据相关。所述数据参见，例如，V.McKusick， MendelianInheritance in Man(可在线获自Johns Hopkins University Welch Medical Library)。然后，通过连锁分析鉴定基因与已定位至相同染色体区域的疾病之间的关系(空间(physically)相邻的基因的共遗传)。 

其次，必须测定患病和未患病个体之间cDNA或基因组序列的差异。如果在一些或全部患病个体中发现但是在任何正常个体中都未发现一种突变，那么该突变可能是所述疾病的致病因素。 

根据物理作图和遗传作图技术的目前分辨率，精确定位至疾病相关的染色体区域的cDNA是50-500个潜在致病基因中的一种。(这里假定1兆碱基的作图分辨度，且每20kb一个基因)。 

候选药物的筛选试验

本发明包括筛选化合物的方法，以鉴定能模拟EGFL7(激动剂)或阻止EGFL7作用(吉抗剂)的化合物。拮抗剂候选药物筛选试验设计为用于鉴定与EGFL7结合或复合、或干扰所述编码多肽与其他细胞蛋白质相互作用的化合物。所述筛选试验包括适于高通量筛选化学文库的试验，使其特别适于鉴定小分子候选药物。 

该试验可以本领域熟知的多种方式进行，所述方式包括蛋白-蛋白结合测定、生物化学筛选试验、免疫测定和基于细胞的试验。 

拮抗剂的全部试验都是常见的，因为它们都要求候选药物与EGFL7接触，在一定条件作用足够长的时间，来使这两种组分相互作用。 

结合试验中，所述相互作用是结合，所形成的复合体可以从反应混合物中分离或检测。一个具体的实施方案中，EGFL7或候选药物通过共价或非共价连接固定于固相，例如，微量滴定板上。非共价连接通常通过用EGFL7溶液包被固体表面后干燥来实现。可选地，可以使用特异性针对待固定EGFL7的固定抗体，例如单克隆抗体，将待固定EGFL7锚定至固相表面。所述试验可以如下进行：将可用可检测标记物标记的非固定成分加至固定成分，例如含有锚定成分的包被表面。当所述反应完成时，通过例如洗涤去除未反应的成分，然后对锚定在固体表面的复合物进行检测。当最初的非固定成分带有可检测标记物时，检测到标记物固定在表面上说明发生了复合反应。当最初的非固定成分不带标记物时，可以通过，例如使用特异性地结合固定复合体的标记抗体，来检测复合反应。 

如果候选化合物与具体EGFL7多肽相互作用但不结合，那么该化合物与该多肽的相互作用可用熟知用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法进行 检测。所述试验包括常规方法，例如，交联、共免疫沉淀法、以及通过梯度或层析柱共纯化。此外，蛋白质-蛋白质相互作用可以通过使用Fields及同事(Fields and Song，Nature(London)340：245-246(1989)；Chien et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9578-9582(1991))描述的基于酵母的遗传系统来监测，描述见Chevray and Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5789-5793(1991)。许多转录活化因子，例如酵母GAL4，都由两个空间上分离(physically discrete)的模块结构域组成，其中的一个作为DNA-结合结构域，另一个作为转录-活化结构域。上述出版物描述的酵母表达系统(通常称为双杂合系统”)利用了这一特性，使用了两种杂合蛋白，在一种蛋白中目标蛋白融合于GAL4的DNA-结合结构域，而在另一种蛋白中候选的活化蛋白质融合于活化结构域。在GAL4-活化启动子调控下的GALl-lacZ报道基因的表达取决于通过蛋白质-蛋白质相互作用的GAL4活性重构。含相互作用多肽的菌落用β-半乳糖苷酶的显色底物检测。使用双杂合技术鉴定两种特定蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用的成套试剂盒(MATCHMAKERTM)可购自Clontech。该系统还可以扩展到对参与特定蛋白质相互作用的蛋白结构域作图，以及精确定位(pinpoint)在这些相互作用关键的氨基酸残基。 

干扰EGFL7与其他胞内或胞外的成分相互作用的化合物可以用下述方法测试：通常制备含EGFL7与所述胞内或胞外的成分的反应混合物，在足以保证两种产物相互作用并结合的条件作用足够长的时间。为了测试侯选化合物抑制结合的能力，在待测化合物缺无和存在的条件下进行反应。此外，向第三反应混合物加入安慰剂作为阳性对照。混合物中出现的待测化合物与所述胞内或胞外成分的结合(复合物形成)用上述方法来监测。在对照反应中而不在含待测化合物的反应混合物中形成复合物，这表明该待测化合物能够干扰待测化合物与其反应配偶体间的相互作用。 

EGFL7拮抗剂可以通过下述方法检测：在适当的条件下，让EGFL7和潜在的拮抗剂与膜-结合EGFL7多肽受体或重组受体联合，来进行竞争性抑制试验。EGFL7可以例如通过放射性来标记，从而使得结合至受体的EGFL7多肽分子数目可用于测定潜在的拮抗剂的有效性。编码所述受体的基因可用本领域技术人员已知的很多方法鉴定，例如配体淘选和FACS分选。Coliganet al.，Current Protocols in Immun.l(2)：Chapter 5(1991)。优选地，使用表达克隆，其中从EGFL7反应性细胞制备聚腺苷酰化的RNA，然后将从该RNA 制备的cDNA文库分为多个库，用于转染COS细胞或其他非EGFL7反应性细胞。将培养于载玻片上的转染细胞暴露于标记的EGFL7多肽。EGFL7可以用多种方法标记，包括碘化或包括位点特异性蛋白激酶的识别位点。在固定和温育后，对载玻片进行放射自显影分析。鉴定阳性库，制备多个亚库，用可相互作用的亚库再次转染并再次筛选，最终产生编码推定受体的单个克隆。 

鉴定受体的可选方法包括，可以将标记的EGFL7多肽与表达所述受体分子的细胞膜或提取物的制备物通过光亲和性连接。用PAGE电泳分离交联物质，并暴露于X射线胶片。切割含所述受体的标记物复合物，分解为肽片段，然后进行蛋白质微量测序。使用得自微量测序的氨基酸序列设计一组简并寡核苷酸探针，以筛选cDNA文库来鉴定编码推定受体的基因。 

在另一种拮抗剂试验中，将表达受体的哺乳动物细胞或膜制备物与标记的EGFL7多肽在侯选化合物存在的条件下温育。从而可以测量所述化合物增强或阻断这种相互作用的能力。 

可用于治疗心血管、内皮和血管生成病症的组合物包括，但不限于，能抑制靶基因产物表达和/或活性的抗体、有机及无机小分子、肽、磷酸肽、反义和核糖核酸酶分子、三股螺旋分子等。 

潜在的拮抗剂的更多具体实例包括，能与免疫球蛋白和EGFL7的融合物结合的寡核苷酸，具体为抗体，包括但不限于，多克隆抗体及单克隆抗体和抗体片段，单链抗体，抗-独特型抗体，以及所述抗体或片段的嵌合或人源化形式，以及人的抗体及抗体片段。可选地，潜在的拮抗剂可以是一种密切相关的蛋白质，例如能识别受体但不施加任何作用、从而竞争性抑制EGFL7作用的EGFL7突变形式。 

另一种潜在的EGFL7拮抗剂是使用反义技术制备的反义RNA或DNA的构建体，其中，例如反义RNA或DNA分子发挥直接阻断mRNA翻译的作用，通过与靶mRNA杂交从而阻止蛋白质翻译。反义技术可用于通过形成三股螺旋或者反义DNA或RNA来控制基因表达，这两种方法都以多核苷酸与DNA或RNA的结合为基础。例如，编码本文所述成熟EGFL7多肽的多核苷酸序列的5′编码部分，可用于设计长度为约10-40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被设计成与参与转录的基因区域互补(三股螺旋-参见，Lee et al.，Nucl.Acids Res.6：3073(1979)；Cooney et al.，Science 241：456(1988)；Dervan et al.，Science 251：1360(1991))，从而阻止EGFL7的转录和生成。本文所述的与RNA一部分“互补的”序列是指，具有与RNA杂交形成稳定双链体的足够互补性的序列；在双链反义核酸情况下，可以测试双链体DNA的单链，或者可以测试三股螺旋的形成。杂交能力取决于互补程度以及反义核酸的长度。通常，杂交核酸越长，它含有的与RNA错配的碱基越多，但仍可形成稳定的双链体(或者三链体，视情况而定)。本领域技术人员可以通过使用常规方法测定杂交复合物的解链温度，来确定错配的耐受程度。反义RNA寡核苷酸在体内可与mRNA杂交，并阻断所述mRNA分子翻译成EGFL7(反义-Okano，Neurochem.56：560(1991)； Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(CRC Press：Boca Raton，FL，1988))。 

所述反义寡核苷酸可以是单链或双链形式的DNA或RNA、或其嵌合混合物、衍生物、或改良形式。所述寡核苷酸可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架上经过修饰，例如，为了提高分子、杂交等的稳定性。所述寡核苷酸可以包括：其他附加基团，例如肽(例如，为了靶向体内宿主细胞受体)，或有助于穿过细胞膜(参见，例如，Letsinger，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：6553-6556(1989)；Lemaitre，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：648-652(1987)；1988年12月15日公开的PCT公开号为WO88/09810的专利文献)或血脑屏障(参见，例如，1988年4月25日公开的PCT公开号为WO89/10134的专利文献)转运的物质，杂交-触发的切割物质(参见，例如，Krol et al.，BioTechniques 6：958-976(1988))或嵌入剂(参见，例如，Zon，Pharm.Res.5：539-549(1988))。为此，可以将所述寡核苷酸与另一分子例如肽、杂交触发的交联剂、转运剂、杂交-触发的切割剂等偶联。 

