CN117264909A - 反式互补缺陷猴痘病毒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了反式互补缺陷猴痘病毒及其应用。本申请的第一方面,提供一种生物材料,该生物材料可以是分离的核酸分子,包括猴痘病毒全基因组的核酸序列,核酸序列缺失多个基因。利用该核酸分子构建的猴痘反式互补系统所产生的子代缺陷病毒在理化性质上和真实活病毒几乎相同,在互补细胞系中,可以完成病毒侵入、复制和包装释放的全过程,比其它病毒系统相比具有天然优势。可以在保证安全性的同时,开展猴痘病毒的各项基础研究,并进行抗猴痘病毒药物筛选、中和抗体评测、疫苗保护评价以及弱毒疫苗研发等。
Description
技术领域
本申请涉及病毒技术领域,尤其是涉及反式互补缺陷猴痘病毒及其应用。
背景技术
猴痘病毒是天花病毒的近亲,其基因组为双链DNA,长度接近200kb;病毒具有包膜,直径大约200-300nm,形似砖型,具有哑铃型内核。猴痘病毒在自然界的天然宿主是啮齿类等哺乳动物,主要通过密切接触传播。感染猴痘病毒后,皮肤表面会出现大范围的皮疹,伴随有发烧,肌肉酸痛等症状。猴痘病毒目前没有专用疫苗和治疗性抗体,天花疫苗对猴痘有一定的预防和保护效果,但对于特定人群的副作用较大。国内尚无商用抗猴痘药物和疫苗。
猴痘病毒和正痘病毒属的天花病毒和痘苗病毒有较高的同源性,但也编码很多自身特异性的蛋白。目前,领域内对猴痘病毒感染后与宿主相互关系的研究尚不充分。在病毒学研究中,野生型活病毒是遗传进化和致病机理研究、药物筛选和药效评估的“金标准”。猴痘病毒具有较高的传播能力和致病性,其活毒研究必须在生物安全3级及以上设施内开展,需要熟练的技术操作人员和复杂的安全防护设备。对猴痘野生活毒的直接研究存在着额外的病毒泄露风险,亟需高效、安全的研究平台去阐明猴痘病毒在宿主上的致病机理。
目前应用较多的高安全性病毒系统包括,病毒的亚复制子(Replicon)、假病毒系统、病毒样颗粒(VLP)。病毒亚复制子只能研究病毒在细胞内的复制和扩增。假病毒系统在变种病毒的抗体/抗血清中和研究中发挥重要作用,但猴痘病毒的双层膜结构具有50种以上的表面蛋白,假病毒系统无法模拟猴痘病毒表面的结构。病毒样颗粒(VLP)虽然可以产生与真实病毒表面类似的机构,但无法用来研究病毒感染后在细胞中和宿主的相互作用。
反式互补缺陷病毒系统是在低生物安全条件下开展高致病性病毒基础研究和药物筛选评估的优质病毒平台。该系统中的缺陷病毒缺少多个病毒复制和增殖的必需基因区域,只能在特定的回补这些必需基因的细胞系中才能产生子代的缺陷病毒。但和VLP系统不同的是,反式互补缺陷病毒尽可能维持了病毒其它基因组的完整性,其病毒颗粒具有和野生活毒几乎相同的理化性质;在缺陷病毒感染回补细胞后,可以表达病毒所有的非结构蛋白,便于研究它们和宿主中与各个信号通路的相关性;也可以在药物筛选中模拟最接近于真实病毒感染的全过程。反式互补系统往往会缺失多个病毒不同位置和生理阶段的必须基因,来降低病毒通过同源重组发生野生型回复的风险;同时引入重组致死元件来进一步增加病毒的安全性;多种反式互补缺陷病毒的安全性已经在细胞和动物模型上被充分验证。
因此,有必要搭建猴痘病毒的反式互补缺陷病毒系统,用于猴痘病毒的遗传进化、与宿主相互关系的基础研究和抗猴痘药物的筛选和评估。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本申请提出一种反式互补缺陷猴痘病毒系统,能够于猴痘病毒的遗传进化、与宿主相互关系的基础研究和抗猴痘药物的筛选和评估。
本申请的第一方面,提供一种生物材料,该生物材料选自以下A1)~A9)中的任一种:A1)分离的核酸分子,包括猴痘病毒全基因组的核酸序列,所述核酸序列缺失多个基因;A2)包含A1)所述核酸分子的表达盒;A3)包含A1)所述核酸分子的载体;A4)包含A2)所述表达盒的载体;A5)包含A1)所述核酸分子的细胞;A6)包含A2)所述表达盒的细胞;A7)包含A3)所述载体的细胞;A8)包含A4)所述载体的细胞;A9)由A5)~A8)任一项所述细胞培养产生的缺陷猴痘病毒。
在其中一些实施方式中,所述生物材料的所述猴痘病毒全基因组的核酸序列的GenBank登录号为ON563414.3。
在其中一些实施方式中,所述多个基因中任选相邻两个在所述全基因组的核酸序列上至少距离1000nt、2000nt、5000nt、10000nt、12000nt、15000nt、20000nt、25000nt、30000nt以上。
在其中一些实施方式中,所述多个基因包括痘病毒感染和复制的必需基因。在其中一些实施方式中,所述多个基因包括痘病毒为痘病毒的高度保守基因。在其中一些实施方式中,所述多个基因包括病毒细胞进入和蛋白表达的必需基因。
在其中一些实施方式中,所述多个基因包括中期转录因子和后期转录因子中的至少一种。在其中一些实施方式中,所述核酸序列缺失的多个基因包括G9R、A9R、A24R、A1L中的至少两个、至少三个、全部四个。在其中一些实施方式中,所述核酸序列缺失的多个基因包括A9R、A24R和A1L中的至少一种以及G9R。在其中一些实施方式中,所述核酸序列缺失的多个基因包括G9R和A9R,G9R和A24R,G9R和A1L,G9R、A9R和A24R,G9R、A9R和A1L,G9R、A24R和A1L,G9R、A9R、A24R和A1L。
其中,G9R(VLTF-1)作为后期基因转录因子基因,与痘苗病毒哥本哈根株的G8R基因相似;A9R是中期转录因子(VITF-3)的亚基,与痘苗病毒哥本哈根株的A8R基因相似;A24R同样是中期转录因子(VITF-3)的亚基,与痘苗病毒哥本哈根株的A23R基因相似;A1L(VLTF-2)是后期基因转录因子基因,与痘苗病毒哥本哈根株的A1L基因相似。
