ES2288634T3 - Poxvirus recombinante que comprende al menos dos promotores ati de la viruela de las vacas. - Google Patents
Poxvirus recombinante que comprende al menos dos promotores ati de la viruela de las vacas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2288634T3 ES2288634T3 ES03789029T ES03789029T ES2288634T3 ES 2288634 T3 ES2288634 T3 ES 2288634T3 ES 03789029 T ES03789029 T ES 03789029T ES 03789029 T ES03789029 T ES 03789029T ES 2288634 T3 ES2288634 T3 ES 2288634T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- promoter
- sequence
- virus
- recombinant
- recombinant poxvirus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
- C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Poxvirus recombinante que comprende en el genoma viral al menos dos casetes de expresión, cada una de las cuales comprende el promotor ATI de la viruela de las vacas de acuerdo con SEQ ID.: No. 1, un derivado del mismo o una subsecuencia del promotor ATI, y una secuencia codificante, en donde la expresión de la secuencia codificante está regulada por dicho promotor, derivado o subsecuencia y en donde el derivado del promotor ATI de la viruela de las vacas es una secuencia en la cual no más de 6 nucleótidos están sustituidos, delecionados y/o insertados en la secuencia de SEQ ID.: No. 1, en donde la subsecuencia del promotor ATI tiene una longitud de al menos 10 nucleótidos de la secuencia de SEQ ID.: No. 1 y en donde el promotor, derivado o la subsecuencia comprende los nucleótidos 22 a 29 de SEQ ID.: No. 1 y en donde el promotor, derivado o subsecuencia tiene la actividad biológica de ser activo como promotor.
Description
Poxvirus recombinante que comprende al menos dos
promotores ATI de la viruela de las vacas.
La invención se refiere a poxvirus recombinantes
que comprenden en el genoma viral al menos dos casetes de
expresión, cada una de las cuales comprende el promotor ATI de la
viruela de las vacas o un derivado del mismo y una secuencia
codificante, en donde la expresión de la secuencia codificante está
regulada, por dicho promotor o derivado del mismo. El virus puede
ser útil como vacuna o como parte de una composición
farmacéutica.
Los poxvirus recombinantes se utilizan
ampliamente para expresar antígenos extraños en células infectadas.
Además, poxvirus recombinantes se ensayan actualmente como vacunas
muy prometedoras para inducir una respuesta inmunitaria contra
antígenos extraños expresados por el vector del poxvirus. Son muy
populares los poxvirus de aves por una parte y los virus vaccinia
por otra parte. Los documentos US 5.736.368 y US 6.051.410 describen
la cepa Wyeth del virus vaccinia recombinante que expresa antígenos
y proteínas de HIV. El documento US 5.747.324 describe una cepa
NYCPH del virus vaccinia recombinante que expresa genes de
lentivirus. El documento EP 0 243 029 describe una cepa Western
Reserve del virus vaccinia recombinante que expresa genes de
retrovirus humanos. Poxvirus de aves de corral que contienen genes
HIV en el genoma viral se describen en los documentos US 5.736.368
y US 6.051.410.
Para inducir una respuesta inmunitaria eficaz es
deseable expresar no sólo una proteína simple de un agente contra
el cual debe inducirse una respuesta inmunitaria. En lugar de ello,
se prefiere expresar tantas proteínas diferentes y epítopes de
dicho agente como sea posible a fin de obtener una inmunidad amplia
y eficaz contra dicho agente. Así, podría ser ventajoso insertar
varias casetes de expresión diferentes en el mismo genoma poxviral
si se pretende utilizar un poxvirus como vector para vacunación. El
documento US 5.736.368 describe la construcción de un poxvirus
recombinante que alberga casetes de expresión para el gen env de
HIV-1 y el gen gag\cdotpol de
HIV-1. Para la expresión de las proteínas
codificadas por las diferentes casetes de expresión se utilizaron
promotores diferentes, a saber el promotor D1 del virus vaccinia y
el promotor 40K. La ventaja de esta estrategia es que las
actividades de los diferentes promotores no son idénticas, dando
como resultado un nivel diferente de las proteínas expresadas por
las diferentes casetes de expresión.
Podría obtenerse en un nivel de expresión
prácticamente idéntico si los promotores de las diferentes casetes
de expresión en el genoma del poxvirus fuesen idénticos. No
obstante, la desventaja de esta estrategia es que existe un riesgo
de que puedan producirse sucesos de recombinación indeseables entre
las secuencias promotoras homólogas/idénticas. De hecho, ha sido
demostrado, por Howley et al. (Gene (1996) 172,
233-237) que puede generarse un virus vaccinia
recombinante que comprende tres promotores p7.5 en diferentes
localizaciones del genoma viral; sin embargo, la recombinación
ocurría entre las secuencias homólogas del promotor, dando como
resultado una población genómica mixta del poxvirus recombinante.
Una población genómica mixta e indefinida que refleja la
inestabilidad del genoma viral no es aceptable si se pretende
utilizar un poxvirus recombinante para vacunación, en particular
para la vacunación de humanos.
Hänggi et al. (EMBO J. (1986) 5:
1071-1076) caracterizaron el promotor tardío de 11kd
del virus vaccinia por deleciones en 5' y 3' y mutagénesis
orientada, y encontraron un motivo TAAAT conservado.
El objeto de la presente invención fue
proporcionar virus recombinantes estables que albergan al menos dos
casetes de expresión, preferiblemente para genes que no forman parte
naturalmente del genoma poxviral, en donde debería ser posible
producir las proteínas codificadas por dichas al menos dos casetes
de expresión diferentes en cantidades similares.
Este objeto ha sido resuelto por la provisión de
poxvirus recombinantes que comprenden en el genoma viral al menos
dos casetes de expresión, cada una de las cuales comprende el
promotor ATI de la viruela de las vacas o un derivado del mismo y
una secuencia codificante, en donde la expresión de la secuencia
codificante está regulada por dicho promotor o derivado del
mismo.
Se demostró por los autores de la presente
invención que poxvirus que comprenden dos o más copias del promotor
ATI son inesperadamente estables; se demostró que no tenía lugar
suceso alguno detectable de recombinación entre las secuencias
promotoras ATI homólogas o incluso idénticas. Esto está en contraste
con los virus vaccinia que comprenden dos o más promotores p7.5 en
el genoma viral.
De acuerdo con la presente invención, el
poxvirus puede ser cualquier poxvirus en el cual la expresión de
genes debería estar regulada por el promotor ATI o derivado del
mismo. Así pues, los poxvirus pueden ser cualquier virus de la
sub-familia de Chordopoxvirinae y Entomopoxvirinae
(véase Fields Virology, 3rd Edition,
Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, EE.UU.,
capítulo: 83, ISBN 0-7817-0253.4).