所述反义寡核苷酸可包括至少一种修饰后碱基部分，其选自包括但不限于下列基团的组：5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧羟甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-半乳糖Q核苷(galactosylqueosine)，次黄嘌呤核苷，N6-异戊烯基腺苷，1-甲基鸟苷，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟苷，2-甲基腺苷，2-甲基鸟苷，3-甲基胞苷，5-甲基胞苷，N6-腺苷，7-甲基鸟苷，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧氨甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖基Q核苷(β-D-mannosylqueosine)，5’-甲氧羧甲基尿嘧啶，5-甲氧 基尿嘧啶，2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷，尿嘧啶-5-羟乙酸(oxyacetic acid)(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，Q核苷，2-硫代胞苷，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-羟乙酸甲基酯，尿嘌呤-5-羟乙酸(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘌呤，(acp3)w，和2，6-二氨基嘌呤。 

所述反义寡核苷酸另外还可以包含至少一种经过修饰的糖部分，其选自包括但不限于下列基团的组：阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。 

另一实施方案中，所述反义寡核苷酸包含至少一种经过修饰的磷酸酯骨架，其选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代亚磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯(phosphordiamidate)、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯，及其formacetal或类似物组成的组。 

另一实施方案中，所述反义寡核苷酸是一种-异头(anomeric)寡核苷酸。-异头寡核苷酸与互补RNA形成特异性双链杂合体，其中与通常的-单元不同，所述链是彼此平行的(Gautier，et al.，Nucl.Acids Res.15：6625-6641(1987))。所述寡核苷酸是一种2’-0-甲基核糖核苷酸(Inoue，et al.，Nucl.Acids Res.15：6131-6148(1987))，或一种嵌合的DNA-DNA类似物(Inoue，et al.，FEBS Lett.215：327-330(1987))。 

本发明的寡核苷酸可以用本领域已知的标准方法合成，例如，通过利用一种自动DNA合成仪(例如可购自Biosearch，Applied Biosystems，etc.)。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸可以用Stein，et al.(Nucl.Acids Res.16：3209(1988))所述的方法合成，甲基膦酸酯寡核苷酸可以通过使用可控的有孔玻璃多聚体支持物(controlled pore glass polymer supports)(Sarin，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：7448-7451(1988))等来制备。 

上述寡核苷酸还可以递送至细胞，从而使反义RNA或DNA在体内表达抑制EGFL7的生成。当使用反义DNA时，优选源自翻译起始位点的寡脱氧(核糖)核苷酸，例如，位于靶基因核苷酸序列第-10至+10位之间。 

反义RNA或DNA分子通常为至少约5个碱基长，约10个碱基长，约15个碱基长，约20个碱基长，约25个碱基长，约30个碱基长，约35个碱基长，约40个碱基长，约45个碱基长，约50个碱基长，约55个碱基长，约60个碱基长，约65个碱基长，约70个碱基长，约75个碱基长，约80个碱基长，约85个碱基长，约90个碱基长，约95个碱基长，约100个碱基长，或更长。 

潜在的拮抗剂还包括与EGFL7的活性位点、受体结合位点、或者生长因子或其他相关结合位点的小分子，从而封闭EGFL7的正常生物活性。小分子的实例包括，但不限于，肽或肽-样小分子，优选可溶性肽，和合成的非-肽基的有机或无机化合物。 

另外的潜在拮抗剂是核酶，它是一种能催化RNA特异性切割的酶促RNA分子。核酶通过与互补的靶RNA序列特异性杂交，然后内核分离(endonucleolytic cleavage)来起作用。潜在RNA靶标中的特异性核酶切割位点可以用已知技术鉴定。更多细节见，例如，Rossi，Current Biology 4：469-471(1994)，和PCT公开号为WO 97/33551的专利文献(公开于1997年9月18日)。 

尽管能在位点特异性识别序列处切割mRNA的核酶都可用于破坏靶基因mRNA，优选使用锤头核酶。锤头核酶在受侧翼区域指导(dictated)的位置切割mRNA，所述侧翼区域与所述靶mRNA形成互补碱基对。唯一的要求是靶mRNA具有下列两个碱基的序列：5′-UG-3′。锤头核酶的构建和制备已为本领域所熟知，更完整的描述见Myers，Molecular Biology and Biotechnology：AComprehensive Desk Reference，VCH Publishers，New York(1995)，(特别是参见第833页图4)和Haseloff and Gerlach，Nature，334：585-591(1988)，在此全文引入作为参考。 

优选将所述核酶改造为将所述切割识别位点置于靶基因mRNA 5′端附近，即，为了提高效率，并将无功能mRNA转录物的胞内堆积降至最低。 

本发明的核酶还包括RNA核糖核酸内切酶(在下文中称为“Cech-型核酶”)例如在嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中天然出现的核酶(被称为IVS，或L-19 IVS RNA)，已被Thomas Cech和合作者进行了全面描述(Zaug，et al.，Science，224：574-578(1984)；Zaug and Cech，Science，231：470-475(1986)；Zaug，et al.，Nature，324：429-433(1986)；已公开的University Patents Inc.的国际专利申请WO 88/04300；Been and Cech，Cell，47：207-216(1986))。所述Cech-型核酶具有一个8个碱基对的活性位点，其与靶RNA序列杂交然后靶RNA的被切割。本发明包括靶向存在于靶基因的8个碱基对活性位点序列的Cech-型核酶。 

反义方法中，核酶可由修饰的寡核苷酸组成(例如，为了提高的稳定性，靶向性，等)，应该被递送至体内表达靶基因的细胞。一种优选的递送方法包括：使用受强效组成型pol III或pol II启动子控制的“编码”核酶的DNA构建 体，从而使得转染细胞产生足量核酶来破坏内源性的靶基因信使并抑制翻译。因为核酶与反义分子不同，是催化性的，所以发挥效力需要较低的胞内浓度。 

用于抑制转录的呈三股螺旋形式的核酸分子应该是单链的并由脱氧核苷酸组成。这些寡核苷酸的碱基组成被设计成经Hoogsteen碱基配对规则促进三股螺旋的形成，这通常需要在双链体的一条链上有相当长的一段嘌呤或嘧啶。更多细节参见，例如，如上公开号为WO 97/33551的PCT申请。 

这些小分子可以通过上述任何一或多种筛选试验和/或本领域技术人员熟知的任何其他筛选技术进行鉴定。 

待治疗的心血管、内皮和血管生成病症的类型

在具有本文所述的心血管、血管生成及内皮试验中具有活性的EGFL7或其激动剂，可以用于治疗多种心血管、内皮和血管生成病症，包括影响血管的全身性病症，例如糖尿病。它们的治疗用途可包括动脉、毛细血管、静脉和/或淋巴系统的疾病。下文中的治疗的实例包括：治疗肌肉萎缩性疾病，治疗骨质疏松症，帮助植入物固定来刺激植入物周围的细胞生长从而促进其与预期位点的结合，提高组织或血清中的IGF稳定性，可行的话可以提高与IGF受体的结合(由于体外实验表明IGF能增强人骨髓红细胞及粒细胞的祖细胞的生长)。 

EGFL7或其激动剂还可用于刺激红细胞生成或粒细胞生成，刺激伤口愈合或组织再生以及与组织(例如结缔组织、皮肤、骨、软骨、肌肉、肺或肾)再生相关的治疗，促进血管生成，刺激或抑制内皮细胞的迁移，，以及使血管平滑肌生长和内皮细胞生成增加。EGFL7或激动剂介导的血管生成增加对缺血组织和冠状动脉狭窄后心脏内侧支冠状动脉的发育有好处。如果EGFL7能促进所述生成的话，抑制所述多肽作用的拮抗剂可用于，例如，在伤口愈合或肺纤维化期间限制过度结缔组织的生成。这包括对急性心肌梗塞和心力衰竭的治疗。 

疾病的具体类型描述如下，其中EGFL7可用于血管-相关的药物靶向或者作为治疗或预防所述病症的治疗靶标。动脉粥样硬化是一种具有下列特征的疾病：由于动脉壁内脂类堆积、平滑肌细胞增生和纤维组织形成，导致动脉内膜变厚的斑块堆积。所述疾病能够影响任何器官中的大、中及小动脉。现已知内皮和血管平滑肌细胞功能的变化在调控这些斑块的堆积和退化中 发挥重要作用。 

高血压的特点在于全身动脉、肺动脉或门静脉系统内血管压力的升高。压力升高可能源于或导致内皮功能受损和/或血管疾病。 

炎性血管病包括：巨细胞动脉炎，高安动脉炎(Takayasu′s arteritis)，结节性多动脉炎(polyarteritis nodosa)(包括微血管病形式)，川崎病(Kawasaki′sdisease)，显微多血管炎(microscopic polyangiitis)，韦格纳肉芽肿病(Wegener′sgranulomatosis)，以及多种感染性-相关的血管病症(包括Henoch-Schonleinprupura)。已发现内皮细胞功能的改变对于这些疾病很重要。 

雷诺综合征(Reynaud′s syndrome)和雷诺现象(Reynaud′s phenomenon)的特征在于：由于四肢暴露于寒冷导致循环间歇性异常损伤。已发现内皮细胞功能的改变对于该疾病很重要。 

动脉瘤是动脉或静脉树的囊状(saccular)或梭形(fusiform)膨胀，与内皮细胞和/或血管平滑肌细胞的变化有关。 

动脉再狭窄(动脉壁再狭窄)发生在血管成形术后，是内皮和血管平滑肌细胞的功能及增生改变的结果。 

血栓静脉炎和淋巴管炎分别是静脉及淋巴系统的炎性病症，源于和/或导致内皮细胞功能的改变。类似地，淋巴水肿是一种涉及由内皮细胞功能导致的淋巴管受损的病症。 

良性和恶性动脉瘤家族的特征为血管系统细胞分子的异常增生和生长。例如，淋巴管瘤是先天性的淋巴系统良性瘤，通常是常见于新生儿的淋巴系统的囊性畸形。囊性瘤倾向于生长进入邻接组织。囊性瘤通常发生在子宫颈和腋部。它们还可能出现在四肢的软组织。主要症状是由结缔组织围绕的结构膨胀的、有时呈网状的淋巴系统以及淋巴囊肿。淋巴管瘤被认为起因于不恰当连接的胚胎淋巴系统或其缺损。该结果是局部的淋巴引流受损。Grieneret al.，Lymphology 4：140-144(1971)。 