在其中一些实施方式中,核酸序列在最上游的缺失基因的敲除位置插入第一报告基因,和/或,在最下游的缺失基因的下游插入第二报告基因。
在其中一些实施方式中,最上游的缺失基因为G9R。在其中一些实施方式中,最下游的缺失基因为A9R、A24R和A1L中的任一种。
在其中一些实施方式中,核酸序列在G9R敲除位置插入了第一报告基因,和/或,在A24R的下游插入了第二报告基因。在其中一些实施方式中,核酸序列在G9R敲除位置插入了第一报告基因,和/或,在A1L的下游插入了第二报告基因。
在其中一些实施方式中,第一报告基因和第二报告基因为不同的荧光报告基因。在其中一些实施方式中,不同的荧光报告基因的荧光波段不同。在其中一些实施方式中,第一报告基因和第二报告基因分别为mCherry和mNeonGreen,或mNeonGreen和mCherry。
本申请的第二方面,提供一种反式互补缺陷猴痘病毒系统,该反式互补缺陷猴痘病毒系统包括:前述的生物材料;回补细胞,所述回补细胞表达所述生物材料中缺失的多个基因。
在其中一些实施方式中,所述多个基因中任选相邻两个在所述全基因组的核酸序列上至少距离1000nt、2000nt、5000nt、10000nt、12000nt、15000nt、20000nt、25000nt、30000nt以上。
在其中一些实施方式中,所述多个基因包括痘病毒感染和复制的必需基因。在其中一些实施方式中,所述多个基因包括痘病毒为痘病毒的高度保守基因。在其中一些实施方式中,所述多个基因包括病毒细胞进入和蛋白表达的必需基因。在其中一些实施方式中,所述多个基因包括中期转录因子和后期转录因子中的至少一种。在其中一些实施方式中,所述核酸序列缺失的多个基因包括G9R、A9R、A24R、A1L中的至少两个、至少三个、全部四个。在其中一些实施方式中,所述核酸序列缺失的多个基因包括A9R、A24R和A1L中的至少一种以及G9R。在其中一些实施方式中,所述核酸序列缺失的多个基因包括G9R和A9R,G9R和A24R,G9R和A1L,G9R、A9R和A24R,G9R、A9R和A1L,G9R、A24R和A1L,G9R、A9R、A24R和A1L。
在其中一些实施方式中,生物材料包含所述核酸分子或所述表达盒或所述载体的细胞。在其中一些实施方式中,生物材料包含上述细胞培养产生的缺陷猴痘病毒。在其中一些实施方式中,回补细胞为原核生物细胞或真核生物细胞。在其中一些实施方式中,回补细胞为哺乳动物细胞。
在其中一些实施方式中,回补细胞包括Vero(如Vero和Vero E6)、Caco2、MRC5、RK13、LLC-MK2、Huh7(如Huh7、Huh7.5、Huh7.5.1-8)、SW13、15P-1、A549、293T、Neuro-2a、OVCAR3、Hela、22RV1、PSCH、HTR-8、SK-OV-3、HCT-8、JEG-3、BeWo、H295R、DU145、HUT-78、SK-Mel-28等其中至少一种。
本申请的第三方面,提供一种复制缺陷型猴痘病毒的制备方法,该方法包括以下步骤:将缺陷猴痘病毒感染回补细胞,拯救得到复制缺陷型猴痘病毒;所述缺陷猴痘病毒缺失多个基因,所述回补细胞表达所述多个基因。
在其中一些实施方式中,所述多个基因中任选相邻两个在所述全基因组的核酸序列上至少距离1000nt、2000nt、5000nt、10000nt、12000nt、15000nt、20000nt、25000nt、30000nt以上。
在其中一些实施方式中,所述多个基因包括痘病毒感染和复制的必需基因。在其中一些实施方式中,所述多个基因包括痘病毒为痘病毒的高度保守基因。在其中一些实施方式中,所述多个基因包括病毒细胞进入和蛋白表达的必需基因。在其中一些实施方式中,所述多个基因包括中期转录因子和后期转录因子中的至少一种。在其中一些实施方式中,所述核酸序列缺失的多个基因包括G9R、A9R、A24R、A1L中的至少两个、至少三个、全部四个。在其中一些实施方式中,所述核酸序列缺失的多个基因包括A9R、A24R和A1L中的至少一种以及G9R。在其中一些实施方式中,所述核酸序列缺失的多个基因包括G9R和A9R,G9R和A24R,G9R和A1L,G9R、A9R和A24R,G9R、A9R和A1L,G9R、A24R和A1L,G9R、A9R、A24R和A1L。
在其中一些实施方式中,所述缺陷猴痘病毒通过包含以下步骤的方法制得:将猴痘病毒的全长基因中敲除所述多个基因,并插入报告基因,得到缺陷猴痘病毒全长基因;将所述缺陷猴痘病毒全长基因拆分,设计引物分别扩增,并通过同源重组的方法分别克隆到重组载体中;酶切所述重组载体后,用连接酶连接,得到猴痘病毒全基因组敲除所述多个基因的全长克隆;将所述全长克隆进行细胞转染,得到缺陷猴痘病毒。
在其中一些实施方式中,将猴痘病毒的全长基因中敲除所述多个基因,并插入报告基因,得到缺陷猴痘病毒全长基因包括:将猴痘病毒的全长基因中敲除所述多个基因,在被敲除的最上游基因的位点插入第一报告基因序列,在被敲除的最下游基因的起始位点插入第二报告基因序列,并通过自我切割序列连接被敲除的最下游基因。
在其中一些实施方式中,第一报告基因和第二报告基因所表达的蛋白具有不同的荧光波段。在其中一些实施方式中,第一报告基因和第二报告基因分别为不同波段的荧光蛋白基因。在其中一些实施方式中,第一报告基因和第二报告基因分别为mCherry和mNeonGreen基因,或mNeonGreen和mCherry基因。
在其中一些实施方式中,自我切割序列为2A肽序列。
在其中一些实施方式中,将所述缺陷猴痘病毒全长基因拆分,设计引物分别扩增,并通过同源重组的方法分别克隆到重组载体中包括:将所述缺陷猴痘病毒全长基因拆分为长度在1000-5000bp的基因片段,分别设计扩增引物;利用所述扩增引物扩增所述基因片段,得到不同的扩增产物;将所述扩增产物通过同源重组的方式克隆到重组载体中,得到5~10种包含长度在1~20kb的不同拼接片段的重组载体。
