DE60314541T2

DE60314541T2 - Mindestens zwei ati promotoren enthaltendes rekombinantes pockenvirus

Info

Publication number: DE60314541T2
Application number: DE60314541T
Authority: DE
Inventors: Sonja Leyrer; Paul Glen Waverly HOWLEY
Original assignee: Bavarian Nordic AS
Current assignee: Bavarian Nordic AS
Priority date: 2002-11-25
Filing date: 2003-11-12
Publication date: 2008-02-28
Anticipated expiration: 2023-11-13
Also published as: IL167844A; AU2003293675A1; ES2288634T3; AU2003293675B2; CY1106883T1; MXPA05005549A; WO2004048582A2; UA85379C2; WO2004048582A3; NZ540156A; EP1567653B1; NO20053125D0; ATE365220T1; US20060153874A1; CA2501168A1; NO20053125L; EA012723B1; DE60314541D1; DK1567653T3; EP1567653A2

Description

Die Erfindung betrifft rekombinante Pockenviren, die im viralen Genom wenigstens zwei Expressionskassetten umfassen, die jeweils den Kuhpocken-ATI-Promotor oder ein Derivat davon sowie eine codierende Sequenz umfassen, wobei die Expression der codierenden Sequenz von dem Promotor oder Derivat davon reguliert wird. Das Virus kann als Impfstoff oder als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung geeignet sein.
Stand der Technik
Rekombinante Pockenviren finden breite Anwendung bei der Expression fremder Antigene in infizierten Zellen. Zudem werden rekombinante Pockenviren gegenwärtig als sehr vielversprechende Impfstoffe zur Induktion einer Immunantwort gegen vom Pockenvirusvektor exprimierte fremde Antigene getestet. Am beliebtesten sind dabei einerseits Avipoxviren und andererseits Vacciniaviren. Aus US 5,736,368 und US 6,051,410 ist der rekombinante Vacciniavirusstamm Wyeth bekannt, der HIV-Antigene und -Proteine exprimiert. Aus der US 5,747,324 ist ein rekombinanter Vacciniavirusstamm NYCBH bekannt, der Lentivirusgene exprimiert. Aus der EP 0 243 029 ist ein rekombinanter Vacciniavirusstamm Western Reserve bekannt, der menschliche Retrovirusgene exprimiert. Fowlpoxviren mit HIV-Genen im viralen Genom sind aus US 5,736,368 und US 6,051,410 bekannt.
Zur Induktion einer wirksamen Immunantwort ist es wünschenswert, nicht nur ein einzelnes Protein eines Agens, gegen das eine Immunantwort induziert werden soll, zu exprimieren. Stattdessen ist es bevorzugt, möglichst viele unterschiedliche Proteine und Epitope des Agens zu exprimieren, um eine breite und wirksame Immunität gegen das Agens zu erhalten. Somit kann es vorteilhaft sein, mehrere unterschiedliche Expressions kassetten in das gleiche Pockenvirusgenom zu inserieren, falls ein Pockenvirus als Impfvektor verwendet werden soll. In der US 5,736,368 ist die Konstruktion eines rekombinanten Pockenvirus beschrieben, das Expressionskassetten für das HIV-1-Gen env und das HIV-1-Gen gag.pol enthält. Zur Expression der von den unterschiedlichen Expressionskassetten kodierten Proteine wurden unterschiedliche Promotoren, nämlich der Vacciniavirus-Promotor Dl und der Promotor 40K, verwendet. Der Nachteil dieser Strategie besteht darin, daß die Aktivitäten der verschiedenen Promotoren nicht identisch sind, was zu einem unterschiedlichen Niveau der von den unterschiedlichen Expressionskassetten exprimierten Proteine führt.
Ein nahezu gleiches Expressionsniveau ließe sich erreichen, falls die Promotoren in den unterschiedlichen Expressionskassetten im Pockenvirusgenom identisch wären. Allerdings besteht der Nachteil dieser Strategie in der Gefahr eines möglichen Auftretens unerwünschter Rekombinationsereignisse zwischen den homologen/identischen Promotorsequenzen. Tatsächlich konnte von Howley et al. (Gene (1996) 172, 233-237) gezeigt werden, daß ein rekombinantes Vacciniavirus erzeugt werden kann, das drei p7.5-Promotoren an unterschiedlichen Orten des viralen Genoms umfaßt; allerdings trat eine Rekombination zwischen den homologen Promotorsequenzen auf, was zu einer gemischten genomischen Population des rekombinanten Pockenvirus führte. Eine derartige gemischte und nicht definierte genomische Population, die die Instabilität des viralen Genoms widerspiegelt, ist nicht akzeptierbar, falls ein rekombinantes Pockenvirus für die Impfung, insbesondere für die Impfung von Menschen, verwendet werden soll.
Von Hänggi et al. (EMBO J. (1986) 5: 1071-1076) wurde der späte 11-kd-Promotor des Vacciniavirus über 5'- und 3'-Deletionen sowie stellengerichtete Mutagenese charakterisiert, wobei ein konserviertes TAAAT-Motiv gefunden wurde.
Aufgabe der Erfindung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, stabile rekombinante Pockenviren bereitzustellen, die wenigstens zwei Expressionskassetten enthalten, und zwar vorzugsweise für Gene, die nicht von Natur aus Teil des Pockenvirusgenoms sind, wobei es möglich sein sollte, die von den wenigstens zwei unterschiedlichen Expressionskassetten codierten Proteine in gleichen Mengen zu produzieren.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Diese Aufgabe wurde durch Bereitstellung rekombinanter Pockenviren, umfassend im viralen Genom wenigstens zwei Expressionskassetten, die jeweils den Kuhpocken-ATI-Promotor oder ein Derivat davon sowie eine codierende Sequenz umfassen, wobei die Expression der codierenden Sequenz von dem Promotor oder Derivat davon reguliert wird, gelöst.
