CN109456948A - Mif和tipe2双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用，该所述重组腺病毒基因组中包含一个MIF和TIPE2双基因表达盒，所述MIF和TIPE2双基因表达盒由上游至下游依次包含EF1α启动子、MIF基因、终止子、内部核糖体进入位点IRES、TIPE2基因和终止子；该重组腺病毒的制备方法简单,成本低；将其体外转染巨噬细胞再回输脑出血的血肿周围组织，能够抑制巨噬细胞，有效抑制脑出血的炎症反应和脑水肿，并提高神经功能评分，为脑出血的治理提供理想的策略，在脑出血的治疗领域具有良好的开发应用前景。

Description

MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种重组腺病毒，具体地说是一种MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒，以及该重组腺病毒的制备方法和应用。
背景技术
脑出血为常见的急性脑血管病，是一种常见的神经系统危重症，因其高发病率，高致残率，高死亡率而受到广泛关注。根据最新统计数据显示，每年脑出血死亡患者人数约为全部疾病死亡患者人数的20%。目前脑出血的内科治疗以脱水降颅压，清除自由基，营养神经及对症支持治疗为主，近年尚无突破性的治疗方法。研究表明，脑出血作为一种损伤因子诱发的炎性反应，可引起局部脑血流量的改变，诱导细胞因子的基因表达及其蛋白产物的生成，激活并趋化炎性细胞向损伤区域游走、浸润并释放多种生物活性物质。炎性反应一方面清除和吸收坏死组织和细胞碎片，并通过实质细胞或间质细胞的再生修复损伤；另一方面，炎性反应通过释放的多种酶及炎性介质，加重局部组织的水肿和神经细胞的破坏。
巨噬细胞迁移抑制因子( macrophage migration inhibitory factor，MIF) 是一类多效性的前炎症细胞因子，能够促进其他多种前炎症因子的分泌或表达。其基因在大多数哺乳动物基因组中具有90%的同源性。MIF启动子区含有能够与多种转录因子结合的DNA结合位点，同时含有与其表达水平相关的多态性位点。MIF 发挥其生物学功能，一方面可以通过非受体介导的内吞作用，实现 MIF与c-Jun激活结构域结合蛋白-1(JAB1)的相互作用; 另一方面，受体依赖型的MIF能够激活包括 PI3K/AKT、MAPK和G蛋白偶联受体相关的信号传导途径等。MIF已经被证实参与调解炎症、肿瘤生成和纤维化等生物学过程。
肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(tumor necrosis factor-α-induced protein8-like 2,TIPE2)是肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(tumor necrosis factor-α-inducedprotein 8,TNFAIP8)家族成员之一,最早在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型中发现的,TIPE2主要表达于胸腺、淋巴结、脾脏及小肠粘膜等,在巨噬细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞等免疫细胞中高表达,在免疫反应中发挥重要的负向调节作用。TIPE2参与多条信号通路的调控,如JNK、NF-kB等。研究发现TIPE2在系统性红斑狼疮、慢性乙肝病毒感染及哮喘中表达均有改变。TIPE2在系统性红斑狼疮患者中表达下调,有研究发现TIPE2可以通过诱导M2型巨噬细胞极化减轻系统性红斑狼疮。
基因联合治疗的方式主要有两种：一是将多种分别携带不同基因的重组表达载体同时转染靶细胞，这种方式可以自由调节各重组表达载体的比例，但需要分别构建携带不同基因的重组表达载体，构建工作繁琐、费时，影响因素多；此外，由于转染过程具有一定随机性，转染后的细胞存在基因拷贝不均一的问题，既不利于目的基因的表达及后续治疗，又导致实验结果难于评估分析；上述缺点限制了此种方式的进一步应用。二是将两个或两个以上的基因由一个载体携带表达，这种方式可以通过多启动子载体、多顺反子载体或融合基因等调控手段提高基因转染效率，增加表达强度，并维持相对的表达比例，从而克服了前一种方式的不足，近年来日益受到研究者的重视。
巨噬细胞是体内的免疫调节细胞，可以在体内微环境的作用下，分化为促进或抑制免疫应答反应的免疫细胞。体外构建携带免疫抑制分子基因的重组病毒并转染巨噬细胞，再将其回输体内，已广泛应用于诱导免疫耐受等方面的治疗。
发明内容
有鉴于此，针对背景技术中所存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒，能够诱导抑制性巨噬细胞，有效抑制脑出血后的免疫活化，并提高神经功能；本发明的目的之二在于提供所述MIF和TIPE2重组腺病毒的制备方法；本发明的目的之三在于提供所述MIF和TIPE2重组腺病毒的应用，具体地说是一种MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用。
为达到上述目的，本发明所采用如下技术方案：
本发明所述的MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒，所述重组腺病毒基因组中包含一个MIF和TIPE2双基因表达盒，所述MIF和TIPE2双基因表达盒由上游至下游依次包含EF1α启动子、MIF基因、终止子、内部核糖体进入位点IRES、TIPE2基因和终止子。
本发明还公开了所述MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
a、RT-PCR扩增MIF cDNA全长；
b、RT-PCR扩增TIPE2 cDNA全长；
c、将步骤a所得MIF cDNA全长插入pEGFP载体的IRES上游，步骤b所得TIPE2 cDNA全长插入pEGFP载体的IRES下游，得重组载体pEGFP-MIF-IRES-TIPE2；
d、以步骤c所得重组载体pEGFP-MIF-IRES-TIPE2为模板，PCR扩增MIF-IRES-TIPE2片段并更换该片段两端的酶切位点；
e、将步骤d所得MIF-IRES-TIPE2片段插入腺病毒穿梭载体pShuttle-EF1α的EF1α启动子下游，得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-EF1α-MIF-IRES-TIPE2；