在其中一些实施方式中,将所述猴痘病毒的全长拆分为长度约为1kb、2kb、3kb、4kb、5kb的若干个基因片段,分别设计扩增引物。
在其中一些实施方式中,将所述扩增产物通过同源重组的方式克隆到重组载体中,得到5、6、7、8、9、10种包含长度约为1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、16kb、17kb、18kb、19kb、20kb、21kb、22kb、23kb、24kb、25kb、26kb、27kb、28kb、29kb、30kb的不同拼接片段的重组载体。
在其中一些实施方式中,所述扩增产物克隆到重组载体中后,通过Gibsonassembly和酵母体内重组的方式整合成多个拼接片段。在其中一些实施方式中,所述扩增引物如SEQNo.1~112所示。
在其中一些实施方式中,所述回补细胞通过包含以下步骤的方法制得:将猴痘病毒的所述多个基因中的若干个基因经密码子优化后插入第一慢病毒载体进行包装,收集第一慢病毒并感染第一细胞,筛选得到表达所述若干个基因的所述第一细胞;将猴痘病毒的所述多个基因中的剩余基因经密码子优化后插入第二慢病毒载体进行包装,收集第二慢病毒并感染表达所述若干个基因的所述第一细胞,筛选得到回补细胞。
在其中一些实施方式中,所述若干个基因为A9R、A24R和A1L中的至少一种;所述剩余基因为G9R。在其中一些实施方式中,所述若干个基因为A9R和A24R,或A1L;所述剩余基因为G9R。
在其中一些实施方式中,将全长克隆通过转染试剂进行细胞转染,并在痘病毒RNA转录酶的作用下,在转染的细胞中得到缺陷猴痘病毒。在其中一些实施方式中,在大量细胞出现病变后,收取含有P0代缺陷猴痘病毒的上清和含有P0代缺陷猴痘病毒的细胞。破碎细胞后重新感染回补细胞上,在大量细胞出现病变后,收取P1代缺陷猴痘病毒。
本申请的第四方面,提供按照前述任一种的制备方法制得的复制缺陷型猴痘病毒。
在其中一些实施方式中,复制缺陷型猴痘病毒包括前述得到的P1代缺陷猴痘病毒。
本申请的第五方面,提供前述的生物材料,或前述的反式互补缺陷猴痘病毒系统,或前述的复制缺陷型猴痘病毒在以下B1)~B7)中任一种的应用:B1)制备筛选抗猴痘病毒的药物的产品;B2)筛选抗猴痘病毒的药物;B3)制备评估抗猴痘病毒的药物的药效的产品;B4)评估抗猴痘病毒的药物的药效;B5)制备研究猴痘病毒遗传进化和致病机理的产品;B6)研究猴痘病毒遗传进化和致病机理;B7)制备预防和/或治疗猴痘病毒的药物或疫苗。
在其中一些实施方式中,上述应用为非疾病的诊断或治疗目的。
在本申请的实施例中,使用缺失多个猴痘病毒感染增殖必需基因的缺陷猴痘病毒基因组,根据痘苗病毒等多种正痘病毒上的研究成果,选定了猴痘病毒上的G9R以及A9R和A24R或A1L基因作为敲除目标。这些基因已经被证明是痘病毒家族感染和复制的必需基因,缺失这几个基因中的任意一个基因,就会导致痘病毒致死。其中,猴痘病毒的G9R和A1L基因编码一个后期转录因子,它在所有的痘病毒中都高度保守。G9R和/或A1L基因缺陷的痘病毒无法启动病毒的细胞进入。A9R基因和A24R基因编码形成的异源二聚体是猴痘病毒的中期转录因子,缺失这两个基因的任意一个都会造成痘病毒中期蛋白表达的阻断。这几个猴痘病毒必需基因分布在猴痘病毒上的不同位置,将进一步降低病毒同源重组回复到野生型的风险。通过反向遗传学手段,构建缺失以上多个痘病毒必需基因的缺陷猴痘基因组,并在多基因互补的胞系上拯救出缺陷猴痘病毒,用于后续的猴痘病毒遗传进化和致病机理研究。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本申请的实践了解到。
附图说明
图1为本申请的一个实施例中缺陷猴痘病毒回补细胞系的筛选和鉴定结果。其中,a为Western Blot检测三基因回补细胞系中的G9R、A9R和A24R基因表达量;b为IFA染色检测各个回补基因在细胞中的表达比例和定位。
图2为本申请的一个实施例中细菌/酵母穿梭载体的构建结果。其中,a为载体图谱。b中左侧泳道M为分子量标记(Marker),右侧泳道为酵母YAC基因元件插入pSMART-Bac2.0质粒后,通过SalI和HpaI酶切得到的1718bp的目的条带。
图3为本申请的一个实施例中MPV-F1~MPV-F7(分别为a~g)基因片段克隆组装鉴定结果。其中,a~g中最左侧泳道M为分子量标记(Marker),a中泳道1~10分别为Bac-F1、F1ab、F1bc、F1cd、F1de、F1ef、F1fg、F1gh、F1hi、F1i-Bac的条带,b中泳道1~9分别为Bac-F2、F2ab、F2bc、F2cd、F2de、F2ef、F2fg、F2gh、F2h-Bac的条带,c中泳道1~8分别为Bac-F3、F3ab、F3bc、F3cd、F3de、F3ef、F3fg、F3g-Bac的条带,d中泳道1~9分别为Bac-F4、F4ab、F4bc、F4cd、F4de、F4ef、F4fg、F4gh、F4h-Bac的条带,e中泳道1~9分别为Bac-F5、F5ab、F5bc、F5cd、F5de、F5ef、F5fg、F5gh、F5h-Bac的条带,f中泳道1~9分别为Bac-F6、F6ab、F6bc、F6cd、F6de、F6ef、F6fg、F6gh、F6h-Bac的条带,g中泳道1~9分别为Bac-F7、F7ab、F7bc、F7cd、F7de、F7ef、F7fg、F7gh、F7h-Bac的条带。
图4为本申请的一个实施例中MPV亚克隆酶切鉴定结果。其中,两侧泳道M为分子量标记(Marker),泳道1~7为MPV-F1~MPV-F7的鉴定结果,下方条带为载体,上方条带为MPV亚基因克隆DNA片段。