Es konnte mit der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, daß Pockenviren, die mindestens zwei Kopien des ATI-Promotors umfassen, unerwartet stabil sind; es konnte demonstriert werden, daß keine nachweisbaren Rekombinationsereignisse zwischen den homologen oder sogar identischen ATI-Promotorsequenzen stattfanden. Dies steht im Gegensatz zu Vacciniaviren, die mindestens zwei p7.5-Promotoren im viralen Genom umfassen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann es sich bei dem Pockenvirus um ein beliebiges Pockenvirus handeln, bei dem die Expression von Genen durch den ATI-Promotor oder ein Derivat davon reguliert werden sollte. Somit kann das Pockenvirus ein beliebiges Virus der Unterfamilie der Chordopoxvirinae und Entomopoxvirinae sein (siehe Fields Virology 3. Auflage, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, USA, Kapitel: 83, ISBN 0-7817-0253.4). Viren aus der Unterfamilie Chordopoxvirinae sind besonders bevorzugt, falls das rekombinante Pockenvirus zur Expression von Genen in Säugetieren, einschließlich dem Menschen, verwendet wird. Besonders bevorzugte Gattungen, die zur Unterfamilie Chordopoyvirinae gehören, sind Orthopoxviren, Parapoxviren, Avipoxviren, Capripoxviren, Leporipoxviren und Suipoxviren. Am stärksten bevorzugt sind Orthopoxviren und Avipoxviren. Beispiele für Avipoxviren sind Canarypoxviren und Fowlpoxviren. Ein Beispiel für ein Orthopoxvirus ist das Vacciniavirus. Der Vacciniavirusstamm, der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann ein beliebiger Vacciniavirusstamm sein, wie beispielsweise die Stämme Copenhagen, Temple of Heaven, Wyeth, Western Reserve, Elstree, NYCBH und so weiter. Besonders bevorzugt ist das MVA (Modified Vaccinia Ankara). MVA wurde durch 516 in Hühnerembryofibroblasten nacheinander ausgeführte Passagierungen des Ankara-Stamms des Vacciniavirus (CVA) erzeugt (siehe Übersichtsartikel von Mayr, A., et al. Infection 3, 6-14 [1975]). Als Folge dieser Langzeitpassagierungen deletierte das erhaltene MVA-Virus etwa 31 Kilobasen seiner genomischen Sequenz und wurde daher als stark Wirtszellen beschränkt, und zwar auf Vogelzellen, beschrieben (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 [1991]). In verschiedenen Tiermodellen konnte gezeigt werden, daß das erhaltene MVA signifikant avirulent war (Mayr, A. & Danner, K. [1978] Dev. Biol. Stand. 41: 225-34). Darüber hinaus wurde dieser MVA-Stamm in klinischen Versuchsreihen als Impfstoff zur Immunisierung gegen die menschliche Pockenkrankheit getestet (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]).
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiger MVA-Stamm verwendet werden. Beispiele für MVA-Virusstämme, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet und in Übereinstimmung mit den Forderungen des Budapester Vertrags hinterlegt wurden, sind die Stämme MVA572 und MVA575, die bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (UK) mit den Hinterlegungsnummern ECACC V94012707 bzw. ECACC V00120707 hinterlegt wurden, sowie MVA-BN mit der Hinterlegungsnummer ECACC V00083008.
Am stärksten bevorzugt ist der MVA-Stamm MVA-BN oder ein Derivat davon. Die Merkmale von MVA-BN, die Beschreibung biologischer Tests, die die Beurteilung darüber, ob es sich bei einem MVA-Stamm um MVA-BN oder ein Derivat davon handelt, gestatten, sowie Verfahren, die die Gewinnung von MVA-BN oder eines Derivats davon gestatten, sind in der WO 02/42480 offenbart. Der Inhalt dieser Anmeldung wird durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen.
Allgemein gesehen ist die Verwendung von Viren bevorzugt, die für das Tier, einschließlich dem Menschen, nicht schädlich sind, falls das Virus zur Impfung oder zur Behandlung des Tiers, einschließlich des Menschen, verwendet wird. Insbesondere beim Menschen handelt es sich bei sicheren Pockenviren um die verschiedenen Vacciniavirusstämme, wie z.B. MVA, sowie Avipoxviren, wie z.B. Fowlpoxvirus und Canarypoxvirus.
Um Pockenviren zu vermehren, werden eukaryontische Zellen mit dem Virus infiziert. Bei den eukaryontischen Zellen handelt es sich um Zellen, die der Infektion mit dem jeweiligen Pockenvirus zugänglich sind und die Replikation und Produktion von infektiösem Virus gestatten. Derartige Zellen sind dem Fachmann für jede Pockenvirusspezies bekannt. Ein Beispiel für diese Art von Zellen stellen bei MVA Hühnerembryofibroblasten (CEF[= Chicken Embryo Fibroblasts]) und BHK-Zellen dar (Drexler I., Heller K., Wahren B., Erfle V. und Sutter G., J. Gen. Virol. (1998), 79, 347-352). CEF-Zellen lassen sich unter Bedingungen kultivieren, die dem Fachmann bekannt sind. Vorzugsweise werden die CEF-Zellen in serumfreiem Medium in stationären Kolben oder Rollerflaschen kultiviert. Dabei dauert die Inkubation vorzugsweise 48 bis 96 Stunden bei 37°C ± 2°C. Für die Infektion wird MVA vorzugsweise mit einer MOI (Multiplicity of Infektion) von 0,05 bis 1 TCID₅₀ verwendet, wobei die Inkubation vorzugsweise 48 bis 72 Stunden bei 37°C ± 2°C stattfindet.
Die Sequenz des Promotors des ATI(A-Type Inclusion)-Protein-Gens des Kuhpockenvirus (ATI-Promotor) ist dem Fachmann bekannt. In diesem Zusammenhang wird auf den Genebank-Eintrag mit der Zugangsnummer D00319 verwiesen. Eine bevorzugte ATI-Promotorsequenz ist als SEQ ID.: Nr. 1 angegeben und lautet wie folgt: 5'GTTTT GAATA AAATT TTTTT ATAAT AAAT 3'.
Gemäß der vorliegenden Erfindung besteht die Möglichkeit, den ATI-Promotor wie in SEQ ID.: NR. 1 angegeben oder ein Derivat des ATI-Promotors zu verwenden, wobei es sich bei letzterem um eine Teilsequenz der Sequenz gemäß SEQ ID.: Nr. 1 handeln kann. Der Begriff "Teilsequenz der Sequenz gemäß SEQ ID.: Nr. 1" bezieht sich dabei auf kürzere Fragmente der SEQ ID.: Nr. 1, die noch als Promotor fungieren, insbesondere als später Vacciniavirus-Promotor. Ein typisches Fragment der Sequenz der SEQ ID.: NR. 1 weist eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden, stärker bevorzugt von wenigstens 15 Nukleotiden, noch stärker bevorzugt von wenigstens 20 Nukleotiden, am stärksten bevorzugt von wenigstens 25 Nukleotiden der Sequenz der SEQ ID.: NR. 1 auf. Die Teilsequenz umfaßt wenigstens die Nukleotide 22 bis 29 der SEQ ID: NR. 1, d.h. die am 3'-Ende der SEQ ID.: NR. 1 lokalisierte Sequenz 5'TAATAAAT-3'.
Der Promotor kann stromaufwärts einer codierenden Sequenz so inseriert werden, daß die Nukleotide 28 bis 29 der SEQ ID: 1 (in der obigen Sequenz unterstrichen) Teile des 5'-ATG-3'-Startkodons der Translation sind. Als Alternative kann der Promotor durch mehrere Nukleotide vom Startkodon der Translation getrennt sein. Der Spacer (= Abstandhalter) zwischen dem 3'-Ende des Promotors gemäß der SEQ ID.: NR. 1 und dem A im 5'-ATG-3'-Startkodon besteht vorzugsweise aus weniger als 100 Nukleotiden, stärker bevorzugt aus weniger als 50 Nukleotiden und noch stärker bevorzugt aus weniger als 25 Nukleotiden. Allerdings könnte der Spacer sogar länger sein, solange der Promotor noch in der Lage ist, die Expression der stromabwärts vom Promotor liegenden codierenden Sequenz zu steuern.