EGFL7拮抗剂的另一用途是预防肿瘤血管生成，包括由于肿瘤血管形成导致其生长和/或转移。该过程取决于新血管的生长。涉及肿瘤血管生成的肿瘤及相关病症的例子包括：鳞状细胞癌，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌以及肺鳞状癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃或肠的癌症(包括胃肠癌)，胰腺癌，恶性胶质瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾或肾的 癌，肝癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝的癌及多种头颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金的淋巴瘤(NHI)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级扩散性NHL；高级成免疫细胞NHL；高级成淋巴细胞NHL；高级小无裂细胞NHL；巨块病NHL；慢性淋巴细胞白血病；AIDS-相关淋巴瘤；以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性成淋巴母细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；和移植后淋巴组织增生病症(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病有关的异常血管增殖，水肿(例如与脑瘤有关的)，以及梅热综合征。 

所述EGFL7拮抗剂还可用于治疗眼内新生血管性疾病，包括但不限于，增生性视网膜病，脉络膜的新生血管生成(CNV)，年龄-相关的黄斑变性(AMD)，糖尿病及其他缺血-相关的视网膜病，糖尿性黄斑水肿，病理的近视，病理性近视，希林二氏病(von Hippel-Lindau disease)，眼睛的组织胞浆菌病，视网膜中央静脉闭塞(CRVO)，角膜新生血管生成，视网膜新生血管形成，等。 

类风湿性关节炎是另一种适应症。血管生长和通过脉管系统靶向炎性细胞是类风湿性及血清-阴性形式的关节炎的发病机理的重要组成部分。 

如上所述，已证明能够改变或影响内皮细胞功能及迁移的本文所述EGFL7、其激动剂或拮抗剂，可能在多数或全部上述病症的病因学及发病机理中发挥重要作用，所以能够用作加强或抑制这些过程或者在这些病症中的血管相关性药物所靶向的治疗靶标。 

施用方式、方案、剂量和配制剂

上本文所述分子及其激动剂和拮抗剂在药学可作为上列各种病症及疾病的预防及治疗剂。 

通过下述操作制备EGFL7或激动剂或拮抗剂的呈冻干配制剂或水溶液形式的治疗组合物备用：将具有适当纯度的所需分子与可选的药物可接受的载体、赋形剂、或稳定剂混合(Remington′s Pharmaceutical Sciences，16thedition，Osol，A.ed.(1980))。可接受的载体，赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度对于接受者是无毒的，并包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐，及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚：环己 醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量多肽(少于约10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子(counter-ion)如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子型表面活性剂如TWEEN^TM，PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。 

所述载体的其他例子包括离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白，如人血清白蛋白，缓冲剂物质如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯(partial glyceride of saturated vegetable fattyacids)混合物，水，盐或电解质如鱼精蛋白硫酸盐(protamine sulfate)，磷酸氢二钠，磷酸氢二钾，氯化钠，锌盐，胶态(colloidal)硅石，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，以纤维素为基的物质，和聚乙二醇。激动剂或拮抗剂的局部或以胶体为基的(topical or gel-based)形式的的载体，包括多糖例如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酸酯，聚氧乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇，和木蜡醇(wood wax alcohols)。对于所有施用而言，常规储存形式是适合使用的。所述形式包括，例如，微胶囊，毫微胶囊(nano-capsules)，脂质体，膏剂(plaster)，吸入形式，喷鼻剂，舌下片剂，和缓释制剂。EGFL7或激动剂或拮抗剂通常以约0.1mg/ml至100mg/ml的浓度配制于所述载体中。 

另一种配制剂包括将EGFL7或其激动剂或拮抗剂装入有一定形状的制品。所述制品可用于调控内皮细胞生长和血管生成。此外，可以用这些制品调控肿瘤的侵入和转移。 

将要用于体内施用的EGFL7多肽或激动剂或拮抗剂必须是无菌的。这可以通过在冻干和重建之前或之后通过除菌滤膜进行过滤而轻易实现。如果全身给药，EGFL7多肽一般会以冻干形式或在溶液中储存。如果采用冻干形式，EGFL7或其激动剂或拮抗剂通常与其他成分联合配制，来在使用时用合适的稀释剂重建。EGFL7或激动剂或拮抗剂的液体制剂的例子是一种无菌、澄清、无色的未经防腐处理的溶液，该溶液被装入单-剂量小瓶来作皮下注射。例如，主要根据适应症和多肽类型，适于重复使用的经过防腐处理的药物组合物可包含： 

EGFL7多肽或其激动剂或拮抗剂； 

能够保持溶液中的多肽或其他分子的最大稳定性的pH范围的缓冲剂优选约4-8； 

主要用于使抵抗搅拌引发的聚集的多肽或分子稳定的洗涤剂/表面活性剂； 

等渗剂(isotonifier)； 

选自苯酚、苯甲醇和苄乙铵卤化物，例如氯化的防腐剂；以及 

水。 

如果使用非离子型洗涤剂，它可以为例如，聚山醇酯(polysorbates)(例如，POLYSORBATE^TM(TWEEN^TM)20，80，等)或泊洛沙姆(poloxamers)(例如，POLOXAMER^TM188)。使用非离子型表面活性剂可使得所述配制剂暴露于剪切面应力(shear surface stresses)，但不使多肽变性。另外，所述含表面活性剂的配制剂可以用气溶胶设备，如肺部定量给药(pulmonary dosing)所用的那些设备，和无针喷射注射枪(jet injection gun)(参见，例如，EP 257,956}。 

可存在等渗剂以保证EGFL7或其激动剂或拮抗剂的液态组合物的等渗性，并包括多羟基糖醇，优选三羟基或更高级的糖醇，例如甘油，赤藓糖醇，阿拉伯糖醇，木糖醇，山梨醇，和甘露醇。这些糖醇可以单独或联合使用。可选地，氯化钠或其他合适无机盐可用于使溶液等渗。 

所述缓冲液可以，例如，是一种醋酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，或磷酸盐缓冲液，视需要的pH而定。本发明所述的一种类型的液态配制剂的pH被缓冲到约4-8的范围，优选大约为生理pH。 

防腐剂苯酚、苯甲醇和苄乙铵卤化物，例如氯化苄乙铵是已知可以使用的抗微生物剂。 

本文所述的多肽组合物通常置于一带有无菌存取口(access port)的容器中，(例如该容器可以是静脉点滴袋(intravenous solution bag)或带有能通过皮下注射针穿刺的塞子的小瓶)。所述配制剂优选以重复静脉内(i.v.)，皮下(s.c.)或肌内(i.m.)注射剂，或以适于鼻内或肺内传递的气溶胶配制剂来施用(肺内传递参见，例如，EP 257,956)。 

治疗性多肽还可以缓释配制剂的方式来施用。缓释配制剂的合适的实例包括包含蛋白质的固态疏水聚合物的半通透性基质，所述基质为具有一定形状的制品，如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟基 乙基-异丁烯酸酯)，如Langer et al.，J. Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)和Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982)所述，或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利3,773,919，EP 58,481)，L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman et al.，Biopolymers 22：547-556(1983))，不可降解的乙烯乙酸乙酯(Langer et al.，同上文)，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物例如Lupron Depot^TM(由乳酸-羟基乙酸共聚物与醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)。 

聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，而一些水凝胶释放蛋白的时间较短。当胶囊化的蛋白质在生物体保留长时间，在37℃接触湿气可使它们变性或聚集，导致生物活性的丧失并可能导致免疫原性改变。可以根据选择机理的不同制定合理策略进行蛋白质稳定化处理。例如，如果发现聚集机理是由于硫代-二硫化物互换而形成分子间S-S键，可以通过下述操作实现稳定化：修饰巯基残基，从酸性溶液冻干，控制湿度，使用合适添加剂，和开发特异性聚合物基质组合物。 

缓释的EGFL7多肽组合物还包括脂质体包埋的EGFL7多肽。含EGFL7多肽的脂质体用本领域已知的方法制备：DE 3,218,121；Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688-3692(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP142,641；日本专利申请83-118008；美国专利4,485,045和4,544,545；和EP102,324。通常所述脂质体是小的(约200-800埃)单层型的，其中脂类含量大于约30mol％胆固醇，对所选比例调整以求最佳疗效。 

EGFL7或激动剂或拮抗剂的治疗有效量的改变取决于下列等因素：所治疗(包括预防)的病症，施用方法，治疗用化合物的类型，任何涉及的共同治疗(co-therapy)，患者年龄，体重，身体状况，病史，等，医生可以很好地确定剂量。因此，医生必须根据需要来滴定剂量并调整给药途径，以求获得最佳治疗效果。如果EGFL7的宿主范围狭窄，对人类患者的治疗优选使用含有人EGFL7多肽的配制剂，更优选天然序列的人EGFL7多肽。临床医生施用EGFL7直至达到治疗需要治疗的症状得到理想效果的剂量。例如，如果目标是治疗CHF，那么所述量就是能抑制与该病症相关的进行性心脏肥大的量。治疗过程通过回声心动描记法可以很容易地监测。类似地，在肥厚型心肌病患者，可以根据经验施用EGFL7。 