Los virus de la subfamilia Chordopoxvirinae son particularmente
preferidos si el poxvirus recombinante se utiliza para expresar
genes en animales mamíferos, con inclusión de humanos. Géneros
particularmente preferidos pertenecientes a la subfamilia
Chordopoxvirinae son Ortopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus,
Capripoxvirus, Leporipoxvirus y Suipoxvirus. Son muy preferidos
Ortopoxvirus y Avipoxvirus. Ejemplos de Avipoxvirus son poxvirus de
canario y poxvirus de aves de corral. Un ejemplo de un Ortopoxvirus
es el virus vaccinia. La cepa del virus vaccinia que puede
utilizarse de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier
cepa del virus vaccinia, tal como las cepas Copenhagen, Temple of
Heaven, Wyeth, Western Reserve, Elstree, NYCBH, etcétera. Es
prácticamente preferida la cepa Modified vaccinia Ankara (MVA). MVA
ha sido generada por 516 pasadas en serie sobre fibroblastos de
embrión de pollo de la cepa Ankara del virus vaccinia (CVA) (para
revisión véase Mayr, A. et al. Infection 3,
6-14 [1975]). Como consecuencia de estas pasadas de
larga duración, el virus MVA resultante delecionaba aproximadamente
31 kilobases de su secuencia genómica y, por consiguiente, fue
descrito como altamente restringido en cuanto a células hospedadoras
para células de ave (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72,
1031-1038 [1991]). Se demostró, en una diversidad
de modelos animales, que el MVA resultante era notablemente
avirulenta (Mayr, A. & Danner K. [1978] Dev. Biol. Stand. 41:
225-34). Adicionalmente, esta cepa de MVA ha sido
ensayada en pruebas clínicas como vacuna para producir inmunización
contra la enfermedad de la viruela humana (Mayr et al., Zbl.
Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987],
Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99,
2386-2392 [1974]).
De acuerdo con la presente invención, puede
utilizarse cualquier cepa de MVA. Ejemplos de cepas del virus MVA
utilizadas de acuerdo con la presente invención y depositadas en
cumplimiento de los requerimientos de Tratado de Budapest son las
cepas MVA572 y MVA575 depositadas en la Colección Europea de
Cultivos de Células Animales (ECACC), Salisbury (Reino Unido) con
los números de depósito ECACC V94012707 y ECACC V00120707,
respectivamente, y MVA\cdotBN con el número de depósito ECACC
V00083008.
La cepa de MVA mas preferida es
MVA-BN o un derivado de la misma. Las
características de MVA-BN, la descripción de los
ensayos biológicos que permiten evaluar si una cepa MVA es
MVA-BN o un derivado del mismo y métodos que
permiten obtener MVA-BN o un derivado del mismo se
exponen en el documento WO 02/42480. El contenido de esta solicitud
se incluye en la presente solicitud por referencia.
En términos generales se prefiere utilizar virus
que no sean dañinos para el animal, con exclusión de un humano, si
el virus se utiliza para vacunar o tratar el animal con inclusión de
un humano. Para humanos particularmente, poxvirus seguros son las
diferentes cepas del virus vaccinia, tales como MVA y avipoxvirus
tales como poxvirus de aves de corral y poxvirus de canario.
Con objeto de propagar los poxvirus, las células
eucariotas se infectan con el virus. Las células eucariotas son
células que son susceptibles de infección con el poxvirus respectivo
y permiten la replicación y producción de virus infeccioso. Tales
células son conocidas por las personas expertas en la técnica para
cada especie de poxvirus. Para MVA, un ejemplo de este tipo de
células son los fibroblastos de embrión de pollo (CEF) y las
células BHK (Drexler I., Heller K., Wahren B., Erfle V. y Sutter G.,
J. Gen. Virol. (1998), 79, 347-352). Las células
CEF pueden cultivarse en condiciones conocidas por las personas
expertas en la técnica. Preferiblemente, las células CEF se
cultivan en medio exento de suero en matraces estacionarios o
frascos rodantes. La incubación tiene lugar preferiblemente de 48 a
96 horas a 37ºC \pm 2ºC. Para la infección, se utiliza
preferiblemente MVA con una multiplicidad de infección (MOI) de
0,05 a 1 TCID_{50} y la incubación requiere preferiblemente de 48
a 72 horas a 37ºC \pm 2ºC.
La secuencia del promotor del gen de la proteína
de inclusión de tipo A del virus de la viruela de las vacas
(promotor ATI) es conocida por las personas expertas en la técnica.
En este contexto se hace referencia al número de acceso de entrada
a Genebank D00319. Una secuencia del promotor ATI preferida se
muestra como SEQ ID: No. 1 y es como sigue:
- 5' GTTTT GAATA AAATT TTTTT ATAAT AAAT 3'
De acuerdo con la presente invención, es posible
utilizar el promotor ATI como se especifica en SEQ ID: No. 1 o
utilizar un derivado del promotor ATI, que puede ser una
subsecuencia de la secuencia de acuerdo con SEQ ID: No. 1. La
expresión "subsecuencia de la secuencia de acuerdo con SEQ ID: No.
1" hace referencia a fragmentos más cortos de la secuencia de
SEQ ID: No. 1 que son todavía activas como promotor, en particular
como promotor tardío del virus vaccinia. Un fragmento típico de la
secuencia de SEQ ID.: No. 1 tiene una longitud de al menos 10
nucleótidos, más preferiblemente de al menos 15 nucleótidos, todavía
más preferiblemente de al menos 20 nucleótidos, muy preferiblemente
de al menos 25 nucleótidos de la secuencia de SEQ ID.: No. 1. La
subsecuencia comprende al menos los nucleótidos 22 a 29 de SEQ ID.:
No. 1, es decir la secuencia
5'-TAATAAAT-3' localizada en el
extremo 3' de SEQ ID.: No. 1.
El promotor puede insertarse aguas arriba de una
secuencia codificante de tal manera que los nucleótidos 28 a 29 de
SEQ ID.: No. 1 (subrayados en la secuencia anterior) forman parte
del codón inicial 5'ATG3' de la traducción. Alternativamente, el
promotor puede estar separado por varios nucleótidos del codón
inicial de la traducción. El espaciador entre el extremo 3' del
promotor de acuerdo con SEQ ID.: No. 1 y la A en el codón inicial
5'ATG3' es preferiblemente menor que 100 nucleótidos, más
preferiblemente menor que 50 nucleótidos y todavía más
preferiblemente menor que 25 nucleótidos. Sin embargo, el espaciador
podría ser incluso más largo siempre que el promotor sea todavía
capaz de dirigir la expresión de la secuencia codificante localizada
aguas abajo del promotor.
El derivado del promotor ATI puede ser también
una secuencia que no tiene más de 6 sustituciones, deleciones y/o
inserciones de nucleótidos con respecto a la secuencia de SEQ ID.:
No. 1 o subsecuencias de la misma, en donde dichos derivados son
todavía activos como promotor, en particular como promotor tardío
del virus vaccinia. Una secuencia que no tiene más de 6
sustituciones de nucleótidos es una secuencia en la cual no más de
6 nucleótidos de la secuencia de acuerdo con SEQ ID.: No. 1 están
sustituidos por nucleótidos diferentes. Una secuencia que no tiene
más de 6 inserciones de nucleótidos es una secuencia en la cual no
más de 6 nucleótidos están insertados en uno o más puntos de la
secuencia de acuerdo con SEQ ID.: No. 1. Una secuencia que tiene no
más de 6 deleciones de nucleótidos es una secuencia en la cual uno o
más nucleótidos de la secuencia de acuerdo con SEQ ID.: No. 1 están
delecionados en uno o más puntos. En los derivados de SEQ ID.: No.
1, pueden estar combinadas deleciones, sustituciones e inserciones
en una sola secuencia. Preferiblemente, el derivado tiene una
homología de al menos 80%, muy preferiblemente de al menos 90%
cuando se compara con la secuencia de SEQ ID.: No. 1. De acuerdo
con la invención reivindicada, en el derivado no más de 6
nucleótidos, todavía más preferiblemente no más de 3 nucleótidos
están sustituidos, delecionados y/o insertados en la secuencia de
SEQ ID.: No. 1.