图5为本申请的一个实施例中缺陷猴痘病毒全长基因组的拼接结果。其中,a为基因组的拼接示意图,拼接的MPV-F1~MPV-F7中缺失了必需基因G9R、A9R和A24R,并引入了mCherry和mNeonGreen报告基因;b为MPV-F1~MPV-F7中的单个片段的组装示意图;c为PCR扩增涵盖片段连接位点的基因片段,并通过测序验证体外连接成的全长基因组的完整性。
图6为本申请的一个实施例中三敲除缺陷猴痘病毒的拯救结果。其中,a为缺陷猴痘病毒的拯救策略示意图,b为病毒转染后形成的噬斑的荧光团。
图7为本申请的一个实施例中免疫印迹的结果。其中,从左到右的泳道依次为分子量标记M(Marker)、对照组和感染组。
图8为本申请的一个实施例中复制缺陷型猴痘病毒的安全性鉴定结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述,以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然,所描述的实施例只是本申请的一部分实施例,而不是全部实施例,基于本申请的实施例,本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例,均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例,描述的实施例是示例性的,仅用于解释本申请,而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中,若干的含义是一个以上,多个的含义是两个以上,大于、小于、超过等理解为不包括本数,以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
除非另有定义,本申请中所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的术语只是为了描述本申请实施例的目的,不是旨在限制本申请。
本申请的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
实施例1:猴痘病毒必需基因回补细胞系的建立
猴痘病毒(MPV,GenBank:ON563414.3)的A9R基因和A24R基因经密码子优化改造后,插入pLVX-Puromycin慢病毒载体(A9R基因和A24R基因分别添加V5标签和HA标签),和辅助质粒在293T细胞上共转染进行慢病毒包装。48小时后收集慢病毒,感染Vero E6细胞,使用Puromycin进行筛选,得到A9R基因和A24R基因稳定表达的Vero细胞系。
猴痘病毒(GenBank:ON563414.3)的G9R基因经密码子优化改造后,插入pLVX-Blasticidin慢病毒表达载体(添加Flag标签),和辅助质粒在在293T细胞上进行慢病毒包装。48小时后收集表达G9R基因的慢病毒,并感染A9R基因和A24R基因稳定表达的Vero细胞系,采用Puromycin和Blasticidin进行筛选,得到三回补基因细胞系。
筛选完成的三回补基因细胞系使用Western Blot和IFA鉴定蛋白的表达。结果如图1所示,从图中可以看到,三回补基因细胞系中的G9R、A9R和A24R具有较高的表达量。
实施例2:全长缺陷猴痘基因组的设计和拼接
全长缺陷猴痘病毒,以美国马萨诸塞州毒株MA001,GenBank:ON563414.3为模板进行设计与构建。将猴痘病毒的全长基因先删除G9R、A9R和A24R三个基因。在G9R基因位点插入mCherry报告基因序列,使之可以借助G9R启动子表达mCherry荧光蛋白。在A46R基因起始位点引入mNeonGreen报告基因,并通过FMDV 2A自我切割序列连接A46R基因,使mNeonGreen荧光蛋白与A46R蛋白串联表达后可以通过FMDV 2A自我裂解后分开。其中,为了实验观察与鉴定,G9R基因敲除后引入mCherry基因,并在猴痘病毒后期转录A46R基因启动子后插入mNeonGreen基因与A46R基因共表达(两个蛋白直接使用FMDV 2A连接)。将猴痘病毒197kb的基因组拆分成57个基因片段(基因片段大小为3-5kb)分别进行基因合成。通过酵母同源重组将MPV亚基因克隆DNA片段拼接成7个大的片段(F1-F7),正确的MPV基因亚克隆转入细菌中进行扩增培养。最后使用限制性内切酶将F1-F7基因组片段切割下来,在体外通过T4连接酶连接成MPV全长缺陷基因组,并通过片段间PCR和全基因组测序验证。具体步骤如下:
1.细菌/酵母穿梭载体的构建
参考图2,在细菌人工染色体载体pSMART-BAC 2.0内切酶位点SalI和HpaI中间引入人工合成的酵母人工染色体基因片段,形成可在细菌和酵母间穿梭的载体(pSMART-BAC/YAC)。该酵母人工染色体基因片段包含酵母分子筛选标记TRP、酵母自主复制元件ARS和着丝粒序列CEN,从而使细菌人工染色体具有可以分别在细菌和酵母中进行复制穿梭的特性。通过SalI和HpaI位点的酶切,能够得到1718bp的目的条带,表明细菌/酵母穿梭载体构建成功。构建好的穿梭载体通过质粒酶切线性化,可以进行MPV病毒DNA片段的酵母组装。
2.MPV病毒基因片段克隆及组装
2.1MPV-F1基因片段克隆及组装
以猴痘病毒(GenBank:ON563414.3)的基因组序列全长经过三基因敲除和荧光蛋白敲入后的质粒为模板,使用下表中的9对引物,用Q5 High-Fidelity DNAPolymerase PCR扩增,PCR反应体系为:98℃5min,98℃10s,65℃30s,72℃3min,72℃5min,35个循环。所得的扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(SYBR Safe DNAGel Stain,10,000×),使用OMEGA GelExtraction Kit试剂盒回收目的DNA片段,并测定浓度。将得到的9段PCR产物以及穿梭载体等比例加入离心管中,按照YeastmakerTMYeast Transformation System 2的步骤要求转化酵母进行体内重组,涂板于SD/-trp平板,30℃培养。
