DE10221411A1 - Rekombinantes Fowlpox-Virus - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Fowlpox-Virus (FWPV) sowie einen DNA-Vektor, der Gensequenzen für ein solches rekombinantes Fowlpox-Virus enthält. Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das rekombinante Fowlpox-Virus oder einen DNA-Vektor umfasst, die Verwendung des rekombinanten Fowlpox-Virus zur Behandlung von Infektionskrankheiten oder Tumorerkrankungen sowie ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Fowlpox-Virus oder DNA-Vektors. Zuletzt betrifft die vorliegende Erfindung Eukaryontenzellen oder Prokaryontenzellen, die den rekombinanten DNA-Vektor oder das rekombinante Fowlpox-Virus enthalten. Die Erfindung beruht auf der Identifikation des FWPV-F11L-Gens als neue Isertionsstelle für Fremd-DNA.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Fowlpox-Virus (FWPV) sowie einen DNA-Vektor, der Gensequenzen für ein solches rekombinantes Fowlpox-Virus enthält. Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das rekombinante Fowlpox-Virus oder einen DNA-Vektor umfasst, die Verwendung des rekombinanten Fowlpox-Virus zur Behandlung von Infektionskrankheiten oder Tumorerkrankungen sowie ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Fowlpox-Virus oder DNA- Vektors. Zuletzt betrifft die vorliegende Erfindung Eukaryontenzellen oder Prokaryontenzellen, die den rekombinanten DNA-Vektor oder das rekombinante Fowlpox-Virus enthalten.
- Pockenviren verschiedener Gattungen wurden bereits als rekombinante Impfstoffvektoren etabliert (Moss, 1996; Paoletti, 1996). Von Vogelpockenviren, einschließlich Geflügelpockenviren (Fowlpox-Viren bzw. FWPV) als prototypischem Mitglied, ist bekannt, dass sie sich nur in Vogelzellen replizieren. In Säugerzellen ist die Virusvermehrung je nach dem Zelltyp zu verschiedenen Zeitpunkten im Replikationszyklus blockiert, aber es erfolgt eine virus-spezifisch gesteuerte Genexpression (Taylor et al., 1988; Somogyi et al., 1993). Diese Eigenschaft wurde ausgenutzt, um rekombinante Kandidaten-Vogelpockenviren als sichere, nicht replizierende Vektoren für die Impfung von Säugern, einschließlich Menschen, gegen Infektionskrankheiten und Krebs zu entwickeln (Wang et al., 1995; Perkus et al., 1995; Roth et al., 1996). Einige dieser Impfstoffe hat man bereits in klinischen Phase I- (Cadoz et al., 1992; Marshall et al., 1999, Berencsi et al., 2001) oder Phase II-Studien getestet (Belshe et al., 2001).
- Zukünftige, komplexere Impfstrategien erfordern wahrscheinlich die gleichzeitige Expression verschiedener Antigene oder die Expression einer Kombination von Antigenen und immuncostimulatorischen Molekülen (Leong et al., 1994; Hodge et al., 1999). Diese Gene können entweder als einzelne Kassette an einer Stelle des Virusgenoms inseriert werden oder nacheinander eingefügt werden, so dass bereits konstruierte Vektorviren kontinuierlich verbessert werden können. Im letzteren Fall ist es wünschenswert, die Wahl unter verschiedenen stabilen Insertionsstellen zu haben und die Selektionsmarker eliminieren zu können, damit die gleiche Selektionsstrategie für die Insertion an verschiedenen Stellen wiederholt werden kann. Das Vorliegen eines Markergens ist zudem bei einem Impfstoff für den Gebrauch bei Menschen nicht zu empfehlen. Mittels Shotgun-Insertionsstrategien hat man mehrere Insertionsstellen im FWPV-Genom identifiziert (Taylor et al., 1988; Jenkins et al., 1991). Zudem hat man die Fremdgen-Insertion im Virusgenom in den Bereich der terminalen Inverted Repeats (Boursnell et al., 1990), zu nicht essentiellen Genen, wie dem Thymidinkinasegen (Boyle & Coupar, 1988) oder zu Bereichen zwischen kodierenden Gensequenzen (Spehner et al., 1990) gelenkt.
- Mehrere Strategien zur Erzeugung von rekombinanten Viren, aus denen das zur Plaqueisolation verwendete Markergen nach der Verwendung deletiert worden war, wurden beschrieben.
- Die erste Strategie ist das von Falkner und Moss (1990) beschriebene, häufig eingesetzte transiente dominante Selektionsverfahren, bei dem der Selektionsmarker in der Plasmidsequenz außerhalb der Insertionskassette vorliegt. Rekombinante Viren, die durch ein Einfachcrossover-Ereignis erzeugt werden und die gesamte Plasmidsequenz enthalten, werden in Anwesenheit von Selektionsmedium erhalten. Diese rekombinanten Viren sind aufgrund des Vorliegens der wiederholten Sequenzen der flankierenden Regionen instabil. In Abwesenheit von Selektionsmedium wird das zwischen diesen Wiederholungen liegende Markergen nach einer zweiten Rekombination deletiert, die entweder zur Produktion des Wildtyp-(wt-)Virus oder eines stabilen rekombinanten Virus führt. Letzteres muss wieder nach dem Plaqueverfahren isoliert und anschließend durch PCR oder Southern-Blotting identifiziert werden.
- Ein zweites Verfahren basiert auf der Beobachtung, dass bei rekombinantem FWPV, das das Zielprotein und β-Galactodsidase jeweils unter der Kontrolle des P7.5-Promotors in direkt wiederholter Orientierung exprimierte, eine homologe Rekombination zwischen den Promotorwiederholungen erfolgte, wodurch das lacZ-Gen deletiert wurde (Spehner et al., 1990). Daher wurden weiße Plaques von rekombinanten Viren gebildet, die das Markergen verloren hatten. Eine ähnliche Strategie ist entwickelt worden, um rekombinante MVA- Viren unter Verwendung des regulatorischen Vacciniavirus K1L-Gens als transienten Selektionsmarker herzustellen, der mittels intragenomischer homologer Rekombination entfernt wird (Staib et al., 2000).
- FWPV wächst langsamer als das Vacciniavirus. Die Aufrechterhaltung der vollen Replikationsfähigkeit von rekombinanten Viren ist für Erzeugung wie auch Verwendung potentieller FWPV-Impfviren von entscheidender Bedeutung.
- Gegenüber den bisher existierenden Vektoren liegen der vorliegenden Erfindung die Aufgaben zu Grunde, ein rekombinantes Fowlpox-Virus bereitzustellen, das eine erhöhte Vektorstabilität nach Insertion von Fremd-DNA sowie eine höhere Sicherheit bei Einsatz als Impfstoffvektor ergibt und dabei die volle Replikationsfähigkeit und optimale Effizienz während der Selektion rekombinanter Viren beibehält.
