CN1653182A - 重组禽痘病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组禽痘病毒(FWPV)和包含用于这种重组禽痘病毒的基因序列的DNA载体。本发明还涉及包含所述重组禽痘病毒或DNA载体的药用组合物、所述重组禽痘病毒治疗传染病或肿瘤疾病的用途，以及产生所述重组禽痘病毒或DNA载体的方法。本发明还涉及包含重组DNA载体或重组禽痘病毒的真核细胞或原核细胞。本发明基于鉴定到FWPV－F11L基因是外源DNA的新的插入位点。

Description

重组禽痘病毒
发明领域
本发明涉及重组禽痘病毒以及包含用于重组禽痘病毒的基因序列的DNA载体。另外，本发明涉及包含重组禽痘病毒或DNA载体的药用组合物，重组禽痘病毒用于治疗传染病或肿瘤疾病的用途，以及制备重组禽痘病毒或DNA载体的方法。最后，本发明涉及包含重组DNA载体或重组禽痘病毒的真核细胞或原核细胞。
发明背景
不同种属的痘病毒已经确认为重组疫苗载体(Moss，1996；Paoletti，1996)。已知包括原型成员禽痘病毒(FWPV)的禽类痘病毒仅在禽类细胞中复制。在哺乳动物中，病毒繁殖被阻断在复制周期的不同时期，这取决于细胞类型，但是也存在有病毒特异性的受控基因表达(Taylor et al.，1988；Somogyi et al.，1993)。利用该特征来开发重组的候选禽类痘病毒，作为接种哺乳动物包括人类的、对抗传染病和癌症的安全而不复制的载体(Wang et al.，1995；Perkus et al.，1995；Roth et al.，1996)。这些疫苗中有些已处于I期临床试验(Cadoz et al.，1992；Marshall et al.，1999；Berencsiet al.，2001)或II期临床试验(Belshe et al.，2001)。
另外，更复杂的接种策略可能需要不同抗原的同时表达或者抗原和免疫共刺激分子组合表达(Leong et al.，1994；Hodge et al.，1999)。这些基因可以以单一序列盒的形式插入到病毒基因组的一个位点中，或者连续插入，使得构建的载体病毒可以连续地改进。在后一情况下，需要在不同稳定插入位点中进行选择，并能够消除选择标记，以便对于向不同位点的插入来说可以重复相同的选择策略。另外，对于人用疫苗来说不能存在标记基因。通过鸟枪插入策略已经在FWPV基因组中鉴定到了数个插入位点(Taylor et al.，1988；Jenkins et al.，1991)。另外，外源基因的插入已经将病毒基因组靶向导入末端反向重复区中(Boursnell et al.，1990)，靶向到非必需基因如胸苷激酶基因(Boyle & Coupar，1988)，或靶向到编码基因序列之间的区域(Spehner et al.，1990)。
已经描述了用于产生重组病毒的几个策略，其中，用于噬斑分离的标记基因在使用后缺失。
第一个策略是Falkner和Moss(1990)所述、广泛使用的优势选择法，其中选择标记存在于插入序列盒外部的质粒序列中。通过单交换事件产生的、包含全部质粒序列的重组病毒在选择培养基存在的条件下获得。由于旁侧区域重复序列的存在，这些重组病毒不稳定。在不存在选择培养基的条件下，位于这些重复序列之间的标记基因在第二次重组后缺失，产生野生型(wt)病毒或稳定的重组病毒。后者必须根据噬斑法再次分离，并通过PCR或Southern印迹法鉴定。
第二种方法基于一个发现：在表达位于正向重复取向的P7.5启动子控制之下的靶蛋白和β-半乳糖苷酶的重组FWPV中，在启动子重复之间发生同源重组，导致lacZ基因的缺失(Spehner et al.，1990)。由于这一原因，丢失标记基因的重组病毒形成白色噬斑。还建立了类似的策略，使用调控型痘苗病毒K1L基因作为瞬时选择标记产生重组MVA病毒，所述痘苗病毒K1L基因通过基因组内同源重组方法消除(Staib etal.，2000)。
FWPV比痘苗病毒生长缓慢。对于强FWPV接种病毒的生成和使用来说，维持重组病毒的完全复制能力是非常重要的。
和现有的载体相比，本发明基于一个目的，即提供重组禽痘病毒，使载体在插入外源DNA后稳定性增加，并且用作疫苗载体时更为安全，同时在选择重组病毒过程中保留完全复制能力和最佳效力。
这些目的已经达到，参考各项独立权利要求。在从属权利要求中描述了本发明的优选实施方案。
根据本发明的解决方案基于鉴定到FWPV-F11L基因是外源DNA的新的插入位点。F11L突变的病毒在感染CEF(鸡胚成纤维细胞)之后有效复制。研究表明，使用能够使标记基因瞬时表达的F11L载体质粒，能够快速产生重组FWPV病毒，其稳定生成肿瘤模式抗原酪氨酸酶。
FWPV的F11L基因本身是公知的，已经得以精确地鉴定。在Afonso et al.，2000的出版物中，F11L基因同源物精确地鉴定为ORF FPV110，基因组位置为131.387-132.739。但是Afonso等没有公开F11L基因作为外源DNA整合位点的特征。
使用F11L基因作为外源DNA的整合位点提供几个意想不到的优点：首先，令人惊奇地发现在F11L基因中包含一个或多个外源DNA插入物的重组禽痘病毒和传统的载体相比具有更高的载体稳定性。其次，根据本发明的FWPV已证实在体内用作疫苗载体时非常安全。根据本发明插入F11L基因的另一个优点是插入可以在基因的任意位点进行。
根据本发明的基本想法，结果提供了在F11L基因中包含至少一个外源DNA插入物的重组禽痘病毒(FWPV)。如上所述，插入在FWPV基因组的位置131.387-132.739进行。虽然插入基本上可以在F11L基因的任意位置进行，往禽痘病毒基因组中限定为核苷酸位置131.387-132.739的基因组区域插入是优选的。
在本发明的上下文中，外源DNA通常指通过基因工程手段导入生物有机体、细胞或病毒等DNA中而不能从这些DNA中获得的任意DNA。
根据一个优选实施方案，外源DNA包含至少一个外源基因，任选地与调控外源基因的表达序列组合。