Bei dem Derivat des ATI-Promotors kann es sich auch um eine Sequenz handeln, die in bezug auf die Sequenz der SEQ ID.: NR. 1 oder Teilsequenzen davon nicht mehr als 6 Nukleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen aufweist, wobei die Derivate noch als Promotor, insbesondere als später Vacciniavirus-Promotor, aktiv sind. Bei einer Sequenz mit nicht mehr als 6 Nukleotidsubstitutionen handelt es sich um eine Sequenz, in der nicht mehr als 6 Nukleotide der Sequenz gemäß der SEQ ID.: NR. 1 gegen andere Nukleotide ausgetauscht sind. Eine Sequenz mit nicht mehr als 6 Nukleotidinsertionen stellt eine Sequenz dar, bei der nicht mehr als 6 Nukleotide an einem oder mehreren Orten der Sequenz gemäß der SEQ ID.: NR. 1 inseriert sind. Bei einer Sequenz mit nicht mehr als 6 Nukleotiddeletionen handelt es sich um eine Sequenz, bei der ein oder mehrere Nukleotide der Sequenz gemäß der SEQ ID.: NR. 1 an einem oder mehreren Orten deletiert sind. Bei den Derivaten der SEQ ID.: Nr. 1 können Deletionen, Substitutionen und Insertionen in einer Sequenz kombiniert sein. Vorzugsweise weist das Derivat eine Homologie von wenigstens 80%, am stärksten bevorzugt von wenigstens 90% im Vergleich mit der Sequenz des SEQ ID.: Nr. 1 auf. Gemäß der beanspruchten Erfindung sind in dem Derivat nicht mehr als 6 Nukleotide, noch stärker bevorzugt nicht mehr als 3 Nukleotide, in der Sequenz der SEQ ID.: Nr. 1 substituiert, deletiert, und/oder inseriert. Insbesondere beläßt man die Nukleotide 25 bis 29 der SEQ ID.: NR. 1, d.h. die Sequenz 5'-TAAAT-3, im Promotor, um die maximale Promotoraktivität zu erzielen. Gemäß der beanspruchten Erfindung läßt man die Nukleotide 22 bis 29 der SEQ ID.: NR. 1, d.h. die Sequenz 5'-TAATAAAT-3, im Promotor.
Die obigen Anmerkungen hinsichtlich des Ortes des ATI-Promotors oder von Teilsequenzen davon gelten auch für die oben definierten Sequenzen mit einer oder mehreren Nukleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen in bezug auf die Sequenz gemäß SEQ ID.: NR. 1 oder in bezug auf Teilsequenzen davon.
Eine Sammlung von Dokumenten des Standes der Technik gestattet dem Fachmann, vorherzusagen, welche Derivate der SEQ ID.: NR. 1 noch die biologische Aktivität der Wirkung als Pockenvirus-Viruspromotor, insbesondere als später Vacciniavirus-Promotor, besitzen. In diesem Zusammenhang wird auf Chakrarbati et al., Biotechniques (1997) 23, 1094-1097 und Davison und Moss, J. Mol. Biol. (1989) 210, 771-784 verwiesen. Zudem läßt sich vom Fachmann leicht überprüfen, ob ein Fragment noch als Pockenvirus-Promotor, insbesondere als später Vacciniavirus-Promotor, noch aktiv ist. Insbesondere kann das Sequenzderivat stromaufwärts eines Reportergens in einem Plasmidkonstrukt kloniert werden. Dieses Konstrukt kann in eine eukaryontische Zelle oder Zellinie, wie z.B. CEF- oder BHK-Zellen, die mit einem Pockenvirus infiziert wurde, transfiziert werden. Bei dem zur Infektion verwendeten Pockenvirus handelt es sich vorzugsweise um ein Pockenvirus aus der gleichen Gattung und noch stärker bevorzugt, um das gleiche Pockenvirus wie das Pockenvirus, in dessen Genom der Promotor inseriert werden sollte. Danach wird die Expression des Reportergens bestimmt und mit der Expression des vom Promotor gemäß der SEQ ID.: NR. 1 kontrollierten Reportergens verglichen. Bei einem Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich vorzugsweise um ein Derivat mit einer Promotoraktivität in dem Testsystem von wenigstens 10%, bevorzugt von wenigstens 30%, stärker bevorzugt von wenigstens 50%, noch stärker bevorzugt von wenigstens 70%, am stärksten bevorzugt von 90% im Vergleich mit der Aktivität der Promotorsequenz der SEQ ID.: NR. 1. Ebenso sind von der vorliegenden Erfindung diejenigen Derivate der SEQ ID.: NR. 1 umfaßt, die eine höhere Promotcraktivität als die SEQ ID.: NR. 1 aufweisen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt das rekombinante Pockenvirus wenigstens zwei Expressionskassetten, die jeweils einen ATI-Promotor oder ein Derivat davon umfassen. In anderen Worten, das Genom des rekombinanten Pockenvirus kann zwei oder mehr ATI-Promotoren oder Derivate davon umfassen. Die ATI-Promotoren im viralen Genom können gleich oder verschieden sein. Somit kann es passieren, daß alle ATI-Promotoren die Sequenz gemäß der SEQ ID.: NR. 1 aufweisen. Ebenso kann es vorkommen, daß es sich bei allen ATI-Promotoren um das gleiche Derivat gemäß der SEQ ID.: NR. 1 handelt. Andererseits können einer oder mehrere der ATI-Promotoren die Sequenz der SEQ ID.: NR. 1 aufweisen sowie einer oder mehrere der ATI-Promotoren im gleichen Pockenvirusgenom Derivate der Sequenz gemäß der SEQ ID.: Nr. 1 sein. Umfaßt ein solches Pockenvirusgenom mehrere Derivate des ATI-Promotors, so können diese Derivate gleich oder verschieden sein. Gemäß einer weiteren Alternative kann es sich bei allen ATI-Promotoren im Pockenvirusgenom um unterschiedliche Derivate der Sequenz gemäß der SEQ ID.: Nr. 1 handeln.
Allgemein betrifft die Erfindung rekombinante Pockenviren, die wenigstens zwei ATI-Promotoren oder Derivate davon im Pockenvirusgenom umfassen. So kann das virale Genom beispielsweise 2, 3, 4, 5, 6 oder mehr ATI-Promotoren oder Derivate davon im viralen Genom umfassen.
Die ATI-Promotoren oder Derivate davon sind üblicherweise Teil von Expressionskassetten, die jeweils einen Kuhpocken-ATI-Promotor oder ein Derivat davon, sowie eine codierende Sequenz, deren Expression durch die Promotoren reguliert wird, umfassen. Bei codierenden Sequenzen kann es sich um beliebige Sequenzen handeln, deren Expression von dem ATI-Promotor oder dem Derivat davon kontrolliert werden sollte.
Gemäß einer Alternative kann wenigstens einer der ATI-Promotoren im Pockenvirusgenom zur Expression eines Gens verwendet werden, das bereits Teil des Pockenvirusgenoms ist. Bei einem solchen Gen kann es sich um ein Gen, das natürlicherweise Teil des viralen Genoms ist, oder um ein fremdes Gen handeln, das bereits in das Pockenvirusgenom inseriert wurde. In diesen Fällen ist der ATI-Promotor stromaufwärts des Gens, dessen Expression vom ATI-Promotor kontrolliert werden soll, im Pockenvirusgenom inseriert.