根据上述指导原则，所述有效剂量的范围通常为约0.001至约1.0mg/kg，更优选约0.01-1.0 mg/kg，最优选约0.01-0.1mg/kg。 

在治疗成人高血压中以非口服方式使用，以注射剂的形式施用EGFL7是有利的，其中以静脉内注射方式每日注射1-3次，每公斤体重注射约0.01-50mg，优选约0.05-20mg，更优选1-20mg。对于口服施用，每日1-3次给药基于EGFL7多肽的分子，优选每公斤体重约5mg-1g，优选约10-100mg。应该理解的是，内毒素污染应该控制在最低安全限度，例如，0.5ng/mg蛋白质以下。此外，为了施用给人，所述配制剂优选要达到FDA Office andBiologics标准所要求的无菌性、热原性、一般安全性及纯度。 

用于组织再生的含EGFL7的药物组合物的剂量方案，将由主治医师结合下列改变多肽作用的多项因素来确定，例如，预计形成的组织重量，损害部位，破损组织的状况，伤口大小，破损组织的类型(例如，骨)，患者年龄，性别及饮食，任何感染的严重程度，施用时间，以及其他临床因素。所述剂量可随重建中所用的基质种类、药物组合物中所包括的其他蛋白质而变化。例如，向最终的组合物加入其他已知的生长因子，例如IGF-I，也可能影响剂量。可通过周期性评估组织/骨的生长和/或修复(例如X射线、组织形态学测定和四环素标记)来监测进展。 

EGFL7多肽或拮抗剂或激动剂的施用途径与已知方法一致，例如，经过静脉内、肌内、脑内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、眼内、关节内、滑膜内、鞘内、经口、局部、或吸入途径，通过注射或输注，或通过下文所述的缓释系统。EGFL7或其激动剂或拮抗剂还可以通过瘤内、肿瘤周围、病灶内(intralesional)或病灶周围(perilesional)途径施用，以实现局部及全身的治疗效果。腹膜内途径是最有用的，例如在卵巢肿瘤治疗中。 

如果一种肽或小分子作为拮抗剂或激动剂使用，优选以液态或固态的形式口服或非-口服施用至哺乳动物。 

成盐且下文中可用的分子的可药用盐的实例包括碱金属盐(例如，钠盐，钾盐)，碱土金属盐(例如，钙盐，镁盐)，铵盐，有机碱盐(例如，吡啶盐，三乙胺盐)，无机酸盐(例如，氢氯化物，硫酸盐，硝酸盐)，以及有机酸盐(例如，醋酸盐，草酸酯，对甲苯磺酸盐)。 

对于本文所述可用于骨、软骨、肌腱再生的组合物而言，治疗方法包括局部、全身或部分作为植入物或装置来局部施用该组合物。当施用时，所述 治疗组合物为无致热原、可生理接受的形式。另外，期望所述组合物被胶囊化或以粘稠形式注射，递送至骨、软骨或组织损伤位置。局部施用要适于伤口愈合和组织修复。优选地，对于骨和/或软骨形成而言，所述组合物包括一种能将含蛋白质的组合物递送至骨和/或软骨损害位置的基质，为正在发育的骨和软骨提供结构，并且优选能被再吸收回体内。所述基质可以用目前用于其他植入的医学装备的材料制成。 

对基质材料的选择根据生物相容性、生物可降解性、机械特性、外观(cosmetic appearance)及界面特性而定。所述组合物的具体用途限定了合适的配制剂。对于所述组合物可能的基质可以是生物可降解的及化学限定的硫酸钙、磷酸三钙、羟磷灰石、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸(polyglycolic acid)，和聚酐(polyanhydride)。其他可能的材料是生物可降解的和生物学限定良好的，例如骨或皮的胶原蛋白。基质还包含纯的蛋白质或胞外基质成分。其他有效的基质是生物不可降解且化学限定的，例如烧结过的羟磷灰石，生物玻璃，铝酸盐或其他陶瓷。基质可以包含任何上述类型材料的组成，例如聚乳酸和羟磷灰石或胶原蛋白和磷酸三钙。所述生物陶瓷可以在组分(如磷酸钙铝)上发生改变，并且加工来改变孔径、粒径、颗粒形状、和生物可降解度。 

一个具体的实施方案是一种乳酸和羟基乙酸的50∶50(摩尔重)共聚物，呈直径150-800微米的多孔颗粒形式。一些申请中，使用螯合剂例如羧甲基纤维素或自体血液凝块，来阻止多肽组合物从所述基质中脱离出来。 

合适的一类螯合剂是纤维素材料，例如烷基纤维素(包括羟烷基纤维素)，包括甲基纤维素，乙基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素，优选为羧甲基纤维素(CMC)的阳离子盐。其他优选的螯合剂包括透明质酸，海藻酸钠，聚(乙二醇)，聚氧乙基氧化物，羧乙基聚合物，和聚(乙烯醇)。本申请中螯合剂的用量为占制剂总重量的O.5-20wt％，优选1-10wt％，所述量对防止多肽(或其拮抗剂)从聚合物基质中释出(desorpt)并适当地处理所述组合物是必要的，但是这样的量并不足以阻止祖细胞浸润到基质，从而为所述多肽(或其拮抗剂)提供辅助祖细胞成骨活性的机会。 

联合治疗

提高EGFL7或其激动剂或拮抗剂在预防或治疗需要治疗的病症中的效果，可以通过在同一组合物中或者作为独立的组合物、顺序或联合施用活性药剂与另一有效药剂。 

例如，用于治疗血管生成相关性病症例如癌症或眼科疾病的EGFL7拮抗剂，可以与上述细胞毒性的、化学治疗的或抗-血管生成的药剂联合。在一个肿瘤模型中发现，用抗-VEGF抗体治疗肿瘤后，EGFL7仍保留在退化的肿瘤血管的轨迹(track)中(参见实施例)。不希望受具体理论的限制，EGFL7能够发挥支持EC沿已有ECM轨道迁移的作用，从而帮助抗-血管生成治疗后的血管再生。因此，将EGFL7拮抗剂与抗-血管生成药剂联用来增强或致敏所述抗-血管生成药剂的活性是理想的。一个优选实施方案中，将所述EGFL7拮抗剂与抗-VEGF抗体bevacizumab联用来它增强的抗-肿瘤效力。 

与EGFL7或其激动剂或拮抗剂联用的治疗剂的有效量由医师或兽医确定。剂量施用及对它的调整是为了最大限度地治疗要治疗的病症。例如，对于高血压的治疗而言，这些量的确定最好要将利尿剂或洋地黄的使用，高或低血压等状况，肾损伤等考虑在内。另外，所述剂量还取决于所用治疗剂的类型和所治疗的具体患者等因素。通常，如果给定的治疗剂不与EGFL7联用，那么所述用量等于其使用剂量。 

制品

对诊断或治疗上述病症有用的制品，例如含有EGFL7或其激动剂或拮抗剂的试剂盒，包含至少一个容器和标签。合适的容器包括，例如，瓶，小瓶，注射器，和试管等。所述容器可以各种材料如玻璃或塑料制成。所述容器装有能有效诊断或治疗所述病症的组合物，并带有灭菌存取口(例如，所述容器可以是一种静脉点滴袋或带有能通过皮下注射针穿刺的塞子的小瓶)。所述组合物中的活性药剂是EGFL7或其激动剂或拮抗剂。所述容器上或与容器相连的标签标明，所述组合物可用于诊断或治疗指定的病症。所述制品还可以包含第二个容器，其中含有可药用的缓冲液，例如磷酸盐-缓冲盐水，林格溶液(Ringer’s solution)，及葡萄糖溶液。它还可以包括根据从商业及用户角度理想的其他材料，包括其他缓冲液，稀释剂，滤器，针头，注射器，和带有使用说明的包装插页。所述制品还可以包括装有上述另一种活化剂的第二个或第三个容器。 

EGFL7抗体 

本发明所述的最有前途的一些候选药物是能抑制本申请所述基因的生成或基因产生物和/或降低基因产物活性的抗体及抗体片段。 

多克隆抗体

制备多克隆抗体的方法已为本领域技术人员所知。多克隆抗体可以在哺乳动物产生，例如通过一或多次注射免疫剂，如果需要的话，注射佐剂。通常，所述免疫剂和/或佐剂通过皮下或腹膜内多点注射。所述免疫剂包括EGFL7多肽或其融合蛋白。可以采用将所述免疫剂偶联至已知对于所免疫动物来说具有免疫原性的蛋白质。这类免疫原性蛋白质的实例包括但不限于，匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)，血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白，和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以使用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质体A或合成的trehalose dicorynomycolate)。免疫方案本领域技术人员无需过多试验即可选定。 

单克隆抗体

可选地，所述抗-EGFL7抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，例如描述见Kohler and Milstein，Nature 256：495(1975)。杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其他合适宿主动物，来激发淋巴细胞产生或能产生可特异性结合所述免疫剂的抗体。可选地，可以体外免疫所述淋巴细胞。 

所述免疫剂通常包括EGFL7多肽或其融合蛋白。通常，如果需要人源细胞时，则使用外周血单核细胞(″PBLs″)，或者如果需要非人源哺乳动物的细胞时，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后，使用一种合适的助融剂，例如聚乙二醇，将淋巴细胞与无限增殖细胞系融合形成杂交瘤细胞。Goding， Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(New York：Academic Press，1986)，pp.59-103。无限增殖细胞系通常是转化后的哺乳动物细胞，特别是来源于啮齿动物、牛和人的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠的骨髓瘤细胞系。可以将所述杂交瘤细胞培养于合适的培养基中，优选含有一种或多种能抑制未融合的无限增殖细胞的生长或存活的物质。例如，如果所述亲代细胞不含次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么杂交瘤的培养基通常会含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(“HAT培养基”)，这些物质阻止了HGPRT-缺陷型细胞的生长。 