本发明中重组禽痘病毒(FWPV)包含的外源基因编码多肽，优选治疗用多肽；和/或编码可检测标记和/或是可选择基因。
本文所用的报道基因指基因产物可通过简单的生化手段或组织化学方法得以检测的基因。术语报道基因的同义词是指示基因或标记基因。
在本发明的上下文中，可选择基因或可选择标记分别指分别用于病毒或细胞的基因，其中各自的基因产物分别产生相对于不合成各基因产物的病毒或细胞来说的生长优势或存活优势。优选使用的选择标记是大肠杆菌(E.coli)鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、大肠杆菌潮霉素抗性和新霉素抗性的基因。
举例来说，外源DNA序列可以是分别编码病原性试剂或病原性试剂组分的基因。病原性试剂指能够导致疾病的病毒、细菌或寄生虫，还指在生物有机体中表现为不受控生长从而导致致病性生长的肿瘤细胞。这些病原性试剂的实例描述在Davis，B.D.et al中(Microbiology，第3版，Harper International Edition)。优选的病原性试剂是流感病毒或风疹病毒或呼吸道合胞体病毒、Dengue病毒、人免疫缺陷病毒如HIVI和HIVII、人肝炎病毒如HCV和HBV、疱疹病毒、乳突淋瘤病毒、疟疾恶性疟原虫和导致肺结核的分支杆菌的组分。
举例来说，病原性试剂的特定实例可以是病毒的包膜蛋白(HIV Env、HCVE1/E2、流感病毒HA-NA、RSV F-G)、调控性病毒蛋白(HIV Tat-Rev-Nef、HCVNS3-NS4-NS5)、炭疽芽孢杆菌的保护性抗原蛋白、裂殖虫表面抗原、恶性疟原虫的环子孢子蛋白、作为黑素瘤抗原的酪氨酸酶蛋白或作为人类腺癌抗原的HER-2/neu蛋白。
编码肿瘤相关抗原的优选基因编码黑素瘤相关抗原，例如分别属于癌症测试抗原或肿瘤测试抗原的酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1和2；例如分别是非突变共有抗原或数种肿瘤类型的共有抗原的MAGE-1、-2、-3和BAGE；在肿瘤上超表达的抗原，如Her-2/neu、MUC-1和p53。
尤其优选的是多肽，其是HIV、分支杆菌或恶性疟原虫的组分，或是黑素瘤细胞的组分。
组分通常指上文所引用的、表现出免疫特征的组分，即能够在哺乳动物，尤其是人类中诱导免疫反应的组分(如表面抗原)。
对于能够表达的外源DNA序列或基因而言，DNA上有必要存在基因转录所需的调控序列。这种调控序列(指启动子)对于本领域的技术人员来说是公知的，例如可以使用痘病毒特异性启动子。
优选可检测标记是β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、鸟嘌呤核糖转移酶、荧光素酶或绿色荧光蛋白。
根据一个优选的实施方案，标记基因和/或可选择基因可以消除。在本文开头已详细说明对于向不同位点的插入来说可以重复相同的选择策略，因此这一特征提供了一大优势。另外，对于人用疫苗来说不能存在标记基因。通过标记可选择基因表达序列盒旁侧的相同基因序列之间的基因组内同源重组方法，准“自动化”地实现这些基因序列在最终重组病毒中的缺失。
根据本发明的另一个基本想法，提供了包含根据本发明的重组禽痘病毒的DNA载体，后F11L基因中包含至少一个外源DNA插入物的其功能部分，还优选包含使载体在原核或真核细胞中复制的复制子，以及可在原核或真核细胞中选择的可选择基因或标记基因。用于原核及真核宿主的有用克隆和表达载体描述在Sambrook，et al.，分子克隆：实验室指南，第二版，冷泉港，纽约(1989)中。
本发明的DNA载体以能够复制的独立单位发挥作用，具有在适当宿主细胞中进行DNA复制的能力。因此，不能复制的外源DNA也被动复制，随后和载体一起进行分离和纯化。除了本发明的重组禽痘病毒基因序列，DNA载体还可包括下列序列元件：用于增强基因表达的增强子、作为基因表达先决条件的启动子、复制起点、报道基因、可选择基因、剪切信号和包装信号。
根据本发明的DNA载体主要用作传递载体，使病毒感染的细胞中发生外源基因插入物的同源重组。通常，其用在禽痘病毒插入物的前后序列中，因为调控元件依赖于其他病毒蛋白的存在。
根据本发明，重组禽痘病毒或DNA载体提供在药用组合物中，所述药用组合物包括和药学上可接受的辅助试剂和/或载体的组合。药用组合物优选疫苗。
为了制备疫苗，将根据本发明产生的FWPV转化为生理学上可接受的形式。可以在制备用来接种抗痘疱疫苗方面的许多年经验的基础上，进行这种转化(Kaplan，Br.Med.Bull.25，131-135[1969])。典型地，约106-107重组FWPV颗粒在盛有含2％蛋白胨和1％人血清的100ml磷酸缓冲液(PBS)的小瓶中冻干，所述小瓶优选玻璃瓶。冻干物可以分别包含填充物或稀释试剂(例如甘露醇、右旋糖苷、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮)或适于非肠道用药的其他辅助试剂(例如抗氧化剂、稳定剂等)。然后将玻璃瓶封闭或密封，优选在低于-20℃的温度下可以保存数月。
对于疫苗接种而言，冻干物可以溶解于0.1至0.2ml水溶液中，优选生理盐水中，通过非肠道途径施用，如通过皮内接种。根据本发明的疫苗优选通过皮内途径注射。在注射部位会出现轻度水肿和皮疹，有时也会发炎。施用途径、剂量、施用次数可以由本领域的技术人员以公知的方式进行优化。应用时，可以方便地在较长的时期内施用疫苗数次，以获得对外源抗原的高水平免疫反应。
如上文所限定的，上述物质，即重组禽痘病毒、DNA载体或药用组合物优选用于治疗传染病或肿瘤疾病。
根据本发明的禽痘病毒、DNA载体或药用组合物可以单独使用(如作为疫苗)，或以预防或治疗方式用在所谓引发-加强方法的程序中。也就是说，重复施用根据本发明的接种剂量的禽痘病毒，可以进一步加强对禽痘病毒疫苗的免疫反应。
将本发明的禽痘病毒与其他病毒载体，如MVA联用是尤其有利的。