2.2MPV-F2基因片段克隆及组装
以合成的质粒为模板,使用下表中的8对引物,用Q5 High-Fidelity DNAPolymerase PCR扩增,PCR反应体系为:98℃5min,98℃10s,65℃30s,72℃3min,72℃5min,35个循环。所得的扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(SYBR Safe DNAGel Stain,10,000×),使用OMEGAGel Extraction Kit试剂盒回收目的DNA片段,并测定浓度。将得到的8段PCR产物以及穿梭载体等比例加入离心管中,按照YeastmakerTMYeast TransformationSystem 2的步骤要求转化酵母进行体内重组,涂板于SD/-trp平板,30℃培养。
2.3MPV-F3-G9R-KO-mCherry基因片段克隆及组装
以合成的质粒为模板,使用下表中的7对引物,用2×PlatinumTMSuperFiTMII PCRMaster Mix酶PCR扩增,PCR反应体系为:98℃1min,98℃10s,65℃10s,72℃2min,72℃5min,35个循环。所得的扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(SYBR Safe DNAGel Stain,10,000×),切取含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶,使用OMEGAGel Extraction Kit试剂盒回收目的片段,并测定浓度。将得到的7段PCR产物以及穿梭载体等比例加入离心管中,按照YeastmakerTMYeast Transformation System 2的步骤要求转化酵母进行体内重组,涂板于SD-trp平板,30℃培养。
2.4MPV-F4基因片段克隆及组装
以合成的质粒为模板,使用下表中的8对引物,用2×PlatinumTMSuperFiTMII PCRMaster Mix酶PCR扩增,PCR反应体系为:98℃1min,98℃10s,65℃10s,72℃2min,72℃5min,35个循环。所得的扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(SYBR Safe DNA Gel Stain,10,000×),切取含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶,使用OMEGA Gel Extraction Kit试剂盒回收目的片段,并测定浓度。将得到的8段PCR产物以及穿梭载体等比例加入离心管中,按照YeastmakerTMYeast Transformation System 2的步骤要求转化酵母进行体内重组,涂板于SD-trp平板,30℃培养。
2.5MPV-F5-A9R-A24R-KO基因片段克隆及组装
以合成的质粒为模板,使用下表中的8对引物,用2×PlatinumTMSuperFiTMII PCRMaster Mix酶PCR扩增,PCR反应体系为:98℃1min,98℃10s,65℃10s,72℃2min,72℃5min,35个循环。所得的扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(SYBR Safe DNA Gel Stain,10,000×),切取含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶,使用OMEGA Gel Extraction Kit试剂盒回收目的片段,并测定浓度。将得到的8段PCR产物以及穿梭载体等比例加入离心管中,按照YeastmakerTMYeast Transformation System 2的步骤要求转化酵母进行体内重组,涂板于SD-trp平板,30℃培养。
2.6MPV-F6-A46R-mNeonGreen基因片段克隆及组装
以合成的质粒为模板,使用下表中的8对引物,用2×PlatinumTMSuperFiTMII PCRMaster Mix酶PCR扩增,PCR反应体系为:98℃1min,98℃10s,65℃10s,72℃2min,72℃5min,35个循环。所得的扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(SYBR Safe DNA Gel Stain,10,000×),切取含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶,使用OMEGA Gel Extraction Kit试剂盒回收目的片段,并测定浓度。将得到的8段PCR产物以及穿梭载体等比例加入离心管中,按照YeastmakerTMYeast Transformation System 2的步骤要求转化酵母进行体内重组,涂板于SD-trp平板,30℃培养。
2.7MPV-F7基因片段克隆及组装
