CN101220374B - 鸡痘病毒双基因表达载体（pg7.5n） - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鸡痘病毒双基因表达载体，其具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，包括启动子P7.5、LacZ基因、位于LacZ基因上的多克隆位点、稀有酶切位点Not1、鸡痘病毒DNA同源臂F11L1和F11L2、AmpR抗性标记基因、复制起点(ori)。本发明构建的双基因表达载体，最大限度地减少了载体长度，从而可以容纳更大的外源基因；增加了可用酶切位点数量，方便克隆不同的外源基因；对插入位点Not1处的启动子不作限定，可以自由选择与外源基因搭配的启动子，从而提高了表达效率，并且，采用反式表达的方法，从而提高了外源基因的表达效率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸡痘病毒双基因表达载体、其构建方法及应用。
背景技术
痘病毒科是一大群、专性的病毒，直径300～400nm，脂质蛋白外壳，包绕着一个复杂的核心结构此结构含有一个线性近20kb双链DNA分子，编码多个亚单位，DNA依赖的RNA聚合酶，转录因子，帽结构和甲基化酶，多聚A聚合酶，都在病毒核心中包装，并转译成mRNAs。鸡痘病毒(Fowlpox Virus，FPV)属痘病毒科禽痘病毒属。病毒粒子核心含有双股线状DNA，G+C＝35％，基因组长约300kb。其自然条件下只能感染禽类，但能对哺乳动物细胞产生流产性感染，不产生有感染性的病毒粒子，但能表达、提呈FPV表达的蛋白，刺激机体产生对FPV表达蛋白的免疫。因此FPV不仅可以作为禽类基因工程活疫苗载体，而且可以作为哺乳动物非复制型活疫苗载体。、
目前，现有的鸡痘病毒载体还不完善，如载体太大，可载的外源基因长度有限，可用的酶切位点不多，操作繁琐。而且，双基因表达载体多为顺式表达，对第二个基因的表达量有一定的降低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡痘病毒双基因表达载体(PG7.5N)；
本发明的另一个目的在于提供上述载体的构建方法；
本发明的再一个目的在于提供上述载体在真核表达和构建重组病毒基因疫苗中的应用。
本发明的表达载体具有序列表SEQ ID NO.1所示的序列，其包括启动子P7.5、LacZ基因、位于LacZ基因上的多克隆位点、稀有酶切位点Not1、鸡痘病毒DNA同源臂F11L1和F11L2、AmpR抗性标记基因、复制起点(ori)。其中F11L1和F11L2为载体的同源臂，F11L1的跨度是2169-2637，长为468bp；F11L2的跨度是3082-3592，长为510bp；Amp+ori的跨度是1-2168；Not1跨度是2638-2646；P7.5LacZ跨度是2650-3068。F11L基因为痘病毒的非必需基因，长约1000bp。
对于上述的抗性标记，其还可以为KanR或TetR等抗性标记基因。
本发明还提供了构建上述载体的方法，其包括如下步骤：
1)以pGEM4z为模板，Amp+ori F和Amp+ori R为引物，扩增出pGEM4z的Amp+ori片段；以鸡痘病毒DNA为模板，F11L1F和F11L1+Not1R为引物，扩增出鸡痘病毒F11L1同源臂；连接Amp+ori片段和F11L1同源臂，转化JM109感受态细胞，筛选出阳性菌落，扩大培养后抽提质粒，得到pAmp+ori+F11L1 Not1；
2)以pGEM4z为模板，P7.5LacZ F和LacZ R为引物，扩增出P7.5LacZ片段；线性化pAmp+ori+F11L1 Not1并与P7.5LacZ片段连接，转化JM109感受态细胞，筛选出阳性菌落，扩大培养后抽提质粒得到pAmp+ori+F11L1 Not1+P7.5LacZ；
3)以鸡痘病毒DNA为模板，PolyA+F11L2F和F11L2为引物，扩增出鸡痘病毒F11L2同源臂；线性化pAmp+ori+F11L1Not1+P7.5LacZ并与F11L2同源臂连接，转化JM109感受态细胞，筛选出阳性菌落，扩大培养后抽提质粒，即得到鸡痘病毒双基因表达载体。
上面所述的引物分别是：
Amp+ori F：5’gcgtaatcatggtcatagc3’
Amp+ori R：5’acgtcaggtggcactttt3’
P7.5LacZ F：