在联合接种系统中，如上所述，可以使用的例如MVA或其他痘苗病毒属于正粘病毒属。已知某些痘苗病毒株已经用于抗痘疮免疫许多年，例如英国Lister研究所的Elstree株。痘苗病毒还经常用作产生和递送外来抗原的载体(Smith et al.，Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2，383-407[1984])。痘苗病毒是研究最透彻的活载体，例如表现出支持其用作重组疫苗的特定特征：它们高度稳定、能以节约成本的方式制备、易于施用并能够引入大量的外源DNA。痘苗病毒具有下列优势：它们具有抗体反应和细胞毒反应，使抗原以更天然的方式呈递到免疫系统，已经成功地用作载体疫苗，以预防传染病。
但是，痘苗病毒对人类具有感染性，其在实验室中用作表达载体的用途受到安全事项和规定的限制。文献中描述的痘苗病毒基于痘苗病毒的Western Reserve(WR)株。已知该病毒株表现出高水平的神经毒性，因此并不是非常适用于人类(Morita etal.，Vaccine 5，65-70(1987))。
通过从高度减毒的病毒株开发痘苗载体，说明了和VV标准株相关的安全事项。所述高度减毒病毒株特征在于其在体外的增殖有限，在体内无毒。基于Ankara株，已经培养了所谓的改良痘苗病毒Ankara(modified vaccinia virus Ankara，MVA)。MVA病毒根据布达佩斯条约的要求于1987年12月15日保藏在CNCM，保藏号为I-721。
还可以采用具有类似特征的其他无毒痘苗病毒和痘病毒进行上述的接种程序，例如重组形式的痘苗病毒NYVAC、CV-I-78、LC16m0或LC16m8；重组副痘病毒，如减毒的Orf病毒D1701。除了痘病毒，可以采用腺病毒(尤其是人腺病毒5)、正粘病毒(尤其是流感病毒)、疱疹病毒(尤其是人或马疱疹病毒)、或α病毒(尤其是Semliki Forest病毒和Sindbis病毒和马脑炎病毒-VEE)作为其他病毒载体。
在引发-加强方法的系统中，根据本发明的禽痘载体优选在第一免疫，即引发免疫中施用。
例如可用于对抗传染病或肿瘤疾病的保护性接种系统或用于所述疾病的治疗中、根据本发明的疫苗接种程序可以按照下述步骤进行：
根据本发明的、免疫动物优选人类的方法优选包括下述步骤：
a)用治疗有效量的、根据本发明的禽痘病毒、根据本发明的DNA载体或药用组合物引发哺乳动物的免疫；
b)1周至8个月后，任选地重复所述步骤a)1至3次；
c)用治疗有效量的、包含与根据本发明的禽痘病毒、DNA载体或药用组合物相同之外源DNA的另一病毒载体加强哺乳动物的免疫；
优选的是，引发步骤在加强步骤之前进行两次，特别优选的是，引发步骤在治疗的开始和免疫第3周至第5周，优选第4周进行；其中加强步骤在免疫的第11周至第13周，优选第12周进行。
在这一点上，本发明还旨在获得组合制剂，以连续使用上述单独组分进行疫苗接种。这种组合制剂包含下述组分：
a)根据的禽痘病毒、根据本发明的DNA载体，任选地包含药学上可接受的载体，
b)编码与a)中禽痘病毒或DNA载体相同的外源抗原的另一种病毒载体。
和使用根据本发明的禽痘病毒或另一种载体如单一的MVA进行接种相比，上述的引发-加强方案提供更好的免疫反应。
根据本发明的、制备重组禽痘病毒或DNA载体的方法包括：通过重组DNA技术将外源DNA导入禽痘病毒的F11L基因中。优选的是，通过将病毒DNA和包含F11L特异序列的外源DNA进行同源重组实现导入，然后增殖和分离重组病毒或DNA载体。
另外，本发明提供了包含根据本发明的重组DNA载体或重组FWPV的真核细胞或原核细胞。原核细胞优选使用细菌细胞，优选大肠杆菌细胞。真核细胞可以使用禽类细胞，优选鸡细胞；或来源于哺乳动物的细胞，优选人类细胞，其中人胚胎干细胞和人胚系细胞排除在外。
例如，可以通过转染如磷酸钙沉淀法(Graham et al.，Virol.52，456-467[1973]；Wigler et al.，Cell 777-785[1979])、电穿孔法(Neumann et al.，EMBO J.1，841-845[1982])、微注射法(Graessmann et al.，Meth.Enzymology 101，482-492(1883))、脂质体法(Straubinger et al.，Mothods in Enzymology 101，512-527(1983))、原生质球(spheroblast)法(Schaffner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77，2163-2167(1980))或本领域技术人员公知的其他方法将根据本发明的DNA载体导入细胞。优选的是，通过磷酸钙转染法进行转染。
下面通过实施例和附图来说明本发明。
图1：(A)用于FWPV-F11L测序的引物步移测序法。示出了每个测序反应的长度。(B)说明F11L基因中反向末端重复(ITR)和中央位置的FWPV基因组示意图，和制备用作同源重组旁侧序列的F11L基因序列的示意图。示出了沿着F11L ORF的、用于扩增flank 1的引物F1和F2的位置与用于扩增flank 2的引物F3和F4的位置。
图2：用于制备带有突变F11L的病毒即载体质粒Plgfv7.5的插入质粒Plgf11的示意性图谱，以及用于制备FWPV-酪氨酸酶重组子的Plgfv7.5-mTyr的示意性图谱。以黑框表示的序列flank 1和flank 2来源于FWPV-F11L，指导质粒和病毒基因组DNA之间的同源重组。大肠杆菌lacZ和gpt基因用作选择标记(以灰框表示)。P7.5和P11是研究透彻的痘苗病毒特异性启动子，从启动子的转录以箭头表示。pLGFV7.5中的单一PmeI限制性位点可用于插入外源基因，位于P7.5的控制之下。编码小鼠酪氨酸酶(mTyr)的基因用作第一重组模式基因。