以合成的质粒为模板,使用下表中的8对引物,用Q5 High-Fidelity DNAPolymerase PCR扩增,PCR反应体系为:98℃5min,98℃70s,65℃30s,72℃3min,72℃5min,35个循环。所得的扩增产物进行7%琼脂糖凝胶电泳(SYBR Safe DNA Gel Stain,70,000×),使用OMEGA Gel Extraction Kit试剂盒回收目的DNA片段,并测定浓度。所得的8段PCR产物以及穿梭载体等比例加入离心管中,按照YeastmakerTMYeast Transformation System2的步骤要求转化酵母进行体内重组,涂板于SD/-trp平板,30℃培养。
3.MPV病毒基因片段鉴定
3.1MPV-F1基因片段鉴定
2.1中的SD/-trp平板30℃培养2~3天后,随机挑取单个酵母克隆至4×4小皿进行小量放大培养,隔天随机挑取酵母克隆至含有10μL酵母裂解液的PCR管中,采用PCR仪器按照94℃10分钟进行酵母裂解。以酵母裂解液为模板,使用下表中的引物,PCR扩增Bac-F1、F1ab、F1bc、F1cd、F1de、F1ef、F1fg、F1gh、F1hi、F1i-Bac验证。PCR反应体系为:95℃3min,95℃15s,55℃15s,72℃1min,72℃5min,34个循环。鉴定结果参考下表和图3的a。
3.2MPV-F2基因片段鉴定
2.2中的SD/-trp平板30℃培养2~3天后,随机挑取单个酵母克隆至4×4小皿进行小量放大培养,隔天随机挑取酵母克隆至含有10μL酵母裂解液的PCR管中,采用PCR仪器按照94℃10分钟进行酵母裂解。以酵母裂解液为模板,使用下表中的引物,PCR扩增Bac-F2、F2ab、F2bc、F2cd、F2de、F2ef、F2fg、F2gh、F2h-Bac验证。PCR反应体系为:95℃3min,95℃15s,55℃15s,72℃1min,72℃5min,32个循环。鉴定结果参考下表和图3的b。
3.3F3-G9R-KO-mcherry基因片段鉴定
2.3中的SD/-trp平板30℃培养2~3天后,随机挑取单个酵母克隆至4×4小皿进行小量放大培养,隔天随机挑取酵母克隆至含有10μL酵母裂解液的PCR管中,采用PCR仪器按照94℃10分钟进行酵母裂解。以酵母裂解液为模板,使用下表中的引物,PCR扩增Bac-F3、F3ab、F3bc、F3cd、F3de、F3ef、F3fg、F3g-Bac验证。PCR反应体系为:95℃3min,95℃15s,55℃15s,72℃1min,72℃5min,32个循环。鉴定结果参考下表和图3的c。
3.4MPV-F4基因片段鉴定
2.4中的SD/-trp平板30℃培养2~3天后,随机挑取单个酵母克隆至4×4小皿进行小量放大培养,隔天随机挑取酵母克隆至含有10μL酵母裂解液的PCR管中,采用PCR仪器按照94℃10分钟进行酵母裂解。以酵母裂解液为模板,使用下表中的引物,PCR扩增Bac-F4、F4ab、F4bc、F4cd、F4de、F4ef、F4fg、F4gh、F4h-Bac验证。PCR反应体系为:95℃3min,95℃15s,55℃15s,72℃1min,72℃5min,32个循环。鉴定结果参考下表和图3的d。
3.5MPV-F5-A9R-A24R-KO基因片段鉴定
2.5中的SD/-trp平板30℃培养2~3天后,随机挑取单个酵母克隆至4×4小皿进行小量放大培养,隔天随机挑取酵母克隆至含有10μL酵母裂解液的PCR管中,采用PCR仪器按照94℃10分钟进行酵母裂解。以酵母裂解液为模板,使用下表中的引物,PCR扩增Bac-F5、F5ab、F5bc、F5cd、F5de、F5ef、F5fg、F5gh、F5h-Bac验证。PCR反应体系为:95℃3min,95℃15s,55℃15s,72℃1min,72℃5min,32个循环。鉴定结果参考下表和图3的e。
3.6MPV-F6-A46R-mNeonGreen基因片段鉴定
2.6中的SD/-trp平板30℃培养2~3天后,随机挑取单个酵母克隆至4×4小皿进行小量放大培养,隔天随机挑取酵母克隆至含有10μL酵母裂解液的PCR管中,采用PCR仪器按照94℃10分钟进行酵母裂解。以酵母裂解液为模板,使用下表中的引物,PCR扩增Bac-F6、F6ab、F6bc、F6cd、F6de、F6ef、F6fg、F6gh、F6h-Bac验证。PCR反应体系为:95℃3min,95℃15s,55℃15s,72℃1min,72℃5min,32个循环。鉴定结果参考下表和图3的f。
3.7MPV-F7基因片段鉴定
2.7中的SD/-trp平板30℃培养2~3天后,随机挑取单个酵母克隆至4×4小皿进行小量放大培养,隔天随机挑取酵母克隆至含有10μL酵母裂解液的PCR管中,采用PCR仪器按照94℃10分钟进行酵母裂解。以酵母裂解液为模板,使用下表中的引物,PCR扩增Bac-F7、F7ab、F7bc、F7cd、F7de、F7ef、F7fg、F7gh、F7h-Bac验证。PCR反应体系为:95℃3min,95℃15s,55℃15s,72℃1min,72℃5min,34个循环。鉴定结果参考下表和图3的g。
4.MPV病毒基因克隆酵母抽提
对PCR验证正确的酵母克隆进行放大培养,收集酵母菌落至含有500μL 10mM EDTA的1.5mL Ep管中,按照Easy Yeast Plasmid Isolation Kit(630467,TAKARA)操作说明进行酵母DNA提取。
5.MPV病毒基因克隆细菌转化
从-80℃冰箱中取出感受态BOR细胞,置于冰上解冻;取5μL从酵母抽提的MPV病毒DNA于感受态BOR细胞中,小心混匀并将其加入到预冷的0.2CM电极杯中,轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部,冰上放置5min。打开电转仪,调节参数voltage:2.5KV,capacitance:25μF,resistance:300Ω,cuvette:2mm。将电极杯推入电转化仪,按一下pulse键,听到蜂鸣声后,向电击杯中迅速加入1000μL的SOC液体培养基,重悬细胞后,转移到1.5mL的离心管中。37℃,220rpm复苏1小时。4000rpm离心5min,去除大部分上清培养基留约200μL SOC涂板,放于37℃孵箱,过夜培养,次日查看转化结果。