5’aaaaattgaaaaactagtctaatttattgcacggatgaccatgattacgccaag3’
LacZ R：5’ctatgcggcatcagagca3’
F11L1 F：5’ctagatgaacatgacacc3’
F11L1+Not1 R：5’ttttgcggccgcgcattacgtgttgtttgtt3’
PolyA+F11L2 F：5’aaaaaaaaaaaaaagataatttctgctta3’
F11L2 R：5’cttctttagaggaaatcg3’
上述表达载体，与鸡痘病毒重组后，可以获得重组病毒FPV-PG7.5LacZ，其在含有X-gal的培养基上培养呈蓝色。重组病毒经过装有目的基因的表达载体穿梭后(装有目的基因的两臂之间的片段相交换)，挑选白色蚀斑，经纯化的白色蚀斑即为可以表达目的基因的重组鸡痘病毒。该重组病毒除了表达目的基因外不表达其他外源性蛋白，可以降低接种重组病毒后机体的应激反应。
上述重组病毒FPV-PG7.5LacZ亦可作为病毒载体。该重组病毒，具有GC含量高的Not1稀有酶切位点，由于痘病毒本身基因组长度为260kb-280kb，该病毒可以装载比较大的DNA片段，还可以用作装载在细菌内不稳定的DNA序列。
在本发明表达载体的Not1位点装入连有P7.5启动子和polyA尾巴的目的基因片段，将该穿梭载体穿梭鸡痘活疫苗(I)纯化出蓝色蚀斑病毒，之后再将另一个目的基因装入已经在Not1装上一个目的基因的表达载体的多克隆位点上，将这个质粒与之前纯化的篮斑毒再重组，挑取白色蚀斑，纯化后的白色蚀斑毒即为可以表达两个基因的重组痘病毒。并且，上述连接有P7.5启动子和polyA尾巴的目的基因片断具有一定的灵活性，可以根据需要将P7.5替换为不同的启动子，并且可以反向插入到载体中，采用反式表达的方法提高表达效率。
本发明构建的双基因表达载体，最大限度地减少了载体长度，从而可以容纳更大的外源基因；增加了可用酶切位点数量，方便克隆不同的外源基因；对插入位点Not1处的启动子不作限定，可以自由选择与外源基因搭配的启动子，可以用于启动子效率的评估，从而可以提高表达效率；采用反式表达的方法，从而提高了外源基因的表达效率。
附图说明
附图1是本发明实施例1表达载体的结构示意图，图中F11L1、F11L2表示同源臂，AmpR是卡那霉素抗性标记基因，Ori表示复制起点，P7.5是启动子，MCS表示多克隆位点；
图2是PG7.5-S1-N质粒的构建图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例将以SEQ ID NO.1所示的表达载体为例来具体描述其构建方法及应用。
1.材料
鸡痘活疫苗(I)购自乾元浩南京生物制药厂。pGEM4z购自华美生物工程有限公司。6孔细胞培养板、DMEM、Opti-MEM和Lipofatamine2000购自Invitrogen。X-gal，低熔点琼脂糖，T4多聚核苷酸激酶、PrimeSTARTMHS DNA polymerase和DNA LigationKit(Mighty Mix)购自Takara。Gel Extraction Kit和Plasmid miniKit(200)购自Omega。JM109感受态细胞购自Takara。所用引物与说明书中相同。
2.构建方法
2.1穿梭质粒构建方法
以pGEM4z为模板，Amp+ori F和Amp+ori R为引物，98℃15s，50℃ 15s，72℃ 2min，30个循环，扩增出pGEM4z的Amp+ori片段。以鸡痘活疫苗为模板，F11L1 F和F11L1+Not1 R为引物，98℃ 15s，50℃ 15s，72℃ 40s，30个循环，扩增出鸡痘病毒F11L1同源臂。回收Amp和ori片段和F11L1同源臂，按T4多聚核苷酸激酶的说明书操作磷酸化F11L1同源臂的5’端羟基，按照DNALigation Kit(Mighty Mix)说明书操作将磷酸化的F11L1同源臂和Amp和ori片段连接后转化入JM109感受态细胞，培养14-16小时后，挑取可疑阳性菌落于含有Ampicilline的LB液体培养基中培养4小时，以F11L1F和Amp+ori R为检测引物，对可疑菌落进行菌液PCR检测，鉴定阳性菌落后，扩大培养阳性菌落后利用Plasmid miniKit(200)抽取阳性质粒，该质粒即为pAmp+ori+F11L1 Not1。
