CN105002145B - 利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用，采用从C57BL/6小鼠的胸腺DNA、小鼠黑色素瘤B16细胞总RNA和新城疫病毒(NDV)LaSota株中分别扩增出的mTERT启动子、mTyr启动子和HN基因，将获得的目的基因克隆到pShuttle‑IRES‑hrGFP‑2穿梭载体中，线性化重组穿梭载体后与骨架载体pAdeasy‑1共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进行同源重组，构建了包含上述目的基因的重组腺病毒质粒Ad‑mTERTp‑Tyrp‑HN；将重组腺病毒质粒由PacⅠ酶切后，经脂质体介导转染HEK293细胞，包装获得高滴度的重组腺病毒；评价HN基因在双启动子的联合调控作用下对B16细胞的抑瘤效果。
Description
技术领域
本发明涉及构建重组腺病毒的方法，具体说，是一种利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用。
背景技术
黑色素瘤(melanoma)是一种常见的皮肤恶性肿瘤，其发病率较低，占恶性肿瘤的1％～3％，但其恶性度高，转移早且发生广泛，是临床治疗过程中颇为棘手的恶性肿瘤。恶性黑色素瘤具有快速生长以及高死亡率的特点，黑色素瘤的转移往往发生在肿瘤形成的初期阶段，且转移性的黑色素瘤侵袭性非常高，传统的治疗方法对其无效或效果很差。由于以上的种种原因，使得研究者们亟需一种新的研究策略来治疗恶性黑色素瘤。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用。将两种启动子对肿瘤细胞的靶向性、HN基因的细胞凋亡作用和腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性结合起来，构建出能够融合表达上述基因的重组腺病毒，检验HN基因在双启动子的联合调控作用下对B16细胞的抑瘤作用。为进一步利用重组腺病毒在体内外诱导肿瘤细胞凋亡及研制动物肿瘤的广谱疫苗奠定理论和实验基础。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种利用mTERT启动子和mTyr启动子调控HN基因构建重组腺病毒的方法，包括以下步骤：
1)从C57BL/6小鼠的胸腺DNA、小鼠黑色素瘤B16细胞总RNA和新城疫病毒(NDV)LaSota株感染的鸡胚尿囊液中分别扩增出mTERT启动子基因序列GI:AF157502.1、mTyr启动子基因序列GI:D00439.1和HN基因序列GI:EF 211815.1；
所述的mTERT启动子基因、mTyr启动子基因和HN基因的扩增包括：以mTERTp-F SEQID NO：1和mTERTp-R SEQ ID NO：2为引物，以C57BL/6小鼠的胸腺DNA为模版，扩增mTERT启动子；以Tyrp-F SEQ ID NO：3和Tyrp-R SEQ ID NO：4为引物，以小鼠黑色素瘤B16细胞总RNA为模版，扩增mTyr启动子；以HN-F SEQ ID NO：5和HN-R SEQ ID NO：6为引物，以新城疫病毒NDV LaSota株感染的鸡胚尿囊液为模版，扩增HN基因；
2)将获得的目的基因克隆到pShuttle-IRES-hrGFP-2穿梭载体中，线性化重组穿梭载体后与骨架载体pAdeasy-1共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进行同源重组，构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd-mTERTp-Tyrp-HN；
3)将重组腺病毒质粒由PacⅠ酶切后，经脂质体介导转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN。
所述的利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法制备的重组腺病毒。
所述的利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法制备的重组腺病毒在防治小鼠黑色素瘤生物制品方面的应用。