6.MPV病毒基因克隆质粒大提
蘸取保种菌液划线,挑单克隆于5mL LB培养基中培养过夜,然后再转接至1L LB培养基中进一步培养。当菌液OD600达到0.3时,加入1mL的诱导剂诱导质粒扩增约8小时。诱导结束后收集菌体,采用天根无内毒素质粒大提试剂盒(DP117),按照操作说明进行质粒DNA的提取。
7.MPV病毒基因克隆质粒酶切、胶回收
酶切体系如下:
将6中提取的质粒按照上述体系混匀,37℃孵育8hr或者过夜。将酶切产物进行0.6~0.8%琼脂糖凝胶,80V,2hr。电泳结果参考图4,与预期相符,每种质粒均切出了载体(下面条带)与MPV亚基因克隆DNA片段(上面条带)2个片段。使用OMEGA Gel&PCR Clean Kit试剂盒回收目的片段,并测定浓度。
8.MPV病毒全基因体外连接
将7中PaqCI酶切回收的猴痘病毒亚基因片段按照等摩尔浓度比例(0.1pmol/片段)进行T4体外连接。首先将猴痘病毒亚基因片段分成三组:Group A、Group B、和Group C。Group A将Hairpin、MPV-F1、MPV-F2连接在一起;Group B将MPV-F3-G9R-KO-mCherry、MPV-F4、MPV-F5-A9R-A24R-KO连接在一起;Group C将MPV-F6-A46R-mNeonGreen、MPV-F7和Hairpin连接在一起。
连接反应体系如下:
连接反应放置4℃进行连接16~20小时后,将3组连接产物合并至一管中,继续进行体外连接16~20小时。通过DNA电泳回收连接产物即猴痘病毒全长基因组。
参考图5,在本实施例的上述步骤中,先将基因合成的57个小片段猴痘病毒亚基因组通过Gibson组装(Gibson assembly)和酵母体内重组的方式整合成7个大的片段,再使用体外T4酶连接的方式拼接出完整的缺陷猴痘病毒基因组。随后,通过PCR对各个片段的连接处进行验证,再全基因组测序确认缺陷基因组的完整性无误,也未引入其它额外的突变。
实施例3:MPV病毒细胞转染
参考图6的a,为本实施例中的缺陷猴痘病毒的拯救策略示意图,具体步骤如下:
在进行复制缺陷病毒拯救的前一天将实施例1中建立的猴痘病毒必需基因回补细胞系VeroE6-G9R-A9R-A24R细胞消化后,以2×106/孔进行铺板。在病毒全长DNA进行转染前,使用0.1MOI禽痘病毒(鸡痘病毒鹌鹑化弱毒株,CVCC AV1003)感染细胞,提供痘病毒RNA转录酶(痘病毒中保守),以此启动缺陷猴痘基因组的早期基因的表达。禽痘病毒感染4小时后,吸弃病毒上清,并用PBS洗3次,每孔加入400μL Opti-MEM。
将上一步骤连接得到的缺陷猴痘病毒全长基因组的病毒DNA与6转染试剂按照DNA:转染试剂的比例为1:3进行混合。室温孵育15min后,按照实施例2拼接得到的全长缺陷猴痘病毒1μg/孔将DNA转染混合物逐滴加入到禽痘病毒感染后的细胞中进行转染。6小时后,更换新鲜的2%FBSDMEM培养基进行培养。转染后从Day1~Day12每天观察细胞的荧光蛋白表达和细胞病变(CPE)。
荧光显微镜的观察结果参考图6的b,病毒荧光蛋白的表达和病毒CPE在5~7天内出现。在转染后的第5天可看见具有红色和绿色荧光的噬斑图,在第7天到第9天观察到噬斑的扩大和扩散。噬斑的外围细胞处于感染早期,只启动中期基因启动子控制的mCherry,内部感染细胞启动了后期基因启动子控制的mNeonGreen。在大量细胞出现明显病变后,收取病毒上清和细胞(P0代病毒)。通过细胞冻融的方法破碎细胞,将细胞裂解液扩大接种到新的回补细胞系上,观察细胞病变及荧光变化,收取P1代复制缺陷型病毒并测定其滴度。
实施例4:免疫印迹验证
采用猴痘病毒A35R蛋白小鼠单克隆抗体对实施例3中的产物进行免疫印迹鉴定,采用没有加禽痘病毒、没有进行猴痘病毒DNA转染的互补细胞裂解液作为对照组与感染组的细胞裂解液进行蛋白电泳。免疫印迹结果如图7所示,从图中可以看出,与对照组相比,感染组上清出现明显的病毒A35R蛋白显色,证明通过在稳定表达病毒蛋白的细胞系上,可以拯救出互补缺陷的猴痘病毒。
实施例5:复制缺陷型猴痘病毒安全性鉴定
参考实施例3,分别按照0.01MOI的病毒滴度采用实施例3中的P1代病毒对包括Vero E6G9R-A9R-A24R、Caco2、22RV1、RK13、LLC-MK2、Huh7、Vero E6、SW13、15P-1、A549、293T、Neuro-2a等不同种类的细胞进行细胞感染,鉴定病毒在其它非互补细胞系中的安全性。结果参考图8,复制缺陷型猴痘病毒只在表达病毒关键基因的互补细胞系Vero E6G9R-A9R-A24R中生长,在其它任一种非互补细胞系如Caco2、293T等其中无法生长。
实施例6:G9R和A1L双基因敲除猴痘缺陷病毒的构建
参考前述实施例的制备过程,构建G9R和A1L双基因敲除的猴痘缺陷病毒:将实施例2的2.4中MPV-F4克隆的F4f采用基因合成缺失了A1L基因的新F4f片段进行替换,构建缺失A1L基因的MPV-F4-A1L-KO克隆;而2.5中MPV-F5-A9R-A24R-KO基因克隆的F5a片段采用基因合成的具有完整猴痘病毒A9R基因的新F5a进行替换,F5e片段采用基因合成的具有完整猴痘病毒A24R基因的新F5e进行替换,最终构建具有完整猴痘病毒基因A9R和A24R的MPV-F5克隆。以此方式参考实施例2中的方案进行MPV-G9R-A1L-KO病毒全基因体外连接。