图3：转染未消化(A)或线形化pLGF11质粒DNA(B)之后，对产生的、带有突变F11L的病毒中的病毒DNA进行PCR分析。上面一幅图说明使用引物F1和F4进行PCR反应的结果，产生重组病毒(rec.)的高MG的条带，或产生wt病毒(wt)的低MG的条带。下面的一幅图说明了使用引物F1和F2进行的对照(cntr.)PCR反应，说明了每个样品中病毒DNA的各自含量。每个分离物噬斑纯化的次数起始于0，对应于最初挑取的噬斑分离物。pLGF11用作对照基质DNA；FP9为wt病毒DNA对照，UC为来自未感染细胞的对照DNA。
图4：多步生长曲线实验。用FP9病毒或F11L敲除病毒以0.05pfu/细胞的感染复数对CEF接种，每个样品设3个重复。感染后，在不同时间收获三个重复样品，并测定底层琼脂滴度。误差线表示三个重复样品之间的标准差。
图5：对重组FWPV酪氨酸酶病毒MT31中基因组DNA的PCR分析。最初的噬斑分离(泳道0)和最开始2个噬斑纯化周期(泳道1和2)在选择培养基(MXH)中进行，而最后的3次噬斑纯化步骤(泳道3至6)在不存在MXH的条件下进行。pLGFV7.5-mTyr-DNA用作对照基质DNA。(A)说明病毒DNA的相对量的对照PCR(F1-F2)。(B)PCR F1-4：984bp条带对应于从wt病毒DNA扩增的目的DNA片段(wt)；7282bp条带对应于包含酪氨酸酶基因和包含在中间(intermediate)重组病毒中的lacZ gpt亚序列盒(subcassette)的扩增产物(interm.)；2880bp条带对应于仅代表酪氨酸酶基因表达序列盒扩增产物的产物(rec.)。(C)PCR PR43-44说明lacZ序列的存在。(D)通过CEF中黑色素的产生而检测到的小鼠酪氨酸酶的表达。直径为6cm的培养皿中的CEF细胞用0.1pfu/细胞的感染复数感染。感染6天后收获细胞，转移至U形底的微孔板中，用PBS洗涤。泳道1-5：用5种不同的重组病毒感染的细胞；泳道6：未感染细胞；泳道7：用wt病毒感染的细胞。
图6：引发-加强方法中用FWPV酪氨酸酶和MVA酪氨酸酶疫苗联合接种的优势。每组两只小鼠以四周的间隔免疫两次，每次将108感染单位的病毒疫苗通过腹腔内施用进行感染。接种组如下：
组FF：用FWPV酪氨酸酶引发，用FWPV酪氨酸酶加强。
组FM：用FWPV酪氨酸酶引发，用MVA酪氨酸酶加强。
组MM：用MVA酪氨酸酶引发，用MVA酪氨酸酶加强。
组MF：用MVA酪氨酸酶引发，用FWPV酪氨酸酶加强。
第二次免疫(加强)3周后，对比检验酪氨酸酶特异性T细胞应答。为此，制备来自哺乳动物脾脏的T细胞，培养7天的时间，在染色体释放试验中测试其对酪氨酸酶特异性靶细胞的细胞毒性。所示为从每种靶细胞的特定裂解物获得的值(以％表示，效应细胞/靶细胞比例为30∶1)。观察到组FM中的联合接种显示出最高的反应性。相反，在接受同种疫苗免疫的组FF和组MM小鼠中，只测定到中度的细胞毒性应答。在首先用MVA酪氨酸酶接种、然后用FWPV酪氨酸酶接种的组MF组T细胞的测试中显示出最低的细胞毒性。
这些结果明显支持：用FWPV酪氨酸酶载体和MVA酪氨酸酶载体联合接种与单独用每种载体疫苗接种相比具有优越性。从这一点上说，使用FWPV载体疫苗作为初级疫苗似乎是特别重要的。
材料与方法
细胞与病毒
使用孵化11日的蛋制备原代鸡胚成纤维细胞(CEF)，在含有10％乳白蛋白(Gibco)和5％基本培养基补充剂(BMS-Seromed)的MEM(Gibco)中培养。Hela细胞和Vero细胞在添加有10％胎牛血清(FCS)(Gibco)的DMEM(Gibco)中培养。FWPV-FP9，研究透彻的、减毒株HP1-438(Boulanger et al.，1998)的噬斑分离物在添加有2％FCS的MEM中培养在CEF上。
基因组FWPV DAN的测序
一次冻-融循环后收获培养在CEF上的FWPV-FP9。如早期研究所述，通过超速离心浓缩病毒，并通过25％琼脂糖垫层进行半-纯化(Boulanger et al.，1998)。沉淀重悬于含1％SDS、100μMβ-巯基乙醇和500μg/ml蛋白酶K的0.05M Tris，pH8中，于50℃孵育1hr。酚/氯仿抽提后分离DNA，用乙醇沉淀，并重悬于H2O中。通过在病毒DNA上进行引物步移的方法进行测序。根据Ogawa等(1993)发表的、注册号为M88588的鸽子痘病毒F11L基因的部分序列设计第一个引物(PR30)。用于测序的引物如下：PR30：5′-CTCGTACCTTTAGTCGGATG-3′；PR31：5′-GGTAGCTTTGATTACATAGCCG-3′；PR32：5′-GATGGTCGTCTGTTATCGACTC-3′；和5′-GTCTGATAGTGTATTAGCAGATGTAAAA-3′。
质粒构建
(a)pBSLG.对应于包含在Sutter & Moss(1992)所述质粒pIIILZgpt中序列盒、包含位于晚期痘苗病毒启动子P11控制之下的大肠杆菌lacZ基因和位于早期/晚期痘苗病毒启动子P7.5控制之下的gpt基因的4.2bp的lacZ gpt序列盒，直接插入到pBluescript II SK+质粒(Stratagene)的多克隆位点中，获得质粒pBSLG。
(b)pLGF11.使用分别包含NotI和SmaI限制性位点(带下划线部分)的引物PRF1(5′-GGCCG CGGCCGCCACTAGATGAACATGACACCGG-3′)和PRF2(5′-GGCCC CCCGGGGCATTACGTGTTGTTTGTTGC-3′)作为引物，通过PCR方法扩增长度为471碱基对(bp)的基因组病毒flank 1序列。该片段插入到事先用相同酶切割的pBSLG中，产生pBSLGF11。使用分别包含PstI和SalI限制性位点的引物PRF3(5′-GGCCC CTGCAGGCAACAAACAACACGTAATGC-3′)和PRF4(5′-CGCCC GTCGACCTTCTTTAGAGGAAATCGCTGC)扩增flank 2(534bp)。该片段插入到事先用两种酶消化的pBSLGF11中，产生pLGF11。