- Diese Aufgaben werden durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
- Die erfindungsgemäße Lösung beruht auf der Identifikation der FWPV-F11L-Gens als neue Insertionsstelle für Fremd-DNA. F11L-mutierte Viren replizierten sich nach Infektion von CEF (chicken embryo fibroblasts) effizient. Die Verwendbarkeit von F11L- Vektorplasmiden, die eine transiente Expression des Markergens ermöglichen, wurde durch die schnelle Produktion rekombinanter FWPV-Viren gezeigt, die das Tumormodellantigen Tyrosinase stabil produzieren.
- Das F11L-Gen von FWPV ist an sich bereits bekannt und genau identifiziert. In der Publikation von Afonso et al. 2000 ist das F11L-Gen-Homolog präzise als ORF FPV110 mit der Genomposition 131.387-132.739 identifiziert. Afonso et al. offenbaren jedoch nicht die Eigenschaft des F11L-Gens als Integrationsort für Fremd-DNA.
- Die Verwendung des F11L-Gens als Integrationsort für Fremd-DNA bietet einige unerwartete Vorteile: zunächst hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass die rekombinanten Fowlpox-Viren, die eine oder mehrere Insertionen von Fremd-DNA im F11L-Gen enthalten, eine gegenüber herkömmlichen Vektoren erhöhte Vektorstabilität aufweisen. Zudem haben sich die erfindungsgemäßen rekombinanten FWPV als in der in vivo Anwendung als Impfstoffvektoren sehr sicher herausgestellt. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Insertion in das F11L-Gen ist darin zu sehen, dass die Insertion an einer beliebigen Stelle des Gens vorgenommen werden kann.
- Gemäß eines Grundgedankens stellt die vorliegende Erfindung folglich ein rekombinantes Fowlpox-Virus (FWPV) bereit, das zumindest eine Insertion einer Fremd-DNA im F11L- Gen enthält. Die Insertion erfolgt, wie bereits oben angesprochen, in Position 131.387-132.739 des FWPV-Genoms. Obwohl die Insertion grundsätzlich an jeder beliebigen Stelle des F11L-Gens erfolgen kann, wird eine Insertion in dem durch die Nukleotidpositionen 131.860-131.870 im Fowlpoxvirusgenom definierten Genomabschnitt bevorzugt.
- Als Fremd-DNA wird im Kontext der vorliegenden Erfindung generell jegliche DNA bezeichnet, die mit Hilfe gentechnologischer Methoden in die DNA eines Organismus, einer Zelle oder eines Virus etc. eingebracht wird, aus der/dem sie nicht stammt.
- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Fremd-DNA zumindest ein Fremdgen, wahlweise in Kombination mit einer Sequenz zur Regulation der Expression des Fremdgens.
- Das im erfindungsgemäßen rekombinanten Fowlpox-Virus (FWPV) enthaltene Fremdgen kodiert für ein Polypeptid, das bevorzugt therapeutisch einsetzbar ist und/oder kodiert für einen nachweisbaren Marker und/oder ist ein Selektionsgen.
- Unter einem Reportergen, wie hierin verwendet, werden Gene bezeichnet, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer oder histochemischer Methoden nachweisen lassen. Synonyme für den Begriff Reportergen sind Indikatorgen sowie Markergen.
- Unter einem Selektionsgen bzw. Selektionsmarker werden im Kontext der vorliegenden Erfindung Gene bezeichnet, die Viren bzw. Zellen, in denen die entsprechende Genprodukte gebildet werden, einen Wachstumsvorteil bzw. Überlebensvorteil gegenüber anderen Viren bzw. Zellen verschaffen, die das entsprechende Genprodukt nicht synthetisieren. Vorzugsweise verwendete Selektionsmarker sind die Gene für E. coli Guanin- Phosphoribosyltransferase, E. coli Hygromycin-Resistenz und Neomycin-Resistenz.
- Die Fremd-DNA-Sequenz kann ein Gen sein, das beispielsweise für ein pathogenes Mittel bzw. für einen Bestandteil eines pathogenen Mittels kodiert. Unter pathogenen Mitteln sind Viren, Bakterien und Parasiten zu verstehen, die eine Krankheit verursachen können, ebenso wie Tumorzellen, die sich unkontrolliert in einem Organismus vermehren und somit zu einem pathologischen Wachstum führen können. Beispiele derartiger pathogener Mittel sind in Davis, B. D. et al., (Microbiology, 3. Ausgabe, Harper International Edition) beschrieben. Bevorzugte pathogene Mittel sind Bestandteile von Influenza-Viren oder Masern und von Respiratory-Syncytial-Viren, von Dengue-Viren, von humanen Immundefizienzviren, beispielsweise HIV I und HIV II, von humanen Hepatitis-Viren, beispielsweise HCV und HBV, von Herpes-Viren, von Papilloma-Viren, vom Malariaparasiten Plasmodium falciparum und von den Tuberkulose verursachenden Mykobakterien.
- Spezielle Beispiele von Bestandteilen pathogener Mittel sind z. B. Hüllproteine von Viren (HIV-Env, HCV-E1/E2, Influenzavirus-HA-NA, RSV-F-G), regulatorische Virusproteine (HIV-Tat-Rev-Nef, HCV-NS3-NS4-NS5), das Protective Antigen Protein von Bacillus anthracis, Merozoite Surface Antigen und Circumsporozoite Protein von Plasmodium falciparum, zu nennen.
- Bevorzugte Gene, die Tumorassoziierte Antigene kodieren, sind die, die für Melanomassoziierte Differenzierungs-Antigene, beispielsweise Tyrosinase, Tyrosinase-verwandte Proteine 1 und 2, von Cancer-Testes-Antigenen bzw. Tumor-Hoden-Antigenen, beispielsweise MAGE-1, -2, -3 und BAGE, für nicht mutierte Shared Antigene bzw. Antigene, die von mehreren Tumortypen geteilt werden, die auf Tumoren überexprimiert werden, beispielsweise Her-2/neu, MUC-1 und p53, kodiert werden.
- Besonders geeignet sind Polypeptide, die ein Bestandteil von HIV, Mykobakterium spp. oder Plasmodium falciparum oder Bestandteil einer Melanomzelle sind.
- Als Bestandteile sind allgemein Bestandteile des Vorgenannten zu verstehen, die immunogene Eigenschaften aufweisen, dass heißt dazu in der Lage sind, bei Säugern, insbesondere Menschen, eine Immunreaktion hervorzurufen (z. B. Oberflächenantigene).
- Damit die Fremd-DNA-Sequenz oder das Gen exprimiert werden kann ist es notwendig, daß Regulatorsequenzen, die zur Transkription des Gens erforderlich sind, auf der DNA vorliegen. Derartige Regulatorsequenzen (als Promotoren bezeichnet) sind dem Fachmann bekannt, beispielsweise kann ein Pockenvirus-spezifischer Promotor eingesetzt werden.
- Vorzugsweise ist der nachweisbare Marker eine beta-Galactosidase, beta-Glucoronidase, eine Luziferase oder ein Grün-Fluoreszierendes-Protein.
- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Markergen und/oder Selektionsgen eliminierbar. Wie bereits eingangs ausgeführt, ist diese Eigenschaft von großem Vorteil, weil damit die gleiche Selektionsstrategie für die Insertion an verschiedenen Stellen wiederholt werden kann. Das Vorliegen eines Markergens ist zudem bei einem Impfstoff für den Gebrauch bei Menschen nicht zu empfehlen. Die Deletion dieser Gensequenzen aus dem Genom der endgueltigen rekombinanten Viren erfolgt quasi "automatisch" durch eine intragenomische homologe Rekombination zwischen identischen Gensequenzen die die Marker-Selektionsgen-Expressionskassette flankieren.
- Gemäß einem weiteren Grundgedanken stellt die vorliegende Erfindung einen DNA- Vektor bereit, der ein erfindungsgemäßes rekombinantes Fowlpox-Virus oder funktionelle Teile hiervon, die zumindest eine Insertion einer Fremd-DNA im F11L-Gen enthalten, und weiterhin bevorzugt ein Replikon zur Replikation des Vektors in einer Pro- oder Eukaryontenzelle und ein in Pro- oder Eukaryontenzellen selektierbares Selektionsgen oder Markergen, enthält. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit prokaryontischen und eukaryontischen Wirten sind in Sambrook, et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York (1989), beschrieben.
- Die DNA-Vektoren der vorliegenden Erfindung spielen die Rolle einer eigenständigen, vermehrungsfähigen Einheit, die in geeigneten Wirtszellen die Fähigkeit zur DNA- Replikation besitzen. Die nicht replizierfähige Fremd-DNA wird somit passiv mitrepliziert und kann sodann zusammen mit dem Vektor isoliert und gereinigt werden. Neben dem erfindungsgemäßen rekombinanten Fowlpox-Virusgensequenzen kann der DNA-Vektor noch folgende Sequenzelemente enthalten: Enhancer zur Verstärkung der Genexpression, Promotoren, die die Voraussetzung für die Genexpression darstellen, Replikationsursprünge, Reportergene, selektierbare Gene, Spleißsignale und Verpackungssignale.
- Der erfindungsgemäße DNA-Vektor dient in erster Linie als Transfervektor, um in einer virusinfizierten Zelle über homologe Rekombination die Insertion von Fremdgenen zu ermöglichen. Er wird in der Regel im Kontext einer Fowlpox-Virusinfektion eingesetzt, da die Regulationselemente vom Vorhandensein anderer Virusproteine abhängig sind.
- Erfindungsgemäß wird das rekombinante Fowlpox-Virus oder der DNA-Vektor in einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt, die diese in Verbindung mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen und/oder Trägerstoffen umfasst. Die pharmazeutische Zusammensetzung ist vorzugsweise eine Vakzine.
- Um eine Vakzine herzustellen, werden die gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugten FWPV in eine physiologisch verträgliche Form umgewandelt. Dies kann auf Grundlage der vieljährigen Erfahrung in der Zubereitung von Vakzinen, die zur Impfung gegen Pocken verwendet werden, durchgeführt werden (Kaplan, Br. Med. Bull. 25, 131-135 [1969]). Typischerweise werden ungefähr 106-107 Teilchen des rekombinanten FWPV in 100 ml Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) in Gegenwart von 2% Pepton und 1% menschlichen Albumin in einer Ampulle gefriergetrocknet, vorzugsweise in einer Glasampulle. Das Lyophilisat kann Füllmittel bzw. Verdünnungsmittel (wie beispielsweise Mannitol, Dextran, Zucker, Glycin, Laktose oder Polyvinylpyrrolidon) oder andere Hilfsmittel (beispielsweise Antioxidanzien, Stabilisatoren etc.) enthalten, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind. Die Glasampulle wird dann verschlossen bzw. versiegelt und kann vorzugsweise bei Temperaturen unterhalb -20°C für mehrere Monate aufbewahrt werden.
- Zur Vakzinierung kann das Lyophilisat in 0,1 bis 0,2 ml einer wäßrigen Lösung, vorzugsweise physiologischer Salzlösung, gelöst und parenteral verabreicht werden, beispielsweise durch intradermale Inokulation. Die erfindungsgemäße Vakzine wird vorzugsweise intrakutan injiziert. Ein leichtes Anschwellen und eine Rötung und manchmal auch ein Juckreiz kann an der Injektionsstelle auftreten. Der Verabreichungsweg, die Dosis und die Anzahl der Verabreichungen kann vom Fachmann in einer bekannten Weise optimiert werden. Wo dies angebracht ist, ist es zweckdienlich, die Vakzine mehrere Male über eine verlängerte Zeitspanne hinweg zu verabreichen, um ein hohes Niveau von Immunreaktionen gegen das Fremdantigen zu erzielen.
- Die vorgenannten erfindungsgemäßen Gegenstände, d. h. das rekombinante Fowlpox-Virus, der DNA-Vektor oder die pharmazeutische Zusammensetzung werden vorzugsweise zur Behandlung von Infektionskrankheiten oder Tumorerkrankungen, wie sie oben definiert sind, eingesetzt.
- Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Fowlpox-Virus oder DNA-Vektors umfasst das Einbringen von Fremd-DNA in das F11L-Gen eines Fowlpox-Virus durch rekombinante DNA-Techniken. Vorzugsweise erfolgt das Einbringen durch homologe Rekombination der Virus-DNA mit der Fremd-DNA, die F11L- spezifische Sequenzen enthält, gefolgt von einer Vermehrung und Isolierung des rekombinanten Virus oder des DNA-Vektors.
- Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Eukaryontenzellen oder Prokaryontenzellen bereit, die den erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Vektor oder das rekombinante FWPV enthalten. Als Prokaryontenzelle findet vorzugsweise eine Bakterienzelle, bevorzugt E. coli-Zelle, Verwendung.
- Als Eukaryontenzellen können Vogelzellen, bevorzugt Hühnerzellen, oder eine vom Säugetier stammende Zelle, bevorzugt eine humane Zelle, eingesetzt werden.
- Beispielsweise kann der erfindungsgemäße DNA-Vektor in die Zellen durch Transfektion, beispielsweise mittels einer Kalziumphosphat-Ausfällung (Graham et al., Virol. 52, 456-467 [1973]; Wigler et al., Cell 777-785 [1979] mittels Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1, 841-845 [1982]), durch Mikroinjektion (Graessmann et al., Meth. Enzymology 101, 482-492 (1983)), mittels Liposomen (Straubinger et al., Methods in Enzymology 101, 512-527 (1983)), mittels Sphäroblasten (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2163-2167 (1980)) oder durch andere Verfahren eingebracht werden, die dem Fachmann bekannt sind. Die Transfektion mittels einer Kalziumphosphat-Ausfällung wird vorzugsweise angewendet.
- Die vorliegende Erfindung wird nun durch Beispiele und die begleitenden Abbildungen veranschaulicht, die Folgendes zeigen:
- Fig. 1 (A) Primer Walking-Sequenzierstrategie für die Sequenzierung von FWPV-F11L. Die Länge jeder Sequenzreaktion ist dargestellt. (B) Schematische Darstellung des FWPV- Genoms, die die invertierten terminalen Repeats (ITR) und die zentrale Lage des F11L- Gens zeigt, sowie eine Darstellung der Herstellung von F11L-Gensequenzen, die als flankierende Sequenzen für die homologe Rekombination verwendet wurden. Es sind die Positionen entlang des F11L-ORFs für die Primer F1 und F2, die zur Amplifizierung von Flank 1 verwendet wurden, sowie die Primer F3 und F4, die zur Amplifizierung von Flank 2 verwendet wurden, gezeigt.