f、将步骤e所得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-EF1α-MIF-IRES-TIPE2与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌o157中进行胞内同源重组，得重组腺病毒载体pAd-MIF/TIPE2；
g、将重组腺病毒载体pAd-MIF/TIPE2在293细胞中包装成重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2。
进一步，本发明所述MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其中步骤a的具体方法为：提取人肝组织总RNA，逆转录得到cDNA，再以该cDNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有HindIII和BamHI酶切位点的MIF cDNA全长，PCR条件为：94℃预变性4分钟；然后94℃变性45秒，58℃退火60秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-MIF。
进一步，本发明所述MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其中步骤b的具体方法为：提取人胰腺组织总RNA，逆转录得到cDNA，再以该cDNA为模板，以SEQ IDNo.4和SEQ ID No.5所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有BamHⅠ和NotI 酶切位点的TIPE2 cDNA全长，PCR条件为：94℃预变性4分钟；然后94℃变性45秒，58℃退火60秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-TIPE2。
进一步，本发明所述MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其中步骤c的具体方法为：自重组载体pT-MIF中用HindIII和BamHI双酶切出MIF cDNA全长，经纯化后与同样用HindIII和BamHI双酶切的pEGFP载体连接，得重组载体pEGFP-MIF；再自重组载体pT-TIPE2中用BamHⅠ和NotI 双酶切出TIPE2 cDNA全长，经纯化后与同样用BamHⅠ和NotI 双酶切的重组载体pEGFP-MIF连接，得重组载体pEGFP-MIF-IRES-TIPE2。
进一步，本发明所述MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其中步骤d的具体方法为：以重组载体pEGFP-MIF-IRES-TIPE2为模板，SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示序列为上下游引物进行PCR，将MIF-IRES-TIPE2片段两端的酶切位点更换为NotI 酶切位点和NotⅠ酶切位点，PCR条件为：94℃预变性4分钟；然后94℃变性45秒，58℃退火60秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-MIF-IRES-TIPE2。
进一步，本发明所述MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其中步骤e的具体方法为：自重组载体pT-MIF-IRES-TIPE2中用NotI和NotⅠ双酶切出MIF-IRES-TIPE2片段，经纯化后与同样用NotI和NotⅠ双酶切的腺病毒穿梭载体pShuttle-EF1Α连接，得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-EF1Α-MIF-IRES-TIPE2。
进一步，本发明所述MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其中步骤f的具体方法为：将重组腺病毒穿梭载体pShuttle-EF1Α-MIF-IRES-TIPE2用PmeⅠ酶切线性化，再与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同时电转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞，进行胞内同源重组，得重组腺病毒载体pAd-MIF/TIPE2。
进一步，本发明所述MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其中步骤g的具体方法为：将人胚胎肾293细胞以40-60%的细胞密度接种至培养瓶中，待细胞生长至30-50%融合时，采用Lipofectamine 2000试剂将重组腺病毒载体pAd-MIF/TIPE2转染293细胞，待细胞出现明显病变时离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液重悬后，反复冻融使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上清液，即得重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2。
本发明还公开了所述MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒在制备巨噬细胞基因载体的应用。
本发明的有益效果在于：将本发明所述的MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒用于体外转染巨噬细胞再回输脑出血的血肿周围组织，能够抑制巨噬细胞，有效抑制脑出血的炎症反应和脑水肿，并提高神经功能评分，为脑出血的治理提供理想的策略。在脑出血的治疗领域具有良好的开发应用前景。同时，本发明所述的重组腺病毒的制备方法简单，成本低。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细说明，其中：
图1显示了MIF全长cDNA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果；