En particular, los nucleótidos 25 a 29 de SEQ
ID.: No. 1, es decir la secuencia
5'-TAAAT-3 se mantienen en el
promotor para alcanzar actividad promotora máxima. De acuerdo con la
invención reivindicada, los nucleótidos 22 a 29 de SEQ ID.: No. 1,
es decir la secuencia 5'-TAATAAAT-3
se mantienen en el promotor.
Los comentarios anteriores en relación con la
localización del promotor ATI o subsecuencias del mismo son
aplicables también a las secuencias arriba definidas que tienen una
o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de nucleótidos con
respecto a la secuencia de acuerdo con SEQ ID.: No. 1 o con respecto
a subsecuencias de la misma.
Un legajo de documentos de la técnica anterior
permiten a las personas expertas en la técnica predecir cuáles son
los derivados de SEQ ID.: No. 1 que tienen todavía la actividad
biológica de ser activos como promotor vírico de poxvirus, en
particular como promotor tardío del virus vaccinia. En este
contexto, se hace referencia a Chakrarbarti et al.,
Biotechniques (1997) 23, 1094-1097 y Davison y Moss,
J. Mol. Biol. (1989) 210, 771-784. Además, si un
fragmento es activo todavía como promotor de poxvirus, en particular
un promotor tardío del virus vaccinia puede ser comprobado
fácilmente por una persona experta en la técnica. En particular, el
derivado de la secuencia puede clonarse aguas arriba de un gen
informador en un constructo plasmídico. Dicho constructo puede
transfectarse a una célula o línea de células eucariota(s)
tal como células CEF o BHK que ha(n) sido
infectada(s) con un poxvirus. El poxvirus utilizado para la
infección es preferiblemente un poxvirus del mismo género y todavía
más preferiblemente el mismo poxvirus que el poxvirus en cuyo genoma
debe insertarse el promotor. La expresión del gen informador se
determina luego y se compara con la expresión del gen informador
controlado por el promotor de acuerdo con SEQ ID.: No. 1. Un
derivado de acuerdo con la presente invención es preferiblemente un
derivado que tiene una actividad promotora en dicho sistema de
ensayo de al menos 10%, preferiblemente al menos 30%, más
preferiblemente al menos 50%, aún más preferiblemente al menos 70%,
muy preferiblemente al menos 90% comparada con la actividad de la
secuencia promotora de SEQ ID.: No. 1. Asimismo, están dentro del
alcance de la presente invención aquellos derivados de SEQ ID.: No.
1 que tienen una actividad promotora mayor que SEQ ID.: No. 1.
De acuerdo con la presente invención, el
poxvirus recombinante comprende al menos dos casetes de expresión,
cada una de las cuales comprende un promotor ATI o un derivado del
mismo. Dicho de otro modo, el genoma del poxvirus recombinante
puede comprender dos o más promotores ATI o derivados de los mismos.
Los promotores ATI en el genoma viral pueden ser iguales o
diferentes. Así, puede ser que la totalidad de los promotores ATI
tenga la secuencia de acuerdo con SEQ ID.: No. 1. También puede
ocurrir que la totalidad de los promotores ATI sean el mismo
derivado de la secuencia de acuerdo con SEQ ID.: No. 1.
Alternativamente, uno o más de los promotores ATI puede tener la
secuencia de SEQ ID.: No. 1 y uno o más de los promotores ATI en el
mismo genoma poxviral pueden ser derivados de la secuencia de
acuerdo con SEQ ID.: No. 1. Si un genoma poxviral de este tipo
comprende dos o más derivados del promotor ATI, estos derivados
pueden ser iguales o diferentes. De acuerdo con una alternativa
adicional, todos los promotores ATI en el genoma poxviral pueden ser
derivados diferentes de la secuencia de acuerdo con SEQ ID.: No.
1.
En términos generales, la invención se refiere a
pox-virus recombinantes que comprenden al menos dos
promotores ATI o derivados de los mismos en el genoma poxviral.
Así, el genoma poxviral puede comprender v.g. dos, tres, cuatro,
cinco, seis o más promotores ATI o derivados de los mismos en el
genoma viral.
Los promotores ATI o derivados de los mismos son
usualmente parte de casetes de expresión, cada una de las cuales
comprende un promotor ATI de la viruela de las vacas o derivado de
mismo y una secuencia codificante, cuya expresión está regulada por
dichos promotores. Las secuencias codificantes pueden ser secuencias
cualesquiera cuya expresión debería estar controlada por el
promotor ATI o derivado del mismo.
De acuerdo con una alternativa, al menos uno de
los promotores ATI en el genoma poxviral puede utilizarse para
expresar un gen que es ya parte del genoma poxviral. Un gen de este
tipo puede ser un gen que forma parte naturalmente del genoma viral
o un gen extraño que ha sido ya insertado en el genoma poxviral. En
estos casos, el promotor ATI se inserta aguas arriba del gen en el
genoma poxviral, cuya expresión debe ser controlada por el promotor
ATI.
Alternativa o adicionalmente, al menos uno de
los promotores ATI o derivados de los mismos puede ser parte de una
casete de expresión que se introduce en el genoma poxviral. Las
casetes de expresión que comprenden un promotor ATI o derivado del
mismo y una secuencia codificante pueden insertarse en cualquier
punto adecuado del genoma viral. Sin quedar ligados a los ejemplos
que siguen, sitios de inserción adecuados pueden seleccionarse de:
(i) genes no esenciales tales como el gen TK, (ii) genes que son
necesarios para la replicación del virus si la función de dicho gen
está complementada por la célula que se utiliza para la propagación
del virus; (iii) regiones intergénicas del genoma poxviral, en
donde el término "región intergénica" hace referencia
preferiblemente aquellas partes del genoma viral localizadas entre
dos genes adyacentes que no comprenden secuencias codificantes;
(iv) sitios de deleción existentes naturalmente del genoma poxviral.
Un ejemplo de un genoma viral que tiene un sitio de deleción
existente naturalmente es el genoma de MVA, en el cual ciertas
regiones están delecionadas con respecto al genoma de la cepa
Copenhagen del virus vaccinia.
Como se ha indicado arriba, los sitios de
inserción no están restringidos a estos sitios de inserción
preferidos, dado que está dentro del alcance de la presente
invención que la casete de expresión pueda insertarse en cualquier
punto en el genoma viral siempre que sea posible obtener
recombinantes que puedan amplificarse y propagarse en al menos un
sistema de cultivo de células, tales como Fibroblastos de Embrión de
Pollo (células CEF) en el caso de MVA y otros poxvirus tales como
los virus vaccinia en general y poxvirus de aves.
Las diferentes casetes de expresión/promotores
ATI o derivados de los mismos pueden estar insertadas en diferentes
sitios de inserción en el genoma poxviral.
Por diversas razones podría ser preferible
insertar dos o más casetes de expresión en el mismo sitio de
inserción del genoma del poxvirus. No obstante, en tal caso tiene
que excluirse que ocurra recombinación homóloga entre las
diferentes casetes de expresión. La recombinación homóloga podría
conducir a virus recombinantes en los cuales partes de las casetes
de expresión están delecionadas. Dado que no está delecionada
ninguna parte importante del genoma vector poxviral, los
recombinantes resultantes son todavía viables. Así pues, no existe
selección alguna de virus que hayan mantenido dos o más casetes de
expresión en el mismo sitio de inserción. Para evitar tales sucesos
de recombinación indeseables, en la técnica anterior se utilizaban
diferentes promotores si se insertan dos o más casetes de expresión
en el mismo sitio de inserción. De acuerdo con la presente
invención, es ahora posible insertar dos o más casetes de
expresión, cada una de las cuales comprende un promotor ATI o
derivado del mismo en el mismo sitio de inserción dado que no ocurre
recombinación homóloga alguna entre los promotores en las casetes
de expresión.