Als Alternative oder zusätzlich kann wenigstens einer der ATI-Promotoren oder eines der Derivate davon Teil einer Expressionskassette sein, die in das Pockenvirusgenom eingeführt wird. Die einen ATI-Promotor oder ein Derivat davon sowie eine codierende Sequenz umfassenden Expressionskassetten können an einem beliebigen Ort des viralen Genoms inseriert werden. Ohne an die folgenden Beispiele gebunden zu sein, können geeignete Insertionsstellen ausgewählt werden aus: (i) nichtessentiellen Genen, wie z.B. dem TK-Gen, (ii) Genen, die für die Replikation des Virus notwendig sind, falls die Funktion des Gens durch die Zelle, die für die Vermehrung des Virus verwendet wird, ergänzt wird; (iii) Zwischengenbereiche des Pockenvirusgenoms, wobei der Begriff "Zwischengenbereich" sich vorzugsweise auf diejenigen Teile des viralen Genoms bezieht, die zwischen zwei benachbarten Genen liegen und keine codierenden Sequenzen umfassen; (iv) natürlich vorkommenden Deletionsstellen des Pockenvirusgenoms. Ein Beispiel für ein Virusgenom mit einer natürlich vorkommenden Deletionsstelle ist das Genom von MVA, in dem bestimmte Bereiche in bezug auf das Genom des Vacciniavirusstamms Copenhagen deletiert sind.
Wie oben angedeutet, sind die Insertionsstellen nicht auf diese bevorzugten Insertionsstellen beschränkt, da es im Umfang der vorliegenden Erfindung liegt, daß die Expressionskassette irgendwo im viralen Genom inseriert werden kann, solange die Möglichkeit besteht, Rekombinante zu erhalten, die in wenigstens einem Zellkultursystem, wie z.B. CEF-Zellen (Chicken Embryo Fibroblasts) bei MVA und anderen Pockenviren, wie etwa Vacciniaviren allgemein sowie Avipoxviren, amplifiziert und vermehrt werden können.
Die unterschiedlichen Expressionskassetten/ATI-Promotoren oder Derivate davon können in unterschiedliche Insertionsstellen im Pockenvirusgenom inseriert werden.
Aus verschiedenen Gründen könnte es bevorzugt sein, mehrere Expressionskassetten in die gleiche Insertionsstelle des Pockenvirusgenoms zu inserieren. Allerdings muß in einem solchen Fall ausgeschlossen werden, daß eine homologe Rekombination zwischen den unterschiedlichen Expressionskassetten stattfindet. Eine homologe Rekombination würde zu rekombinanten Viren führen, bei denen Teile der Expressionskassetten deletiert sind. Da keine signifikanten Teile des Pockenvirusvektorgenoms deletiert sind, sind die erhaltenen Rekombinanten noch lebensfähig. Somit findet keine Selektion auf Viren statt, die mehrere Expressionskassetten in der gleichen Insertionsstelle behalten haben. Um derartige unerwünschte Rekombinationsereignisse zu vermeiden, wurden im Stand der Technik unterschiedliche Promotoren verwendet, falls mehrere Expressionskassetten in die gleiche Insertionsstelle inseriert werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es nun möglich, mehrere Expressionskassetten, die jeweils einen ATI-Promotor oder ein Derivat davon umfassen, in die gleiche Insertionsstelle zu inserieren, da zwischen den Promotoren in den Expressionskassetten keine homologe Rekombination stattfindet.
Somit werden gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wenigstens zwei oder sogar alle Expressionskassetten in die gleiche Insertionsstelle im Pockenvirusgenom inseriert. In diesem Fall sind die unterschiedlichen Expressionskassetten unmittelbar benachbart, wobei zwischen den unterschiedlichen Expressionskassetten keine oder zumindest nur relativ kurze Pockenvirussequenzen liegen.
Die zur Konstruktion rekombinanter Pockenviren benötigten Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise kann die Expressionskassette und/oder der ATI-Promotor oder das Derivat davon in das Pockenvirusgenom durch homologe Rekombination inseriert werden. Hierzu wird eine Nukleinsäure in eine permissive Zellinie transfiziert, wobei die Nukleinsäure die Expressionskassette und/oder den ATI-Promotor oder das Derivat davon mit flankierenden Nukleotidabschnitten, die zu demjenigen Bereich des Pockenvirusgenoms homolog sind, in den die Expressionskassette und/oder der ATI-Promotor oder das Derivat davon inseriert werden soll, umfaßt. Für MVA permissive Zellen sind CEF-Zellen und BAK-Zellen. Die Zellen werden mit dem Pockenvirus infiziert, wobei in den infizierten Zellen eine homologe Rekombination zwischen der Nukleinsäure und dem viralen Genom erfolgt. Andererseits besteht auch die Möglichkeit, zunächst die Zellen mit dem Pockenvirus zu infizieren und danach die Nukleinsäure in die infizierten Zellen zu transfizieren. Dabei findet wiederum eine Rekombination in den Zellen statt. Anschließend wird das rekombinante Pockenvirus durch im Stand der Technik bekannte Verfahren selektioniert. Die Konstruktion rekombinanter Pockenviren ist dabei nicht auf dieses bestimmte Verfahren beschränkt. Stattdessen können hierzu alle dem Fachmann bekannten geeigneten Verfahren verwendet werden.
Der ATI-Promotor im rekombinanten Pockenvirus kann zur Kontrolle der Expression einer (von) beliebigen codierenden Sequenz(en) verwendet werden. Die codierende Sequenz kann dabei vorzugsweise für wenigstens ein antigenes Epitop oder Antigen codieren. In diesem Fall kann das rekombinante Pockenvirus zur Expression des Antigens nach Infektion von Zellen in einem Organismus, z.B. einem Säugetier, einschließlich dem Menschen, verwendet werden. Die Präsentation des Antigens/Epitops kann eine Immunantwort in dem Organismus hervorrufen, die zu einer Impfung des Organismus gegen das Agens, von dem das Antigen/Epitop stammt, führen kann. Insbesondere kann es sich bei dem Epitop/Antigen um einen Teil einer größeren Aminosäurensequenz, wie z.B. eines Polyepitops, Peptids oder Proteins, handeln. Derartige Polyepitope, Peptide oder Proteine können beispielsweise aus (i) Viren, wie z.B. HIV, HTLV, Herpesvirus, Denguevirus, Poliovirus, Masernvirus, Mumpsvirus, Rötelnvirus, Hepatitisviren und so weiter, (ii) Bakterien, (iii) Pilzen stammende Polyepitope, Peptide oder Proteine sein.