优选地，无限增殖细胞系能高效融合，支持由所选的抗体-生成细胞稳定高水平地表达抗体，并且对于HAT培养基等培养基敏感。更优选地，无限增殖细胞系是鼠骨髓瘤系，例如可获自the Salk Institute Cell DistributionCenter，San Diego，California和the American Type Culture Collection，Manassas，Virginia。另外还公开了使用人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系制备人单克隆抗体。Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur et al.， MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications(Marcel Dekker，Inc.：NewYork，1987)pp.51-63。 

然后测定培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在抗EGFL7多肽的单克隆抗体。优选地，所述通过杂交瘤细胞制备的单克隆抗体的结合特异性，可以通过免疫沉淀法或通过体外结合试验来测定，所述试验例如为放射性同位素测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)。这类技术及测定在本领域都已知。单克隆抗体的结合亲合力可以，例如用Munson and Pollard，Anal.Biochem.107：220(1980)的Scatchard分析来确定。 

在鉴定出所需杂交瘤细胞后，将这些克隆用有限稀释法进行再克隆并用标准方法使其生长。Goding，同上。适于此目的的培养基包括，例如，Dulbecco′s改良Eagle′s培养基和RPMI-1640培养基。可选地，所述杂交瘤细胞可以以哺乳动物腹水的形式在体内生长。 

亚克隆分泌的单克隆抗体，可以用常规的免疫球蛋白纯化方法，例如，蛋白质A-Sepharose，羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析或亲和层析，从培养基或腹水中分离或纯化。 

也可用重组DNA方法制备单克隆抗体，所述方法如美国专利4,816,567所述。可用传统方法容易地分离并测序编码本发明单克隆抗体的DNA(例如，通过使用能够特异性结合鼠抗体重链和轻链的编码基因的寡核苷酸探针)。本发明的杂交瘤细胞可作为所述DNA的优选来源。所述DNA在分离后可被置入表达载体中，然后转染到宿主细胞(如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生其他免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)中，来在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。也可以修饰DNA，例如，通过用人重链和轻链恒定区的编码序列取代同源鼠序列(美国专利4,816,567；Morrison等，见上文)，或通过将免疫球蛋白编码序列与全部或部分的非免疫球蛋白多肽编码序列共价连接。所述的非免疫球蛋白多肽可以被本发明抗体的恒定区取代，或被本发 明抗体的一个抗原结合位点的可变区取代，来制备嵌合的二价抗体。 

所述抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法本领域已知。例如，一种方法涉及重组表达免疫球蛋白轻链和修饰的重链。所述重链通常在Fc区的任意点被截短，从而避免重链的交联。或者，相关的半胱氨酸残基被其他的氨基酸残基取代或者缺失，从而避免交联。 

体外方法也适合用于制备单价抗体。可以使用本领域已知常规技术消化抗体制备其片段，尤其是Fab片段。 

人抗体及人源化抗体

所述的抗-EGFL7抗体还可以进一步包括人源化抗体或人的抗体。非人(例如，鼠)抗体的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白，免疫球蛋白链，或其片段(如 Fv，Fab，Fab′，F(ab′)₂，或者抗体的其他抗原结合亚序列(subsequence))，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(接受者的抗体)，其中来自接受者CDR的残基被具有理想的特异性、亲和性和能力的来自非人物种(供者的抗体)如小鼠、大鼠、或兔的CDR的残基所取代。有些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基取代。人源化抗体也可包含既不在接受者抗体也不在引进的(imported)CDR或框架序列中发现的残基。通常，人源化抗体会包含基本所有可变区中的至少一个可变区，通常为两个可变区，其中所有的或基本所有的CDR区与非人免疫球蛋白对应，并且所有的或基本所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体优选还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmannet al.，Nature 332：323-329(1988)；Presta，Curr. Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。 

本领域已知将非人抗体人源化的方法。通常，人源化抗体具有一或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“引进的”残基，它们常来自“引进的”可变区。人源化基本可根据Winter及合作者的方法进行(Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988))，该方法将啮齿类动物的CDRs或CDR序列取代为人抗体的相应序列。由此，这些“人源化”的抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中完整人类可变区的很少一部分(less than an intact human variable domain)基本被来自非人物种的相应 序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中一些CDR残基且可能有部分FR残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代。 

人抗体还可以使用各种本领域已知技术制备，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581(1991)。Cole et al.和Boerner et al所述技术也可用于制备人单克隆抗体。Cole et al。 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)and Boerner et al.，J.Immunol.147(1)：86-95(1991)。或者，可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物来制备人抗体，所述转基因动物如，内源性免疫球蛋白基因已经被部分或全部灭活的小鼠。攻击后，可观察到人抗体的产生极其类似在人所见的所有方面，包括基因重排，装配(assembly)，以及抗体的所有组成成分(repertoire)。对此方法的描述见例如，例如美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016，以及下列科技出版物：Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature，368：812-813(1994)；Fishwild etal.，Nature Biotechnology 14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology14：826(1996)；Lonberg and Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。 

双特异性抗体

双特异性抗体是具有针对至少两种不同抗原的结合特异性的单克隆抗体(优选人抗体或人源化抗体)。在本发明中，一种结合特异性是针对EGFL7多肽，另一种结合特异性是针对任何其它抗原，优选针对细胞表面的蛋白质或受体或受体亚基。 

制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组制备是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条重链具有不同特异性。Milstein and Cuello，Nature 305：537-539(1983)。由于免疫球蛋白重链和轻链随机分配(random assortment)，这些杂交瘤(quadroma)产生10种不同抗体分子的可能的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。对所述正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤来进行。类似的方法见1993年5月13日公开的WO 93/08829和Traunecke et al.，EMBO J.10：3655-3659(1991)。 

可以将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。优选与包含铰链区、CH2及CH3区的至少一部分 的免疫球蛋白重链恒定区发生融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少一种融合物中。可将编码免疫球蛋白重链融合体，以及必要时，编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，共转染至适当宿主生物。更多制备双特异性抗体的细节见例如Suresh et al.，Methods inEnzymology 121：210(1986)。 

异源偶联抗体

异源偶联抗体由共价联结的两个抗体组成。有观点认为，这类抗体例如可以使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利4,676,980)，并用于治疗HIV感染。WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089。可以使用巳知的合成蛋白化学方法，包括涉及交联剂的方法，体外制备所述抗体。例如，免疫毒素可用二硫化物互换反应或通过形成硫醚键来构建。适宜的试剂例如包括亚胺硫醇(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁酰亚胺(methyl-4-mercaptobutyrimidate 和如美国专利4,676,980所公开的那些试剂。 

免疫偶联物

本发明还涉及包含偶联于细胞毒药剂的本文所述抗体的免疫偶联物，所述细胞毒药剂诸如化疗剂，毒素(例如细菌，真菌，植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射偶联物)。 

可用于产生所述免疫偶联物的化疗剂已经在上文描述。可以应用的酶活性毒素及其片段包括：白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecenes)。多种放射性核素可用于制备放射偶联物抗体。实例包括²¹²Bi，¹³¹I，¹³¹In，⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。 

抗体和细胞毒作用制剂的偶联物可通过多种双功能蛋白偶联剂来连接，所述双功能蛋白偶联剂如：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亚胺基硫烷(IT)，亚胺酸酯的双功能衍生物(如盐酸二甲基己二酸亚氨酯)，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛)，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲 酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，Science 238：1098(1987)所述制备。C14标记的l-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三氨五乙酸(MX-DTPA)是将放射性核苷酸偶联至抗体的偶联剂之一。见WO94/11026。 

在另一实施方案中，抗体可与肿瘤预靶向所用的“受体”(如链霉抗生物素蛋白)偶联，在所述肿瘤预靶向中，先将该抗体-受体偶联物给予患者，之后用清除剂(clearing agent)除去循环中未结合的偶联物，再给予已偶联了细胞毒作用制剂(如放射性核苷酸)的“配体”(如抗生物素蛋白)。 

免疫脂质体

本发明公开的抗体也被配制成免疫脂质体。含有所述抗体的脂质体通过本领域已知方法制备，诸如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；以及美国专利4,485,045和4,544,545中所述。具有延长的循环时间的脂质体在美国专利5,013,556中公开。 

特别有用的脂质体可利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物经反相蒸发法产生。通过使脂质体在挤压之下穿过指定孔径大小的滤膜，可获得具有所需直径的脂质体。本发明抗体的Fab’片段可如Martin等，J.Biol.Chem.，257：286-288(1982)所述，经二硫键交换反应与脂质体偶联。可任选在所述脂质体中包含化疗药物(如多柔比星)。见Gabizon等，J.National Cancer Inst，81(19)1484(1989)。 

抗体的药物组合物

特异性结合本申请所述EGFL7多肽的抗体以及通过上文所述筛选试验鉴定出的其他分子，可以药物组合物形式施用，用于治疗本文所述的各种病症。 

本发明所述配制剂还可含有一种以上的治疗具体适应症必需的活性化合物，优选具有不会彼此抵触的互补活性的化合物。可选地，或者另外地，所述组合物可以含有能增强其功能的物质，例如，细胞毒素物质、细胞因子、化疗剂或生长-抑制剂。这类分子适合以对预定目标有效的量联合出现。 

还可以将活性成分包埋在制备的微胶囊中，例如，通过团聚技术或通过界面聚合，例如，羟甲基纤维素或明胶-微胶囊及聚(methylmethacylate)微胶 囊中，胶体药物传送系统(例如，脂质体，白蛋白微球体，微乳状液(microemulsion)，纳米颗粒，和毫微胶囊)中或者大分子乳状液(macroemulsions)中。所述技术描述见Remington′s  Pharmaceutical Sciences，同上文。 