Así pues, de acuerdo con una realización
preferida, al menos dos, si no la totalidad de las casetes de
expresión, están insertadas en el mismo sitio de inserción en el
genoma poxviral. En este caso, las diferentes casetes de expresión
son directamente adyacentes sin secuencia poxviral alguna entre las
diferentes casetes de expresión o al menos solamente con secuencias
poxvirales más bien cortas entre las diferentes casetes de
expresión.
Los métodos necesarios para construir poxvirus
recombinantes son conocidos por las personas expertas en la
técnica. A modo de ejemplo, la casete de expresión y/o el promotor
ATI o derivado del mismo puede estar insertado(a) en el
genoma poxviral por recombinación homóloga. A este fin, se
transfecta un ácido nucleico en una línea de células permisiva, en
donde el ácido nucleico comprende la casete de expresión y/o el
promotor ATI o derivado del mismo flanqueado(a) por tramos
de nucleótidos que son homólogos a la región del genoma poxviral en
la cual la casete de expresión y/o el promotor ATI o derivado del
mismo debe insertarse. Células permisivas para MVA son células CEF
y células BHK. Las células se infectan con el poxvirus y en las
células infectadas ocurre recombinación homóloga entre el ácido
nucleico y el genoma viral. Alternativamente, es posible también
infectar primeramente las células con el poxvirus y transfectar
luego el ácido nucleico a las células infectadas. De nuevo, tiene
lugar recombinación en las células. El poxvirus recombinante se
selecciona luego por métodos conocidos en la técnica anterior. La
construcción de poxvirus recombinantes no está limitada a este
método particular. En lugar de ello, puede utilizarse a este fin
cualquier método adecuado conocido por las personas expertas en la
técnica.
El promotor ATI en el poxvirus recombinante
puede utilizarse para controlar la expresión de cualquier o
cualesquiera secuencias codificantes. La secuencia codificante
puede codificar preferiblemente al menos un epítope antigénico o
antígeno. En este caso, el poxvirus recombinante puede utilizarse
para expresar dicho antígeno después de infección de las células en
un organismo, v.g. un animal mamífero con inclusión de un humano. La
presentación de dicho antígeno/epítope puede provocar una respuesta
inmune en el organismo, que puede conducir a una vacunación del
organismo contra el agente del que se deriva el antígeno/epítope.
Más específicamente, el epítope/antígeno puede formar parte de una
secuencia de aminoácidos más larga tal como un poliepítope, péptido
o proteína. Ejemplos de tales poliepítopes, péptidos o proteínas
pueden ser poliepítopes, péptidos o proteínas derivados de (i)
virus, tales como HIV, HTLV, Herpesvirus, Denguevirus, Poliovirus,
virus del sarampión, virus de las paperas, virus de la rubéola,
virus de la hepatitis etcétera, (ii) bacterias, (iii) hongos.
Las proteínas, péptidos o epítopes expresados
por las diferentes casetes de expresión pueden derivarse del mismo
agente, tal como un virus, bacteria u hongo. A modo de ejemplo,
todos los productos expresados por las casetes de expresión pueden
ser proteínas HIV. Si todos los productos se derivan del mismo
agente, es posible inducir una respuesta inmunitaria muy amplia
contra dicho agente. Alternativamente, es también posible que las
proteínas, péptidos o epítopes expresados por las diferentes casetes
de expresión se deriven de agentes diferentes. A modo de ejemplo,
los productos derivados de las casetes de expresión en un genoma
poxviral se derivan de virus diferentes, tales como los virus de
las paperas, del sarampión y de la rubéola. De acuerdo con esta
realización, es posible utilizar un poxvirus recombinante para
inducir una respuesta inmune contra varios agentes.
Alternativamente, al menos una de las secuencias
codificantes puede codificar un compuesto terapéutico tal como
interleuquinas, interferones, ribozimas, enzimas, etcétera.
El poxvirus recombinante de acuerdo con la
presente invención puede administrarse al cuerpo animal o humano de
acuerdo con el conocimiento de la persona experta en la técnica.
Así, el poxvirus recombinante de acuerdo con la presente invención
puede ser útil como medicamento (es decir, composición farmacéutica)
o vacuna.
La composición farmacéutica o la vacuna puede
incluir generalmente uno o más vehículos farmacéuticos aceptables
y/o aprobados, aditivos, antibióticos, conservantes, adyuvantes,
diluyentes y/o estabilizadores además del poxvirus recombinante.
Tales sustancias auxiliares pueden ser agua, solución salina,
glicerol, etanol, agentes humectantes o emulsionantes, sustancias
amortiguadoras del pH, o análogas. Vehículos adecuados son moléculas
típicamente grandes que se metabolizan lentamente, tales como
proteínas, polisacáridos, ácidos poli-lácticos,
ácidos poliglicólicos, aminoácidos polímeros, copolímeros de
aminoácidos, agregados lipídicos, o análogos.
Para la preparación de composiciones
farmacéuticas o vacunas, el poxvirus recombinante se convierte en
una forma fisiológicamente aceptable. Esto puede hacerse basándose
en la experiencia en la preparación de vacunas de poxvirus
utilizadas para vacunación contra la viruela (como ha sido descrito
por Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. Med. Wschr. 99,
2386-2392). Por ejemplo, si el poxvirus es MVA, el
virus purificado puede guardarse a -80ºC con un título de
5x10^{8} TCID_{50}/ml formulado en Tris aproximadamente 10 mM,
NaCl 140 mM, pH 7,4. Para la preparación de dosis de vacuna, v.g.,
10^{1}-10^{9} partículas del virus recombinante
de acuerdo con la presente invención se liofilizan en solución
salina tamponada con fosfato (PBS) en presencia de 2% de peptona y
1% de albúmina humana en una ampolla, preferiblemente una ampolla de
vidrio. Alternativamente, las dosis de vacuna pueden producirse por
liofilización gradual del virus en una formulación. Esta formulación
puede contener aditivos adicionales tales como manitol, dextrano,
azúcar común, glicina, lactosa o polivinilpirrolidona u otros
aditivos tales como antioxidantes o gas inerte, estabilizadores o
proteínas recombinantes (v.g. seroalbúmina humana) adecuadas para
administración in vivo. Una formulación típica adecuada para
liofilización de MVA recombinante comprende tampón Tris 10 mM, NaCl
140 mM, 18,9 g/l de dextrano (PM 36.000-40.000), 45
g/l de sacarosa, 0,108 g/l de ácido L-glutámico,
sal monopotásica monohidratada, de pH 7,4. La ampolla de vidrio se
sella luego y puede guardarse entre 4ºC y la temperatura ambiente
durante varios meses. No obstante, en tanto que no exista necesidad
alguna, la ampolla se guarda preferiblemente a temperaturas
inferiores a -20ºC.