图2显示了TIPE2全长cDNA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果；
图3显示了MIF和TIPE2双基因共表达的免疫印迹结果；
图4显示了巨噬细胞分泌细胞因子能力的检测结果；
图5显示了脑出血小鼠的脑水肿情况；
图6显示了脑出血小鼠的神经功能情况。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2的制备
1、MIF全长cDNA的克隆
按Trizol试剂盒说明书提取人肝组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以F1：5’-aatctgcagccgcacaacttttcgcgagcgg-3’（SEQ ID No.1，下划线部分为HindIII酶切位点）和R1：5’-tacgaattcgaggaagcgcgtgcacaggtcacg-3’（SEQ ID No.2，下划线部分为BamHI酶切位点）为上下游引物，PCR扩增MIF全长cDNA，PCR反应体系为50μl，循环条件参数为：94℃预变性4分钟；然后94℃变性45秒，58℃退火60秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pT-Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为pT-MIF。
琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物在约1000bp处呈单一特异性条带（如图1所示），与预期结果相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列（SEQ ID No.3）与GenBank登录号为NC_000022.11的MIF全长cDNA序列一致。
2、TIPE2全长cDNA的克隆
按Trizol试剂盒说明书提取人胰腺组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以F2：5’-gatcggatcccgtagaggtacccc-3’（SEQ ID No.4，下划线部分为BamH Ⅰ酶切位点）和R2：5’-acgcgtcgactttagaacaaataggttcc-3’（SEQ ID No.5，下划线部分为NotI 酶切位点）为上下游引物，PCR扩增TIPE2全长cDNA，PCR反应体系为50μl，循环条件参数为：94℃预变性4分钟；然后94℃变性45秒，58℃退火60秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pT-Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为pT-TIPE2。
琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物在约1200bp处呈单一特异性条带（如图2所示），与预期结果相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列（SEQ ID No.6）与GenBank登录号为NC_000001.11 的TIPE2全长cDNA序列一致。
3、重组载体pEGFP-MIF/TIPE2的构建
根据MIF和TIPE2全长cDNA两端所设计的酶切位点，首先将MIF全长cDNA插入pEGFP载体的IRES上游，再将TIPE2全长cDNA插入pEGFP载体的IRES下游。具体方法为：先将pT-MIF载体用HindIII和BamHI双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经HindIII和BamHI双酶切的pEGFP载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，HindIII和BamHI双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pEGFP-MIF；再将pT-TIPE2载体用BamHⅠ和NotI 双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经BamHⅠ和NotI 双酶切的pEGFP-MIF载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，BamHⅠ和NotI 双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pEGFP-MIF-IRES-TIPE2。
4、重组载体pShuttle-EF1Α-MIF-IRES-TIPE2的构建
以pEGFP-MIF-IRES-TIPE2载体为模板，以F3：5’-acgcgtcgacggccgcacatcgcgagcacttt-3’（SEQ ID No.7，下划线部分为NotI 酶切位点）和R3：5’-agaatgcggccgctatttagaacaaaggttcc-3’（SEQ ID No.8，下划线部分为NotⅠ酶切位点）为上下游引物，PCR扩增MIF-IRES-TIPE2片段并将该片段两端的酶切位点更换为NotI酶切位点和NotⅠ酶切位点，PCR反应体系和循环条件参数同前。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pT-Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为pT-MIF-IRES-TIPE2。
将pT-MIF-IRES-TIPE2载体用NotI和NotⅠ双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经NotI和NotⅠ双酶切的pShuttle-EF1α载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，NotI和NotⅠ双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pShuttle-EF1α-MIF-IRES-TIPE2。
5、重组腺病毒载体pAd-MIF/TIPE2的构建