(c)pIIIV7.5F11Rep和pLGFV7.5.使用分别包含SnaBI和NotI限制性位点(带下划线部分)的引物PRF5(5′-GGCCC TACGTAGCAACAAACAACACGTAATGC-3′)和PRF6(5′-GGCC GCGGCCGCCTCTATGTTTTTGTAGATATCTTTTTCC-3′)，通过PCR方法扩增长度为263bp的、对应于flank 2 5′末端重复的序列。该片段插入到事先用相同的限制酶消化的质粒pIIIdhrP7.5(Staib et al.，2000)中痘苗病毒P7.5启动子序列的下游。然后通过用PstI消化将flank 2-重复-P7.5启动子序列盒从质粒中切除，用Klenow聚合酶处理，并插入到pLGF11的SmaI位点中，产生插入质粒pLGFV7.5。
(d)pLGFV7.5-mTyr.使用质粒pLGFV7.5中痘苗病毒P7.5启动子序列下游的单一PmeI位点，将编码小鼠酪氨酸酶的基因插入到质粒中。用NheI和NotI消化质粒pZeoSV2+/muTy(Drexler et al.，未发表结果)。用Klenow聚合酶处理所需的片段，并插入到pLGFV7.5中的平末端PmeI限制性位点，产生质粒pLGFV7.5-mTyr。
制备突变FWPV病毒
使用lipofectin(Gibco)，使感染FWPV FP9的CEF转染质粒pLGF11。收获病毒，并铺在包含霉酚酸、黄嘌呤和次黄嘌呤的底层琼脂(MHX-培养基)上。形成β-半乳糖苷酶阳性噬斑的病毒通过涂布Xgal变得可见，噬斑在选择培养基中纯化两次。LacZ/gpt+病毒不用选择培养基进一步纯化，直至获得100％蓝色噬斑。
病毒DNA的PCR分析
如以前所述(Boulanger et al.，1998)，用蛋白酶K处理，从感染不同选定病毒分离物的CEF中分离总DNA，并通过PCR方法使用引物PRF1和PRF4进行分析，验证wt序列的存在；使用引物PRF1和PRF2进行分析，验证DNA的存在。
病毒生长分析
用wt病毒或F11L突变体以0.05pfu/细胞的感染复数感染铺满的CEF，设3个重复。1hr后除去接种物，更换为新鲜的培养基。感染后不同时间，从孵箱中取出烧瓶，并保存于-80℃。通过噬斑测试法低速使病毒悬液澄清后测定滴度。
制备重组病毒
感染FWPV FP9的CEF转染线形化的pLGFV7.5-mTyr质粒DNA(图2)。重组病毒在选择培养基中纯化三次。Flank 2和flank 2重复之间发生新的同源重组，使lacZgpt亚序列盒丢失，已经在CEF上增殖一次的蓝色噬斑分离物进一步在不存在选择培养基的条件下纯化。然后对形成白色噬斑的病毒进行噬斑纯化。如前所述通过PCR方法验证所获得的克隆，其中使用对lacZ序列特异的2个引物(PR43：5′-GACTACACAAATCAGCGATTTCC-3′和PR44：5′-CTTCTGACCTGCGGTCG-3′)再进行一次PCR，以便评价选择序列盒的存在。
F11L基因的序列分析
FWPV-F11L基因位于病毒基因组的中央区域(图1B)。因为适应CEF的痘苗病毒株MVA的基因组中的各阅读框是断开的(Antoine et al.，1998)，我们推测该基因可能不是FWPV复制所必需的。鸽子痘病毒中直向同源F11L基因的C末端部分序列，以及编码F12L鸽子痘病毒直向同源物的完整基因与F13L直向同源物的部分序列都是公知的(Ogawa et al.，1993；注册号M88588)。这一发表的序列和包含全部F13L直向同源物的FWPV序列重叠，和几乎全部F12L直向同源物重叠(Calvert etal.，1992；注册号M88587)。两个序列重叠2598bp，表现出100％的核苷酸相同性。假设F11L直向同源物在鸽子痘病毒和禽痘病毒之间也是高度保守的，使用部分鸽子痘F11L序列(453bp)设计用于FWPV基因测序的第一个引物(PR30)(图1A)。使用该引物获得的序列(488bp)和发表的鸽子痘序列表现出100％的核苷酸相同性。使用新的序列设计下列引物(PR31至33)，以产生覆盖F11L基因序列两次的重叠(图1A)。获得了FWPVF11L ORF中的最后1254bp序列(图1A)。和发表的FWPV的全部基因组序列(Afonso et al.，2000)相比较，结果表明该序列和发表的直向同源FWPV F11L基因FPV110的序列相同。
痘苗病毒MVA中F11L编码序列的阅读框漂移说明F11L可能是非必需基因，从而可能用作插入位点。但是，我们使用GeneStream Align程序对FWPV F11L蛋白(451个氨基酸)的分析表明：和痘苗病毒株Kopenhagen的直向同源物(354个氨基酸)相比仅有18.6％的氨基酸相同性，说明两种病毒具有不同的性质。在可能性必要F11L基因功能的筛选中，我们通过BLAST发现没有重要的其他同源物。FWPV和痘苗病毒蛋白中都没有信号序列或跨膜结构域。
制备带有突变F11L的活FWPV病毒
为了确定FWPV-F11L能否用作新的插入位点，我们通过插入破坏编码F11L序列的方法构建了突变病毒。使用包含旁侧带有2个FWPV F11L ORF序列的lacZ序列盒的质粒，制备重组病毒，由于它们在霉酚酸存在的条件下在Xgal涂层下生长，从而对其进行选择。重组子可以从发生在flank 1和flank 2中的双重组事件获得，其产生稳定的重组病毒；或通过发生在一个旁侧基因序列中的单重组事件获得，其产生中间重组病毒基因组。在后一情况下，在不存在选择培养基条件下的进一步传代是必要的，其使得wt病毒呈现为白色噬斑，直至获得只呈现蓝色噬斑的稳定重组病毒。使用用于产生旁侧序列的外部引物(PRF1和PRF4)进行PCR，分析连续病毒分离物的基因型。通过优选扩增基因组wt序列即较短的PCR产物来检测wt病毒污染的存在，使得测试非常灵敏。病毒克隆F2(图3A)在4次噬斑纯化后丢失wt基因序列(克隆F2.1.2.1.1)。病毒克隆F15在3次噬斑纯化后只产生蓝色噬斑(F15.1.1.1)，但经PCR鉴定仍含有wt序列(图3A)。该病毒克隆(F15.1.1.1.1)通过3次连续传代扩增后，CEF有限稀释仍有病毒表现出白色噬斑。
