CN105274089B - 一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的rev病毒传染性克隆的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒传染性克隆的构建方法，是将特定PCR引物扩增出的绿色荧光EGFP基因片段，插入到线性化的REV病毒基因组Env基因的N端，利用商品化的重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆，随后转化到大肠杆菌进行质粒扩增与鉴定；并将阳性克隆转染DF1细胞，拯救获得表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒。

Description

一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒传染性克隆的构 建方法

技术领域

本发明涉及一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒传染性克隆的构建方法。此发明不仅可获得表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV示踪病毒，填补了国内外空白；为研究REV病毒在机体内复制，组织嗜性及其致病机理提供了材料；同时为开发REV作为病毒载体表达外源基因提供了可能。

背景技术

禽网状内皮组织增生症病毒(REV)主要引起以网状内皮细胞增生为主要特征的一组综合征，包括急性网状细胞增生症、矮小综合征和淋巴组织及其它组织的慢性肿瘤增生性疾病。REV感染鸡群往往生长迟缓，淘汰率和死亡率升高；并引起感染鸡的免疫抑制，干扰其它禽病疫苗的免疫效应，导致免疫失败。该病目前已呈世界范围流行，但对其细胞感染受体、病毒复制位点及其致病机理等方面知之甚少。构建表达绿色荧光蛋白的示踪病毒已被广泛应用于病毒受体、组织嗜性及其致病机理等研究中。国内外学者也尝试将绿色荧光蛋白基因插入REV基因组，拯救表达绿色荧光蛋白的REV示踪病毒，但由于选择的插入位点的不适宜目前尚未成功获得表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒。本研究将绿色荧光EGFP基因，利用商品化的重组酶ExnaseTM II，插入到REV病毒基因组合适的插入位点，构建并成功拯救出了表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒。

发明内容

本发明的目的是在于构建表达绿色荧光囊膜蛋白的REV病毒传染性克隆，并拯救出相应病毒。本发明的原理和最核心的关键技术是科学地设计引物扩增出含REV传染性线性化载体以及EGFP基因片段，利用商品化的重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，将EGFP基因片段插入到REV传染性克隆env基因的N端，在体外快速重组克隆，并将阳性克隆转染DF1细胞拯救出表达绿色荧光囊膜蛋白的REV病毒。

所述引物如下：

a，PCR扩增出REV传染性克隆SNV线性化载体；

上游引物：5′CTAATTCTCCTTGTGGCTTGGTGGGGGTTT3′(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5′GATTTTGCTCGCCTGGTCAACTTTACCCTC3′(SEQ ID NO.2)。

b，PCR扩增出绿色荧光蛋白基因EGFP；

上游引物：5′CAGGCGAGCAAAATCATGGTGAGCAAGGGCGAG3′(SEQ ID NO.3)；

下游引物：5′CACAAGGAGAATTAGCTTGTACAGCTCGTCCAT3′(SEQ ID NO.4)。

本发明公开了PCR扩增REV传染性克隆SNV线性化载体以及PCR扩增EGFP基因，用于构建表达绿色荧光囊膜蛋白的REV传染性克隆的引物序列。本发明还公开了一种基于REV病毒LTR的外源基因快速构建表达绿色荧光囊膜蛋白的REV传染性克隆的方法，是用重组酶ExnaseTM II，将线性化的REV传染性克隆载体与EGFP基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆获得表达绿色荧光囊膜蛋白的REV传染性克隆。

本发明一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒传染性克隆的构建方法，包括以下步骤：

1)利用序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物，以REV传染性克隆质粒SNV质粒为模板，PCR扩增出SNV线性化载体；

2)利用序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4引物，以pcDNA3.1-EGFP质粒为模板，PCR扩增出绿色荧光蛋白基因EGFP；

3)利用重组酶ExnaseTM II对步骤1)和2)得到的PCR产物进行快速重组克隆；阳性克隆转染DF1细胞拯救出表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒。

本发明表达绿色荧光囊膜蛋白的REV传染性克隆的构建及病毒拯救；分别以含REV病毒前病毒全基因组质粒SNV以及含EGFP基因质粒为模版，PCR分别扩增出REV传染性克隆线性化载体以及EGFP基因片段(附图1，步骤1)；并利用重组酶ExnaseTM II进行快速重组克隆(附图1，步骤2)；阳性克隆即可进行DF1细胞转染、拯救病毒(附图1，步骤3)。

利用本发明设计的引物，通过重组酶ExnaseTM II可以快速获得含有EGFP基因片段的REV传染性克隆质粒。该克隆方法不依赖于限制性内切酶以及连接酶，大大简化了含EGFP基因片段的REV传染性克隆的构建过程，提高了效率。获得的含EGFP基因片段的REV传染性克隆转染DF1细胞，即可获得表达绿色荧光囊膜蛋白的REV病毒。获得表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV示踪病毒，填补了国内外空白；为研究REV病毒在机体内复制，组织嗜性及其致病机理提供了材料；同时为开发REV作为病毒载体表达外源基因提供可能。

附图说明

图1表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV传染性克隆构建及病毒拯救策略

步骤1：以含REV病毒前病毒全基因组质粒SNV以及含EGFP基因的pcDNA3.1-EGFP为模版，利用表1中相应引物，PCR分别扩增出线性化REV传染性克隆载体以及EGFP基因片段；步骤2：利用重组酶ExnaseTM II进行快速重组克隆；步骤3：阳性克隆转染DF1细胞拯救病毒。