将pShuttle-EF1α-MIF-IRES-TIPE2载体用PmeⅠ酶切线性化，再与pAdEasy-1载体同时电转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞，进行菌体内同源重组，用含有卡那霉素的LB平板培养，挑取较小菌落，用含有卡那霉素的LB液体培养基培养过夜，提取质粒，PacⅠ酶切鉴定，将阳性质粒命名为pAd-MIF/TIPE2。
6、重组腺病毒载体pAd-MIF/TIPE2的包装
将人胚胎肾293细胞以40～60%的细胞密度接种至T-25培养瓶中，待细胞生长至30～50%融合时弃去培养液，用Lipofectamine 2000试剂将pAd-MIF/TIPE2载体转染293细胞，通过显微镜观察细胞病理改变，待出现明显细胞病变效应时离心收集细胞，细胞沉淀用PBS重悬后，反复冻融4次使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上清液，即得Ad-MIF/TIPE2病毒原液；将病毒原液按1:10的比例重新感染293细胞，收集含病毒的上清液，重复上述操作3次，得第四代重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2。
二、重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2转染巨噬细胞疫苗的制备
1、巨噬细胞的分选
取C57BL/6正常小鼠,脱颈处死,经75%酒精常规消毒。向小鼠腹腔中注射无血清RPMI1640培养基5 m L,反复揉搓腹部5 min,静置3 min后打开腹腔,抽取腹腔液体离心、检测细胞密度后种于6孔板中培养3 h,去除未贴壁细胞,重新加入培养基及细胞因子:IFN-γ10ng/m L、LPS 100 ng/m L;M2型巨噬细胞:IL-4 10 ng/m L)刺激培养24 h。
2、重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2转染巨噬细胞
将巨噬细胞以细胞浓度为1×106个/ml接种于6孔板，按感染复数（MOI）为100加入第四代重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2，感染后48小时收集细胞，用PBS洗涤并重悬，即得Ad-MIF/TIPE2病毒转染巨噬细胞。
Western Blot检测：分别超声裂解Ad-MIF/TIPE2病毒转染巨噬细胞和空病毒转染巨噬细胞，收集细胞总蛋白进行SDS-PAGE，电泳完毕后电转印PVDF膜，洗膜，封闭，加入兔抗人MIF或TIPE2多克隆抗体，37℃孵育1小时，洗膜，再加入羊抗兔IgG，37℃孵育1小时，洗膜，显色。结果见图3所示，Ad-MIF/TIPE2病毒在巨噬细胞中可以表达MIF和TIPE2。
三、重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2转染巨噬细胞的抗炎效应研究
1、红细胞裂解物处理后巨噬细胞的炎症因子的检测
将巨噬细胞于6孔板内单层培养至覆盖面积约30%，换入无血清DMEM培养基2mL，并加入重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2 100μL，培养4小时，再换入完全DMEM培养基2mL，培养48小时，收集细胞，用PBS洗涤并重悬，获得重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2转染的巨噬细胞。将10μl红细胞裂解液加入巨噬细胞或对照巨噬细胞，37℃，24 h，用ELISA法检测红细胞裂解液刺激巨噬细胞分泌IL-8和 TNF-α的能力。研究结果如图4所示，重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2转染的的巨噬细胞所分泌的IL-8和 TNF-α均少于对照巨噬细胞。
2、脑出血小鼠的脑水肿的检测
将25μl自体全血注射到小鼠基底节，10min后，并于相同部位注射重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2 100μL或对照。3天后，处死小鼠，取得脑组织，并用干湿重法检测小鼠的脑水肿情况。研究结果如图5所示，与对照组相比，重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2能明显减轻脑出血小鼠的脑水肿。
3、脑出血小鼠的神经功能的检测
将25μl自体全血注射到小鼠基底节，10min后，并于相同部位注射重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2 100μL或对照。3天后，用神经功能评分法，观察小鼠的神经功能。研究结果如图6所示，与对照组相比，重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2能明显提高小鼠的神经功能。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，凡依据本发明的技术方案所作的任何细微修改、等同替换和改进，均应包含在本发明技术方案的保护范围之内。
序列表
<110> 遵义医学院附属医院
<120> MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用
<141> 2018-11-23
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>

Claims (10)

1.MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒，其特征在于：所述重组腺病毒基因组中包含一个MIF和TIPE2双基因表达盒，所述MIF和TIPE2双基因表达盒由上游至下游依次包含EF1α启动子、MIF基因、终止子、内部核糖体进入位点IRES、TIPE2基因和终止子。
2.权利要求1所述MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
a、RT-PCR扩增MIF cDNA全长；
b、RT-PCR扩增TIPE2 cDNA全长；
c、将步骤a所得MIF cDNA全长插入pEGFP载体的IRES上游，步骤b所得TIPE2 cDNA全长插入pEGFP载体的IRES下游，得重组载体pEGFP-MIF-IRES-TIPE2；