本发明的有益效果是：将mTERT启动子对肿瘤细胞的靶向性、mTyr启动子对小鼠黑色素瘤的组织特异性、HN基因的细胞凋亡作用与腺病毒表达载体系统高效稳定表达外源基因的特性相结合，构建表达上述基因的重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN，使HN基因在双启动的联合调控作用下更好的发挥其在抑制肿瘤细胞生长及凋亡方面的作用。通过对重组腺病毒在B16细胞中外源基因的蛋白表达、细胞活力和细胞凋亡的检测，综合评价了重组腺病毒对B16细胞的抑瘤作用，研究结果显示重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN对B16细胞生长的抑制作用在第4d达到最大值，对B16细胞的凋亡率为58.39±1.47％，其余重组腺病毒均可在不同程度上抑制B16细胞的生长并诱导肿瘤细胞凋亡，且重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN的抑瘤作用(凋亡率为58.39±1.47％)显著优于对照组腺病毒Ad-GFP(凋亡率为19.05±0.89％)(P<0.05)。本发明最终研制出一种针对动物肿瘤性疾病的广谱疫苗。
附图说明
图1是mTERTp、mTyrp和HN基因RT-PCR/PCR扩增结果(M:DL250bp DNA分子质量标准；1:mTERTp基因PCR产物；2:mTyrp基因RT-PCR产物；3:HN基因PCR产物)。
图2是腺病毒穿梭载体的PCR扩增结果(M：DL 250bp DNA Marker；1：mTERT启动子片段的PCR扩增产物；2：mTyr启动子片段的PCR扩增产物；3：HN基因的PCR扩增产物；4：mTERTp-HN基因片段的PCR扩增产物；5：mTyrp-HN基因片段的PCR扩增产物；6：mTERTp-mTyrp-HN基因片段的PCR扩增产物)。
图3是腺病毒穿梭载体双酶切鉴定结果(M：DL 1kb DNA Marker；1：pShuttle-HN经Nhe I和Xho I的双酶切产物；2：pShuttle-mTERTp-HN经Bgl II和Xho I的双酶切产物；3：pShuttle-mTyrp-HN经Sca I和Xho I的双酶切产物；4：pShuttle-mTERTp-Tyrp-HN经Bgl II和Xho I的双酶切产物)。
图4是重组腺病毒质粒的电泳结果(M：DL 1Kb DNA Marker；1：重组腺病毒质粒pAd-HN；2：重组腺病毒质粒pAd-mTERTp-HN；3：重组腺病毒质粒pAd-mTyrp-HN；4：重组腺病毒质粒pAd-mTERTp-Tyrp-HN；5：重组腺病毒质粒pAd-GFP)。
图5是重组腺病毒质粒的Pac I酶切鉴定结果(M：DL 1Kb DNA Marker；1：重组腺病毒质粒pAd-HN的Pac I酶切产物；2：重组腺病毒质粒pAd-mTERTp-HN的Pac I酶切产物；3：重组腺病毒质粒pAd-mTyrp-HN的Pac I酶切产物；4：重组腺病毒质粒pAd-mTERTp-Tyrp-HN的Pac I酶切产物；5：重组腺病毒质粒pAd-GFP的Pac I酶切产物)。
图6是重组腺病毒感染HEK293细胞荧光检测图(10×)(A：正常HEK293细胞图；B：重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN感染HEK293细胞后24h图；C：重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN感染HEK293细胞感染后24h荧光图；D：重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN感染HEK293细胞感染后72h图；E：重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN感染HEK293细胞感染后72h荧光图)。
图7是是重组腺病毒感染HEK293细胞后经RT-PCR检测HN基因的结果(M：DL 250bpDNA Marker；1：重组腺病毒Ad-HN；2：重组腺病毒Ad-mTERTp-HN；3：重组腺病毒Ad-mTyrp-HN；4：重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN)。