Die von den unterschiedlichen Expressionskassetten exprimierten Proteine, Peptide oder Epitope können aus dem gleichen Agens, wie z.B. einem Virus, Bakterien oder einem Pilz stammen. Beispielsweise kann es sich bei allen von den Expressionskassetten exprimierten Produkten um HIV-Proteine handeln. Stammen alle Produkte von dem gleichen Agens, so besteht die Möglichkeit, eine sehr breite Immunantwort gegen das Agens zu induzieren. Andererseits ist es auch möglich, daß die von den unterschiedlichen Expressionskassetten exprimierten Proteine, Peptide oder Epitope aus unterschiedlichen Agentien stammen. Beispielsweise stammen die von den Expressionskassetten in einem Pockenvirusgenom abgeleiteten Produkte aus unterschiedlichen Viren, wie z.B. Mumps-, Masern- und Rötelnvirus. Nach dieser Ausführungsform besteht die Möglichkeit, ein einzelnes rekombinantes Pockenvirus zur Induktion einer Immunantwort gegen mehrere Agentien zu verwenden.
Andererseits kann wenigstens eine der codierenden Sequenzen für eine therapeutische Verbindung, wie beispielsweise Interleukine, Interferone, Ribozyme, Enzyme und so weiter codieren.
Das rekombinante Pockenvirus gemäß der vorliegenden Erfindung kann dem tierischen oder menschlichen Körper nach dem Wissen des Fachmanns verabreicht werden. Somit kann das rekombinante Pockenvirus gemäß der vorliegenden Erfindung als Arzneimittel (d.h. pharmazeutische Zusammensetzung) oder Impfstoff geeignet sein.
Die pharmazeutische Zusammensetzung oder der Impfstoff kann im allgemeinen einen oder mehrere pharmazeutisch unbedenkliche und/oder zugelassene Trägerstoffe, Zusatzstoffe, Antibiotika, Konservierungsmittel, Adjuvantien, Verdünnungsmittel und/oder Stabilisatoren neben dem rekombinanten Pockenvirus enthalten. Bei derartigen Hilfsstoffen kann es sich um Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin, Ethanol, Benetzungsmittel oder Emulgatoren, pH-puffernde Substanzen oder dergleichen handeln. Geeignete Trägerstoffe sind typischerweise große, langsam metabolisierte Moleküle, wie z.B. Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäurecopolymere, Lipidaggregate oder dergleichen.
Zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen oder Impfstoffe wird das rekombinante Pockenvirus in eine physiologisch unbedenkliche Form umgewandelt. Dies kann auf der Grundlage der Erfahrung bei der Herstellung von Pockenvirusimpfstoffen, die zur Impfung gegen Pocken verwendet wurden, durchgeführt werden (wie bei Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 beschrieben). Handelt es sich beispielsweise bei dem Pockenvirus um MVA, so kann das gereinigte Virus mit einem in etwa 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,4 formulierten Titer von 5 × 10⁵ TCID₅₀/ml bei –80°C gelagert werden. Zur Herstellung der Impfstoffinjektionen werden z.B. 10¹–10⁹ Partikel des rekombinanten Virus gemäß der vorliegenden Erfindung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS[= Phosphate Buffered Saline]) in Gegenwart von 2% Pepton und 1% menschlichem Albumin in einer Ampulle, vorzugsweise einer Glasampulle lyophilisiert. Als Alternative können die Impfstoffinjektionen durch schrittweises Gefriertrocknen des Virus in einer Formulierung produziert werden. Diese Formulierung kann zusätzliche Zusatzstoffe, wie z.B. Mannit, Dextran, Zucker, Glycin, Lactose oder Polyvinylpyrrolidon, oder andere Zusatzstoffe, wie z.B. Antioxodantien oder inertes Gas, Stabilisatoren oder rekombinante Proteine, (z.B. menschliches Serumalbumin), die zur In-vivo-Verabreichung geeignet sind, enthalten. Eine typische, für die Gefriertrocknung von rekombinanten MVA geeignete Formulierung umfaßt 10 mM Tris-Puffer, 140 mM NaCl, 18,9 g/l Dextran (MW 36,000–40,000), 45 g/l Saccharose, 0,108 g/l L-Glutaminsäure-Monokaliumsalz-Monohydrat, pH 7,4. Die Glasampulle wird dann verschlossen und kann mehrere Monate zwischen 4°C und Raumtemperatur gelagert werden. Allerdings wird die Ampulle, solange kein Bedarf besteht, vorzugsweise bei Temperaturen unterhalb von –20°C gelagert.
Zur Impfung oder Therapie kann das Lyophilisat in 0,1 bis 0,5 ml einer wäßrigen Lösung, vorzugsweise Wasser physiologischer Kochsalzlösung oder Tris-Puffer, gelöst und entweder systemisch oder lokal, d.h. durch Verabreichung auf parenteralem, intramuskulärem oder einem anderen Weg der Verabreichung, der dem Facharzt bekannt ist, verabreicht werden. Die Art der Verabreichung, die Dosis und die Anzahl der Verabreichungen können vom Fachmann in bekannter Weise optimiert werden.
Somit betrifft gemäß einer verwandten Ausführungsform die Erfindung ein Verfahren zur Beeinflussung, vorzugsweise Induktion, einer immunologischen Antwort in einem lebenden Tierkörper, einschließlich dem Menschen, bei dem man das Virus, die Zusammensetzung oder den Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung dem zu behandelnden Tier oder Menschen verabreicht. Falls es sich bei dem rekombinanten Pockenvirus um ein rekombinantes MVA handelt, umfaßt eine Impfstoffinjektion typischerweise wenigstens 10², vorzugsweise wenigstens 10⁴, stärker bevorzugt wenigstens 10⁶, noch stärker bevorzugt 10⁸–10⁹ TCID₅₀ (Tissue Culture Infectious Dose [Infektiöse Gewebekulturdosis]) des Virus.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Einführung wenigstens zweier codierender Sequenzen in Zielzellen, bei dem man die Zielzellen mit dem Virus gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert. Bei der Zielzelle kann es sich um eine Zelle, in der das Virus replizieren kann, oder eine Zelle, die mit dem rekombinanten Virus infiziert werden kann, in der das Virus jedoch nicht repliziert, wie z.B. allen Arten menschlicher Zellen im Falle von rekombinantem MVA, handeln.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids, Proteins und/oder Virus, bei dem man eine Wirtszelle mit einem rekombinanten Virus gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert, anschließend die infizierte Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert und danach ferner das von der Wirtszelle produzierte Peptid und/oder Protein und/oder die von der Wirtszelle produzierten Viren isoliert und/oder anreichert. Falls das Virus gemäß der vorliegenden Erfindung produziert, d.h. amplifiziert werden soll, so muß es sich bei der Zelle um eine Zelle handeln, in der das Virus replizieren kann, wie z.B. CEF- oder BHK-Zellen im Fall von rekombinanten MVA. Falls ein von dem Virus codiertes Peptid/Protein, vorzugsweise ein von einer codierenden Sequenz codiertes Protein/Peptid, dessen Expression von dem ATI-Promotor oder einem Derivat davon kontrolliert wird, produziert werden soll, so kann es sich bei der Zelle um eine beliebige Zelle handeln, die mit dem rekombinanten Virus infiziert werden kann und die die Expression Pockenvirus-codierter Proteine/Peptide gestattet.
Ferner betrifft die Erfindung Zellen, die mit dem Virus gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert sind.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 und 2: Schematische Darstellung der Rekombinationsvektoren pBN70 (1) und pBN71 (2).