以pAmp+ori+F11L1 Not1为模板，Amp+ori F和F11L1+Not1 R为引物，98℃ 15s，50℃ 15s，72℃ 2min20s，30个循环，把pAmp+ori+F11L1 Not1线性化。以pGEM4z为模板，P7.5LacZ F和LacZ R为引物，98℃ 15s，45℃ 15s，72℃ 40s，30个循环，扩增出P7.5LacZ，回收线性化的pAmp+ori+F11L1 Not1和P7.5LacZ，按T4多聚核苷酸激酶的说明书操作磷酸化P7.5LacZ同源臂的5’端羟基，连接磷酸化的P7.5LacZ和线性化的pAmp+ori+F11L1 Not1后转化入JM109感受态细胞，培养14-16小时后，挑取可疑阳性菌落于含有Ampicilline的LB液体培养基中培养4小时，以F11L1 F和LacZR为检测引物，对可疑菌落进行菌液PCR检测，鉴定阳性菌落后，扩大培养阳性菌落后利用Plasmid mini Kit(200)抽取阳性质粒，该质粒即为pAmp+ori+F11L1 Not1+P7.5LacZ。
以pAmp+ori+F11L1 Not1+P7.5LacZ为模板，Amp+ori F和LacZR为引物，98℃ 15s，50℃ 15s，72℃ 3min，30个循环，把pAmp+ori+F11L1 Not1+P7.5LacZ线性化。以鸡痘活疫苗为模板，PolyA+F11L2 F和F11L2 R为引物，98℃ 15s，50℃ 15s，72℃ 40s，30个循环，扩增出鸡痘病毒F11L2同源臂。回收线性化的pAmp+ori+F11L1 Not1+P7.5LacZ和F11L2同源臂，按T4多聚核苷酸激酶的说明书操作磷酸化F11L2同源臂的5’端羟基，按照DNALigation Kit(Mighty Mix)说明书操作将磷酸化的F11L2同源臂和线性化的pAmp+ori+F11L1 Not1+P7.5LacZ连接后转化入JM109感受态细胞，培养14-16小时后，挑取可疑阳性菌落于含有Ampicilline的LB液体培养基中培养4小时，以F11L1 F和F11L2 R为检测引物，对可疑菌落进行菌液PCR检测，鉴定阳性菌落后，扩大培养阳性菌落后利用Plasmid mini Kit(200)抽取阳性质粒，该质粒即为pG7.5N。
2.1FPV重组篮斑毒的构建
按Lipofatamine2000的操作说明书操作，将pG7.5N转染入已经感染鸡痘活疫苗(I)的鸡胚成纤维细胞的6孔细胞培养板上，培养60小时后，收取病毒液。将病毒液感染鸡胚成纤维细胞，感染1小时后弃去病毒液，铺上一层1％的低熔点琼脂糖，培养24小时后再铺上另一层含X-gal的低熔点琼脂糖，继续培养3-5天后，挑取可疑的蓝绿色蚀斑。以蓝绿色蚀斑为模板，P7.5LacZ F和LacZ R为引物，对可疑蓝绿色蚀斑进行PCR检测，选择阳性蚀斑后，再经过3代的蚀斑纯化，直到所产生的蚀斑全为蓝绿色为止，将该纯化后的重组鸡痘病毒命名为FPV-PG7.5LacZ。
3.应用：
以传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因和NP基因在痘病毒载体中的表达与生物活性的检测为例。
1、构建PG7.5N-S1-NP质粒
根据S1基因设计扩增S1基因ORF的引物，该引物对分别带NotI酶切位点和P7.5启动子，将扩增产物转入pMD18-T载体(购自Takara)，测序正确后，用Not I酶切并和经Not I酶切后的PG7.5N连接，转化大肠杆菌Top10(购自天根生化科技有限公司)，挑选阳性菌落，提取质粒，得到PG7.5N-S1质粒。根据N基因设计扩增N基因ORF的引物，该引物对分别带有BamH I和Hind III酶切位点，将扩增产物转入pMD18-T载体，测序正确后，用BamH I/Hind III双酶切，并和经BamH I/Hind III双酶切后的PG7.5N连接，转化大肠杆菌Top10，挑选阳性菌落，提取质粒，得到PG7.5N-NP质粒。用BamH I/Hind III双酶切PG7.5N-S1和PG7.5N-NP，连接后转化大肠杆菌Top10，挑选阳性菌落，提取质粒，得到PG7.5N-S1-NP质粒。
上面所用的引物是：
NP引物：
M41NP1：5′CTAAGCTTCATGGCAAGCGGTAAGGCAACTG3′
M41NP2：5′GCGAATTCTCAAAGTTCATTCTCTCCTAGG3′
S1引物：
M41S1F：5’aattGCGGCCGCatgttggtaacacctctt3’
M41S1R：5’ttaaGCGGCCGCtaacgtctaaaacgacgtgtt3’