图8是重组腺病毒对B16的细胞毒作用(20×)(A：正常B16细胞图；B：重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN感染B16细胞后24h图；C：重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN感染B16细胞感染后24h荧光图；D：重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN感染B16细胞感染后48h图；E：重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN感染B16细胞感染后48h荧光图；F：重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN感染B16细胞感染后72h图；G：重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN感染B16细胞感染后72h荧光图)。
图9是Western blotting检测重组腺病毒感染B16细胞后HN蛋白的表达情况。
图10是重组腺病毒对B16细胞的细胞活力影响研究。
图11是重组腺病毒诱导B16细胞凋亡作用研究(A.重组腺病毒Ad-GFP；B.重组腺病毒Ad-HN；C.重组腺病毒Ad-mTERTp-HN；D.重组腺病毒Ad-mTyrp-HN；E.重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN引起的B16细胞凋亡率)(见表5)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
随着分子生物学、免疫学、病理学及相关学科的发展，基因治疗现已成为肿瘤学研究的热点。目前，腺病毒(adenovirus,Ad)载体疗法是基因治疗中最有前景的基因转移方法之一，它能有效的将外源基因传递到各种靶细胞或组织中，载体的构建和操作简单，宿主范围广，感染性强，可经不同途径进入不同组织，还能感染分化后的非分裂期细胞。大量研究结果表明，新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)的血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin neuraminidase,HN)基因是NDV抗肿瘤的主要成分，HN蛋白不仅能具有介导病毒吸附于肿瘤细胞并与融合蛋白一起辅助病毒侵入肿瘤细胞的作用，还具有神经氨酸酶活性，能水解宿主细胞表面的唾液酸，暴露宿主细胞的生物识别位点，促进抗原提呈，引起肿瘤周围的细胞因子、化学因子的生成增加，可引发淋巴细胞、单核细胞浸润等。端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT)是负责端粒酶催化活性的最重要组分。端粒酶活性的变化与细胞的衰老和肿瘤的发生息息相关。TERT表达于90％以上的肿瘤，大多数人类和小鼠的癌症或肿瘤衍生的细胞系中都有端粒酶活性的高表达，是广谱的肿瘤标志物。酪氨酸酶(Tyrosinase,Tyr)是黑色素瘤形成过程中的一种关键酶，其表达和活性决定着黑色素生成的速度和产量，该酶活性过高会导致色斑及黑色素瘤的形成。因此，选择mTERT启动子和mTyr启动子调控HN基因构建重组腺病毒，利用双启动子来调控治疗基因HN的表达，可以实现对小鼠黑色素瘤细胞的抑瘤作用。
本发明利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法，包括以下步骤：
1)小鼠TERTp启动子、Tyrp启动子和新城疫病毒HN基因的克隆；
2)双启动子联合调控HN基因重组腺病毒质粒的构建；
3)双启动子联合调控HN基因重组腺病毒质粒的包装与鉴定；
4)重组腺病毒介导小鼠黑色素瘤B16细胞凋亡的体外抑瘤效果。
具体包括步骤如下：
1)从C57BL/6小鼠的胸腺DNA、小鼠黑色素瘤B16细胞总RNA和新城疫病毒(NDV)LaSota株感染的鸡胚尿囊液中分别扩增出mTERT启动子基因序列GI:AF157502.1、mTyr启动子基因序列GI:D00439.1和HN基因序列GI:EF 211815.1；
所述的mTERT启动子基因、mTyr启动子基因和HN基因的扩增包括：以mTERTp-F SEQID NO：1和mTERTp-R SEQ ID NO：2为引物，以C57BL/6小鼠的胸腺DNA为模版，扩增mTERT启动子；以Tyrp-F SEQ ID NO：3和Tyrp-R SEQ ID NO：4为引物，以小鼠黑色素瘤B16细胞总RNA为模版，扩增mTyr启动子；以HN-F SEQ ID NO：5和HN-R SEQ ID NO：6为引物，以新城疫病毒NDV LaSota株感染的鸡胚尿囊液为模版，扩增HN基因；
2)将获得的目的基因克隆到pShuttle-IRES-hrGFP-2穿梭载体中，线性化重组穿梭载体后与骨架载体pAdeasy-1共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进行同源重组，构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd-mTERTp-Tyrp-HN；