Para vacunación o terapia, el liofilizado puede
disolverse en 0,1 a 0,5 ml de una solución acuosa, preferiblemente
agua, solución salina fisiológica o tampón Tris, y administrarse sea
sistémica o localmente, es decir por vía de administración
parenteral, intramuscular o cualquier otra vía conocida por el
técnico experto. El modo de administración, la dosis y el número de
administraciones pueden ser optimizados por los expertos en la
técnica de manera conocida.
Así pues, de acuerdo con una realización afín,
la invención se refiere a un método para afectar, preferiblemente
inducir una respuesta inmunológica en un cuerpo animal vivo con
inclusión de un humano, que comprende administrar el virus, la
composición o la vacuna de acuerdo con la presente invención al
animal o humano a tratar. Si el poxvirus recombinante es un MVA
recombinante, una dosis de vacuna comprende típicamente al menos
10^{2}, preferiblemente al menos 10^{4}, más preferiblemente al
menos 10^{6}, todavía más preferiblemente 10^{8} a 10^{9}
TCID_{50} (dosis infecciosa en cultivo de tejido) del virus.
La invención se refiere adicionalmente a un
método para introducir al menos dos secuencias codificantes en
células diana que comprende la infección de las células diana con el
virus de acuerdo con la presente invención. La célula diana puede
ser una célula en la cual el virus es capaz de replicarse o una
célula que puede estar infectada por el virus recombinante, en la
cual el virus, sin embargo, no se replica, tal como todos los tipos
de células humanas en el caso de MVA recombinante.
La invención se refiere adicionalmente a un
método para producir un péptido, proteína y/o virus que comprende
la infección de una célula hospedadora con un virus recombinante de
acuerdo con la presente invención, seguido por el cultivo de la
célula hospedadora infectada en condiciones adecuadas, y seguido
adicionalmente por el aislamiento y/o enriquecimiento del péptido
y/o la proteína y/o los virus producidos por dicha células
hospedadora. Si se pretende producir, es decir amplificar el virus
de acuerdo con la presente invención, la célula tiene que ser una
célula en la cual el virus sea capaz de replicarse tal como células
CEF o BHK en el caso de MVA recombinante. Si se pretende producir
un péptido/proteína codificado por el virus, preferiblemente una
proteína/péptido codificada(o) por una secuencia
codificante, cuya expresión está controlada por el promotor ATI o un
derivado del mismo, la célula puede ser cualquier célula que pueda
ser infectada por el virus recombinante y que permita la expresión
de proteínas/péptidos codificados por poxvirus.
La invención se refiere adicionalmente a células
infectadas con el virus de acuerdo con la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1 y Figura 2: Representación esquemática
de los vectores de recombinación pBN70 (Figura 1) y pBN71 (Figura
2)
F1A137L = Flanco 1 de la región de inserción;
F2A137L = Flanco 2 de la región de inserción; F2rpt: repetición del
flanco 2; prATI = promotor ATI; pr7.5 = promotor p7.5; GUS = región
codificante GUS; NS1 = región codificante NS1; NPTII: resistencia a
neomicina; IRES = sitio de entrada del ribosoma interno; EGFP =
región codificante de la proteína de fluorescencia verde
incrementada; AmpR = gen de resistencia a la ampicilina.
Figura 3: Ensayo RT-PCT para
determinar la expresión del gen NS1 en células infectadas con
MVA-mBN30 (Figura 3A) o MVA-mBN31
(Figura 3B). En todos los casos en los que se realizó una PCR, el
iniciador era específico para el gen NS1.
- A)M:
- Marcador de peso molecular; pista 1: ensayo con el plásmido pBN70 (control positivo); pista 2: ensayo sin ácidos nucleicos añadidos (control negativo); pista 3: PCR con RNA aislado de células BHK infectadas con MVA-mBN30 sin adición de transcriptasa inversa; pista 4: RT-PCR con RNA aislado de células BHK infectadas con MVA-mBN30; pista 5: PCR con RNA aislado de células BHK infectadas con MVA-BN sin transcriptasa inversa añadida; pista 6: RT-PCR con RNA aislado de células BHK infectadas con MVA-BN.
- B)M:
- Marcador de peso molecular; pista 1: RT-PCR con RNA procedente de células infectadas con mBN31; pista 2: RT-PCR con RNA procedente de células infectadas con un MVA recombinante diferente que comprende el gen NS1 en el genoma; pista 3: RT-PCR con RNA de células infectadas con MVA-BN; pista 4: PCR con RNA de células infectadas con mBN31 (sin adición de transcriptasa inversa); pista 5: PCR con RNA procedente de células infectadas con un MVA recombinante diferente que comprende el gen NS1 en el genoma (sin adición de transcriptasa inversa); pista 6: PCR con RNA de células infectadas con MVA-BN (sin adición de transcriptasa inversa); pista 7: ensayo con el plásmido PBN71 (control positivo); pista 8: ensayo sin ácidos nucleicos añadidos (control negativo).
El ejemplo siguiente ilustrará adicionalmente la
presente invención. Debe quedar bien entendido por la persona
experta en la técnica que el ejemplo proporcionado no puede
interpretarse en modo alguno en un sentido que limite la
aplicabilidad de la tecnología proporcionada por la presente
invención a este ejemplo.
La finalidad de este ejemplo fue demostrar que
una inserción de dos genes extraños regulados ambos por el promotor
ATI es estable.
El ejemplo siguiente demuestra la estabilidad
del MVA recombinante que comprende dos copias del promotor ATI en el
genoma viral. A este fin, el promotor ATI de la viruela de las vacas
se fusionó al gen GUS (\beta-glucuronidasa de
E. coli) y el gen no estructural (NS) 1 del virus del Dengue,
respectivamente. Para comparación, el gen GUS se fusionó también al
promotor pr7.5 del virus vaccinia existente naturalmente. La casete
de expresión promotor ATI-gen NS1 y o bien la
casete de expresión promotor ATI-gen GUS o la casete
de expresión promotor p7.5-gen GUS se insertaron en
un vector de recombinación que comprendía secuencias homólogas al
genoma de MVA. (Fig. 1 y 2). En los plásmidos resultantes pBN70
(casete de expresión promotor ATI-gen NS1 y casete
de expresión promotor ATI-gen GUS) y pBN71 (casete
de expresión promotor ATI-gen NS1 y casete de
expresión promotor p7.5-gen GUS) las casetes de
expresión estaban flanqueadas por secuencias homólogas a las
secuencias en el genoma de MVA en el cual tenía que insertarse la
casete de expresión. Las secuencias homólogas dirigen la inserción
de las casetes de expresión a la región intergénica (IGR)
136-137 del genoma de MVA. Las células CEF se
infectaron con MVA-BN y se transfectaron con pBN70 y
pBN71, respectivamente. En las células homólogas ocurría
recombinación entre el genoma de MVA y los plásmidos de
recombinación, dando como resultado genomas de MVA recombinantes.
Los recombinantes se sometieron a varias tandas de purificación en
placas y se sometieron a pasos en células CEF (número total de
pasos con inclusión de las purificaciones de las placas: 20). Los
recombinantes se ensayaron respecto a estabilidad, expresión de
genes insertados y secuencia de los constructos de MVA
recombinantes que contenían dos disposiciones diferentes de los dos
promotores. El análisis de la secuencia, la PCR y los ensayos
funcionales demostraron que los fragmentos recombinantes están
insertados correctamente y que las inserciones - aun cuando el
promotor ATI se insertó dos veces en el genoma - son estables y
funcionales.