d、以步骤c所得重组载体pEGFP-MIF-IRES-TIPE2为模板，PCR扩增MIF-IRES-TIPE2片段并更换该片段两端的酶切位点；
e、将步骤d所得MIF-IRES-TIPE2片段插入腺病毒穿梭载体pShuttle-EF1α的EF1α启动子下游，得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-EF1α-MIF-IRES-TIPE2；
f、将步骤e所得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-EF1α-MIF-IRES-TIPE2与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌o157中进行胞内同源重组，得重组腺病毒载体pAd-MIF/TIPE2；
g、将重组腺病毒载体pAd-MIF/TIPE2在293细胞中包装成重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2。
3.根据权利要求2所述MIF和TIPE2重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤a的具体方法为：提取人肝组织总RNA，逆转录得到cDNA，再以该cDNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQID No.2所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有HindIII和BamHI酶切位点的MIFcDNA全长，PCR条件为：94℃预变性4分钟；然后94℃变性45秒，58℃退火60秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-MIF。
4.根据权利要求3所述MIF和TIPE2重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤b的具体方法为：提取人胰腺组织总RNA，逆转录得到cDNA，再以该cDNA为模板，以SEQ ID No.4和SEQID No.5所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有BamHⅠ和NotI 酶切位点的TIPE2cDNA全长，PCR条件为：94℃预变性4分钟；然后94℃变性45秒，58℃退火60秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-TIPE2。
5.根据权利要求4所述MIF和TIPE2重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤c的具体方法为：自重组载体pT-MIF中用HindIII和BamHI双酶切出MIF cDNA全长，经纯化后与同样用HindIII和BamHI双酶切的pEGFP载体连接，得重组载体pEGFP-MIF；再自重组载体pT-TIPE2中用BamHⅠ和NotI 双酶切出TIPE2 cDNA全长，经纯化后与同样用BamHⅠ和NotI 双酶切的重组载体pEGFP-MIF连接，得重组载体pEGFP-MIF-IRES-TIPE2。
6.根据权利要求5所述MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤d的具体方法为：以重组载体pEGFP-MIF-IRES-TIPE2为模板，SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8所示序列为上下游引物进行PCR，将MIF-IRES-TIPE2片段两端的酶切位点更换为NotI酶切位点和NotⅠ酶切位点，PCR条件为：94℃预变性4分钟；然后94℃变性45秒，58℃退火60秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-MIF-IRES-TIPE2。
7.根据权利要求6所述MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤e的具体方法为：自重组载体pT-MIF-IRES-TIPE2中用NotI和NotⅠ双酶切出MIF-IRES-TIPE2片段，经纯化后与同样用NotI和NotⅠ双酶切的腺病毒穿梭载体pShuttle-EF1Α连接，得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-EF1Α-MIF-IRES-TIPE2。
8.根据权利要求7所述MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤f的具体方法为：将重组腺病毒穿梭载体pShuttle-EF1Α-MIF-IRES-TIPE2用PmeⅠ酶切线性化，再与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同时电转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞，进行胞内同源重组，得重组腺病毒载体pAd-MIF/TIPE2。
9.根据权利要求8所述MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤g的具体方法为：将人胚胎肾293细胞以40-60%的细胞密度接种至培养瓶中，待细胞生长至30-50%融合时，采用Lipofectamine 2000试剂将重组腺病毒载体pAd-MIF/TIPE2转染293细胞，待细胞出现明显病变时离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液重悬后，反复冻融使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上清液，即得重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2。
10.权利要求1所述MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒在制备巨噬细胞基因载体的应用。
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