3)将重组腺病毒质粒由PacⅠ酶切后，经脂质体介导转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN。
所述的利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法制备的重组腺病毒。
所述的利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法制备的重组腺病毒在防治小鼠黑色素瘤生物制品方面的应用。
也就是说：从C57BL/6小鼠的胸腺DNA、小鼠黑色素瘤B16细胞总RNA和新城疫病毒(NDV)LaSota株中分别扩增出mTERT启动子、mTyr启动子和HN基因；将获得的目的基因克隆到pShuttle-IRES-hrGFP-2穿梭载体中，线性化重组穿梭载体后与骨架载体pAdeasy-1共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进行同源重组，构建了包含上述目的基因的重组腺病毒质粒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-Tyrp-HN、Ad-mTERTp-Tyrp-HN；将重组腺病毒质粒由PacⅠ酶切后，经脂质体介导转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒；应用RT-PCR、Western blotting对重组腺病毒在HEK293细胞中表达情况进行鉴定；通过荧光显微技术检测病毒感染HEK293细胞后的形态变化；利用氯化铯(CsCl)密度梯度离心法纯化病毒并测定其滴度；将获得的重组腺病毒体外转染小鼠黑色素瘤B16细胞，通过RT-PCR和Westernblotting检测重组腺病毒的感染性和外源基因的表达情况；分别采用MTT和流式细胞仪检测重组腺病毒对B16细胞生长的影响及其对B16细胞的凋亡作用，评价HN基因在双启动子联合调控下对小鼠黑色素瘤B16细胞的抑瘤效果。
下面结合具体实例对本发明作进一步详细说明：
1材料与方法
1.1mTERTp基因、mTyrp基因和HN基因的扩增
购买5周龄C57BL/6小鼠6只，脱臼处死之后无菌条件下摘取胸腺，将胸腺组织切碎，按照上海生工生物公司组织DNA提取试剂盒说明书操作，提取胸腺DNA。根据GenBank中小鼠TERT基因序列(AF157502.1)，设计一对PCR扩增引物，并进行目的片段的扩增，将扩增产物克隆至pMD19-T载体上，将鉴定正确的重组质粒命名为pMD-mTERTp，于-20℃保存备用。
收获生长状况良好的小鼠黑色素瘤B16细胞，加入1mL Trizol试剂，按照产品说明书操作，提取总RNA。根据GenBank中小鼠的Tyr基因序列(D00439.1)，设计一对RT-PCR扩增引物，按Takara公司PrimeScriptTMOne Step RT-PCR kit说明书采用一步法进行mTyrp基因序列的扩增，将扩增产物克隆至pMD19-T载体上，将鉴定正确的重组质粒命名为pMD-mTyrp，于-20℃保存备用。
用灭菌生理盐水溶解冻干保存的NDV LaSota系毒株(1:1000倍稀释)，经双抗(青霉素:链霉素＝1:1配成100万U/ml溶液)处理后，接种10-11日龄的SPF鸡胚，收取4天～7天的鸡胚尿囊液，按照Trizol法提取病毒总RNA。根据GenBank中NDV HN cDNA序列(EF211815.1)，设计一对RT-PCR扩增引物，RT-PCR扩增和T-A克隆参照上述，将鉴定正确的重组质粒命名为pMD-HN。
PCR(反应体系见表1)、RT-PCR扩增(反应体系见表2)和T-A克隆(反应体系见表3)，引物序列见下表4。
表1 PCR反应体系
注：反应程序：95℃，预变性5min；{94℃，30s；58℃，30s；72℃，30s}30个循环，72℃延伸10min。4℃保存备用。
表2 RT-PCR反应体系
注：反应程序：50℃，30min，94℃，预变性2min；{94℃，30s；58℃，30s；72℃，45s}35个循环，72℃延伸10min。4℃保存备用。
表3 T-A克隆连接体系
| 组分group | 用量(μl)volume of use |
| 目的基因 | 9.0 |
| pMD18-T vector | 1.0 |
| SolutionⅠ | 10.0 |
| Total | 20.0 |
表4 扩增目的片段的引物
1.2亚克隆穿梭腺病毒载体的构建
回收纯化产物HN基因片段及载体pShuttle-IRES-hrGFP-2分别用NheⅠ、XhoⅠ进行双酶切。将双酶切获得的目的基因HN与pShuttle-IRES-hrGFP-2相连，16℃连接过夜。连接反应体系为10×T4DNA Ligase Buffer 2.0μL，载体片段4.0μL，目的片段10.0μL，T4 DNALigase 0.5μL。经卡那霉素抗性筛选，菌液PCR、酶切及测序鉴定，构建pShuttle-HN重组穿梭质粒。
回收纯化产物mTERTp基因片段及载体pShuttle-HN分别用NotⅠ、BglⅡ进行双酶切。将双酶切获得的目的基因与pShuttle-HN相连，16℃连接过夜。连接反应及后续鉴定参照上述，构建pShuttle-mTERTp-HN重组穿梭质粒。
回收纯化产物mTyrp基因片段及载体pShuttle-HN分别用ScaⅠ、NheⅠ进行双酶切。将双酶切获得的目的基因与pShuttle-HN相连，16℃连接过夜。连接反应及后续鉴定参照上述，构建pShuttle-mTyrp-HN重组穿梭质粒。
回收纯化产物mTERTp基因片段及载体pShuttle-mTyrp-HN分别用NotⅠ、BglⅡ进行双酶切。将双酶切获得的目的基因与pShuttle-mTyrp-HN相连，16℃连接过夜。连接反应及后续鉴定参照上述，构建pShuttle-mTERTp-mTyrp-HN重组穿梭质粒。
1.3重组腺病毒质粒的构建
用限制性内切酶PmeⅠ分别酶切pShuttle-HN、pShuttle-mTERTp-HN、pShuttle-mTyrp-HN、pShuttle-mTERTp-mTyrp-HN和pShuttle-IRES-hrGFP-2，使其线性化。37℃酶切过夜，0.7％琼脂糖凝胶电泳酶切产物，切胶回收目的片段(用去离子水洗脱)。取线性化1μg穿梭载体与1μg pAdEasy-1质粒共转化BJ5183感受态细胞，卡那霉素抗性筛选，挑取针尖样小菌落进行菌液PCR筛选及PacⅠ酶切鉴定，获得同源重组腺病毒质粒，命名为pAd-HN、pAd-mTERTp-HN、pAd-mTyrp-HN、pAd-mTERTp-mTyrp-HN和pAd-GFP。
1.4重组腺病毒的包装
重组腺病毒质粒的质粒提取按照Tiangen质粒大提试剂盒说明书进行。取经PacⅠ酶切重组腺病毒质粒5μg，由12.0μL脂质体Lipofectamine2000介导，转染HEK293细胞，包装后获得重组腺病毒。利用RT-PCR检测目的基因mRNA转录，Western blotting检测目的蛋白的表达，通过荧光显微镜检测重组腺病毒的细胞转染情况，对重组腺病毒转染HEK293细胞的情况进行鉴定；采用氯化铯(CsCl)密度梯度离心法纯化所扩增的病毒，参照TCID50法进行病毒滴度测定。
1.5重组腺病毒介导小鼠黑素瘤B16细胞凋亡的体外实验
为了评价双启动子联合调控HN基因重组腺病毒在动物肿瘤基因治疗中的作用，本研究选择了小鼠黑色素瘤B16细胞株为研究对象，将构建成功的重组腺病毒用于感染B16细胞，观察重组腺病毒pAd-mTERTp-mTyrp-HN对B16细胞的体外抑制作用，并探讨其诱导B16细胞凋亡的生物学效应。
试验中利用MTT法检测重组腺病毒对B16细胞生长抑制的作用，该方法中的细胞数量需要限定在一定的范围内，只有这样才能使生成MTT结晶物的量与活细胞数量呈正比关系。如果细胞生长量过多时，会大量消耗培养液中的营养物质，造成细胞死亡；细胞量过少时，实验结果将不能准确反应活细胞的实际数量。参考已有研究，本试验确定的细胞密度为2×104个/mL，在96孔板加入100μL/孔(约含2000个细胞)细胞培养液，24h后于96孔板中加入MOI分别为0.1，1，10，100的重组腺病毒，每个MOI做5个复孔；将96孔板置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中孵育一定时间(24h、48h、72h、96h)；于每个检测时间点，在96孔板中每孔加入20μL配置好的MTT溶液，在37℃孵育4h；弃去上清液，每孔加150μL DMSO使紫色晶体溶解，在室温下以低速避光振摇15min，使用酶标仪在490nm波长处检测每孔的光吸收值。
传代细胞B16细胞，按每孔1mL，1×105个/mL比例加入6孔板；分别加入5组MOI为10的重组腺病毒，标记为感染组Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-mTyrp-HN和对照组Ad-GFP，采用Western blotting法检测重组腺病毒在B16细胞中的表达情况,以及流式细胞术检测重组腺病毒对B16细胞的凋亡作用。