Células CEF primarias; MVA-BN
con un título de 10^{8} TCID_{50}/ml; kit de transfección
Effectene (Qiagen); medio de cultivo de células
VP-SFM (Gibco BRL); G418 (Gibco BRL); Kit DNA
Nucleospin Blood Quick Pure (Macherey Nagel);
DNA-polimerasa Triple Master (Eppendorf); Oligos
(MWG); Kit Sequencing DCTS Quickstart (Beckman Coulter).
Los vectores de recombinación pBN70 y pBN71
(Fig. 1 y 2) se clonaron de acuerdo con protocolos estándar
conocidos por las personas expertas en la técnica.
Se sembraron 5 x 10^{5} células CEF por
reacción de transfección en un pocillo en una placa de 6 pocillos y
se mantuvieron en VP-SFM durante una noche a 37ºC y
5% de CO_{2}. Las células se infectaron con MVA-BN
(moi 1,0) en 0,5 ml de VP-SFM por pocillo y se
incubaron durante 1 h a la temperatura ambiente en un aparato de
sacudidas. La transfección de pBN70 y 71 linealizados se realizó
como se describe en el protocolo del fabricante (Qiagen).
Los virus recombinantes resultantes se
sometieron a pasos varias veces en condiciones selectivas
(G418,
300 \mug/ml) y se aislaron placas individuales, se amplificaron y se analizaron hasta que se generaron clones purificados. El virus analizado finalmente se sometió a pasos 20 veces.
300 \mug/ml) y se aislaron placas individuales, se amplificaron y se analizaron hasta que se generaron clones purificados. El virus analizado finalmente se sometió a pasos 20 veces.
Se crearon dos secuencias NS1 y GUS que
expresaban MVA recombinante bajo control de dos combinaciones
promotoras diferentes
(ATI-NSI/ATI-GUS o
ATI-NS1/p7.5-GUS). Estas secuencias,
junto con la casete de selección IRES/EGFP (sitio de entrada de
ribosoma interno/proteína fluorescente verde intensificada), se
insertaron en el sitio IGR 136-137 (inserción
intergénica entre ORF A136L y A137L del genoma de MVA) del genoma de
MVA de acuerdo con métodos conocidos por las personas expertas en la
técnica. Los virus se purificaron y se sometieron a pasos 20 veces
en condiciones selectivas. Ambos MVA recombinantes se amplificaron a
la escala de stock crudo (un frasco de 175 cm^{2}). La secuencia
promotora ATI en este ejemplo corresponde a la secuencia de SEQ ID.:
No. 1.
A fin de determinar la funcionalidad del gen de
ensayo insertado en la IGR 136-137 se observó la
fluorescencia durante los pasos. Si el gen insertado no fuese
funcional en este sitio, no debería ser detectable expresión alguna
de EGFP. Las células BHK infectadas con MVA-mBN30 y
MVA-mBN31 demostraban claramente que se transcribía
un gen insertado en la IGR 136-137.
Para descubrir las posibles contaminaciones con
vector vacío en el sitio IGR 136-137 y comprobar si
el genoma viral comprende inserciones de tamaño esperado se realizó
un análisis PCR. A este fin, se utilizaron iniciadores que se fijan
en las regiones que flanquean el sitio de inserción. Las bandas PCR
esperadas para los iniciadores que se fijan en el sitio de flanco 1
y 2 son (i) 3,4 kb para el MVA-mBN30 recombinante,
(ii) 3,5 kb para el MVA-mBN31 recombinante y (iii)
212 pb para el vector vacío MVA-BN. Se encontraron
bandas del tamaño esperado para MVA-mBN30 y
MVA-mBN31, lo que indicaba que los recombinantes
tenían la estructura de genoma esperada. No se encontró virus de
tipo salvaje alguno en ninguna de las preparaciones de DNA
MVA-mBN30 o MVA-mBN31 ensayadas.
Adicionalmente, el control de vector vacío MVA-BN
(vector vacío) dio como resultado el producto de 212 pb esperado en
ambos MVAs recombinantes. En los controles negativos no se detectó
señal alguna. Así pues, se obtiene una selección y separación
eficientes del vector recombinante a partir del vector vacío
MVA-BN por presión de selección.
Los resultados de la secuenciación demostraron
que para mBN31 y mBN30 se insertaban promotores y GUS sin cambios
de pares de bases en el sitio IGR 136-137. Para NS1
en mBN30 no se encontró tampoco cambio alguno en la secuencia de
pares de bases. En mBN31, NS1 tenía cuatro mutaciones puntuales en
la secuencia de pares de bases (posición 1315: C en lugar de G,
posición 1582: G en lugar de A, posición 1961: A en lugar de C y
posición 1963: G en lugar de T). Dos de ellas (en las posiciones
1582 y 1963) no daban como resultado cambio alguno de aminoácidos.
Con indiferencia de estas desviaciones de secuencia menores, está
claro por los resultados de la secuenciación que ambos
recombinantes, mBN31 y mBN30, comprenden las secuencias NS1 enteras.
Además, puede llegarse a la conclusión a partir de los datos de
secuenciación que el gen NS1 está comprendido de manera estable en
el mBN30 recombinante que contiene los dos promotores ATI. Los
experimentos demuestran la estabilidad del recombinante aunque se
incluyen dos secuencias promotoras ATI idénticas en el genoma
viral.
La PCR y los datos de secuencia arriba descritos
han revelado que el gen NS1 y el gen GUS están comprendidos en el
genoma de los recombinantes MVA-mBN30 y
MVA-mBN31. Para ensayar si estos genes son
expresados por el genoma viral, se realizaron una
RT-PCR de la región NS1 y un ensayo funcional así
como una cuantificación de las proteínas GUS producidas.
Este experimento se realizó para demostrar que
los MVA-mBN30 y MVA-mBN31
recombinantes, que comprenden ambos el gen NS1 insertado en el
sitio IGR 136-137 expresan funcionalmente NS1 como
mRNA. Se infectaron células BHK con los virus
MVA-mBN30 y MVA-mBN31,
respectivamente. Se aisló RNA a partir de estas células y se utilizó
para un ensayo RT-PCR. Los resultados demuestran
claramente que NS1 es expresado por ambos virus en las células BHK
infectadas. La contaminación por DNA viral podía excluirse, dado que
no se detectó señal alguna de PCR cuando se omitió el paso de
trascripción inversa. El control de agua era negativo y, para el
control positivo del plásmido de ambos virus pudo encontrarse una
banda PCR clara (Figura 3).
Con objeto de demostrar la expresión de GUS
insertado en MVA-mBN30 y mBN31 después de 20 tandas
de pasos, se determinó cuantitativamente la actividad de GUS. La
Tabla 1 muestra claramente que GUS se expresaba en ambos virus
recombinantes, mientras que no pudo medirse expresión alguna de GUS
en MVA-BN sin inserción.
No debería observarse banda alguna en las pistas
de los controles negativos, y sólo debería observarse una banda del
tamaño esperado en el control positivo. Para MVA-BN
se espera un fragmento de 212 pb.
La amplificación por PCR del DNA diana viral con
los iniciadores debería revelar un solo fragmento de la longitud
esperada. El ensamblaje de la secuencia debería dar como resultado
una secuencia contigua representativa de un fragmento de DNA
bicatenario de la longitud esperada. Se aceptan tramos
monocatenarios cortos si no ocurre mutación alguna en esta región.
Adicionalmente, los extremos de la secuencia contigua pueden ser
sólo monocatenarios debido a la naturaleza heterogénea de los
productos de amplificación PCR. La secuencia de la muestra de
ensayo debería exhibir una homología \geq 97% a la secuencia de
referencia de la secuencia respectiva de la base de datos.