为了加速重组病毒的分离，我们测试了用线形化质粒DNA的转染，其为Kerr &Smith(1991)建议的方法，用于减少痘苗病毒诱变过程中单交换事件的发生，减少来自于病毒中不稳定单交换中间体的质粒的维持。使用线形化质粒制备重组病毒是可以实现的，因为发生双重组事件，并随后直接产生稳定的重组子基因组。事实上，使用线形化质粒制备的病毒克隆F9、F10和F16即使在第一次噬斑纯化循环后也不表现出可检测的wt基因序列(图3B)。病毒克隆F8仅需要一次更多的噬斑纯化，以明显不含有wt病毒(图3B)。另外，三次CEF中的增殖循环后F9.1.1.1.1的噬斑滴度测定表明不再掺杂有wt病毒。
带有突变F11L的病毒提外培养物的效力
带有突变F11L的病毒的连续产生表明F11L基因序列不是必要的。为了确定其失活是否能够干扰病毒的生长，将突变病毒克隆F9.1.1.1加以增殖，测试CEF中的多步生长，和wt FWPV相比较(图4)。两株病毒表现出几乎相同的复制动力学，产生等量的感染性子代。
F11L作为插入靶点促使重组基因的稳定表达
因为已经确立F11L是非必需的，该基因的破坏不干扰病毒的生长，因此人们认为F11L基因位点是适当的插入位点。质粒pLGF11用于构建质粒载体(pLGFV7.5)，以便将外源基因和位于痘苗病毒P7.5启动子控制之下的lacZ gpt选择亚序列盒一起插入到FWPV基因组(图2)。质粒还含有flank 2序列的重复(图2)，以随后从重组病毒中除去亚序列盒。由于第一外源基因通过将编码酪氨酸酶这种酶的DNA序列插入pLGFV7.5而获得，所述酪氨酸酶是一种感兴趣的抗原，用于实验性接种，以对抗黑素瘤(Drexler et al.，1999)。酪氨酸酶参与黑色素的生物合成途径。表达该酶的细胞积累黑色素而变黑。该性质提供了根据酪氨酸酶的表达和其功能进行筛选的方法。用pLGFV7.5-mTyr转染后，选择了5个重组病毒克隆进行进一步分析。还可使用在产生带有突变F11L的病毒的过程中已证实非常有效的线形化质粒DNA来制备重组病毒。病毒克隆MT22(数据未列出)和MT31(图5)在选择培养基存在的条件下，只进行一次噬斑纯化后不存在可检测的wt病毒序列(MT31.1，Spur 1，图5B)。在这一阶段，两个病毒克隆的基因组DNA制剂都表明存在不再含有可检测标记基因序列(图5B中2880bp基因产物)、同时含有选定的lacZ gpt阳性基因型(7282bp)的重组病毒基因组，所述lacZ gpt阳性基因型很难通过这种PCR反应加以检测(参见克隆31.1.1，图5B，第3泳道)，但通过PR43-44-PCR得以检测(图5C)。从两种克隆经第四次噬斑纯化，即在不存在选择培养基的条件下仅进行一次噬斑纯化的病毒DNA中不能扩增得到标记序列(图5C)。CEF感染后，所有的5株重组病毒都产生功能性的酪氨酸酶(图5D)。
另外，感染的HeLa细胞和Vero细胞中也表现出了黑色素的特异合成，这两种细胞对于FWPV都是不许可的。这些哺乳动物细胞中生成黑色素的量似乎比CEF感染要少。这可能是由于这些细胞中缺少病毒复制，或酪氨酸酶的表达降低，或黑色素合成途径不是那么有效(数据未列出)。为了评价酪氨酸酶插入的遗传稳定性，所有5种重组病毒分离物在CEF上进行四次连续多步骤生长传代，通过噬斑滴定底层琼脂对病毒子代进行分析。在每株重组病毒中，验证10个不同噬斑分离物中的酪氨酸酶表达。在所有样品中都检测到了黑色素表达。说明每株病毒仍能产生功能性的重组酶(表1)。六次传代后进行同样的测试。仅有5株重组病毒之一的一个噬斑分离物不能再产生功能性酪氨酸酶(表1)。病毒DNA的PCR分析表明该病毒克隆的基因组可能仍包含重组的全长基因序列。这表明很可能是酪氨酸酶基因的表达被一个或多个点突变所灭活(数据未列出)。
痘苗病毒F11L ORF潜在地编码一种蛋白质，其不具有能够推测其功能的同源物或特征性基序。因此，FWPV的F11L直向同源物可能是非必需的。在本发明中，通过将选择序列盒插入到包含标记基因(lacZ)和可选择基因(gpt)的FWPV-Gen中，验证了这一假设。包含该序列盒而不包含wt基因序列的重组病毒的产生说明直向同源的全长FWPV基因对于FWPV的生长不是必需的。突变病毒和wt病毒一样生长(图4)，说明F11L基因位点是重组基因的合适插入位点。因此，我们使用该位点，以成功地产生稳定表达黑素瘤模式抗原酪氨酸酶的FWPV病毒。
在用作载体疫苗或进行进一步遗传改造的情况下，标记或选择基因在重组病毒中的稳定表达是不合适的。在我们的FWPV质粒载体中，选择亚序列盒旁侧具有重复序列，以便能够随后消除。这种重组子的制备首先需要分离仅含有选择亚序列盒而不含wt序列的重组病毒，然后分离丢失选择亚序列盒的稳定重组子。因此，分离策略的效率对于在合理长的时间内回收最终的重组子来说是重要的。和早期研究(Leong et al.，1994；Sutter & Moss，1992)相同，我们发现将报道基因和选择基因联用是简单且非常有效的选择方法。通过用线形化质粒DNA进行转染进一步改进了该策略。质粒DNA和病毒基因组之间的重组可以通过单交换的手段发生，使全部质粒序列整合到病毒基因组中(Spyropoulos et al.，1988；Falkner & Moss，1990；NazarianA& Dhawale，1991)，或者通过双重组发生。根据Spyropoulos等(1988)，两种事件的频率是类似的。在我们这里，如果使用线形化的质粒DNA，则消除任何wt序列所需的噬斑纯化次数大大减少(图3和5)。该技术不但节约时间，而且降低多次传代过程中病毒基因组中不可避免地发生整合随机突变的危险性。如Nazarian &Dhawale(1991)所提出的，用线形化质粒转染后的总重组效率较低，就象使用环形质粒一样。但是，在我们这里，使用线形化质粒没有降低重组效率，因为在制备带有突变F11L的病毒时，我们得到这样的比例：使用环形质粒转染后获得1个蓝色噬斑，而使用线形化质粒转染后获得5个蓝色噬斑。另外，在制备其他重组病毒时我们得到了1和10之间的比例(未发表)。因此，我们的结果证实了以前的数据(Spyropoulos et al.，1982)，表明：如果单交换重组子的形成在非同源区域受到质粒线形化的阻碍，则痘苗病毒中的总重组效率不会发生明显变化。