2结果与分析
2.1小鼠TERT核心启动子基因片段、Tyr核心启动子基因片段和新城疫病毒HN基因的克隆与序列分析
利用特异性引物，分别以C57BL/6小鼠的胸腺DNA、小鼠黑色素瘤B16细胞总RNA和NDV LaSota株的总RNA为模板，通过PCR/RT-PCR方法，分别扩增出333bp的mTERT核心启动子基因片段、422bp的mTyr核心启动子基因片段条带和1716bp的HN基因条带，均与预期相符(见图1)。
测序结果与GeneBank中的数据进行Blast分析，表明mTERTp、mTyrp基因片段及HN基因序列同源性均为99％以上。通过DNAMAN软件对该同源序列做进一步分析。
2.2亚克隆穿梭腺病毒载体的构建
分别对pMD-mTERTp、pMD-mTyrp、pMD-HN和腺病毒穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP-2进行双酶切，胶回收目的片段，以T4 DNA连接酶连接，亚克隆质粒pShuttle-HN、pShuttle-mTERTp-HN、pShuttle-mTyrp-HN和pShuttle-mTERTp-mTyrp-HN进行PCR鉴定，分别得到333bp、422bp、1716bp、2049bp、2138bp和2471bp目的片段，表明穿梭载体的亚克隆成功(见图2)。
分别对亚克隆质粒pShuttle-HN、pShuttle-mTERTp-HN、pShuttle-mTyrp-HN和pShuttle-mTERTp-mTyrp-HN进行双酶切鉴定，分别得到1716bp、2049bp、2138bp和2471bp的目的片段，表明重组穿梭载体构建成功(见图3)。
用限制性内切酶PmeⅠ分别酶切pShuttle-HN、pShuttle-mTERTp-HN、pShuttle-mTyrp-HN、pShuttle-mTERTp-mTyrp-HN和pShuttle-IRES-hrGFP-2，使其线性化。取线性化1μg穿梭载体与1μg pAdEasy-1质粒共转化BJ5183感受态细胞，卡那霉素抗性筛选，挑取针尖样小菌落进行菌液PCR筛选及PacⅠ酶切鉴定，获得同源重组腺病毒质粒，命名为pAd-HN、pAd-mTERTp-HN、pAd-mTyrp-HN、pAd-mTERTp-mTyrp-HN和pAd-GFP。
将提取的重组腺病毒质粒，用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，结果(见图4)。PacⅠ酶切pAd-HN、pAd-mTERTp-HN、pAd-mTyrp-HN、pAd-mTERTp-mTyrp-HN和pAd-GFP，分别得到3kb、4.5kb、4.5kb、4.5kb和3kb的片段(见图5)，表明pAd-HN和pAd-GFP的同源重组发生在复制起点，pAd-mTERTp-HN、pAd-mTyrp-HN、pAd-mTERTp-mTyrp-HN的同源重组发生在左臂。
2.3TRAIL和TRAIL-linker-HN基因重组腺病毒的构建
将线性化的重组腺病毒质粒经脂质体包裹后，转染AD293细胞，用DMEM维持液(含有2％胎牛血清)在37℃5％CO2培养箱内培养，每日于倒置显微镜下观察细胞变化，约第7d，经Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN和Ad-mTERTp-mTyrp-HN转染的AD293细胞出现肿胀、圆缩等典型病毒感染病变(CPE)，在荧光显微镜下可见感染细胞出现绿色荧光，而未感染组细胞未见变化(见图6)。RT-PCR产物的电泳结果显示，1716bp处出现特异性扩增条带(见图7)。
收集经CsCl密度梯度离心浓缩纯化后的病毒，以50％组织培养感染剂量法(TCID50)测定重组腺病毒的病毒滴度，按照KarBer法计算出重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-mTyrp-HN和Ad-GFP的滴度分别为：1011.25TCID50/mL、1012.5TCID50/mL、1011.625TCID50/mL、1011.875TCID50/mL和1012.125TCID50/mL，符合下一步抑瘤实验所需滴度要求。
2.4重组腺病毒介导小鼠黑色素瘤细胞B16的凋亡
用10MOI的重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-mTyrp-HN和Ad-GFP感染B16细胞一定时间后，在倒置显微镜下观察细胞形态。可见未处理的细胞，未见细胞病变；而重组腺病毒感染的B16细胞呈现细胞漂浮、肿胀等显著细胞病变(CPE)(见图8)。
