JP6599316B2 - 改善されたウイルス産生のためのトリ細胞 - Google Patents
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Description
本発明は、少なくとも1種のインターフェロン誘導性膜貫通タンパク質(IFITM)の発現および/または活性が低下しているトリ細胞に関する。
ウイルス感染およびウイルス性疾患の予防および管理は、医学および獣医学の両方についての継続的課題である。このようにウイルス性疾患の発生率および重症度を低下させるための方法は、医学および生物工学的研究の最前線のままである。
インターフェロン誘導性膜貫通(IFITM)タンパク質ファミリーは、SARSコロナウイルス、フィロウイルス(マールブルグウイルスおよびエボラウイルス)、インフルエンザAウイルスならびにフラビウイルス(デングウイルス)を含め、いくつかの非常に病原性のヒトウイルスの複製を制限するインターフェロン刺激性遺伝子ファミリーである。IFITM1、2、3および5を含むIFITM遺伝子座は哺乳動物種に存在するが、この遺伝子座はトリ種では同定および特徴付けされていない。本発明者らは、IFITM遺伝子座がニワトリにおいて存在し、細胞で発現された場合にその細胞のウイルス感染を抑制する能力に関連する新規トリIFITM配列を同定することを示した。
(i)本発明の第一の態様に記載のトリ細胞をウイルスで形質導入するステップ、および、
(ii)前記ウイルスを増殖させるために前記細胞を継代するステップ
を含むウイルスを増殖させるための方法に関する。
(i)本発明の第二の態様の方法に従ってウイルスを増殖させるステップ、および、
(ii)増殖させた前記ウイルスをワクチンに組み込むステップ
を含むワクチンを産生するための方法を提供する。
(i)本発明の第一の態様に従ってトリ細胞をウイルスで形質導入するステップ、および、
(ii)前記ウイルスが複数回の感染を完了し、弱毒化するように前記トリ細胞を継代するステップ
を含む弱毒化ウイルスを生成するための方法を提供する。
(i)本発明の第四の態様に従ってウイルスを弱毒化するステップ、
(ii)弱毒化した前記ウイルスを増殖させるステップ、および
(iii)(ii)において生成された前記ウイルスをワクチンに組み込むステップ
を含むワクチンを産生するための方法を提供する。
(i)前記複数のトリ動物において次のポリペプチド:ニワトリIFITM1(配列番号1)、ニワトリIFITM2(配列番号2)およびニワトリIFITM3(配列番号3)もしくはそのホモログの1個もしくは複数をコードするヌクレオチド配列および/またはゲノム上の前記ヌクレオチド配列のコピー数を調査するステップ、
(ii)ウイルス感染への耐性に関連する、IFITM1、IFITM2および/もしくはIFITM3のヌクレオチド配列ならびに/またはコピー数を有するトリ動物を選択するステップ
を含む、方法を提供する。
本願の特定の態様において、例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
次のポリペプチド:ニワトリIFITM1(配列番号1)、ニワトリIFITM2(配列番号2)およびニワトリIFITM3(配列番号3)またはそのホモログのうちの1個または複数の低下した発現および/または活性を有するトリ細胞。
(項目2)
トリ胚内にあるか、トリ胚由来であるか、またはトリ細胞株である、項目1に記載のトリ細胞。
(項目3)
ニワトリ胚性線維芽細胞(CEF)である、項目2に記載のトリ細胞。
(項目4)
次のポリペプチド:ニワトリIFITM1(配列番号1)、ニワトリIFITM2(配列番号2)およびニワトリIFITM3(配列番号3)またはそのホモログのうちの1個または複数の突然変異バージョンを含み、前記突然変異バージョンがウイルス感染への耐性の減少に関連する、項目1から3のいずれかに記載のトリ細胞。
(項目5)
前記トリ細胞において、次のポリペプチド:ニワトリIFITM1(配列番号1)、ニワトリIFITM2(配列番号2)およびニワトリIFITM3(配列番号3)またはそのホモログのうちの1個をコードするヌクレオチド配列のうちの1個または複数がそのゲノム中に存在しない、項目1から3のいずれかに記載のトリ細胞。
(項目6)