开发合适病毒载体疫苗的一个重要方面是重组病毒的稳定性，所述稳定性基本取决于所寻求的插入位点。病毒酪氨酸激酶基因位点对于制备重组禽痘病毒来说似乎是不合适的，尽管它是用于制备重组痘苗病毒的常规插入位点(Scheiflinger et al.，1997；Amano et al.，1999)。使用F11L作为靶点得到的酪氨酸酶-重组FWPV病毒的稳定性可以通过验证黑色素的合成，即简单地验证细胞沉淀的颜色而容易地进行监测(图5D和表1)。在CEF上6次传代之后，50个噬斑分离物中只有1个不表达功能性重组基因，说明了高水平的基因组稳定性。
表1：5株重组病毒中小鼠酪氨酸酶表达的稳定性
n*                  每个重组子的10个噬斑中表达小鼠酪氨酸酶的分离物数目
MT22.2.1.3.1.1  MT22.2.1.4.1.1 MT22.2.1.5.1.1  MT31.1.1.1.1.1  MT31.1.1.4.1.1
4 10  10 10  10  10
6 10  9 10  10  10
*n＝在CEF中以低复数进行传代的次数
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                             序列表
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<130>P15821
<140>
<141>2003-05-13
<150>DE 102 21 411.5
<151>2002-05-14
<160>12
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(20)
<223>PR30
<400>1
ctcgtacctt tagtcggatg                                                 20
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(22)
<223>PR31
<400>2
ggtagctttg attacatagc cg                                              22
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(22)
<223>PR32
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gatggtcgtc tgttatcgac tc                                              22
<210>4
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<212>DNA
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<220>
<221>引物
<222>(1)..(29)
<223>PR33
<400>4
gtctgatagt gtattagcag atgtaaaac                                      29
<210>5
<211>23
<212>DNA
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<220>
<221>引物
<222>(1)..(23)
<223>PR43
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gactacacaa atcagcgatt tcc                                            23
<210>6
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(17)
<223>PR44
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cttctgacct gcggtcg                                                    17
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<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>Primer
<222>(1)..(34)
<223>PRF1
<400>7
ggccgcggcc gccactagat gaacatgaca ccgg                                 34
<210>8
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>PRF2
<400>8
ggccccccgg ggcattacgt gttgtttgtt gc                                   32
<210>9
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(32)
<223>PRF3
<400>9
ggcccctgca ggcaacaaac aacacgtaat gc                                   32