用10MOI的重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-mTyrp-HN和Ad-GFP分别感染B16细胞，48h后收取细胞，Western blotting检测HN基因的蛋白表达，可见相应的目的条带(见图9)。
用不同MOI(0.1,1,10,100)的重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-mTyrp-HN和Ad-GFP分别感染B16细胞，于不同时间点下(24h，48h，72h，96h)用MTT法检测细胞的生长活力。结果显示：Ad-mTERTp-Tyrp-HN对B16细胞生长的抑制作用在第4d达到最大值，且抑制率大于其他对照组重组腺病毒的作用效果，证实重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN能发挥其良好的靶向性，具备感染和杀伤肿瘤细胞的能力(见图10)。
分别被重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-mTyrp-HN和Ad-GFP染72h后，用流式细胞仪检测B16细胞凋亡和细胞周期的变化。结果显示：Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-Tyrp-HN和对照腺病毒Ad-GFP对B16细胞的凋亡率分别为：28.03±0.45％、48.36±0.95％、39.12±0.78％、58.39±1.47％、19.05±0.89％。用One-Way ANOVA统计方法对各组重组腺病毒的凋亡率进行多重比较，各组腺病毒诱导B16细胞的凋亡作用相较于其他组均呈现显著作用(P<0.05)，分析结果表明重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN诱导B16细胞的凋亡作用最为显著，其他各组Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-HN对B16细胞的凋亡作用相较于对照组腺病毒Ad-GFP也较为显著(见图11)(见表5)。
表5 流式细胞术检测重组腺病毒诱导B16细胞的凋亡作用(n＝3)
3结论
3.1从小鼠胸腺组织、小鼠黑色素瘤B16细胞系和NDV(LaSota株)中分别扩增出TERT核心启动子片段、Tyr核心启动子片段和HN基因，并分别成功连接到pMD19-T载体上。
3.2将目的基因mTERTp、mTyrp和HN分别亚克隆到穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-2中，线性化后与pAdEasy-1骨架载体共转染BJ5183感受态细胞，二者在BJ5183内进行同源重组，成功构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd-HN、pAd-mTERTp-HN、pAd-mTyrp-HN、pAd-mTERTp-Tyrp-HN和对照腺病毒质粒pAd-GFP。
3.3将重组腺病毒质粒pAd-HN、pAd-mTERTp-HN、pAd-mTyrp-HN、pAd-mTERTp-Tyrp-HN和对照腺病毒质粒pAd-GFP经PacⅠ酶切后，转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-Tyrp-HN和对照腺病毒Ad-GFP；经RT-PCR证实重组腺病毒质粒成功导入HEK293细胞中；经Western blotting可检测到HN蛋白的表达，表明构建成功的重组腺病毒具有良好的感染性；上述重组腺病毒经CsCl密度梯度纯化后，应用TCID50法检测其病毒滴度，分别为1011.25TCID50/mL、1012.5TCID50/mL、1011.625TCID50/mL、1011.875TCID50/mL和1012.125TCID50/mL，表明腺病毒介导外源基因感染有效，收获的较高滴度和感染性的重组腺病毒，符合下一步进行体外抑瘤实验要求。
3.4重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN体外感染小鼠黑色素瘤B16细胞系，通过对细胞生长状态和绿色荧光蛋白表达的观察，MTT法对细胞活力进行检测，western blotting检测HN蛋白的表达，结果表明Ad-mTERTp-Tyrp-HN对B16细胞生长的抑制作用在第4d达到最大值，且抑制率大于其他对照组重组腺病毒的作用效果(P<0.01)，证实重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN能发挥其良好的靶向性，具备感染和杀伤肿瘤细胞的能力。
3.5经流式细胞术检测细胞凋亡，以及PI/EB荧光检测等，证实重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN能够在体外对B16细胞的生长起到抑制作用，并能通过双启动子严格调控外源基因HN的表达，对B16细胞的具有良好凋亡作用，Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-Tyrp-HN和对照腺病毒Ad-GFP对B16细胞的凋亡率分别为：28.03±0.45％、48.36±0.95％、39.12±0.78％、58.39±1.47％和19.05±0.89％，分析结果表明重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN诱导B16细胞的凋亡作用最为显著，其他各组Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-HN对B16细胞的凋亡作用相较于对照组腺病毒Ad-GFP也较为显著(P<0.05)。
本发明的创新之处在于，首次利用端粒酶逆转录酶(mTERT)启动子的肿瘤特异性与酪氨酸酶(mTyr)启动子的组织特异性、HN基因的细胞凋亡作用以及腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性，成功构建出能够融合表达上述基因的重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN。通过对重组腺病毒在B16细胞中的复制、转录、外源基因蛋白表达、细胞活力和细胞凋亡的检测，综合评价了重组腺病毒对B16细胞的抑瘤作用，阐明重组腺病毒在B16肿瘤细胞中的表达规律及杀伤肿瘤细胞的生物学效应，证明了构建的重组腺病毒诱导肿瘤细胞凋亡及基因治疗的临床应用前景。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
Claims (3)
1.一种利用mTERT启动子和mTyr启动子调控HN基因构建重组腺病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从C57BL/6小鼠的胸腺DNA、小鼠黑色素瘤B16细胞总RNA和新城疫病毒(NDV)LaSota株感染的鸡胚尿囊液中分别扩增出mTERT启动子基因序列GI:AF157502.1、mTyr启动子基因序列GI:D00439.1和HN基因序列GI:EF211815.1；
所述的mTERT启动子基因、mTyr启动子基因和HN基因的扩增包括：以mTERTp-F SEQ IDNO：1和mTERTp-R SEQ ID NO：2为引物，以C57BL/6小鼠的胸腺DNA为模版，扩增mTERT启动子；以Tyrp-F SEQ ID NO：3和Tyrp-R SEQ ID NO：4为引物，以小鼠黑色素瘤B16细胞总RNA为模版，扩增mTyr启动子；以HN-F SEQ ID NO：5和HN-R SEQ ID NO：6为引物，以新城疫病毒NDV LaSota株感染的鸡胚尿囊液为模版，扩增HN基因；
2)将获得的目的基因克隆到pShuttle-IRES-hrGFP-2穿梭载体中，线性化重组穿梭载体后与骨架载体pAdeasy-1共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进行同源重组，构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd-mTERTp-Tyrp-HN；
3)将重组腺病毒质粒由PacⅠ酶切后，经脂质体介导转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN。
2.如权利要求1所述的利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法制备的重组腺病毒。
3.如权利要求1所述的利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法制备的重组腺病毒在制备防治小鼠黑色素瘤的生物制品中的应用。
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