次のポリペプチド:ニワトリIFITM1(配列番号1)、ニワトリIFITM2(配列番号2)およびニワトリIFITM3(配列番号3)またはそのホモログのうちの1個または複数の発現がRNA干渉(RNAi)によって低下されている、項目1から3のいずれかに記載のトリ細胞。
(項目7)
次のステップ:
(i)項目1から6のいずれかに記載のトリ細胞をウイルスで形質導入するステップ、および、
(ii)前記ウイルスを増殖させるために前記細胞を継代するステップ
を含むウイルスを増殖させるための方法。
(項目8)
次のステップ:
(i)項目7にしたがってウイルスを増殖させるステップ、および、
(ii)増殖させた前記ウイルスをワクチンに組み込むステップ
を含むワクチンを産生するための方法。
(項目9)
次のステップ:
(i)項目1から6のいずれかに記載のトリ細胞をウイルスで形質導入するステップ、および、
(ii)前記ウイルスが複数回の感染を完了し、弱毒化するように前記トリ細胞を継代するステップ
を含む弱毒化ウイルスを生成するための方法。
(項目10)
次のステップ:
(i)項目9にしたがってウイルスを弱毒化するステップ、
(ii)弱毒化した前記ウイルスを増殖させるステップ、および
(iii)(ii)において生成された前記ウイルスをワクチンに組み込むステップ
を含むワクチンを産生するための方法。
(項目11)
前記ウイルスが酸性エンドソームを通って入る、項目7から10のいずれかに記載の方法。
(項目12)
次のポリペプチド:ニワトリIFITM1(配列番号1)、ニワトリIFITM2(配列番号2)およびニワトリIFITM3(配列番号3)またはそのホモログのうちの1個または複数の発現および/または活性が低下、ノックダウンまたはノックアウトされているトランスジェニックトリ動物。
(項目13)
トランスジェニック動物であって、その生殖細胞および体細胞が次のポリペプチド:ニワトリIFITM1(配列番号1)、ニワトリIFITM2(配列番号2)およびニワトリIFITM3(配列番号3)またはそのホモログのうちの1個をコードする1個または複数のヌクレオチド配列の異型遺伝子性バージョンを含み、そのヌクレオチド配列が前記動物に、または前記動物の先祖に、胚期に導入された、トランスジェニックトリ動物。
(項目14)
次のポリペプチド:ニワトリIFITM1(配列番号1)、ニワトリIFITM2(配列番号2)およびニワトリIFITM3(配列番号3)またはそのホモログをコードする1個または複数の遺伝子のコピー数が増加しているトランスジェニックトリ動物。
(項目15)
前記トリ動物が、家禽動物である、項目12から14のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
(項目16)
前記トリ動物が、ニワトリである、項目15に記載のトランスジェニック動物。
(項目17)
項目12から16のいずれかに記載のトランスジェニックトリ動物に由来する、項目1に記載のトリ細胞。
(項目18)
次のポリペプチド:ニワトリIFITM1(配列番号1)、ニワトリIFITM2(配列番号2)およびニワトリIFITM3(配列番号3)またはそのホモログの1個または複数をコードするヌクレオチド配列を調査するステップおよび/またはゲノム上での前記ヌクレオチド配列のコピー数を調査するステップを含む、ウイルス感染へのトリ動物の生得的な耐性を調査するための方法。
(項目19)
同じ種の複数のトリ動物からウイルス感染への耐性を有するトリ動物を選択するための方法であって、次のステップ:
(i)前記複数のトリ動物において次のポリペプチド:ニワトリIFITM1(配列番号1)、ニワトリIFITM2(配列番号2)およびニワトリIFITM3(配列番号3)もしくはそのホモログの1個もしくは複数をコードするヌクレオチド配列および/またはゲノム上の前記ヌクレオチド配列のコピー数を調査するステップ、
(ii)ウイルス感染への耐性に関連する、IFITM1、IFITM2および/もしくはIFITM3のヌクレオチド配列ならびに/またはコピー数を有するトリ動物を選択するステップ
を含む、方法。
(項目20)
前記複数のトリ動物がIFITM遺伝子座で遺伝的変動および/またはコピー数多型を表す、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記ウイルス感染が酸性エンドソームを通って入ったウイルスによって媒介される、項目19または20に記載の方法。