No debería observarse banda alguna en las pistas
de los controles negativos, y únicamente debería observarse una
banda del tamaño esperado en el control positivo. Para pBN71 se
espera un fragmento de 909 pb y para pBN70 un fragmento de 907
pb.
Después de 20 pasos en condiciones selectivas,
el análisis PCR de la IGR 136-137 no exhibía
contaminación alguna con vector vacío para MVA-mBN31
(ATI-NS1/p7.5-GUS) o
MVA-mBN30
(ATI-NS1/ATI-GUS). Para
MVA-mBN30 la PCR reveló que no ocurría recombinación
homóloga alguna en el sitio ATI. Se ensayaron
MVA-mBN30 y MVA-mBN31 por (1) PCR
final para demostrar que el stock está exento de vector vacío y que
ambos genes están insertados todavía aun cuando ambos se encuentran
bajo el mismo promotor en el mismo sitio IGR (para mBN30), (2)
secuenciación de la región para demostrar la secuencia de bases
inalterada y (3) expresión funcional de GUS por un ensayo
cuantitativo de GUS y una RT-PCR para NS1. Los
resultados del estudio muestran que la doble inserción de dos genes
diferentes en la misma IGR bajo el control del mismo promotor da
como resultado la ausencia de sucesos de recombinación en el sitio
promotor incluso después de alto número de pasos. Se demostró que se
expresaban ambos genes insertados.
<100> Bavarian Nordic A/S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Poxvirus recombinante que comprende
al menos dos promotores ATI de la viruela de vacas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BN52PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DK PA 2002 01814
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-11-25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la viruela de las vacas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttttgaata aaattttttt ataataaat
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Poxvirus recombinante que comprende en el
genoma viral al menos dos casetes de expresión, cada una de las
cuales comprende el promotor ATI de la viruela de las vacas de
acuerdo con SEQ ID.: No. 1, un derivado del mismo o una
subsecuencia del promotor ATI, y una secuencia codificante, en donde
la expresión de la secuencia codificante está regulada por dicho
promotor, derivado o subsecuencia y en donde el derivado del
promotor ATI de la viruela de las vacas es una secuencia en la cual
no más de 6 nucleótidos están sustituidos, delecionados y/o
insertados en la secuencia de SEQ ID.: No. 1, en donde la
subsecuencia del promotor ATI tiene una longitud de al menos 10
nucleótidos de la secuencia de SEQ ID.: No. 1 y en donde el
promotor, derivado o la subsecuencia comprende los nucleótidos 22 a
29 de SEQ ID.: No. 1 y en donde el promotor, derivado o subsecuencia
tiene la actividad biológica de ser activo como promotor.
2. Poxvirus recombinante de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde el promotor, derivado o subsecuencia
tiene la actividad biológica de ser activo como promotor tardío del
virus vaccinia.
3. Poxvirus recombinante de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde los promotores,
derivados o subsecuencias en el poxvirus recombinante son
iguales.
4. Poxvirus recombinante de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde al menos dos
casetes de expresión están insertadas en el mismo sitio de inserción
en el genoma del poxvirus.
5. Poxvirus recombinante de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el promotor en al
menos una de las casetes de expresión tiene la secuencia de SEQ ID.:
No. 1.
6. Poxvirus recombinante de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el promotor en
al menos una de las casetes de expresión es un derivado del promotor
ATI o una subsecuencia del promotor ATI o un derivado del
mismo.
7. Poxvirus recombinante de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el poxvirus se
selecciona del grupo constituido por ortopoxvirus y avipoxvirus.
8. Poxvirus recombinante de acuerdo con la
reivindicación 7, en donde el ortopoxvirus es un virus vaccinia y
en donde el avipoxvirus se selecciona de poxvirus de canario y
poxvirus de ave de corral.
9. Poxvirus recombinante de acuerdo con la
reivindicación 8, en donde el virus vaccinia es la cepa de virus
vaccinia modificado Ankara (MVA), en particular MVA.BN y MVA575,
depositadas bajo los números V00083008 y V00120707,
respectivamente, en la Colección Europea de Cultivo de Células
Animales (ECACC).
10. Poxvirus recombinante de acuerdo con la
reivindicación 9, en donde al menos una de las casetes de expresión
está insertada en un sitio de deleción existente naturalmente en el
genoma de MVA con respecto al genoma de la cepa Copenhagen del
virus vaccinia.
11. Poxvirus recombinante de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde al menos una de
las casetes de expresión está insertada en una región intergénica
del genoma del poxvirus.
12. Poxvirus recombinante de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde al menos una de
las secuencias codificantes codifica al menos un antígeno, un
epítope antigénico, y/o un compuesto terapéutico.
13. Poxvirus recombinante de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 como vacuna o
medicamento.
14. Vacuna o composición farmacéutica que
comprende un poxvirus recombinante de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12.
15. Uso del poxvirus recombinante de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la preparación
de una vacuna o medicamento.
16. Método para introducir secuencias
codificantes en células diana que comprende la infección de las
células diana con el virus de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en donde la célula diana no es una célula
existente en el cuerpo humano y/o animal.
17. Método para producir un péptido, proteína
y/o virus que comprende:
- a)
- infección de una célula hospedadora con el poxvirus recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12,
- b)
- cultivo de la célula hospedadora infectada en condiciones adecuadas, y
- c)
- aislamiento y/o enriquecimiento del péptido y/o la proteína y/o virus producidos por dicha célula hospedadora.
18. Uso de un virus de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la preparación de una
vacuna o una composición farmacéutica para afectar, preferiblemente
inducir, una respuesta inmunológica en un cuerpo animal vivo con
inclusión de un humano.
19. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, en
donde se administran al menos 10^{2} TCID_{50} (dosis infecciosa
de cultivo de tejidos) del virus.