参考实施例1中的方案进行猴痘病毒必需基因G9R、A1L的Vero-G9R-A1L回补细胞系的建立,并参考实施例3中的方案在Vero-G9R-A1L回补细胞系中进行MPV-G9R-A1L-KO病毒包装拯救。
参考实施例3对产物进行免疫印迹鉴定,结果显示,与对照组相比,感染组上清出现明显的病毒A35R蛋白显色,证明在稳定表达病毒蛋白的细胞系上,可以拯救出互补缺陷的猴痘病毒。参考实施例5进行安全性鉴定,结果显示,复制缺陷型猴痘病毒只在表达病毒关键基因的互补细胞系Vero-G9R-A1L中生长,在其它任一种非互补细胞系如Caco2、293T等其中无法生长。
综合以上结果可以看到,本申请中采用反向遗传学的研究手段,首次构建猴痘病毒的反式互补缺陷病毒系统;通过产生具有复制缺陷的子代病毒,使生物安全三级猴痘病毒可以在生物安全二级及以下安全条件下进行相关科学研究,保证了研究人员的安全性,降低了对猴痘病毒进行突变研究的风险,为抗猴痘病毒药物高通量筛选和评估提供重要平台。
猴痘反式互补系统产生的子代缺陷病毒在理化性质上和真实活病毒几乎相同,在互补细胞系中,可以完成病毒侵入、复制和包装释放的全过程,比其它病毒系统相比具有天然优势。可以在保证安全性的同时,开展猴痘病毒的各项基础研究,并进行抗猴痘病毒药物筛选、中和抗体评测、疫苗保护评价以及弱毒疫苗研发等。
上面结合实施例对本申请作了详细说明,但是本申请不限于上述实施例,在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外,在不冲突的情况下,本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.生物材料,其特征在于,选自以下A1)~A9)中的任一种:
A1)分离的核酸分子,包括猴痘病毒全基因组的核酸序列,所述核酸序列缺失多个基因;
A2)包含A1)所述核酸分子的表达盒;
A3)包含A1)所述核酸分子的载体;
A4)包含A2)所述表达盒的载体;
A5)包含A1)所述核酸分子的细胞;
A6)包含A2)所述表达盒的细胞;
A7)包含A3)所述载体的细胞;
A8)包含A4)所述载体的细胞;
A9)由A5)~A8)任一项所述细胞培养产生的缺陷猴痘病毒。
2.根据权利要求1所述的生物材料,其特征在于,所述猴痘病毒全基因组的核酸序列的GenBank登录号为ON563414.3,和/或,所述多个基因包括G9R、A9R、A24R、A1L中的至少两个。
3.反式互补缺陷猴痘病毒系统,其特征在于,包括:
权利要求1所述的生物材料;
回补细胞,所述回补细胞表达所述生物材料中缺失的多个基因。
4.复制缺陷型猴痘病毒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将缺陷猴痘病毒感染回补细胞,拯救得到复制缺陷型猴痘病毒;
所述缺陷猴痘病毒缺失多个基因,所述回补细胞表达所述多个基因。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述缺陷猴痘病毒通过包含以下步骤的方法制得:
将猴痘病毒的全长基因中敲除所述多个基因,并插入报告基因,得到缺陷猴痘病毒全长基因;
将所述缺陷猴痘病毒全长基因拆分,设计引物分别扩增,并通过同源重组的方法分别克隆到重组载体中;
酶切所述重组载体后,用连接酶连接,得到猴痘病毒全基因组敲除所述多个基因的全长克隆;
将所述全长克隆进行细胞转染,得到缺陷猴痘病毒。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,将所述缺陷猴痘病毒全长基因拆分,设计引物分别扩增,并通过同源重组的方法分别克隆到重组载体中包括:
将所述缺陷猴痘病毒全长基因拆分为长度在1000-5000bp的基因片段,分别设计扩增引物;
利用所述扩增引物扩增所述基因片段,得到不同的扩增产物;
将所述扩增产物通过同源重组的方式克隆到重组载体中,得到5~10种包含长度在1~30kb的不同拼接片段的重组载体。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述扩增引物如SEQ No.1~112所示。
8.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述回补细胞通过包含以下步骤的方法制得:
将猴痘病毒的所述多个基因中的若干个基因经密码子优化后插入第一慢病毒载体进行包装,收集第一慢病毒并感染第一细胞,筛选得到表达所述若干个基因的所述第一细胞;
将猴痘病毒的所述多个基因中的剩余基因经密码子优化后插入第二慢病毒载体进行包装,收集第二慢病毒并感染表达所述若干个基因的所述第一细胞,筛选得到回补细胞。
9.权利要求4至8任一项所述的制备方法制得的复制缺陷型猴痘病毒。
10.权利要求1至2任一项所述的生物材料,或权利要求3所述的反式互补缺陷猴痘病毒系统,或权利要求9所述的复制缺陷型猴痘病毒在以下B1)~B7)中任一种的应用:
B1)制备筛选抗猴痘病毒的药物的产品;
B2)筛选抗猴痘病毒的药物;
B3)制备评估抗猴痘病毒的药物的药效的产品;
B4)评估抗猴痘病毒的药物的药效;
B5)制备研究猴痘病毒遗传进化和致病机理的产品;
B6)研究猴痘病毒遗传进化和致病机理;
B7)制备预防和/或治疗猴痘病毒的药物或疫苗。
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CN110431228A (zh) * | 2016-11-02 | 2019-11-08 | 戴维·埃文斯 | 合成嵌合痘病毒 |
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Patent Citations (3)
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