- Fig. 2 Schematische Karten des Insertionsplasmids pLGFI 1, das zur Herstellung F11Lmutierter Viren verwendet wurde, des Vektorplasmids pLGFV7.5 und von pLGFV7.5- mTyr, das zur Herstellung von FWPV-Tyrosinase-Rekombinanten verwendet wurde. Die von FWPV-F11L stammenden Sequenzen Flank 1 und Flank 2, als schwarze Kästen dargestellt, dirigieren die homologe Rekombination zwischen dem Plasmid und der viralen genomischen DNA. Die E. coli-lacZ- und -gpt-Gene dienen als Selektionsmarker (als schattierte Kästen dargestellt). P7.5 und P11 sind gut charakterisierte Vacciniavirusspezifische Promotoren, deren Transkriptionsrichtung durch Pfeile dargestellt ist. Eine einzigartige PmeI-Restriktionsstelle in pLGFV7.5 kann zur Insertion von Fremdgenen, die unter die Transkriptionskontrolle von P7.5 gebracht werden, verwendet werden. Das Tyrosinase kodierende Gen (mTyr) aus der Maus diente als erstes rekombinantes Modellgen.
- Fig. 3 PCR-Analyse viraler DNA aus F11L-mutierten Viren, die nach Transfektion mit ungespaltener (A) oder linearisierter pLGF11-Plasmid-DNA (B) erzeugt wurden. Die oberen Bilder zeigen das Ergebnis der PCR-Reaktionen unter Verwendung der Primer F1 und F4, die entweder eine Bande mit hohem MG für die rekombinanten Viren (rec.) oder eine Bande mit niedrigem MG für das wt-Virus (wt) ergeben. Die unteren Bilder zeigen die Kontroll-(entr.) PCR-Reaktionen unter Verwendung der Primer F1 und F2, die die jeweilige Menge Virus-DNA in jeder Probe zeigen. Die Anzahl der Plaquereinigungen für jedes Isolat ist beginnend mit 0, was dem anfänglich gepickten Plaqueisolat entspricht, angegeben. pLGF11 wird als Kontroll-Matrizen-DNA eingesetzt; FP9 steht für die wt-Virus- DNA-Kontrolle und UC ist Kontroll-DNA aus nicht infizierten Zellen.
- Fig. 4 Mehrschritt-Wachstumskurven-Experiment. CEF wurden in Dreifachansätzen entweder mit FP9-Virus oder mit dem F11L-Knockout-Virus in einer moi von 0,05 pfu/Zelle angeimpft. Die Dreifachansätze wurden jeweils zu unterschiedlichen Zeiten nach der Infektion geerntet und unter Agar titriert. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen zwischen den Dreifachproben.
- Fig. 5 PCR-Analyse von genomischer DNA aus dem rekombinanten FWPV-Tyrosinase- Virus MT31. Die anfängliche Plaqueisolation (Spur 0) und die ersten 2 folgenden Plaquereinigungsrunden (Spuren 1 und 2) erfolgten in Anwesenheit von Selektionsmedium (MXH), wohingegen die letzten 3 Plaquereinigungsschritte (Spuren 3 bis 6) in Abwesenheit von MXH erfolgten. pLGFV7.5-mTyr-DNA wurde als Kontroll-Matrizen-DNA eingesetzt, FP9 ist die wt-Virus-Kontroll-DNA und UC die nicht infizierte Kontroll-DNA. (A) Kontroll-PCR (F1-F2), die die relative Menge an Virus-DNA zeigt. (B) PCR F1-F4: Die 984 bp-Bande entspricht dem erwarteten DNA-Fragment, das aus wt-Virus-DNA (wt) amplifiziert wird, die 7282 bp-Bande entspricht dem Amplifizierungsprodukt, das das Tyrosinasegen und die lacZ-gpt-Subkassette enthält, die im intermediären rekombinanten Virus (interm.) enthalten sind, die 2880 bp-Bande entspricht dem Produkt, das nur das Amplifizierungsprodukt der Tyrosinasegen-Expressionskassette (rec.) darstellt. (C) PCR PR43-44, die das Vorliegen der lacZ-Sequenz zeigt. (D) Expression der Tyrosinase aus Maus, die über die Produktion von Melanin in CEF nachgewiesen wird. CEF-Zellen in Petrischalen mit 6 cm Durchmesser wurden mit einer moi von 0,1 pfu/Zelle infiziert. Sechs Tage nach der Infektion wurden die Zellen geerntet, in eine U-Boden-Mikrotiterplatte überführt und in PBS gewaschen. Spuren 1-5: Mit fünf verschiedenen rekombinanten Viren infizierte Zellen; Spur 6: nicht infizierte Zellen; Spur 7: mit wt-Virus infizierte Zellen.
- Primäre Hühnerembryofibroblasten (chicken embryo fibroblasts, CEF) wurden unter Verwendung 11 Tage alter bebrüteter Eier hergestellt und in MEM (Gibco) mit 10% Lactalbumin (Gibco) und 5% Basalmediumsupplement (BMS-Seromed) gezüchtet. HeLa- Zellen und Vero-Zellen wurden in DMEM (Gibco), das mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) (Gibco) angereichert war, gezüchtet. FWPV-FP9, ein gut charakterisiertes Plaqueisolat des abgeschwächten Stammes HP1-438 (Boulanger et al., 1998), wurde in Anwesenheit von MEM, das mit 2% FCS angereichert war, auf CEF gezüchtet.
- Auf CEF gezüchtete FWPV-FP9 wurden nach einem Gefrier-Auftau-Zyklus geerntet. Das Virus wurde durch Ultrazentrifugation konzentriert und durch ein 25% (Gew./Gew.) Saccharosekissen, wie zuvor beschrieben (Boulanger et al., 1998), semi-gereinigt. Das Sediment wurde in 0,05 M Tris, pH 8, mit 1% SDS, 100 µM β-Mercaptoethanol und 500 µg/ml Proteinase K resuspendiert und 1 Std. bei 50°C inkubiert. Die DNA wurde nach Phenol/Chloroform-Extraktion isoliert, mit Ethanol gefällt und in H2O resuspendiert. Die Sequenzierung erfolgte mittels Primer-Walking auf der Virus-DNA. Der erste Primer (PR30) wurde anhand der partiellen Sequenz des Taubenpocken-F11L-Gens gestaltet, die von Ogawa et al. (1993) unter der Zugangsnummer M88588 veröffentlicht wurde. Die zur Sequenzierung verwendeten Primer waren: PR30:5'-CTCGTACCTTTAGTCGGATG-3', PR31:5'-GGTAGCTTTGATTACATAGCCG-3', PR32:5'- GATGGTCGTCTGTTATCGACTC-3' und PR33:5'- GTCTGATAGTGTATTAGCAGATGTAAAAC-3'.