<210>10
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(33)
<223>PRF4
<400>10
cgcccgtcga ccttctttag aggaaatcgc tgc                                  33
<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(32)
<223>PRF5
<400>11
ggccctacgt agcaacaaac aacacgtaat gc                                   32
<210>12
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(40)
<223>PRF6
<400>12
ggccgcggcc gcctctatgt ttttgtagat atctttttcc                            40

Claims (25)

1.一种重组禽痘病毒(FWPV)，在F11L基因中包含至少一个外源DNA插入物。
2.根据权利要求1的重组禽痘病毒(FWPV)，其中所述外源DNA具有至少一个外源基因，任选地与调控外源基因表达的序列组合。
3.根据权利要求1或2的重组禽痘病毒(FWPV)，其中所述外源DNA包括调控序列，优选痘病毒特异性启动子。
4.根据前面权利要求中一项或多项的重组禽痘病毒(FWPV)，其中所述外源基因编码多肽，优选治疗用多肽；和/或编码可检测标记和/或是可选择基因。
5.根据权利要求4的重组禽痘病毒(FWPV)，其中所述治疗用多肽是病毒、细菌、或寄生虫病原体或肿瘤细胞的组分。
6.根据权利要求5的重组禽痘病毒(FWPV)，其中所述治疗用多肽是HIV、分支杆菌或恶性疟原虫的组分。
7.根据权利要求5的重组禽痘病毒(FWPV)，其中所述治疗用多肽是黑素瘤细胞的组分。
8.根据前面权利要求中一项或多项的重组禽痘病毒(FWPV)，其中所述可检测标记是β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、鸟嘌呤核糖转移酶、荧光素酶或绿色荧光蛋白。
9.根据权利要求8的重组禽痘病毒(FWPV)，其中所述标记基因和/或可选择基因可以被消除。
10.根据前面权利要求中一项或多项的重组禽痘病毒(FWPV)，其中禽痘病毒基因组中限定为核苷酸位置131.860-131.870的基因组区域是整合入F11L基因同源物中的优选位点。
11.一种DNA载体，包含根据前面权利要求中一项或多项的重组禽痘病毒(FWPV)或其在F11L基因中包含至少一个外源DNA插入物的功能部分，还优选包含使载体在原核或真核细胞中复制的复制子，以及在原核或真核细胞中可选择的选择基因或标记基因。
12.一种药用组合物，包含根据前面权利要求中一项或多项的重组禽痘病毒(FWPV)或根据权利要求11的DNA载体与药学上可接受的辅助试剂和/或载体。
13.根据权利要求12的药用组合物，为疫苗形式。
14.根据前面权利要求中一项或多项的重组禽痘病毒、DNA载体或药用组合物用于治疗传染病或肿瘤疾病的用途。
15.制备根据前面权利要求中一项或多项的重组禽痘病毒或DNA载体的方法，其中外源DNA通过重组DNA技术导入禽痘病毒的F11L基因中。
16.根据权利要求15的方法，其中导入包括下述步骤：使病毒DNA和包含F11L特异序列的外源DNA发生同源重组，然后增殖和分离重组病毒或DNA载体。
17.包含根据前面权利要求中一项或多项的重组DNA载体或重组病毒的真核细胞或原核细胞。
18.根据权利要求17的原核细胞，它是细菌细胞，优选大肠杆菌细胞。
19.根据权利要求18的真核细胞，它是酵母细胞；禽类细胞，优选鸡细胞；或来源于哺乳动物的细胞，优选人类细胞。
20.一种免疫哺乳动物，优选人类的方法，包括下述步骤：
a)用治疗有效量的、根据权利要求1-10中任一项的禽痘病毒、根据权利要求11的DNA载体或根据权利要求12或13的药用组合物引发哺乳动物的免疫；
b)1周至8个月后，任选地重复所述步骤a)1至3次；和
c)用治疗有效量的、包含与a)中禽痘病毒、DNA载体或药用组合物相同的外源DNA的另一病毒载体加强哺乳动物的免疫。
21.根据权利要求20的方法，其中在加强之前进行两次引发步骤。
22.根据权利要求21的方法，其中引发步骤在治疗开始和免疫第3周至第5周，优选第4周进行；其中加强步骤在免疫第11周至第13周，优选第12周进行。
23.根据权利要求20-22中一项或多项的方法，其中作为其他病毒载体，使用重组MVA、其他无毒痘苗病毒和痘病毒载体，优选重组形式的痘苗病毒NYVAC、CV-I-78、LC16m0或LC16m8；重组副痘病毒，优选减毒的Orf病毒D1701；腺病毒，优选人腺病毒5；正粘病毒，优选流感病毒；疱疹病毒，优选人或马疱疹病毒；或α病毒，优选Semliki Forest病毒；Sindbis病毒或马脑炎病毒(-VEE)。
24.包含下述组分的组合制剂：
a)根据权利要求1-10中任一项的禽痘病毒，根据权利要求11的DNA载体，
或根据权利要求12或13的药用组合物，和
b)包含与a)中禽痘病毒或DNA载体相同的外源DNA的另一种病毒载体。
25.根据权利要求24的组合制剂，其中作为其他病毒载体，使用重组MVA、其他无毒痘苗病毒和痘病毒载体，优选重组形式的痘苗病毒NYVAC、CV-I-78、LC16m0或LC16m8；重组副痘病毒，优选减毒的Orf病毒D1701；腺病毒，优选人腺病毒5；正粘病毒，优选流感病毒；疱疹病毒，优选人或马疱疹病毒；或α病毒，优选SemlikiForest病毒；Sindbis病毒或马脑炎病毒(-VEE)。
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