将要用于体内施用的配制剂必须是灭菌的。这可以通过用除菌滤膜进行过滤而容易实现。 

可以制备缓释配制剂。缓释配制剂的合适的实例包括包含通透性基质，所述基质为具有一定形状的制品，如膜或微胶囊。缓慢释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利3,773,919)，L-谷氨酸及γ乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物例如Lupron Depot^TM(由乳酸-羟基乙酸共聚物与醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，而一些水凝胶释放蛋白的时间较短。当胶囊化的蛋白质在生物体保留长时间，在37℃接触湿气可使它们变性或聚集，导致生物活性的丧失并可能导致免疫原性改变。。可以根据选择机理的不同制定合理策略进行稳定化处理。例如，如果发现聚集机理是由于硫代-二硫化物互换而形成分子间S-S键，可以通过下述操作实现稳定化：修饰巯基残基，从酸性溶液冻干，控制湿度，使用合适添加剂，和开发特异性聚合物基质组合物。 

使用所述抗体的治疗方法

因此，抗EGFL7多肽抗体可用于治疗上述各种血管生成相关性病症。 

所述抗体可经肌内、腹膜内、关节内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、经口、局部、或吸入途径，用已知方法施用给哺乳动物，优选人，例如以推注(bolus)或一段时间内连续输注的方式静脉内施用。优选静脉内施用所述抗体。 

其他治疗方案可以与本发明所述抗体的施用联合进行，如上所述。例如，如果所述抗体用于治疗癌症，那么用所述抗体治疗的患者还可以接受放射疗法。可选地，或另外，可以向患者施用化疗剂。所述化疗剂的制剂及剂量方案可根据厂商说明书使用或者由本领域技术人员凭经验确定。所述化疗的制剂及剂量方案描述还见 Chemotherapy Service，Ed.，M.C.Perry(Williams &Wilkins：Baltimore，MD，1992)所述。所述化疗剂可以在所达抗体施用之前、 之后、或者同时施用。所述抗体可以与已知剂量的抗-雌激素的化合物例如他莫昔芬或EVISTA^TM或抗-黄体酮例如奥那司酮(参见，EP 616812)联用。 

如果所述抗体用于治疗癌症，那么还可以施用抗其他肿瘤-相关性抗原的抗体，例如能够与ErbB2，EGFR，ErbB3，ErbB4或VEGF受体中的一种或多种结合的抗体。这些还包括上述的药剂。另外，所述抗体还适合与放射性治疗顺序或联合施用，其中包括照射或施用放射性物质。可选地，或另外，可以向患者共同施用两种或多种抗体，所述抗体能结合相同的或者两种或多种不同的本文所述抗原。有时，另外还可以向患者施用一种或多种细胞因子可能是有利的。一个优选实施方案中，本文所述抗体可与生长抑制剂共同施用。例如，首先施用所述生长抑制剂，然后施用本发明所述抗体。但是，同时或首先施用本发明所述抗体都是可以考虑的。所述生长抑制剂的合适剂量是目前的用量，可以根据所述生长抑制剂与本文所述抗体的联合作用(协同作用)来降低该剂量。 

一个实施方案中，肿瘤的血管生成在联合治疗中受到攻击。将抗-EGFL7抗体与另一抗体(例如，抗-VEGF)以治疗有效剂量施用给患肿瘤的患者，所述剂量可例如通过观察肿瘤坏死或其转移病灶(如果有的话)来测定。另外，还可施用其他的抗肿瘤剂，例如α-、β-或γ-干扰素，抗-HER2抗体，heregulin，抗-heregulin抗体，D-因子，白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-2(IL-2)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，或促进肿瘤内微血管凝结的药剂，如抗-蛋白质C抗体，抗-蛋白质S抗体，或C4b结合蛋白(参见，WO91/01753，公开于1991年2月21日)，或者加热或辐射。 

其他实施方案中，将FGF或PDGF拮抗剂，例如抗-FGF或抗-PDGF中和抗体，与所述抗-EGFL7抗体联合施用至患者。用抗-EGFL7抗体的治疗优选可以在伤口愈合或目标新血管生成期间被中止。 

就心血管、内皮和血管生成病症的预防或治疗而言，本文所述抗体的合适剂量取决于：如上所述的待治疗病症的类型，疾病的严重程度和病程，施用所述抗体是为预防还是治疗目的，此前的治疗，患者的临床病史及对所述抗体的应答，以及主治医师的判断。所述抗体适合施用给接受一次或一系列治疗的患者。 

例如，根据所述病症的类型和严重程度，例如，无论通过一次或多次单独施用还是通过连续输注，施用至患者的抗体的初始候选剂量都为约 1μg/kg-50mg/kg(例如，0.1-20mg/kg)。根据上述因素，常规的每日或每周剂量为约1μg/kg-100mg/kg或更多。对于在几天或更长时间内重复施用而言，可根据病情重复或持续所述治疗，直至理想地抑制疾病症状。但是，可以使用其他剂量方案。可以用常规技术和试验，包括例如放射照相的肿瘤显影，容易地监测此治疗的进展。 

含有抗体的制品

本发明还提供了一种制品，其包括装有抗体的容器和标签。所述制品如上所述，其中的活性药剂是抗-EGFL7抗体。 

使用抗体诊断和预后肿瘤

如果使用所述抗体的适应症为癌症，那么尽管某些肿瘤中过表达的细胞表面蛋白例如生长受体是候选药物或肿瘤(例如，癌症)治疗的极好靶标，在肿瘤的诊断和预后中还会发现所述蛋白与EGFL7多肽一起的其他用途。例如，针对EGFL7多肽的抗体可以用于肿瘤诊断或预后。 

例如，抗体包括抗体片段可用于定性或定量检测基因的表达，所述基因包括编码EGFL7多肽的基因。所述抗体优选用可检测标记物，例如荧光标记物来标记，结合情况可用光学显微镜、流式细胞计量术、荧光测定法或其他本领域已知技术监测。这些结合试验基本如上述来进行。 

对结合标记基因产物的抗体的原位检测，可以通过免疫荧光或免疫电子显微术来进行。为此，从患者取得组织学样本，然后将标记抗体用于所述样本，优选通过将抗体涂覆在生物样本上。该方法也可用于测定标记基因产物在被检测组织中的分布。对本领域技术人员显而易见的是，原位检测可以使用多种组织学方法。 

下列实施例的提供仅仅用于说明目的，决不对本发明的范围构成限制。 

本说明书中引用的所有专利和参考文献的内容在此全文引入作为参考。 

实施例 

除非另有说明，实施例中提及的商品化试剂按照厂商说明书使用。在下文实施例和说明书全文中用ATCC登记号表示的细胞来源为美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，VA 20108。 

本文中引用的所有文献在此引入作为参考。 

实施例1 EGFL7的克隆 

在试图发现新的人类分泌型及跨膜蛋白，特别是参与血管发育调控的的蛋白质的努力中，鉴定和克隆了EGFL7。克隆和表达人EGFL7的细节参见，例如，专利申请US2003022498A1(其中EGFL7被称为PROl449)。简而言之，进行整装原位杂交筛选试验，鉴定出富集于小鼠胚胎脉管系统内的分泌型因子和受体。通过信号序列推测和胞外结构域同源性搜索，鉴定和收集了数百种代表推定的分泌型因子和受体的人及小鼠cDNA。使用小鼠cDNA作为模板，制备核糖核酸探针(riboprobe)，在E7.5至E14.5的完整小鼠胚胎上进行原位杂交。选择这个发育阶段的窗口是因为，其包含了脉管发生及血管生成中的多个关键阶段。在从该筛选试验中鉴定的多个基因中，EGFL7唯一地表达于活跃生长的血管的内皮中。表达的详细内容参见下文。 

以单一genbank登录号BC044267得到的大致绘图(rough draft)鉴定爪蟾EGFL7。以3个已知物种(人、小鼠及爪蟾)之间的同源性为基础，通过低严紧度PCR，随后对由24hpf胚胎制备的cDNA文库进行筛选，克隆得到了斑马鱼EGFL7。斑马鱼EGFL7 cDNA、部分基因组DNA及氨基酸的序列如图1b所示。EGFL8是使用EGFL7序列通过BLAST鉴定得到的。 

使用T5l板的辐射杂交作图试验将斑马鱼EGFL7置于临近EST标记物fk20d12.y1(登录号AW566846)的连锁群21(LG21)中。斑马鱼LG21的区域显示与人染色体9q33至9q34(人EGFL7驻留的基因座)是接合的。在这个人的基因座内发现了下列基因：Notchl(9q34)，羧基酯脂肪酶(carboxyl esterlipase)(CELL；9q34)，和蛋白酶亚基β7(psmb7；9q33)。这些基因存在于定位斑马鱼EGFL7的区域LG21(LG21，19.6-29.0CM)。 

所述EGFL7基因编码一种推定的相对分子量为～30kD的分泌型蛋白质。EGFL在进化学上是保守的。参见图1a。人的氨基酸序列与小鼠、爪蟾(非洲蟾蜍)及斑马鱼(斑马)的氨基酸序列的同源性分别为77.45％、47.12％和42.96％。 

所述EGFL7蛋白质包含：信号序列，N-末端的EMI结构域(EMI结构域存在于许多参与调控细胞粘附的胞外基质相关性蛋白)，后接两个EGF-样结构域和一个富含亮氨酸和缬氨酸的C-末端区域。所述哺乳动物EGFL7属于一个小基因家族。BLAST搜索鉴定出了一个密切相关的基因EGFL8，它具有与EGFL7相同的结构域组成。值得注意的是，该基因家族在哺乳动物更复杂， 因为在几种鱼(斑马青

鱼和河豚)基因组都没有鉴定到EGFL8的直向同源基因。 

所述编码人EGFL7的cDNA按照布达佩斯条约条款保藏于美国典型微生物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA(ATCC)ATCC保藏号为203243(保藏于1998年9月9日)。 