F1A137L = Flanke 1 des Insertionsbereichs; F2A137L = Flanke 2 des Insertionsbereichs; F2rtp = Wiederholung von Flanke 2; prATI = ATI Promotor; pr7.5 = p7.5-Promotor; GUS= GUS-codierender Bereich; NS1= NS1-codierender Bereich; NPTII = Neomycinresistenz; IRES = Interne Ribosomale Eintrittsstelle; EGFP = EGFP(= Enhanced Green Fluorescence Protein)-codierender Bereich, AmpR = Ampicillin resistance gene = Amplicillin Resistenz-Gen.
3: RT-PCT-Test zur Bestimmung der Expression des NS1-Gens in mit MVA-mBN30 (3A) oder MVA-mBN31 (3B) infizierten Zellen. In allen Fällen, in denen eine PCR durchgeführt wurde, waren die Primer für das NS1-Gen spezifisch.

A) M: Molekulargewichtsmarker; Spur 1: Test mit Plasmid pBN70 (Positivkontrolle); Spur 2: Test ohne Zugabe von Nukleinsäuren (Negativkontrolle); Spur 3: PCR mit aus mit MVA-mBN30 infizierten BHK-Zellen isolierter RNA ohne Zugabe von reverser Transkriptase; Spur 4: RT-PCR mit aus mit MVA-mBN30 infizierten BHA-Zellen isolierter RNA; Spur 5: PCR mit aus mit MVA-BN infizierten BHK-Zellen isolierter RNA ohne Zugabe von reverser Transkriptase; Spur 6: RT-PCR mit aus mit MVA-BN infizierten BHK-Zellen isolierter RNA.
B) M: Molekulargewichtsmarker; Spur 1: RT-PCR mit RNA aus mit mBN31 infizierten Zellen; Spur 2: RT-PCR mit RNA aus mit einem unterschiedlichen, das NS1-Gen im Genom enthaltenden rekombinanten MVA infizierten Zellen; Spur 3: RT-PCR mit RNA aus mit MVA-BN infizierten Zellen; Spur 4: PCR mit RNA aus mit mBN31 infizierten Zellen (ohne Zugabe von reverser Transkriptase); Spur 5: PCR mit RNA aus mit einem unterschiedlichen, das NS1-Gen im Genom enthaltenden rekombinanten MVA infizierten Zellen (ohne Zugabe von reverser Transkriptase); Spur 6: PCR mit RNA aus mit MVA-BN infizierten Zellen (ohne Zugabe von reverser Transkriptase); Spur 7: Test mit Plasmid pBN71 (Positivkontrolle); Spur 8: Test ohne Zugabe von Nukleinsäuren (Negativkontrolle);

Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird durch das folgende Beispiel weiter veranschaulicht. Dabei ist dem Fachmann ersichtlich, daß das bereitgestellte Beispiel in keiner Weise so interpretiert werden kann, daß dadurch die Anwendbarkeit der von der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Technologie auf dieses Beispiel beschränkt ist.
Stabile Insertion von zwei durch den Kuhpocken-ATI-Promotor regulierten Fremdgenen in einer einzelnen Stelle des MVA-Genoms.
Das Ziel dieses Beispiels bestand darin, zu zeigen, daß eine Insertion von zwei Fremdgenen, die beide von ATI-Promotor reguliert werden, stabil ist.
Zusammenfassung:
Das folgende Beispiel demonstriert die Stabilität von rekombinantem MVA, das 2 Kopien des ATI-Promotors im viralen Genom umfaßt. Hierzu wurde der Kuhpocken-ATI-Promotor mit dem GUS-Gen (E.coli β-Glucuronidase) bzw. dem nichtstrukturellen (NS)1-Gen des Denguevirus fusioniert. Zum Vergleich wurde das GUS-Gen auch mit dem natürlich vorkommenden Vacciniavirus-Promotor pr7.5 fusioniert. Die ATI-Promotor-NS1-Gen-Expressionskassete sowie entweder die ATI-Promotor-GUS-Gen-Expressionskassette oder die p7.5-Promotor-GUS-Gen-Expressionkassette wurden in einen Rekombinationsvektor inseriert, der zum MVA-Genom homologe Sequenzen enthielt (1 und 2). In den erhaltenen Plasmiden pBN70 (ATI-Promotor-NS1-Gen-Expressionskassette und ATI-Promotor-GUS-Gen-Expressionskassette) bzw. pBN71 (ATI-Promotor-NS1-Gen-Expressionskassette und p7.5-Promotor-GUS-Gen-Expressionskassette) wurden die Expressionskassetten von Sequenzen flankiert, die zu den Sequenzen in dem MVA-Genom, in das die Expressionskassette inseriert werden sollte, homolog waren. Die homologen Sequenzen steuern die Insertion der Expressionskassetten in dem Zwischengenbereich (IGR[Intergenic Region]) 136–137 des MVA-Genoms. CEF-Zellen wurden mit MVA-BN infiziert und mit pBN70 bzw. pBN71 transfiziert. In den Zellen erfolgte eine homologe Rekombination zwischen dem MVA-Genom und den Rekombinationsplasmiden, wobei rekombinante MVA-Genome erhalten wurden. Die Rekombinanten wurden mehreren Runden von Plaqueaufreinigungen unterzogen und in CEF-Zellen passagiert (Gesamtzahl Passagierungen, einschließlich Plaqueaufreinigungen: 20). Die Rekombinanten wurden auf Stabilität, die Expression inserierter Gene sowie die Sequenz rekombinanter MVA-Konstrukte, die zwei unterschiedliche Anordnungen der beiden Promotoren enthielten, getestet. Die Sequenzanalyse, PCR und Funktionstests zeigten, daß die rekombinanten Fragmente korrekt inseriert sind und daß die Insertionen – selbst bei zweifacher Insertion des ATI-Promotors im Genom – stabil und funktionsfähig sind.
Materialien und Geräte:
Primäre CEF-Zellen; MVA-BN mit einem Titer von 108 TCID₅₀/ml; Effektene-Transfektionskit (Qiagen), VP-SFM-Zellkulturmedium (Gibco BRL); G418 (Gibco BRL); DNA Nucleospin Blood Quick Pure Kit (Macherey Nagel); Triple Master DNA-Polymerase (Eppendorf); Oligos (MWG); Sequencing DCTS Quickstart Kit (Beckman Coulter).
Methoden:
Die Rekombinationsvektoren pBN70 und pBN71 (1 und 2) wurden nach dem Fachmann bekannten Standardvorschriften kloniert.
5 × 10⁵ CEF-Zellen wurden pro Transfektionsreaktion in einer Vertiefung einer 6-Loch-Platte ausgesät und über Nacht bei 37°C und 5% CO₂ in VP-SFM gehalten. Die Zellen wurden mit MVA-BN (moi 1.0) in 0,5 ml VP-SFM pro Vertiefung infiziert und 1 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Die Transfektion von liniarisiertem pBN70 und 71 wurde wie in der Herstellervorschrift beschrieben (Qiagen) durchgeführt.