-
- a) pBSLG. Eine 4,2 bp große lacZ-gpt-Kassette, die der im von Sutter & Moss (1992) beschriebenen Plasmid pIIILZgpt enthaltenen Kassette entspricht und das E. coli-lacZ-Gen unter der Kontrolle des späten Vacciniavirus-Promotors P11 und das E. coli-gpt-Gen unter der Kontrolle des frühen/späten Vacciniavirus-Promotors P7.5 enthält, wurde direkt in die multiple Klonierungsstelle des pBluescript II SK+-plasmids (Stratagene) eingesetzt, wobei Plasmid pBSLG erhalten wurde.
- b) pLGF 11. Die Primer PRF1 (5'- GGCCGCGGCCGCCACTAGATGAACATGACACCGG-3') und PRF2(5'- GGCCCCCCGGGGCATTACGTGTTGTTTGTTGC-3'), die eine NotI bzw. eine SmaI- Restriktionsstelle enthalten (unterstrichen), wurden zur Amplifizierung der 471 Basenpaare (bp) langen Flank 1-Sequenz aus der genomischen Virus-DNA mittels PCR als Matrize verwendet. Dieses Fragment wurde in zuvor mit den gleichen Enzymen gespaltenen pBSLG eingesetzt, wobei pBSLGF11 erhalten wurde. Flank 2 (534 bp) wurde unter Verwendung der Primer PRF3 (5'-GGCCCCTGCAGGCAACAAACAACACGTAATGC-3') und PRF4 (5'-CGCCCGTCGACCTTCTTTAGAGGAAATCGCTGC-3'), die eine PstI- bzw. SalI Restriktionsstelle enthalten (unterstrichen), amplifiziert. Dieses Fragment wurde in zuvor mit beiden Enzymen gespaltenes pBSLGF11 eingesetzt, wobei pLGF11 erhalten wurde.
- c) pIIIV7.5F11Rep und pLGFV7.5. Die Primer PRF5 (5'- GGCCCTACGTAGCAACAAACAACACGTAATGC-3') und PRF6 (5'- GGCCGCGGCCGCCTCTATGTTTTTGTAGATATCTTTTTCC-3'), die eine Sna BI bzw. eine NotI-Restriktionsstelle (unterstrichen) enthalten, wurden zur Amplifizierung der 263 bp langen Sequenz, die einem Repeat am 5'-Ende von Flank 2 entspricht, mittels PCR verwendet. Dieses Fragment wurde stromaufwärts der Vacciniavirus-P7.5- Promotorsequenz in das Plasmid pIIIdhrP7.5 (Staib et al., 2000), das zuvor mit den gleichen Restriktionsenzymen gespalten wurde, eingesetzt. Die Flank 2-Wiederholung-P7.5- Promotor-Kassette wurde dann aus dem erhaltenen Plasmid mittels PstI-Spaltung ausgeschnitten, mit Klenow-Polymerase behandelt und in die Smal Stelle von pLGF11 eingesetzt, wobei das Insertionsplasmid pLGFV7.5 erhalten wurde.
- d) pLGFV7.5-mTyr. Eine einzelne PmeI-Stelle stromabwärts der Vacciniavirus-P7.5- Promotorsequenz im Plasmid pLGFV7.5 wurde verwendet, um in dieses Plasmid das für die Tyrosinase aus der Maus kodierende Gen einzusetzen. Das Plasmid pZeoSV2+/muTy (Drexler et al., unveröffentlichte Ergebnisse) wurde mit NheI und NotI gespalten. Das gewünschte Fragment wurde mit Klenow-Polymerase behandelt und in die PmeI- Restriktionsstelle mit glatten Enden in pLGFV7.5 eingesetzt, wobei das Plasmid pLGFV7.5-mTyr erhalten wurde.
- Mit FWPV FP9 infizierte CEF wurden mit dem Plasmid pLGF11 unter Verwendung von Lipofectin (Gibco) transfiziert. Die Virusnachkommenschaft wurde geerntet und unter Agar, der Mycophenolsäure, Xanthin und Hypoxanthin enthielt (MHX-Medium), ausplattiert. Viren, die β-Galactosidase-positive Plaques bildeten, wurden mit einem Xgalberzug sichtbar gemacht und die Plaques zweimal in Anwesenheit von Selektionsmedium gereinigt. LacZ/gpt+-Viren wurden ohne Selektionsmedium weiter aufgereinigt, bis 100% blaue Plaques erhalten wurden.
- Aus CEF, die mit unterschiedlichen selektierten Virusisolaten infiziert worden waren, wurde nach Proteinase K-Behandlung die Gesamt-DNA isoliert, wie zuvor beschrieben extrahiert (Boulanger et al., 1998) und mittels PCR analysiert, wobei die Primer PRF1 und PRF4 verwendet wurden, um die Abwesenheit der wt-Sequenz zu überprüfen, sowie die Primer PRF1 und PRF2, um das Vorliegen von DNA zu überprüfen.
- Konfluente CEF wurden in Dreifachansätzen mit dem wt-Virus oder mit der F11L-Mutante mit einer Infektionsmultiplizität (moi) von 0,05 pfu/Zelle infiziert. Das Impfgut wurde 1 Std. später entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion wurden die Kolben aus dem Brutschrank entnommen und bei -80°C aufbewahrt. Der Titer wurde nach Klärung der Virussuspension bei niedriger Geschwindigkeit mittels Plaquetest bestimmt.
- Mit FWPV FP9 infizierte CEF wurden mit linearisierter pLGFV7.5-mTyr-Plasmid-DNA transfiziert (Fig. 2). Rekombinante Viren wurden dreimal in Anwesenheit von Selektionsmedium gereinigt. Damit zwischen Flank 2 und der Flank 2-Wiederholung eine erneute Rekombination erfolgen konnte, die zum Verlust der lacZ-gpt-Subkassette führt, wurden blaue Plaqueisolate, die einmal auf CEF vermehrt worden waren, in Abwesenheit von Selektionsmedium weiter gereinigt. Viren, die weiße Plaques bildeten, wurden anschließend Plaque-gereinigt. Die erhaltenen Klone wurden dann wie zuvor beschrieben mittels PCR getestet, wobei zusätzlich eine PCR unter Verwendung von 2 für die lacZ-Sequenz spezifischen Primern (PR43:5'-GACTACACAAATCAGCGATTTCC-3' und PR44:5'- CTTCTGACCTGCGGTCG-3') durchgeführt wurde, sodass die Anwesenheit der Selektionskassette untersucht werden konnte.