20. Una célula que contiene el virus de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
21. Un método para la producción de un virus
recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 12, que comprende el paso de insertar al menos dos casetes de
expresión en el genoma de un poxvirus.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA200201814 | 2002-11-25 | ||
| DK200201814 | 2002-11-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2288634T3 true ES2288634T3 (es) | 2008-01-16 |
Family
ID=32337938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03789029T Expired - Lifetime ES2288634T3 (es) | 2002-11-25 | 2003-11-12 | Poxvirus recombinante que comprende al menos dos promotores ati de la viruela de las vacas. |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7300658B2 (es) |
| EP (1) | EP1567653B1 (es) |
| JP (1) | JP2006515170A (es) |
| KR (1) | KR20050083839A (es) |
| CN (1) | CN1717488A (es) |
| AT (1) | ATE365220T1 (es) |
| AU (1) | AU2003293675B2 (es) |
| CA (1) | CA2501168A1 (es) |
| CY (1) | CY1106883T1 (es) |
| DE (1) | DE60314541T2 (es) |
| DK (1) | DK1567653T3 (es) |
| EA (1) | EA012723B1 (es) |
| ES (1) | ES2288634T3 (es) |
| IL (1) | IL167844A (es) |
| MX (1) | MXPA05005549A (es) |
| NO (1) | NO20053125L (es) |
| NZ (1) | NZ540156A (es) |
| PL (1) | PL375740A1 (es) |
| PT (1) | PT1567653E (es) |
| UA (1) | UA85379C2 (es) |
| WO (1) | WO2004048582A2 (es) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002042480A2 (en) * | 2000-11-23 | 2002-05-30 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia ankara virus variant |
| US7501127B2 (en) | 2002-05-16 | 2009-03-10 | Bavarian Nordic A/S | Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara |
| DK1407033T3 (da) * | 2002-05-16 | 2006-05-22 | Bavarian Nordic As | Intergeniske områder som insertionssteder i genomet af Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA) |
| US20090098529A1 (en) * | 2006-10-16 | 2009-04-16 | Nanhai Chen | Methods for attenuating virus strains for diagnostic and therapeutic uses |
| US20110052627A1 (en) * | 2008-06-20 | 2011-03-03 | Paul Chaplin | Recombinant modified vaccinia virus measles vaccine |
| NZ591662A (en) | 2008-11-21 | 2012-10-26 | Bavarian Nordic As | Vector comprising multiple homologous nucleotide sequences |
| US8394385B2 (en) * | 2009-03-13 | 2013-03-12 | Bavarian Nordic A/S | Optimized early-late promoter combined with repeated vaccination favors cytotoxic T cell response against recombinant antigen in MVA vaccines |
| US9567331B2 (en) | 2011-11-15 | 2017-02-14 | Trustees Of Boston University | Pyridopyrimidinone inhibitors of viruses |
| US11701418B2 (en) * | 2015-01-12 | 2023-07-18 | Geovax, Inc. | Replication-deficient modified vaccinia Ankara (MVA) expressing Ebola virus glycoprotein (GP) and matrix protein (VP40) |
| KR20160140075A (ko) | 2015-05-29 | 2016-12-07 | 코오롱생명과학 주식회사 | 폭스바이러스 유래 프로모터 및 이를 포함하는 벡터 |
| FR3042121A1 (fr) | 2015-10-08 | 2017-04-14 | Jean-Marc Limacher | Composition anti-tumorale |
| AU2016360763B2 (en) * | 2015-11-24 | 2020-11-05 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Stable cell lines for retroviral production |
| WO2017089307A1 (en) * | 2015-11-24 | 2017-06-01 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Transient transfection method for retroviral production |
| JP7150611B2 (ja) | 2016-01-08 | 2022-10-11 | ジオバックス・インコーポレイテッド | 腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘起するための組成物及び方法 |
| BR112018015696A2 (pt) | 2016-02-03 | 2018-12-26 | Geovax Inc | composições e métodos para gerar uma resposta imune para um flavivírus |
| RU2021128158A (ru) * | 2016-08-09 | 2022-04-07 | Сити Оф Хоуп | Композиции химерного поксвируса и их применение |
| US11311612B2 (en) | 2017-09-19 | 2022-04-26 | Geovax, Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5443964A (en) * | 1987-08-10 | 1995-08-22 | Duke University | Poxvirus insertion/expression vector |
| US5759841A (en) * | 1990-11-20 | 1998-06-02 | Virogenetics Corporation | Immunological composition of measles virus utilizing recombinant poxvirus |
| UA68327C2 (en) * | 1995-07-04 | 2004-08-16 | Gsf Forschungszentrum Fur Unwe | A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals |
| MY150893A (en) * | 1996-09-24 | 2014-03-14 | Bavarian Nordic As | Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |
| ATE412762T1 (de) * | 1999-05-28 | 2008-11-15 | Helmholtz Zentrum Muenchen | Vektor zur integration von heterologen sequenzen in poxvirusgenomen |
| MXPA03001680A (es) * | 2000-08-29 | 2004-11-01 | Wyeth Corp | Empaque de particulas de un replicon del virus de acido ribonucleico (arn) de hebra positiva. |
-
2003
- 2003-11-12 EA EA200500879A patent/EA012723B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-11-12 DK DK03789029T patent/DK1567653T3/da active
- 2003-11-12 WO PCT/EP2003/012610 patent/WO2004048582A2/en active IP Right Grant
- 2003-11-12 PL PL03375740A patent/PL375740A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2003-11-12 EP EP03789029A patent/EP1567653B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-12 CN CNA2003801040985A patent/CN1717488A/zh active Pending
- 2003-11-12 DE DE60314541T patent/DE60314541T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-12 PT PT03789029T patent/PT1567653E/pt unknown
- 2003-11-12 US US10/535,371 patent/US7300658B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-11-12 UA UAA200506292A patent/UA85379C2/ru unknown
- 2003-11-12 AU AU2003293675A patent/AU2003293675B2/en not_active Ceased
- 2003-11-12 KR KR1020057007295A patent/KR20050083839A/ko active IP Right Grant
- 2003-11-12 JP JP2004554335A patent/JP2006515170A/ja active Pending
- 2003-11-12 NZ NZ540156A patent/NZ540156A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-11-12 AT AT03789029T patent/ATE365220T1/de active
- 2003-11-12 ES ES03789029T patent/ES2288634T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-12 CA CA002501168A patent/CA2501168A1/en not_active Abandoned
- 2003-11-12 MX MXPA05005549A patent/MXPA05005549A/es active IP Right Grant
-
2005
- 2005-04-04 IL IL167844A patent/IL167844A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-06-24 NO NO20053125A patent/NO20053125L/no not_active Application Discontinuation
-
2007
- 2007-09-20 CY CY20071101220T patent/CY1106883T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL167844A (en) | 2011-03-31 |
| AU2003293675A1 (en) | 2004-06-18 |
| AU2003293675B2 (en) | 2009-04-23 |
| CY1106883T1 (el) | 2012-09-26 |
| MXPA05005549A (es) | 2005-08-16 |
| WO2004048582A2 (en) | 2004-06-10 |
| UA85379C2 (ru) | 2009-01-26 |
| WO2004048582A3 (en) | 2004-08-12 |
| NZ540156A (en) | 2006-11-30 |
| EP1567653B1 (en) | 2007-06-20 |
| NO20053125D0 (no) | 2005-06-24 |
| ATE365220T1 (de) | 2007-07-15 |
| US20060153874A1 (en) | 2006-07-13 |
| CA2501168A1 (en) | 2004-06-10 |
| NO20053125L (no) | 2005-06-24 |
| EA012723B1 (ru) | 2009-12-30 |
| DE60314541D1 (de) | 2007-08-02 |
| DE60314541T2 (de) | 2008-02-28 |
| DK1567653T3 (da) | 2007-10-15 |
| EP1567653A2 (en) | 2005-08-31 |
| PL375740A1 (en) | 2005-12-12 |
| EA200500879A1 (ru) | 2005-10-27 |
| CN1717488A (zh) | 2006-01-04 |
| KR20050083839A (ko) | 2005-08-26 |
| PT1567653E (pt) | 2007-10-01 |
| JP2006515170A (ja) | 2006-05-25 |
| US7300658B2 (en) | 2007-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4693092B2 (ja) | ポックスウイルスゲノムに挿入された相同遺伝子を発現させる組換えポックスウイルス | |
| JP4421188B2 (ja) | 変性ワクシニアアンカラウイルス変異体 | |
| ES2288634T3 (es) | Poxvirus recombinante que comprende al menos dos promotores ati de la viruela de las vacas. | |
| JP2011067219A (ja) | 改変ワクシニアウイルスアンカラにおける発現用プロモーター | |
| ES2256747T3 (es) | Expresion de genes en el virus de la vacuna modificado, usando el promotor ati de la viruela de la vaca. | |
| JP2005534326A (ja) | アビポックスウイルスの力価を増加させるためのワクシニアウイルス宿主域遺伝子 |