图2 PCR扩增线性化REV载体和EGFP片段

泳道1，1kb Marker；泳道2，扩增出的线性化REV传染性克隆载体；泳道3，扩增出的EGFP片段。

图3 PCR鉴定含EGFP的REV传染性克隆

泳道1-6，PCR扩增REV载体片段；泳道M，1kb Marker；泳道7-12，PCR扩增EGFP片段。

图4表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒拯救效果

A，转染含EGFP的REV传染性克隆5天后的荧光；B，第一代传代细胞观察到的荧光；C，第三代传代细胞观察到的荧光；D，第五代传代细胞观察到的荧光。

具体实施方式

为更好的理解本发明的内容，以下实施方式结合附图展示表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV传染性克隆的构建及其病毒拯救。

实施例：

1)设计扩增REV传染性克隆线性化载体以及EGFP基因片段引物：扩增REV传染性克隆线性化载体上游引物位于SNV毒株前病毒基因组6112-6141位；扩增含REV病毒LTR的线性化载体下游引物位于SNV毒株前病毒基因组6082-6111位；扩增EGFP基因的上游引物中除了自EGFP基因ATG起始的18个EGFP基因特异的碱基外，在其5端还带有15个与扩增REV传染性克隆线性化载体下游引物反向互补的碱基；扩增EGFP基因的下游引物中除了EGFP基因3末端特异的18个碱基外，带有15个保守的与扩增含REV传染性克隆线性化载体上游引物互补的碱基。具体引物序列见附表1，由Life Technologies上海赛默飞世尔科技公司合成。

表1 REV线性化载体和EGFP基因引物设计

2)REV线性化载体以及EGFP片段PCR扩增：以含REV病毒前病毒全基因组质粒SNV以及pcDNA3.1-EGFP为模版，表1所述引物为引物进行PCR扩增。如图1中的步骤1。PCR扩增反应体系为：40μl水，5μl 10倍缓冲液，1μl 10mM dNTP，1μl 10μmol上游引物，1μl 10μmol下游引物，1μl 10ng/μl的SNV以及pcDNA3.1-EGFP，1μl商品化的Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶。PCR扩增反应循环参数为：95℃变性3分钟，随后进行30个循环(95℃变性10秒，57℃退火30秒，72℃延伸3分钟)，最后72℃延伸10分钟。PCR结束后，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。如图2所示，其中泳道1表示对照品DNA Marker的电泳分析图，其中泳道2和3分别代表基于REV线性化载体以及EGFP基因片段PCR扩增产物的电泳分析图。

3)EGFP片段快速克隆进REV传染性克隆载体：将以上纯化的REV线性化载体以及EGFP片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTM II的作用下进行重组克隆。如图1中的步骤2。具体重组反应体系如下：纯化的EGFP产物50-100ng，纯化的REV线性化载体50ng，2μl商品化的ExnaseTM II酶，4μl 5倍的缓冲液，其它补加水至20μl。反应物于37℃作用30分钟后，置冰上5分钟。随后将20μl反应物转化到常规感受态细菌，涂LB板。次日挑取细菌克隆进行质粒制备，阳性克隆鉴定，如图3所示。

4)表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒的拯救与鉴定：将获得的含EGFP的阳性克隆(命名为REV-EGFP)转染DF1细胞，转染12hr后，在荧光显微镜下观察EGFP的表达。如图1中的步骤3。具体转染步骤如下：取2μg的REV-LTR-eGFP质粒加入到50μl的OPTI-MEM培养基，随后与4μl的Mirus转染试剂混匀；室温放置45min后，加入450μl的OPTI-MEM培养基混匀后，直接加到新鲜培养的贴壁的DF1。转染5天后观察发现，转染的DF1细胞中仅可见少量表达EGFP的细胞(如图4A)。随即将细胞进行了消化传代。在第一代培养到5天时，荧光显微镜观察发现有少量成簇的特异的绿色荧光(如图4B)。这一结果提示我们已经拯救获得表达EGFP的REV病毒。为进一步确定该病毒的稳定性，对该表达EGFP的REV病毒进行了继续传代，荧光显微镜观察发现该病毒可稳定表达EGFP绿色荧光(如图4D)。

Claims (1)

1.一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒传染性克隆的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)利用下述引物，以REV传染性克隆质粒SNV质粒为模板，PCR扩增出SNV线性化载体；

上游引物：5′CTAATTCTCCTTGTGGCTTGGTGGGGGTTT3′；

下游引物：5′GATTTTGCTCGCCTGGTCAACTTTACCCTC3′；

2)利用下述引物，以pcDNA3.1-EGFP质粒为模板，PCR扩增出绿色荧光蛋白基因EGFP；

上游引物：5′CAGGCGAGCAAAATCATGGTGAGCAAGGGCGAG3′；

下游引物：5′CACAAGGAGAATTAGCTTGTACAGCTCGTCCAT3′；

3)利用重组酶ExnaseTM II对步骤1)和2)得到的PCR产物进行快速重组克隆；阳性克隆转染DF1细胞拯救出表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒。