CN105543183B

CN105543183B - 人肝癌细胞Egfl8基因过表达慢病毒在制备治疗肝癌药物中的应用

Info

Publication number: CN105543183B
Application number: CN201610016278.7A
Authority: CN
Inventors: 吴帆; 王百林; 陈为佳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-01-08
Filing date: 2016-01-08
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2036-01-08
Also published as: CN105543183A

Abstract

本发明公开了一种Egfl8基因过表达慢病毒，包括含目的基因的GV208‑Egfl8慢病毒载体、以及慢病毒包装辅助载体pHelper 1.0质粒和pHelper 2.0质粒；所述GV208‑Egfl8慢病毒载体包括GV208慢病毒表达载体、以Egfl8 cDNA克隆为模板的Egfl8 cDNA PCR产物。此外，还公开了上述Egfl8基因过表达慢病毒的构建方法。本发明首次构建了Egfl8过表达慢病毒，能够高效便捷地感染肝癌细胞并明显上调后者中Egfl8基因的表达，能够有效降低肝癌细胞的侵袭运动能力，从而为肝癌的治疗提供了非常有效的抑制基因，对于肝癌的Egfl8基因治疗药物的制备具有重大意义。

Description

人肝癌细胞Egfl8基因过表达慢病毒在制备治疗肝癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种Egfl8基因过表达慢病毒在制备治疗肝癌药物中的应用。

背景技术

Egfl8（epidermal growth factor-like domain 8，表皮生长因子样结构域8）是由Fitch等于2004年首先在小鼠中发现，其位于小鼠的17号染色体上，编码一个由293个氨基酸组成的蛋白。人Egfl8基因则位于第6号染色体上(6p21.32)，与MHC区域相邻，编码一个分子量为32KD的分泌型蛋白。Egfl8蛋白包含有一个EGF样结构域、一个钙离子结合型EGF样结构域和N末端的信号肽。

近年来，已研究证实Egfl8在结直肠癌组织中的表达明显下调，且其低表达与结直肠癌的远处转移、TNM分期及不良预后密切相关。此外，Egfl8在胃癌组织中亦呈低表达，且其表达水平的下调与胃癌的腹膜播散及TNM分期密切相关。这些结果提示Egfl8在人类恶性肿瘤的侵袭转移中发挥了重要作用。而国际上最新的研究显示，下调小鼠胸腺上皮细胞中Egfl8的表达可使细胞粘附分子ICAM-1的表达明显上调，上调Egfl8的表达则可使ICAM-1的表达明显下调，即Egfl8对胸腺上皮细胞中ICAM-1的表达具有反向调控的作用。此外，体内注射重组的Egfl8蛋白可抑制小鼠胸腺组织中Notch信号传导通路的表达。

综上所述，目前国内外对于Egfl8的研究，大多是集中于Egfl8在肿瘤组织中的表达情况及其与肿瘤恶性程度及临床表现的相关性等方面，而对于Egfl8在人类恶性肿瘤尤其是肝癌组织中的作用及机制等方面研究较少。Egfl8在细胞系中的研究也仅见于胸腺上皮细胞，并且目前又缺少高效稳定上调肿瘤细胞中Egfl8表达的手段和方式。因此，构建Egfl8过表达慢病毒载体及相应慢病毒，观察其感染肿瘤细胞后所产生的作用，对于研究Egfl8在肿瘤发生、发展中的作用及机制都十分重要。目前，尚未见到关于构建Egfl8过表达慢病毒的研究和报道，也尚无任何研究报道Egfl8在肝癌侵袭转移中的作用及机制。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种人肝癌细胞Egfl8基因过表达慢病毒及其构建方法和应用，以高效便捷地实现Egfl8基因在肝癌细胞中的稳定过表达，通过感染HCCLM3肝癌细胞系，从而抑制该肝癌细胞系的迁移运动能力。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供的一种人肝癌细胞Egfl8基因过表达慢病毒，包括含目的基因的GV208-Egfl8慢病毒载体、以及慢病毒包装辅助载体pHelper 1.0质粒和pHelper 2.0质粒；所述GV208-Egfl8慢病毒载体包括GV208慢病毒表达载体、以Egfl8 cDNA 克隆为模板的Egfl8 cDNA PCR产物；其中PCR扩增引物为：

Egfl8上游引物：

GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGGTCCAGGGCTGAGCTGTGCACTC（序列1）

Egfl8下游引物：

TCACCATGGTGGCGACCGGTCGATGATTGACGCCGAGGC（序列2）。

本发明提供的上述人肝癌细胞Egfl8基因过表达慢病毒的构建方法，包括以下步骤：

(1) Egfl8过表达慢病毒载体的构建

(1-1) 以Egfl8 cDNA 克隆为模板，采用上述PCR扩增引物，通过PCR 反应，扩增获得Egfl8 cDNA PCR产物；

(1-2) GV208慢病毒表达载体进行Age I 酶切，得到线性化的GV208慢病毒表达载体；

(1-3) 将Egfl8 cDNA PCR产物交换入线性化的GV208慢病毒表达载体，将得到的连接液转化新鲜的感受态大肠杆菌细胞；并进行PCR鉴定；

(1-4) PCR鉴定采用的引物为：

上游：CGGTGAATGCTGGTGGCATC（序列3）；

下游：TCACCATGGTGGCGACCGGGCTCACACTCAACTGGGC（序列4）；

对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的含目的基因的GV208-Egfl8慢病毒载体；

(2) Egfl8过表达慢病毒的构建

将所述GV208-Egfl8慢病毒载体、以及慢病毒包装辅助载体pHelper 1.0质粒和pHelper 2.0质粒，同时共转染人胚肾细胞293T细胞，在该细胞中进行病毒的包装并分泌到细胞外的培养基中，收集培养基离心后取得的上清液，经离心浓缩即为包含GV208-Egfl8质粒的Egfl8过表达慢病毒。

本发明还提供了上述人肝癌细胞Egfl8过表达慢病毒在制备治疗肝癌药物中的应用，以及包括上述人肝癌细胞Egfl8过表达慢病毒的药物组合物。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次构建了Egfl8过表达慢病毒，能够高效便捷地感染肝癌细胞并明显上调后者中Egfl8基因的表达，能够有效降低肝癌细胞的侵袭运动能力，从而为肝癌的治疗提供了Egfl8基因这样一个非常有效的抑制基因，为开发相应的基因治疗措施提供了一种行之有效的方法，对于肝癌的Egfl8基因治疗药物的制备具有重大意义。

附图说明

下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细描述：

图1是GV208质粒DNA图谱；

图2是pHelper 1.0质粒DNA图谱；

图3是pHelper 2.0质粒DNA图谱；

图4是Egfl8过表达慢病毒及阴性对照慢病毒感染HCCLM3肝癌细胞后的结果示意图（NC：阴性对照组；OE：Egfl8过表达组）；

图5是Egfl8过表达慢病毒及阴性对照慢病毒感染HCCLM3肝癌细胞后Egfl8蛋白表达水平示意图（A：Western blot检测Egfl8表达的结果；B：Western blot结果统计直方图；NC：阴性对照组；OE：Egfl8过表达组；CON：空白组）；

图6是Egfl8过表达慢病毒及阴性对照慢病毒感染HCCLM3肝癌细胞后侵袭实验的结果示意图（A：Transwell小室聚碳脂膜拍照照片；B：侵袭实验结果统计直方图；NC：阴性对照组；OE：Egfl8过表达组；CON：空白组）；

图7是Egfl8过表达慢病毒及阴性对照慢病毒感染HCCLM3肝癌细胞后划痕实验的结果统计直方图（NC：阴性对照组；OE：Egfl8过表达组；CON：空白组）。

具体实施方式

图1～图7所示为本发明Egfl8基因过表达慢病毒及其构建方法和应用的实施例，通过设计和构建人Egfl8基因过表达慢病毒，以高效感染肝癌细胞并明显上调后者中Egfl8基因的表达，从而有效降低肝癌细胞的侵袭运动能力。

1、构建Egfl8过表达慢病毒载体

以Egfl8 cDNA 克隆（BC052591）为模板，设计PCR扩增引物如表1所述（同序列表中序列1和序列2），通过PCR 反应（反应体系及条件分别见表2和表3），扩增获得大小925bp 的PCR 产物。GV208慢病毒表达载体DNA图谱见图1，对其进行Age I 酶切，酶切体系见表4，酶切条件为37℃孵育2h。将Egfl8 cDNA PCR产物交换入线性化慢病毒表达载体，连接反应体系见表5，反应条件为25℃孵育30分钟，再42℃孵育15min。将连接液转化新鲜的感受态大肠杆菌细胞（转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页）。