- Das FWPV-F11L-Gen befindet sich im zentralen Bereich des Virusgenoms (Fig. 1B). Da der entsprechende offene Leserahmen im Genom des CEF-adaptierten Vacciniavirus- Stamms MVA fragmentiert ist (Antoine et al., 1998), spekulieren wir, dass das Gen möglicherweise für die FWPV-Replikation nicht essentiell ist. Die partielle Sequenz des C- Terminus des orthologen F11L-Gens aus Taubenpockenvirus sowie das vollständige, für das F12L-Taubenpockenvirus-Ortholog kodierende Gen und eine partielle Sequenz für das F13L-Ortholog waren bekannt (Ogawa et al., 1993; Zugangsnummer M88588). Diese veröffentlichte Sequenz überlappte eine FWPV-Sequenz, die das gesamte F13L-Ortholog und fast das gesamte F12L-Ortholog umfasste (Calvert et al., 1992; Zugangsnummer M88587). Die beiden Sequenzen überlappen sich um 2598 bp und zeigen 100% Nucleotididentität. Unter der Annahme, dass das F11L-Ortholog ebenfalls zwischen Taubenpocken- und Geflügelpockenviren hochkonserviert ist, wurde der erste zur Sequenzierung des FWPV-Gens verwendete Primer (PR30) anhand der partiellen Taubenpocken-F11L-Sequenz (453 bp) gestaltet (Fig. 1A). Die unter Verwendung dieses Primers erhaltene Sequenz (488 bp) zeigte 100% Nucleotididentität mit dem Ende der veröffentlichten Taubenpocken-Sequenz. Die folgenden Primer (PR31 bis 33) wurden anhand der neuen Sequenzen gestaltet, um Überlappungen zu erzeugen, die zweimal die F11L-Gensequenz abdeckten (Fig. 1A). Eine Sequenzierung wurde für die letzten 1254 bp des FWPV F11L-ORF erhalten (Fig. 1A). Der Vergleich mit der veröffentlichten vollständigen Genomsequenz von FWPV (Afonso et al., 2000) zeigte, dass diese Sequenz identisch mit der veröffentlichten Sequenz des ORF FPV110, des orthologen FWPV-F11L-Gens, ist.
- Leserasterverschiebungsmutationen der kodierenden F11L-Sequenz in Vacciniavirus-MVA deuteten darauf hin, dass F11L möglicherweise ein nicht essentielles Gen ist, das eventuell als Insertionsstelle verwendet werden kann. Unsere Analyse des FWPV-F11L-Proteins (451 Aminosäuren) unter Verwendung des GeneStream Align-Programms zeigte jedoch nur 18,6% Aminosäureidentität mit dem Ortholog (354 Aminosäuren) des Vacciniavirus- Stamms Kopenhagen, was auf unterschiedliche Eigenschaften in beiden Viren hindeuten könnte. Beim Screening nach möglicherweise essentiellen F11L-Genfunktionen fanden wir mittels BLAST-Suche keine signifikanten weiteren Homologien. Weder im FWPV- noch im Vacciniavirus-Protein wurden Signalsequenzen oder Transmembrandomänen vorhergesagt.
- Um zu bestimmen, ob FWPV-F11L als neue Insertionsstelle verwendet werden kann, konstruierten wir mutierte Viren mittels Insertionsdisruption der kodierenden F11L-Sequenz. Das Plasmid pLGF11, das die lacZ-Kassette, flankiert von 2 Sequenzen aus dem FWPV- F11L-ORF, enthielt (Fig. 1B und 2), wurde zur Herstellung rekombinanter Viren verwendet, die aufgrund ihres Wachstums in Anwesenheit von Mycophenolsäure unter einem XGal-Überzug selektiert wurden. Die Rekombinanten können entweder aus einem Doppelrekombinationsereignis sowohl in Flank 1 als auch Flank 2 erhalten werden, was stabile rekombinante Viren ergibt, oder durch ein einfaches Rekombinationsereignis in einer der flankierenden Gensequenzen, was zu instabilen intermediären rekombinanten Genomen führt. Im letzteren Fall sind weitere Passagen in Abwesenheit von Selektionsmedium, die das Sichtbarmachen von wt-Virus als weiße Plaques ermöglichen, nötig, bis ein stabiles rekombinantes Virus erhalten wird, das nur blaue Plaques hervorbringt. Der Genotyp aufeinanderfolgender Virusisolate wurde mittels PCR unter Verwendung der externen Primer charakterisiert, die zur Erzeugung der Flanken verwendet worden waren (PRF1 und PRF4). Die Anwesenheit kontaminierender wt-Viren wurde durch bevorzugte Amplifizierung der genomischen wt-Sequenz anhand des kürzeren PCR-Produktes überwacht, wodurch der Test sehr sensitiv war. Der Virusklon F2 (Fig. 3A) hatte nach 4 Plaquereinigungen die wt- Gensequenz verloren (Klon F2.1.2.1.1). Der Virusklon F15, der nach 3 Plaquereinigungen nur blaue Plaques erzeugte (F15.1.1.1), enthielt immer noch die wt-Sequenz, wie durch PCR gezeigt wurde (Fig. 3A). Nach der Amplifizierung dieses Virusklons (F15.1.1.1.1) durch drei aufeinanderfolgende Passagen in CEF ergab die eingeschränkte Verdünnung zudem die Anwesenheit von Viren, die weiße Plaques erzeugten.
- Bei einem Versuch, die Isolation rekombinanter Viren zu beschleunigen, testeten wir die Transfektion mit linearisierter Plasmid-DNA, eine Strategie, die von Kerr & Smith (1991) empfohlen wurde, um das Auftreten von Einfachcrossoverereignissen und das Erhaltenbleiben von Plasmiden zu reduzieren, die aus der Auflösung instabiler Einfachcrossover- Zwischenprodukte in Viren während der Vacciniavirus-Mutagenese stammten. Die Herstellung rekombinanter Viren unter Verwendung von linerarisiertem Plasmid sollte nur aufgrund eines Doppelrekombinationsereignisses zustande kommen und in der Folge direkt zu stabilen rekombinanten Genomen führen. Tatsächlich zeigten die Virusklone F9, F10 und F16, die durch linearisiertes Plasmid hergestellt wurden, sogar nach der ersten Plaquereinigungsrunde keine nachweisbaren wt-Gensequenzen mehr (Fig. 3B). Der Virusklon F8 benötigte nur eine weitere Plaquereinigung, um offensichtlich von wt-Virus frei zu sein (Fig. 3B). Zudem zeigte die Plaquetitration von Virusklon F9.1.1.1.1 nach drei Vermehrungszyklen in CEF keine Anwesenheit von kontaminierendem wt-Virus.
- Die erfolgreiche Erzeugung lebensfähiger F11L-mutierter Viren legte nahe, dass die F11L- Gensequenz vernachlässigbar ist. Um zu bestimmen, ob die Inaktivierung das Viruswachstum stören kann, wurde der mutierte Virusklon F9.1.1.1 vermehrt und im Vergleich mit wt-FWPV bezüglich des Mehrschrittwachstums in CEF (Fig. 4) getestet. Beide Viren zeigten fast identische Replikationskinetiken und erzeugten gleiche Mengen an infektiöser Nachkommenschaft.