2、同源重组：
病毒：FPV 282E4购自乾元浩南京生物药厂(鸡痘活疫苗I)，转染试剂：Lipofectamine 2000(Invitrogen)
FPV 282E4接种CEF(鸡胚成纤维细胞)适当时间后转染质粒PG7.5N-S1，经IPTG+X-Gal诱导后筛选阳性重组病毒FPV-IBVS1，纯化后得到驯化的能产生蓝斑的重组病毒FPV-IBVS1。
用质粒PG7.5N-NP转染上述重组病毒FPV-IBVS1的宿主CEF，经二次同源重组并挑选白斑获得重组病毒FPV-IBVNP；
用质粒PG7.5N-S1-N转染上述重组病毒FPV-IBVS1的宿主CEF，经二次同源重组并挑选白斑获得重组病毒FPV-IBVS1-NP。
三个重组病毒FPV-IBVS1、FPV-IBVNP、FPV-IBVS1-NP经过若干代次传代后测定其稳定性。
用于对照的载体为ADeno vator购自Qbiogen，装入S1基因及NP基因得到rAD-S1-NP表达载体。
FPV-IBVS1-NP及rAD-S1-NP在相同条件下分别在大肠杆菌Top10中表达。
结果：采用SynGene GeneGenius凝胶成像系统对采用表达蛋白的Westenblot纤维膜进行蛋白量估算。rAd-S1-NP载体的第一蛋白(S1)的表达量约为95-110mg/L，而第二蛋白(NP)的表达量约为15-30mg/L，远低于S1蛋白的表达量。而采用PG7.5N载体，第一蛋白(S1)的表达量为95-120mg/L，与rAd-S1-NP载体表达量相近。但第二蛋白(NP)的表达量为85-110mg/L，远高于rAd-S1-NP载体NP蛋白的表达量。(由于进行了三次以上的重复实验，上述数据为估算值的变动范围)
序列表
<110>华南农业大学
<120>鸡痘病毒双基因表达载体(PG7.5N)
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>3592
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
Claims (4)
1.鸡痘病毒双基因表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种构建权利要求1所述表达载体的方法，其包括如下步骤：
1)以PGEM4z为模板，Amp+ori F和Amp+ori R为引物，扩增出PGEM4z的Amp+ori片段；以鸡痘病毒DNA为模板，F11L1F和F11L1+Not 1 R为引物，扩增出鸡痘病毒F11L1同源臂；连接Amp+ori片段和F11L1同源臂，转化JM109感受态细胞，筛选出阳性菌落，扩大培养后抽提质粒，得到pAmp+ori+F11L1 Not 1；
2)以PGEM4z为模板，P7.5LacZ F和LacZ R为引物，扩增出P7.5LacZ片段；线性化pAmp+ori+F11L1 Not 1并与P7.5LacZ片段连接，转化JM109感受态细胞，筛选出阳性菌落，扩大培养后抽提质粒得到pAmp+ori+F11L1 Not 1+P7.5LacZ；
3)以鸡痘病毒DNA为模板，PolyA+F11L2F和F11L2R为引物，扩增出鸡痘病毒F11L2同源臂；线性化pAmp+ori+F11L1Not1+P7.5LacZ并与F11L2同源臂连接，转化JM109感受态细胞，筛选出阳性菌落，扩大培养后抽提质粒，即得到鸡痘病毒双基因表达载体；
所述的引物分别为：
Amp+ori F：5’gcgtaatcatggtcatagc3’；
Amp+ori R：5’acgtcaggtggcactttt3’；
P7.5LacZ F：5’aaaaattgaaaaactagtctaatttattgcacggatgaccatgattacgccaag3’；
LacZ R：5’ctatgcggcatcagagca3’；
F11L1 F：5’ctagatgaacatgacacc3’；
F11L1+Not1 R：5’ttttgcggccgcgcattacgtgttgtttgtt3’；
PolyA+F11L2 F：5’aaaaaaaaaaaaaagataatttctgctta3’；
F11L2 R：5’cttctttagaggaaatcg3’。
3.权利要求1所述的表达载体在真核表达中的应用。
4.权利要求1所述的表达载体在构建重组病毒基因疫苗中的应用。
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