表1. Egfl8 cDNA PCR扩增引物

引物说明：含交换配对碱基、酶切位点（下划线标记的）、表达增强序列（双下划

线标记的）以及目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因

表2. Egfl8 cDNA PCR扩增反应体系

表3. PCR扩增反应体系

表4. GV208慢病毒载体酶切反应体系

表5. PCR产物交换入线性化表达载体的连接反应体系

说明：a) 加入的线性化载体DNA和纯化的PCR产物的摩尔数比例为1:3～1:9之间

b) 阳性对照加入的纯化PCR产物为GAPDH基因（同样带有交换臂）

针对GV208慢病毒表达载体中目的基因序列的上下游设计PCR鉴定引物（见表6，同序列表中序列3和序列4），进行PCR鉴定实验（PCR反应体系见表7，PCR反应条件见表8），对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的含有Egfl8基因序列的慢病毒表达载体，命名为GV208-Egfl8慢病毒载体。

表6. PCR鉴定引物序列

表7. PCR鉴定实验反应体系

表8. PCR鉴定反应条件

2、Egfl8过表达慢病毒及阴性对照慢病毒的构建

以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取GV208-Egfl8慢病毒载体质粒及慢病毒包装辅助载体pHelper 1.0质粒（DNA图谱见图2）和pHelper 2.0质粒（DNA图谱见图3），质粒 DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所有质粒 DNA 的A260/A280在1.8～2.0之间。转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为1.2×10⁷细胞/20 mL，重新接种于15 cm 细胞培养皿，37℃、5%CO₂培养箱内培养，24h后待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。向一灭菌离心管中加入所制备的GV208-Egfl8慢病毒载体质粒及各包装载体质粒溶液（GV208-Egfl8质粒20μg，pHelper 1.0载体15μg，pHelper2.0载体10μg），与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5mL，在室温下温育5min。将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀后，取100 μL在另一管中与2.4mL Opti-MEM混合，室温下温育5 min；将稀释后的质粒DNA与稀释后的Lipofectamine 2000混合，室温下温育20 min，形成DNA Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物，将该混合物转移至293T细胞的培养基中，混匀，于37℃、5%CO₂细胞培养箱中继续培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 mL PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。每瓶细胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培养基25mL，于37℃、5%CO₂ 培养箱内继续培养48 h，然后收集293T细胞上清液。于4℃、4000 g 离心10 min，除去细胞碎片。以0.45μm滤器过滤上清液于40mL超速离心管中，在4000g离心至所需的病毒浓缩体积。离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，不超过1000g离心2min，把过滤杯。从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液，包含GV208-Egfl8质粒的慢病毒即为Egfl8过表达慢病毒。同法以GV208空载体质粒代替GV208-Egfl8质粒构建的慢病毒即为阴性对照病毒。

3、慢病毒感染HCCLM3肝癌细胞系

胰酶消化对数生长期的肝癌细胞系HCCLM3，制成细胞悬液（细胞密度约为5×10⁴/mL）后接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到30%左右。根据感染复数（MOI）值，加入适量的慢病毒（Egfl8过表达慢病毒的MOI为10，阴性对照慢病毒的MOI为2.5），培养12 h后更换培养基，如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h后更换培养基。感染3天后观察慢病毒上报告基因GFP（绿色荧光蛋白）的表达情况，发现荧光率大于80%，显示感染满意，将感染Egfl8过表达慢病毒及阴性对照慢病毒的HCCLM3细胞分别称为OE（Over-expression，过表达）组及NC（Negative Control，阴性对照）组。OE组及NC组感染后的情况见图4。

4、Western blot检测Egfl8蛋白过表达

取生长状态良好的OE组、NC组和CON（control，未处理的HCCLM3细胞，空白组）组细胞，弃去细胞培养液，PBS 洗涤2 次；弃去PBS，加入适量预冷的1×细胞裂解液（也即蛋白电泳的上样缓冲液，配方见表9）。用移液枪头吹打至细胞充分裂解，将细胞裂解样品转移入离心管中，冰上再裂解细胞10～15min；4℃、12000g，离心5 min，放入沸水中水浴10 min；4℃、12000g，离心1 min，-80℃保存备用。配制SDS-PAGE凝胶，等胶凝固好后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品进行上样；恒压80V，电泳2 h；电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃、300 mA恒流条件下电转150 min，将蛋白转移到PVDF 膜上。用封闭液（含5%脱脂牛奶的TBST溶液）室温封闭PVDF膜1 h；封闭液稀释抗体，然后与封闭好的PVDF膜室温孵育4℃过夜；然后TBST洗膜3次，每次10 min；用封闭液稀释相应的二抗，室温下孵育PVDF膜2h；再用TBST 洗膜3次，每次10 min。采用Amersham 公司ECL+plus^TM Western blottingsystem 试剂盒进行显色，该步骤在暗房中进行以获得显示条带的X光片，显色后取出X 光片，晾干，分析。OE组、NC组和CON组HCCLM3细胞中Egfl8蛋白表达水平如图5所示，可见OE组中Egfl8蛋白相对表达水平（0.85）较之NC组（0.20）和CON组（0.17）明显上升，证明OE组中Egfl8蛋白已过表达。

表9.1×Lysis Buffer配方

成分	浓度
		1M Tris-HCl（pH 6.8）	50 mM
巯基乙醇	1%
		甘油	10%
SDS	2%
		溴酚兰	0.01%

5、Egfl8过表达对肝癌细胞侵袭能力的影响

将 Matrigel胶（Becton-Dickinson公司，美国）预先用4℃的无血清细胞培养液稀释至200μg/mL，取200μl稀释的 DMEM 置于孔径为8μm的Transwell小室（Costar公司，美国）聚碳脂膜上，使膜上所有的微孔被Matrigel胶覆盖，37°C过夜干燥。备好的Transwell小室用紫外线照射2 h，使用前加入少量的灭菌无血清培养液使其水化，并取一小室用考马斯亮兰染色检查确定无漏孔。将各组HCCLM3细胞按1×10⁵细胞数加入每个小室，用无血清培养基培养，放置于配套的24孔板上。同时接种各组细胞约5000个到96孔板，测定接种细胞数的MTT值（OD490，每组细胞重复3次）。24孔板中加入600µL含30% FBS培养基。5%CO₂、37℃孵育48 h。倒扣Transwell小室于吸水纸上以去除培养基，用棉拭子轻轻移去非转移细胞。加400µl Giemsa染色液到24孔板的空孔中，将小室浸泡在染色液中20 min，在膜的下表面染色转移细胞。浸泡小室在一个大的水杯中，冲洗数次。空气中晾干。显微镜拍照Transwell小室的聚碳脂膜，10%醋酸溶解，上分光光度计检测OD570吸光度值（反映侵袭出聚碳脂膜的细胞数），每组细胞的实验重复3次。计算各组细胞的侵袭率：侵袭率＝Giesma染色后OD570 吸光度值/接种时MTT OD490吸光度值。各组细胞聚碳脂膜照片及迁移率见图6，可知OE组细胞的侵袭率明显低于NC及CON组，证明Egfl8过表达使HCCLM3细胞的侵袭能力明显下降。

6、Egfl8过表达对肝癌细胞迁移运动能力的影响

各组HCCLM3细胞按3×10⁴数量加入96孔板，加含10% FBS的培养基培养过夜，使细胞呈现出单层贴壁生长状态且细胞融合度达到100%。更换不含FBS的培养基，并用划痕仪对准96孔板的下端中央部位，向上轻推形成划痕。用不含FBS的培养基漂洗2次，洗去刮下的飘浮细胞。再加入不含FBS的培养基，拍照记录划痕距离。在5%CO₂、37℃培养箱中继续培养72h。分别于划痕后24 h和72 h拍照记录划痕距离，每组实验重复3次，计算并比较各组细胞迁移率，迁移率计算公式为：迁移率＝（0 h划痕宽度－24 h或72 h划痕宽度）/ 0 h划痕宽度×100%。各组0 h、24 h及72 h划痕宽度及迁移率比较分别见表10和图7，可见OE组24 h及72h细胞迁移率均明显低于CON及NC组，证明Egfl8过表达使HCCLM3细胞的迁移运动能力明显下降。

表10.各组HCCLM3细胞各时间点划痕宽度

Claims

1.一种人肝癌细胞Egfl8基因过表达慢病毒在制备治疗肝癌药物中的应用，其特征在于：所述人肝癌细胞Egfl8基因过表达慢病毒，包括含目的基因的GV208-Egfl8慢病毒载体、以及慢病毒包装辅助载体pHelper 1.0质粒和pHelper 2.0质粒；所述GV208-Egfl8慢病毒载体包括GV208慢病毒表达载体、以Egfl8 cDNA 克隆为模板的Egfl8 cDNA PCR产物；其中PCR扩增引物为：

Egfl8上游引物：

GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGGTCCAGGGCTGAGCTGTGCACTC（序列1）

Egfl8下游引物：

TCACCATGGTGGCGACCGGTCGATGATTGACGCCGAGGC（序列2）。