该保藏是按照国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约及其章程(布达佩斯条约)进行的。这确保自保藏日起30年内维持该保藏物的活培养物。该保藏可以根据布达佩斯条约以及本申请的受让人与ATCC之间的协议从ATCC获得，所述协议确保公众在相关美国专利被授权、或者任何美国专利申请或外国专利申请被公开(以先为准)后，可以永久且无限制地获得该保藏物的后代培养物，并确保由美国专利商标委员会根据35 USC§122及委员会的细则(包括37 CFR§1.14，特别参见886 OG 638)确定的人可以获得所述后代培养物。 

本申请的受让人同意，当保藏材料的培养物在适宜条件下培养时死亡或丢失或遭到破坏，将在接到通知后迅速用另一相同材料替换。获得该保藏材料并不表明，可以违背任何政府根据其专利法所授予的权利而实施本发明。 

实施例2 EGFL7的表达 

为了阐明EGFL7的表达模式，在小鼠和斑马鱼的胚胎以及小鼠和人的组织切片上进行了整装原位杂交、免疫荧光染色和放射性原位杂交。 

斑马鱼和小鼠品系

从同步(timed)-怀孕的CD-1小鼠获取小鼠胚胎。将Tüebingen long fin(TL)野生型斑马鱼品系，～30hpf cloche(clo^m39)纯合突变体胚胎和其野生型同窝(siblings)用于本中请下文所述的表达和活性试验。成熟的斑马鱼和胚胎按照此前描述的方法(Westerfield 1993 Zebrabook Book)维持存活。 

放射性原位杂交

用此前描述的方法加工组织来作原位杂交。Phillips et al.(1990)Science250：290-4。按照文献描述制备³³P-UTP-标记的RNA探针。Melton et al.(1984)Nucleic Acids Research 12：7035-56。从分别对应于第382到1062位、第-137到150和第173到774位核苷酸的两段人cDNA和一段鼠cDNA合成得到EGFL7正义和反义探针。(起始密码子中的核苷酸A作为第1位核苷酸)。 

整装原位杂交

整装原位杂交采用已有方法，稍作调整。Shimamura et al.Development120：2225-2234(1994)。染色的胚胎使用苯甲醇/苯甲酸苄酯2∶1混合物清洗用于摄影。使用下列模板制备正义和反义的核糖核酸探针：鼠EGFL7部分cDNA克隆(IMAGE克隆519249，Genbank登录号：AA107358)；对应于第169到807位核苷酸的斑马鱼EGFL7部分cDNA克隆；所有其他分子标记物都来自Fishman(MGH)，Stainier(UCSF)和Weinstein(NIH)实验室。整装原位杂交分析后，胚胎在含4％多聚甲醛(PFA)的1XPBS中再固定，用乙醇系列脱水，然后包埋于JB-4Plus塑料(Polysciences)。用0.2％核坚牢红复染5μm切片，并用Cytomount 60封片。 

AP染色

如上文所述检测48hpf整装斑马鱼胚胎的内源性碱性磷酸酶活性。Childs et al.Development 129：973-982(2002). 

去褶合显微术(Deconvolution microscopy)

用4％ PFA在4C固定胚胎过夜，用20％蔗糖/PBS冷冻保护，在7.5％明胶/15％蔗糖中速冻，然后切片。风干切片，用1X PBS/0.1％Triton X-100/1％DMSO透化处理，用加1％BSA的上述溶液封闭20分钟，用66 nMALEXA Fluor594-鬼笔毒环肽(Molecular Probes)染色20分钟，洗涤，用Vectashield DAPI(Vector labs.)封片，使用装有60X油物镜的Deltavision去褶合显微镜进行分析。 

免疫荧光染色

用大肠杆菌表达的重组鼠EGFL7蛋白质免疫亚美尼亚仓鼠。通过杂交瘤融合和亚克隆制备单克隆抗体。用识别不同表位的两种单克隆抗体1C8和5H7作免疫荧光染色。将小鼠组织速冻并低温切片。如文献描述染色固定后的细胞和5μm未固定的组织切片。Parker et al.Methods in Cell Biology59：313-36(1999)。该试验中使用的抗体是：抗-ZO-1 mab(Zymed Inc.Cat.#33-9100)；抗-GFP(Torrey Pines Biolabs，Cat.# TP401)；抗-粘着斑蛋白mab(Sigma)。 

结果

EGFL7的表达模式在物种间是保守的。小鼠、人和斑马鱼胚胎中，在所有血管中的内皮祖细胞和ECs(图2a，2b，2g，2j-2m)以及心内膜中都检测到了 高水平的EGFL7转录物。强的血管表达持续在胚胎和新生儿发育的整个过程中；但是，在许多成熟器官中却检测不到此信息(图2h)。成熟小鼠中，几种高度血管化的器官例如肺、心脏和肾都在较小的血管亚群组中持续表达EGFL7。值得注意的是，EGFL7表达在许多增生组织中上调，包括肿瘤(图2i)、怀孕期间的生殖器官(图2c)和发炎组织。此外，EGFL7强表达还见于原代的人疾病组织包括但不限于，肺腺癌和鳞状细胞癌，肾细胞癌，前列腺癌，卵巢癌，肝的癌，胃癌，软骨肉瘤，骨肉瘤，患病眼和炎症位置的新生血管膜。 

这种独特的表达模式表明EGFL7的高水平与血管生长及重塑有关。在心血管及造血系统外没有检测到EGFL7，这一结果得到了下述事实的验证：EGFL7的表达在无血管的斑马鱼突变体cloche中完全消失(图2n)。Stainier etal.Dev.Suppl.121：3141-3150(1995)。 

免疫荧光染色表明EGFL7蛋白是分泌型的但是仍保留在EC的附近(图2c的嵌入图)，显然与胞外基质有关。对用抗-VEGF抗体处理过的肿瘤模型作进一步研究表明：在由于抗-VEGF治疗而使肿瘤脉管系统破碎后，EGFL7仍保留在退化的肿瘤血管的ECM轨道中。这表明EGFL7在支持肿瘤血管最终逆向生长并从而“逃脱”抗-VEGF治疗中发挥着强有力的重要作用。 

实施例3对EGFL7活性降低的动物的表型分析 

A.EGFL7敲除的斑马鱼中的血管缺损 

最新研究发现，含重组EGFL7蛋白质的条件培养基能抑制平滑肌细胞(SMC)的体外迁移。Soncin et al.EMBO J.22：5700-5711(2003)。但是，其体内功能还不清楚。由于可以获得研究脉管生成及血管生成的工具，并且易于操控胚胎内的基因表达，所以使用模型生物斑马鱼来揭示EGFL7的体内生物学功能。Fishman et al.Circulation Research 74：757-63(1994)；Weinstein et al.Cardiovascular Research 31：E17-24(1996)；Dooley et al.Current Opinion inGenetics & Development 10：252-6(2000)；Nasevicius & Ekker Nature Genetics26：216-20(2000)。另外，还发现Egfl8表达在小鼠胚胎的血管及外周神经的亚群中，这使得其成为EGFL7的潜在的冗余因子。另一方面，在斑马鱼和几种其他鱼的基因组中未发现Egfl8的直向同源基因。因此，斑马鱼提供了一种定义此基因家族生物学功能的独特工具。 

基因敲除试验使用两种靶向斑马鱼EGFL7的不同吗啉代反义寡聚物来进行，这可确保体内的稳定性和特异性，其中所述寡聚物通过特异性抑制靶向基因的翻译或剪接来起作用。寡聚物AS_Z(-47)与5’UTR杂交并阻断翻译；寡聚物AS₁₉₅与外显子-内含子接头(junction)杂交，导致内含子滞留因而使翻译终止提前。两种反义寡聚物的位置示于图1B。随机化的对照为 

CON(-47)：ACGACGGTCACGATGAA TGGAGAGT(SEQ ID NO：10)；和 

CON(195)：CATTGTTCATCGTCTTGTTGCGTGT(SEQ ID NO：11)。 

添加荧光素标签，以辅助鉴定正确注射后的胚胎，并证实发育胚胎中寡核苷酸的均匀分布。将5mM寡聚物水溶液原液(～40mg/ml)稀释于含0.25％酚红的1×Danieu’s溶液(58mM NaCl，0.7mM KCl，0.4mM MgSO4，5mMHEPES，pH 7.6)中。使用Drummond Nanoject微量注射器，向每个1个细胞至8个细胞阶段的胚胎一次推注约4.6nl。滴定试验发现：给每个胚胎注射4ng反义寡聚物导致特异性的血管缺损，而其他结构中无可见缺损，同时注射了随机对照寡聚物的胚胎的死亡率无显著增加。 

两种寡聚物具有相同的表型结果。在出现循环系统[受精后(hpf)～24小时]后进行检测发现，40％以上的EGFL7敲除胚胎(KDs)出现明显的血管缺损病征：它们要么根本没有循环系统，要么循环回路发育不完全；许多具有心包水肿和出血(图3a)。相反，仅3％注射了对照寡聚物的鱼中出现轻微的血管缺损。 