- F11L als Insertionsziel ermöglicht die stabile Expression rekombinanter Gene
- Da festgestellt wurde, dass das F11L-Gen nicht essentiell ist und die Disruption des Gens das Viruswachstum nicht beeinträchtigt, wurde der F11L-Genlocus als geeignete Insertionsstelle betrachtet. Das Plasmid pLGF11 wurde zur Konstruktion eines Plasmidvektors (pLGFV7.5) verwendet, damit in das FWPV-Genom fremde Gene zusammen mit der lacZ- gpt-Selektionssubkassette unter der Kontrolle des Vacciniavirus-P7.5-Promotors eingesetzt werden konnten (Fig. 2). Das Plasmid enthielt außerdem eine Wiederholung der Flank-2- Sequenz (Fig. 2), damit die Subkassette anschließend aus den rekombinanten Viren entfernt werden konnte. Als erstes von pLGFV7.5 erhaltenes Fremdgen wurde die DNA- Sequenz inseriert, die für das Enzym Tyrosinase kodiert, das als Antigen für eine experimentelle Impfung gegen Melanome von Interesse ist (Drexler et al., 1999). Tyrosinase ist am Biosyntheseweg zur Herstellung von Melanin beteiligt. Zellen, die dieses Enzym exprimieren, akkumulieren Melanin und werden dunkel. Diese Eigenschaft liefert ein einfaches Verfahren für das Screening bezüglich der Expression von Tyrosinase und ihrer funktionellen Unversehrtheit. Nach der Transfektion mit pLGFV7.5-mTyr wurden fünf rekombinante Virusklone für weitere Analysen selektiert. Die Linearisierung der Plasmid- DNA, die sich während der Produktion der F11L-mutierten Viren als sehr effizient herausgestellt hatte, wurde auch zur Herstellung rekombinanter Viren verwendet. Die Virusklone MT22 (Daten nicht gezeigt) und MT31 (Fig. 5) zeigten nach nur einer Plaquereinigung in Anwesenheit von Selektionsmedium keine nachweisbare wt-Virussequenz (MT31.1, Spur 1, Fig. 5B). Auf dieser Stufe zeigte die genomische DNA-Präparation beider Virusklone bereits das Vorliegen rekombinanter Virusgenome, die keine nachweisbaren Markergensequenzen mehr enthielten (2880 bp-Genprodukt in Fig. 5B) und gleichzeitig den selektierten lacZ-gpt-positiven Genotyp (7282 bp), der durch diese PCR-Reaktion kaum nachweisbar ist (siehe Klon 31.1.1, Fig. 5B, dritte Spur), aber mit der PR43-44-PCR nachgewiesen wird (Fig. 5C). Von viraler DNA der vierten Plaquereinigung beider Klone, d. h. nach nur einer Plaquereinigung in Abwesenheit von Selektionsmedium konnte keine Markersequenz mehr amplifiziert werden (Fig. 5C). Alle fünf rekombinanten Viren produzierten nach CEF- Infektion funktionelle Tyrosinase (Fig. 5D).
- Es wurde auch die spezifische Synthese von Melanin in infizierten HeLa- und Vero-Zellen demonstriert, die beide für FWPV nicht permissiv sind. Die in diesen Säugerzellen hergestellte Menge an Melanin schien verglichen mit der CEF-Infektion kleiner zu sein. Der Grund dafür könnte entweder fehlende Virusreplikation oder eine verringerte Expression des Tyrosinasegens oder ein weniger effizienter Melaninsyntheseweg in diesen Zelllinien sein (Daten nicht gezeigt). Zur Untersuchung der genetischen Stabilität der Tyrosinase- Insertion wurden alle fünf rekombinanten Virusisolate in vier aufeinanderfolgenden Mehrschritt-Wachstumspassagen auf CEF amplifiziert und die Virusnachkommen mittels Plaquetitration unter Agar analysiert. Von jedem rekombinanten Virus wurden zehn verschiedene Plaqueisolate auf ihre Tyrosinaseexpression untersucht. In allen Proben wurde Melaninsynthese nachgewiesen, was zeigt, dass jedes Virus noch funktionelles rekombinantes Enzym bildete (Tabelle 1). Der gleiche Test wurde nach sechs Passagen durchgeführt. Nur ein Plaqueisolat von einem der fünf rekombinanten Viren konnte keine funktionelle Tyrosinase produzieren (Tabelle 1). Die PCR-Analyse der Virus-DNA zeigte, dass das Genom dieses Virusklons anscheinend noch die rekombinanten Volllängen-Gensequenzen enthielt. Das legt nahe, dass die Tyrosinasegenexpression höchstwahrscheinlich durch (eine) Punktmutation(en) inaktiviert wurde (Daten nicht gezeigt).
- Der Vacciniavirus-F11L-ORF kodiert potentiell ein Protein, das keine Homologie oder kein charakteristisches Motiv aufweist, das eine spezifische Funktion vorhersagen könnte. Daher ist das F11L-Ortholog von FWPV möglicherweise nicht essentiell. In der vorliegenden Erfindung wurde diese Hypothese durch Insertion einer Selektionskassette in das FWPV-Gen untersucht, die ein Markergen (lacZ) und eine Selektionsgen (gpt) enthielt. Die Erzeugung rekombinanter Viren, die diese Kassette und keine wt-Gensequenzen mehr enthielten, zeigte, dass das orthologe Volllängen-FWPV-Gen für das Wachstum von FWPV nicht essentiell ist. Das mutierte Virus wuchs genauso effizient wie das wt-Virus (Fig. 4), was nahelegt, dass der F11L-Genlocus als geeignete Insertionsstelle für rekombinante Gene betrachtet werden kann. Folglich verwendeten wir diese Stelle, um erfolgreich rekombinante FWPV-Viren zu erzeugen, die das Melanom-Modellantigen Tyrosinase stabil exprimierten.