Die erhaltenen rekombinanten Viren wurden mehrere Male unter selektiven Bedingungen (G418, 300 μg/ml) passagiert, und Einzelplaques wurden isoliert, amplifiziert und analysiert, bis aufgereinigte Klone erzeugt wurden. Das analysierte Virus wurde schließlich 20 mal passagiert.
Ergebnisse:
1. Konstruktion rekombinanter Viren
Es wurden zwei rekombinante MVA erzeugt, die NS1- bzw. GUS-Sequenzen unter der Kontrolle zweier unterschiedlicher Promotorkombinationen (ATI-NSI/ATI-GUS oder ATI-NS1/p7.5-GUS) exprimieren. Diese Sequenzen wurden zusammen mit der Selektionskassette IRES/EGFP (Interne Ribosomeneintrittsstelle/EGFP [enhanced green fluorescent protein]) in die 136-137-IGR-Stelle (Zwischengenbereich zwischen ORF A136L und A137L des MVA-Genoms) des MVA-Genoms gemäß dem Fachmann bekannter Verfahren inseriert. Die Viren wurden aufgereinigt und 20 mal unter selektiven Bedingungen passagiert. Beide rekombinante MVA wurden auf den Maßstab einer rohen Stammlösung (1 × 175 cm²-Flasche) amplifiziert. Die ATI-Promotorsequenz in diesem Beispiel entspricht der Sequenz der SEQ ID.: Nr. 1.
2. Expression des EGFP-codierenden Bereichs
Zur Bestimmung der Funktionalität des inserierten Testgens im IGR 136-137, wurde während der Passagierung die Fluoreszenz beobachtet. Wäre das inserierte Gen an dieser Stelle nicht funktionsfähig, so sollte keine Expression von EGFP nachweisbar sein. Mit MVA-mBN30 und MVA-mBN31 infizierte BHK zeigten eindeutig, daß ein im 136-137-IGR inseriertes Gen transkribiert wurde.
3. PCR-Analyse von 136-137 IGR von MVA-mBN30, und MVA-mBN31
Um mögliche Kontaminationen mit leerem Vektor in der IGR-136-137-Stelle auszuschließen und zu überprüfen, ob das virale Genom Insertionen der erwarteten Größe umfaßt, wurde eine PCR-Analyse durchgeführt. Hierzu wurden Primer verwendet, die in den die Insertionsstelle flankierenden Bereichen binden. Bei den erwarteten PCR-Banden für in der Flanke-1- und -2-Stelle bindende Primer handelt es sich um (i) 3,4 kB für das rekombinante MVA-mBN30, (ii) 3,5 kB für das rekombinante MVA-mBN31 und (iii) 212 Bp für den Leervektor MVA-BN. Banden der erwarteten Größe wurden für MVA-mBN30 und MVA-mBN31 gefunden, was darauf hindeutet, daß die Rekombinanten die erwartete Genomstruktur besaßen. In keiner der getesteten MVA-mBN30- oder MVA-mBN31-DNA-Präparationen wurde Wildtypvirus gefunden. Ferner ergab die Leervektorkontrolle MVA-BN (Leervektor) das erwartete 212 Bp große Produkt in beiden rekombinanten MVAs. Bei den Negativkontrollen wurde kein Signal nachgewiesen. Somit wird durch Selektionsdruck eine effiziente Selektion und Trennung von rekombinantem Vektor vom Leervektor MVA-BN erreicht.
4. Sequenzierung des Bereichs 136-137
Die Ergebnisse der Sequenzierung zeigten, daß bei mBN31 und mBN30 Promotoren und GUS ohne Basenpaaränderungen in der IGR-136-137-Stelle inseriert wurden. Bei NS1 wurden in mBN30 ebenso keine Änderungen in der Basenpaarsequenz gefunden. In mBN31 wies NS1 vier Punktmutationen in der Basenpaarsequenz auf (Position 1315: C statt G, Position 1582: G statt A, Position 1961: A statt C und Position 1963: G statt T). Davon führten zwei (in Position 1582 und 1963) zu keinem Austausch von Aminosäuren. Trotz dieser geringen Sequenzabweichungen geht aus den Ergebnissen der Sequenzierung eindeutig hervor, daß beide Rekombinanten, mBN31 und mBN30 die gesamten NS1-Sequenzen umfassen. Zudem läßt sich aus den Sequenzierdaten schließen, daß das NS1-Gen im rekombinanten mBN30, das die zwei ATI-Promotoren enthält, stabil enthalten ist. Die Experimente zeigen die Stabilität der Rekombinanten, obwohl zwei identische ATI-Promotorsequenzen im viralen Genom enthalten sind.
5. Analyse der Expression des NS1-Gens und des GUS-Gens in den Rekombinanten mBN30 und mBN31.
Durch die oben beschriebene PCR und die Sequenzdaten konnte gezeigt werden, daß das NS1-Gen und das GUS-Gen im Genom der Rekombinanten MVA-mBN30 und 31 enthalten sind. Um zu testen, ob diese Gene vom viralen Genom exprimiert werden, wurde eine RT-PCR des NS1-Bereichs sowie ein Funktionstest und eine Quantifizierung der produzierten GUS-Proteine durchgeführt.
5.1 RT-PCR des NS1-Bereichs
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um zu zeigen, daß die Rekombinanten MVa-mBN30 und mBN31, die beide das NS1-Gen in der IGR-136-137-Stelle inseriert enthalten, NS1 als mRNA funktionell exprimieren. BHK-Zellen wurden mit den Viren MVA-mBN30 bzw. mBN31 infiziert. RNA wurde aus diesen Zellen isoliert und für einen RT-PCR-Test verwendet. Die Ergebnisse zeigen eindeutig, daß NS1 von beiden Viren in infizierten BHK-Zellen exprimiert wird. Eine Kontamination mit viraler DNA konnte ausgeschlossen werden, da kein PCR-Signal nachgewiesen wurde, wenn der reverse Transkriptionsschritt weggelassen wurde. Die Wasserkontrolle war negativ, wobei für die Plasmid-Positivkontrolle beider Viren eine klare PCR-Bande gefunden werden konnte (3).
5.2 Messung der GUS-Aktivität
Um die Expression des in MVA-mBN30 und mBN31 inserierten GUS nach 20 Runden Passagierung zu demonstrieren, wurde die GUS-Aktivität quantitativ bestimmt. In Tabelle 1 ist eindeutig zu sehen, daß GUS in beiden rekombinanten Viren exprimiert wurde, während in MVA-BN ohne Insertion keine GUS-Expression gemessen werden konnte.
Tabelle 1: Messung der GUS-Aktivität in MVA-mBN30, MVA-mBN31 und MVA-BN nach 20 Passagierungen. MVA-mBN30 und MVA-mBN31 wurden insgesamt 20 mal passagiert. Die Zellen wurden mit beiden rekombinanten Viren infiziert und nach 24 Stunden in Lysepuffer geerntet. Die GUS-Aktivität wurde nach dem Fachmann bekannten Verfahren gemessen. Aktivitätswerte wurden über die Adsorption bei 415 nm gemessen. Werte < 0,05 und > 2,0 liegen außerhalb des Bereichs.