另外，还对如下几种血管内皮标记物的表达模式进行了分析，所述标记物包括fli1¹⁴，flk1¹⁵，和tie1，ephrinB2和gridlock(动脉EC标记物)，flt4和EphB4(静脉EC标记物)，和内源性碱性磷酸酶活性。Brown et al.Mech.Dev.90：237-252(2000)；Fouquet et al.Dev.Biol.183：37-48(1997)；Liao et al.Development 124：381-389(1997)；Lyons et al.Dev.Dyn.212：133-140(1998)；Lawson & Weinstein Nature Rev.Genet.3：674-682(2002)；Zhong et al.Science287：1820-1824(2000)；Childs et al.Development 129：973-982(2002)。另外还在一种fik1-启动子-GFP转基因品系中进行了敲除试验¹⁶。从7-体节阶段到30hpf，上述标记物在KDs中的整体空间分布及强度未受影响，另外，KDs中所有初生的(primary)动脉和静脉都在正确位置形成(图3，4)，这表明早期的EC分化、增殖和迁移没有明显缺损。30hpf(受精后小时数)。但是，KDs中整个系统的血管生成都被破坏。在30hpf时，KDs中的许多初生血管的管腔结构遭 到破坏(disorganized)或者根本没有管腔(图3c-d，3h)。在30hpf检测的部分形成的Se似乎是不稳定的，因为检测在48hpf时的极化内皮的内源性AP染色显示，在所有注射了Z(-47)的鱼中都无Se，而注射了对照寡聚物的鱼中的Se不受影响(图4d和4e)。在鱼的AP染色的横切片中，在注射了Z(-47)的鱼中不可见类似Se的结构(图4f)，这提示在30hpf可见的部分Se可能已经随发育进展而退化。在多项试验中，分子标记物所显示的血管生成缺损的发生率为75-85％(图3d)。例如，30hpf时flil染色显示：76％(28/37)的Z(-47)KDs有严重畸形的血管生成缺陷的脉管系统，而所有对照胚胎(n＝37)都发育了正常的血管。为了验证上述敲除的特异性，使用不含5’非翻译区的EGFI7编码RNA对AS-47引发的血管表型进行拯救。 

EGFL7 KDs的管腔形成的缺陷得到了下述发现的证实：这些胚胎中的主要血管都无法染色。尽管血管生成缺损可能是由于缺乏血流导致的血管塌陷(collapse)的结果，但是下述结果否定了这点可能性：首先，EGFL7 KDs中心脏收缩功能是正常的；其次，在缺乏循环系统的心脏不活动(silent heart)的突变体中，初生血管管腔的形成及短期维持都是正常的。Sehnert et al.NatureGenet.31：106-110(2002)；Isogai et al.Development 130：5281-5290(2003)。 

另外，所述EGFL7KD动物还表现进行性血管生成缺陷。节间血管(ISVs)的最初出芽通常发生在22-24hpf的突变体中(图3b)。但是，由于ISVs在30hpf时部分消失，并且到48-72hpf时完全消失，这些次生血管会逐渐消失(图2c-d)。一定程度上很可能是循环系统的缺少导致血管生成缺陷，因为有文献报道在血流缺乏时ISVs发生退化。Isogai et al.Development 130：5281-5290(2003)。由于初生血管中的显性表型，EGFL7在血管生成中的确切作用可用可诱导的敲除等方法进一步判定。 

因为血管发育依赖于邻近组织，因此还需要查清EGFL7 KDs中出现的血管缺损是否是周围组织破坏的间接结果。Brown et al.Mech.Dev.90：237-252(2000)；Sumoy et al.Mech.Dev.63：15-27(1997)；Vokes & Krieg Dev.Suppl.129：775-785 (2002)。在KDs的横切片中发现存在组织的正常互补物(图3)。另外，使用fkd7，ntl，axial/fkd1和gata1作原位杂交表明：KDs中所有中轴结构及造血系统都发育正常。Odenthal & Nusslein-Volhard Dev.Genes Evol.208：245-258(1998)；Schulte-Merker et al.Development 116：102-1032(1992)；Strahle et al.Genes Dev.7：1436-1446(1993)；Parker et al.Methods Cell Biol. 59：313-336(1999)。循环系统出现后，KDs中的gatal⁺细胞仍保留在其初始发育的胚胎后端腹外侧(posterior ventrolateral)区域，这就证实了脉管系统是有缺陷的。最后，SMC的缺陷募集不可能是致病因素，因为在26-体节阶段的野生型胚胎中没有发现血管周的SM22A表达，而在这一时间点KDs中的血管缺损是明显的。综合考虑，这些数据表明血管生成的失败是一种由EGFL7敲除引发的原发性缺陷。 

由于EC数目代表血管形态发生，因此进一步的观察集中在EGFL7 KDs中EC数目是否变化上。Fong et al.Development 126：30l5-3025(1999)。连续的横切片显示：在各个发育阶段的全部轴水平上，敲除EGFL7都没有改变ECs的总数(图4)。另外，基于ephrinB2和flt4的表达，和flkl启动子对flkl:GFP胚胎中动脉和静脉的区别调控，动脉及静脉EC数目也未见变化(图4)。与EGFL7不同，敲除vegf(已知的EC促有丝分裂因子)使得EC数目明显减少，并随之会破坏管腔形成。因此，上述数据表明：EGFL7发挥着与VEGF明显不同的独特作用，是血管生成时主要需要的。 

为了在细胞水平描述血管表型，使用flkl:GFP的鱼进行了时程分析。在22-、24-、26-体节(循环之前)、24hpf(出现循环)和30hpf的阶段，制备连续的躯干横向切片和头部纵向切片。分析这些切片发现了对照胚胎中从索状到管状转变期间的一系列细胞事件。在22-体节阶段，动脉和静脉的成血管细胞聚结成单条索。广泛的紧密接合显示了成血管细胞间的密切连接。在大约24-体节阶段，成血管细胞的逐渐分离通过紧密接合的实质细化(substantialrefinement)显现出来。到了26-体节阶段，成血管细胞充分分离，使得动脉和静脉的成血管细胞占据不同区域，以未成形的(rudimentary)管形排列。随后，ECs经历了明显的形态变化变为鳞状，从而使血管成为最终形状。这种导致主要血管形成的事件顺序在EGFL7 KDs中被严重破坏。在所有检测的阶段，被敲除的成血管细胞都没有能够分离并仍然保持广泛的紧密连接。在后面的阶段它们也没有改变形状(图4h)。 

B.EGFL7敲除小鼠中的肿瘤生长下降和脉管系统缺损 

为了进一步阐明哺乳动物中的EGFL7功能，制备mEGFL7敲除(KO)小鼠，用作宿主动物用于肿瘤植入。所述KO小鼠最初在129/BL6背景下制备，然后与BL6回交。实验使用的动物经过了3-4代回交。 

向每个动物的背侧皮下注射500,000个以上的B16(F10)黑素瘤肿瘤细胞。 每天检查注射部位的肿瘤发病率。定期测量肿瘤来测定生长速率。比较EGFL7^-/-纯合动物与EGFL7^+/-杂合的或野生型同窝的肿瘤生长速率。 

如图6和7所示，与EGFL7完全敲除的动物相比，B16黑素瘤肿瘤生长显著下降。 

使用Lewis肺癌(LLC)中瘤植入物的类似的肿瘤生长试验也显示纯合EGFL7^-/-KO小鼠中肿瘤生长的下降。另外，EGFL7^-/-KO小鼠亚群中的LLC肿瘤没能血管化，这说明了EGFL7在肿瘤血管生成中的作用。 

比较EGFL7^-/-KO小鼠和野生型小鼠中视网膜脉管系统形成的试验显示：EGFL7功能的缺乏导致视网膜脉管迁移推迟，但仍形成了相当正常的视网膜。此外，在野生型小鼠中，EGFL7表达被定位至视网膜发育的迁移前沿。 

实施例4  EGFL7支持EC粘附和迁移 

实施例3所示的EC分离失败表明：EGFL7 KDs中EC的迁移或粘附受到不适当的调控。进行体外的内皮细胞迁移和粘附试验区分这两种可能性。 

用5μg/cm²蛋白质[BSA(Sigma)，胶原蛋白(Upstate)，纤连蛋白(Sigma)，Genentech公司用大肠杆菌制备的重组人EGFL7]包被平板。PBS漂洗后，将HUVEC(Cambrex)以5×10⁵/cm²的密度涂于EGM2培养基(Cambrex)上，于140×g离心5min使细胞同步吸附，然后温育。为了分析特异性，在涂HUVEC之前用指定浓度的抗体预温育平板。 

使用重组的人和小鼠EGFL7多肽作为免疫原制备单克隆抗-人EGFL7抗体。通过ELISA评价抗体-抗原的结合。这些抗体的阻断活性用试验例如HUVEC粘附试验来测定。初步试验从杂交瘤10G9、18F7、3A5和1B12鉴定到了具有最强抑制活性的抗-EGFL7 Mabs。 

为了测定粘附强度，温育60min后以46、183或411×g离心倒置的平板。粘附细胞数目使用基于荧光的试验(CyQUANT，Molecular probes)来定量，用荧光读板仪(Spectramax，Molecular Devices)读取读数。 

结果显示包被在培养平板上的EGFL7增强了HUVEC的粘附(图5)。有趣的是，EGFL7促进粘附的强度显著弱于其他常用的细胞粘附分子例如纤连蛋白和胶原蛋白(图5e)。此外，HUVEC粘附至EGFL7的动力学要比其他基底慢很多(图5g)。从EGFL7表达模式、亚细胞定位、体内功能和细胞粘附特性可以看出：在活性血管生长期间，EGFL7可以提供一种偏好迁移超过稳定连接 的基底，从而允许形成血管所需的成血管细胞作局部运动。另外，在有或无阻断性抗-EGFL7 Mabs存在时使用EGFL7包被的基质的迁移试验表明，EGFL7基质支持HUVEC迁移。 

在所选抗-EGFL7 Mabs存在时的体外血管形成试验表明：一些阻断抗体，包括来自杂交瘤18F7，3A5，10G9和1B12的阻断抗体，显著改变了体外血管的形成，这进一步证实了EGFL7在血管形成过程中的重要作用。 

相信上述说明书足以使本领域技术人员能够实施本发明。但是，除本申请中给出及描述的之外，对本发明的各种改进对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且落在所附权利要求的保护范围之内。 

Claims (4)

1.阻断性抗EGFL7抗体在制备用于在有需要的受试者中减少或抑制内皮细胞迁移的药物中的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述内皮细胞是人内皮细胞。

3.权利要求1的用途，其中所述内皮细胞是血管内皮细胞。

4.权利要求1的用途，其中所述抗EGFL7抗体抑制血管形成。

Images