- Die stabile Expression von Marker- oder Selektionsgenen in rekombinanten Viren kann bei einer Verwendung als Vektorimpfstoff oder für weitere Gentechnik ungeeignet sein. In unserem FWPV-Plasmidvektor war die Selektionssubkassette von Wiederholgungssequenzen flankiert, damit sie anschließend eliminiert werden konnte. Die Herstellung einer solchen Rekombinante erfordert zunächst die Isolation eines rekombinanten Virus, das noch die Selektionssubkassette, aber keine wt-Sequenz mehr enthält, und anschließend die Isolation der stabilen Rekombinante, die die Selektionssubkassette verloren hat. Die Effizienz der Isolationsstrategie ist daher entscheidend, damit endgültige Rekombinanten in einem vernünftigen Zeitraum erhalten werden. Ähnlich wie frühere Untersuchungen (Leong et al., 1994; Sutter & Moss, 1992) fanden wir, dass die Kombination eines Reportergens und eines Selektionsgens ein einfaches und sehr effizientes Selektionsverfahren ist. Diese Strategie wurde weiter verbessert, indem mit linearisierter Plasmid-DNA transfiziert wurde. Die Rekombination zwischen der Plasmid-DNA und dem Virusgenom kann entweder mittels Einfachcrossover, was zur Integration der gesamten Plasmidsequenz im Virusgenom führt (Spyropoulos et al., 1988; Falkner & Moss, 1990; Nazarian & Dhawale, 1991), oder durch doppelte Rekombination erfolgen. Laut Spyropoulos et al. (1988) ist die Häufigkeit für beide Ereignisse ähnlich. In unseren Händen war die Anzahl der Plaquereinigungen, die zur Eliminierung jeglicher wt-Sequenz nötig war, unter Verwendung von linearisierter Plasmid-DNA tatsächlich stark verringert (Fig. 3 und 5). Diese Technik erlaubte nicht nur eine Zeitersparnis, sondern reduzierte zudem das Risiko, zufällige Mutationen im Virusgenom zu integrieren, die während zahlreicher Passagen unvermeidbar auftreten. Wie Nazarian & Dhawale (1991) nahelegen, könnte die Gesamteffizienz der Rekombination nach der Transfektion mit linearisiertem Plasmid niedriger sein als bei Verwendung von zirkulärem Plasmid. In unseren Händen verringerte jedoch die Verwendung von linearisiertem Plasmid die Effizienz der Rekombination nicht, da wir bei der Herstellung F11L-mutierter Viren ein Verhältnis von einem blauen Plaque nach Transfektion mit zirkulärem Plasmid zu fünf blauen Plaques nach der Transfektion mit linearisiertem Plasmid erhielten. Wir erhielten zudem Verhältnisse zwischen 1 und 10 bei der Herstellung anderer rekombinanter Viren (unveröffentlicht). Daher bestätigen unsere Ergebnisse frühere Daten (Spyropoulos et al., 1982), die nahelegen, dass die Gesamthäufigkeit der Rekombination im Vacciniavirus sich nicht merklich ändert, wenn man die Bildung von Einfachcrossover- Rekombinanten durch Linearisierung des Plasmids in nicht homologen Abschnitten verhindert.
- Ein wichtiger Aspekt bei der Entwicklung geeigneter Virusvektorimpfstoffe ist die Stabilität der rekombinanten Viren, die von der angestrebten Insertionsstelle entscheidend bestimmt werden kann. Der Locus des viralen Thymidinkinasegens scheint sich zur Herstellung rekombinanter Vogelpockenviren nicht zu eignen, obwohl er die Standard- Insertionsstelle zur Herstellung von rekombinantem Vacciniavirus ist (Scheiflinger et al., 1997; Amano et al., 1999). Die Stabilität von Tyrosinase-rekombinanten FWPV-Viren, die durch Verwendung von F11L als Ziel erhalten werden, kann leicht durch die Untersuchung der Melaninsynthese überwacht werden, wobei einfach die Farbe der Zellsedimente untersucht wird (Fig. 5D und Tabelle 1). Nach sechs Passagen auf CEF exprimierte nur ein Plaqueisolat von 50 kein funktionelles rekombinantes Gen, was ein hohes Maß an genomischer Stabilität anzeigt. Tabelle 1 Stabilität der murinen Expression von Tyrosinase in 5 rekombinanten Viren
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Claims (19)
1. Rekombinantes Fowlpox-Virus (FWPV), enthaltend zumindest eine Insertion einer
Fremd-DNA im F11L-Gen.
2. Rekombinantes Fowlpox-Virus (FWPV) nach Anspruch 1, wobei die Fremd-DNA
zumindest ein Fremdgen, wahlweise in Kombination mit einer Sequenz zur Regulation
der Expression des Fremdgens, aufweist.
3. Rekombinantes Fowlpox-Virus (FWPV) nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Fremd-DNA
eine Regulationssequenz beinhaltet, bevorzugt einen Pockenvirus-spezifischen Promotor.
4. Rekombinantes Fowlpox-Virus (FWPV) nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche, wobei das Fremdgen für ein Polypeptid kodiert, welches bevorzugt
therapeutisch einsetzbar ist und/oder für einen nachweisbaren Marker kodiert und/oder ein
Selektionsgen ist.
5. Rekombinantes Fowlpox-Virus (FWPV) nach Anspruch 4, wobei das therapeutisch
einsetzbare Polypeptid ein Bestandteil eines viralen, bakteriellen oder parasitären
Krankheitserregers oder einer Tumorzelle ist.
6. Rekombinantes Fowlpox-Virus (FWPV) nach Anspruch 5, wobei das therapeutisch
einsetzbare Polypeptid ein Bestandteil von HIV, Mykobakterium spp. oder Plasmodium
falciparum ist.
7. Rekombinantes Fowlpox-Virus (FWPV) nach Anspruch 5, wobei das therapeutisch
einsetzbare Polypeptid ein Bestandteil einer Melanomzelle ist.
8. Rekombinantes Fowlpox-Virus (FWPV) nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche, wobei der nachweisbare Marker eine beta-Galactosidase, beta-Glucoronidase,
eine Guanin-Ribosyl-Transferase, eine Luziferase oder ein Grün-Fluoreszierendes-Protein
ist.
9. Rekombinantes Fowlpox-Virus (FWPV) nach Anspruch 8, wobei das Markergen und/oder
das Selektionsgen eliminierbar ist.
10. Rekombinantes Fowlpox-Virus (FWPV) nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche, wobei der durch die Nukleotidpositionen 131.860-131.870 im
Fowpoxvirusgenom definierte Genomabschnitt der bevorzugte Integrationsort im F11L-
Genhomolog ist.
11. DNA-Vektor, der ein rekombinantes Fowlpox-Virus (FWPV) nach einem oder mehreren
der vorhergehenden Ansprüche oder funktionelle Teile hiervon, die zumindest eine
Insertion einer Fremd-DNA im F11L-Gen enthalten, weiterhin bevorzugt ein Replikon zur
Replikation des Vektors in einer Pro- oder Eukaryontenzelle und ein in Pro- oder
Eukaryontenzellen selektierbares Selektionsgen oder Markergen enthält.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein rekombinantes Fowlpox-Virus
(FWPV) nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche oder einen DNA-
Vektor nach Anspruch 11 in Verbindung mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen
und/oder Trägerstoffen.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, die in Form einer Vakzine
vorliegt.
14. Verwendung eines rekombinanten Fowlpox-Virus, eines DNA-Vektors oder einer
pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche zur Behandlung von Infektionskrankheiten oder Tumorerkrankungen.
15. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Fowlpox-Virus oder DNA-Vektors nach
einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei Fremd-DNA in das F11L-
Gen eines Fowlpox-Virus durch rekombinante DNA-Techniken eingebracht wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Einbringen durch homologe Rekombination der
Virus-DNA mit der Fremd-DNA erfolgt, die F11L-spezifische Sequenzen enthält, gefolgt
von einer Vermehrung und Isolierung des rekombinanten Virus oder des DNA-Vektors.
17. Eukaryontenzelle oder Prokaryontenzelle, enthaltend einen rekombinanten DNA-Vektor
oder ein rekombinantes Virus nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.
18. Prokaryontenzelle nach Anspruch 17, die eine Bakterienzelle, bevorzugt E. coli-Zelle ist.
19. Eukaryontenzelle nach Anspruch 18, die eine Hefezelle, Vogelzelle, bevorzugt
Hühnerzelle, oder eine vom Säugetier stammende Zelle, bevorzugt Humanzelle ist.
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