Verdünnung 1:2 1:10 1:100

mBN 30 0,968 0,224 0,022

mBN 31 0,414 0,089 0,012

BN 0,007 0,007 0,007
Akzeptanzkriterien:
PCR-Analyse von IGR 136-137
In den Spuren der Negativkontrollen sollten keine Banden beobachtet werden, wobei nur eine Bande der erwarteten Größe in der Positivkontrolle beobachtet werden sollte. Für MVA-BN wird ein 212 Bp großes Fragment erwartet.
Sequenzierung und PCR des Bereichs 136-137
Die PCR-Amplifikation der viralen Ziel-DNA mit den Primern sollte ein einzelnes Fragment der erwarteten Länge zeigen. Die Zusammenstellung der Sequenzen sollte zu einer durchgehenden Sequenz führen, die ein doppelsträngiges DNA-Fragment der erwarteten Länge repräsentiert. Kurze einzelsträngige Abschnitte werden akzeptiert, falls in diesem Bereich keine Mutation auftritt. Darüber hinaus dürfen die Enden der durchgehenden Sequenz nur einzelstrangig sein, und zwar aufgrund der heterogenen Beschaffenheit der PCR-Amplifikationsprodukte. Die Sequenz der Testprobe sollte eine Homologie von >/= 97% zur Referenzsequenz oder der entsprechenden Datenbanksequenz zeigen.
RT-PCR von NS1
Keine Banden sollten in den Spuren der Negativkontrollen beobachtet werden, wobei nur eine Bande der erwarteten Größe in der Positivkontrolle beobachtet werden sollte. Für pBN71 wird ein 909 Bp großes Fragment und für pBN70 ein 907Bp großes Fragment erwartet.
Schußfolgerung:
Nach 20 Passagierungen unter selektiven Bedingungen zeigte die PCR-Analyse des 136-137-IGR keine Kontamination mit Leervektor für MVA-mBN13 (ATI-NV1/p7.5-GUS) oder MVA-mBN30 (ATI-NS1/ATI-GUS). Bei MVA-mBN30 zeigte die PCR, daß an der ATI-Stelle keine homologe Rekombination auftrat. MVA-mBN30 und mBN31 wurden durch (1) eine finale PCR zur Demonstration davon, daß die Stammlösung frei von Leervektor ist und daß beide Gene noch inseriert sind, selbst wenn beide unter dem gleichen Promotor in der gleichen IGR-Stelle stehen (für mBN30), (2) Sequenzieren des Bereichs zur Demonstration der unveränderten Rasensequenz und (3) funktionale Expression von GUS mit einem quantitativen GUS-Test und einer RT-PCR für NS1 getestet. Die Ergebnisse der Untersuchung zeigen, daß die Doppelinsertion von zwei unterschiedlichen Genen an der gleichen IGR-Stelle unter der Kontrolle des gleichen Promotors zu keinem Rekombinationsereignis an der Promotorstelle führt, und zwar selbst nach einer hohen Anzahl von Passagierungen. Es konnte gezeigt werden, daß beide inserierten Gene exprimiert werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombinantes Pockenvirus, umfassend im viralen Genom wenigstens zwei Expressionskassetten, die jeweils den Kuhpocken-ATI-Promotor gemäß SEQ ID.: Nr. 1, ein Derivat davon oder eine Teilsequenz des ATI-Promotors sowie eine codierende Sequenz umfassen, wobei die Expression der codierenden Sequenz von dem Promotor, Derivat oder der Teilsequenz reguliert wird und wobei es sich bei dem Derivat des Kuhpocken-ATI-Promotors um eine Sequenz handelt, bei der höchstens 6 Nukleotide in der Sequenz der SEQ ID.: Nr. 1 substituiert, deletiert und/oder inseriert sind, wobei die Teilsequenz des ATI-Promotors eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden der Sequenz der SEQ ID.: Nr. 1 aufweist und wobei der Promotor, das Derivat oder die Teilsequenz die Nukleotide 22 bis 29 der SEQ ID.: Nr. 1 umfaßt und wobei der Promotor, das Derivat oder die Teilsequenz die biologische Aktivität einer Wirkung als Promotor aufweist.
Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 1, wobei der Promotor, das Derivat oder die Teilsequenz die biologische Aktivität einer Wirkung als später Vacciniavirus-Promotor aufweist.
Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Promotoren, Derivate oder Teilsequenzen im rekombinanten Pockenvirus identisch sind.
Rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei wenigstens zwei Expressionskassetten in die gleiche Insertionsstelle im Pockenvirusgenom inseriert werden.
Rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Promotor in wenigstens einer der Expressionskassetten die Sequenz der SEQ ID: Nr. 1 aufweist.
Rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei dem Promotor in wenigstens einer der Expressionskassetten um ein Derivat des ATI-Promotors oder eine Teilsequenz des ATI-Promotors oder ein Derivat davon handelt.
Rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Pockenvirus aus der Gruppe bestehend aus Orthopoxviren und Avipoxviren ausgewählt ist.
Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Orthopoxvirus um ein Vacciniavirus handelt und das Avipoxvirus aus Canarypoxvirus und Fowlpoxvirus ausgewählt ist.
Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 8, wobei es sich bei dem Vacciniavirus um den modifizierten Vacciniavirusstamm Ankara (MVA), insbesondere MVA-BN bzw. MVA 575, hinterlegt unter Nummer V00083008 bzw. V00120707 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), handelt.
Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 9, wobei wenigstens eine der Expressionskassetten in einer natürlich vorkommenden Deletionsstelle des MVA-Genoms in bezug auf das Genom des Vacciniavirusstamms Copenhagen inseriert wird.
Rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei wenigstens eine der Expressionskassetten in einem intergenen Bereich des Pockenvirusgenoms inseriert wird.
Rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei wenigstens eine der codierenden Sequenzen für wenigstens ein Antigen, antigenes Epitop und/oder eine therapeutische Verbindung codiert.
Rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 12 als Impfstoff oder Arzneimittel.
Impfstoff oder pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
Verwendung des rekombinanten Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines Impfstoffs oder Arzneimittels.
Verfahren zur Einführung codierender Sequenzen in Zielzellen, bei dem man die Zielzellen mit dem Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 12 infiziert, wobei es sich bei der Zielzelle nicht um eine Zelle im menschlichen und/oder tierischen Körper handelt.
Verfahren zur Produktion eines Peptids, Proteins und/oder Virus, wobei man in dem Verfahren a) eine Wirtszelle mit dem rekombinanten Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 12 infiziert, b) die infizierte Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert und c) das von der Wirtszelle produzierte Peptid und/oder Protein und/oder die von der Wirtszelle produzierten Viren isoliert und/oder anreichert.
Verwendung eines Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Impfstoffs oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Beeinflussung, vorzugsweise Induktion, einer immunologischen Antwort in einem lebenden tierischen Körper, einschließlich des Menschen.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei mindestens 102 TCID₅₀ (Tissue Culture Infectious Dose) des Virus verabreicht werden.
Zelle, enthaltend das Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
Verfahren zur Produktion eines rekombinanten Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei man in einem Verfahrensschritt wenigstens zwei Expressionskassetten in das Genom eines Pockenvirus inseriert.