(項目22)
前記ウイルス感染がトリインフルエンザウイルス(AIV)、感染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)またはニューカッスル病ウイルス(NDV)によって媒介される、項目21に記載の方法。
(項目23)
トリ動物においてウイルス感染を予防または処置するための方法であって、前記動物において次のポリペプチド:ニワトリIFITM1(配列番号1)、ニワトリIFITM2(配列番号2)およびニワトリIFITM3(配列番号3)またはそのホモログのうちの1個または複数の発現を増加させるステップを含む、方法。
(項目24)
アミノ酸配列の配列番号2(ニワトリIFITM2)またはその変異体もしくはホモログを含むトリIFITMポリペプチド。
(項目25)
配列番号2に示すアミノ酸位置番号付けに従って、次のアミノ酸残基、Trp35、Ser36、Leu37、Arg64、Asp65、Asp71、Gly74、Ala75、Tyr78、Ala82、Lys83、Asn86およびIle87を含む、項目24に記載のトリIFITMポリペプチド。
(項目26)
前記アミノ酸配列が配列番号2に少なくとも80%相同性を有する、項目24に記載のトリIFITMポリペプチド。
(項目27)
細胞において発現された場合に前記細胞のウイルス感染を抑制する、項目24または25に記載のトリIFITMポリペプチド。
(項目28)
項目24から27のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
IFITM
本発明は、トリIFITMポリペプチドに関する。
MQSYPQHTSINMPSYGQDVTTTIPISPQPPPKDFVLWSLFNFVLCNAFCLGLCALSYSIKSRDRIIAKDFVGASSYGRTAKIFNIFAFCVGLLVTILSIVLVFLYLPLYTVRP
配列番号2:
MKPQQAEVSIPLHPPGRGPPLASLPDEQPRDFILWSLFNVLAGFALAYLGCFCFPSLIFS
IKARDCKVLGDLEGARRYGSRAKVLNIIFSVLIAVGVLSTITIAIMFITAISR
配列番号3:
MERVRASGPGVPPYEPLMDGMDMEGKTRSTVVTVETPLVPPPRDHLAWSLCTTLYANVCCLGFLALVFSVKSRDRKVLGDYSGALSYGSTAKYLNITAHLINVFLIILIIALVASGTIMVANIFNHQQQHPEFIGPT
acagctgccctccagcaccatgcagagctaccctcagcacaccagcatcaacatgccttc
ctacgggcaggatgtgaccaccactattcccatctctccgcagccgccccccaaggattt
tgtactctggtccctcttcaactttgtgctgtgcaacgccttctgcctgggcttatgtgc
tctctcatactccatcaagtccagggataggatcatcgccaaggacttcgtaggcgccag
cagctatgggaggacagcgaagatctttaacatctttgcattctgtgtgggacttcttgt
gaccatcctctccatcgtcctggtgtttctctacctcccgttgtacactgtgcggccctg
atctggcctgatcaagaggagcagcactgcggtcccactcctccttccctctacctctgg
tatcacccccaccgaggtgactcagttcgggatgagcccttggggtgagctgaaggcaaa
taaagcttcttccccattcta
配列番号5:
ATGAAGCCGCAACAGGCGGAGGTGAGCATCCCGCTGCACCCACCCGGGCGGGGGCCGCCCCTCGCCAGCCTCCCCGACGAGCAGCCCCGCGACTTCATCCTCTGGTCCCTCTTCAACGTCCTGGCGGGCTTCGCTCTCGCCTACCTCGGCTGCTTCTGCTTCCCCTCGCTCATCTTCTCCATCAAGGCCCGCGACTGCAAAGTGCTGGGCGACCTGGAAGGTGCTCGGCGGTATGGAAGCCGGGCCAAGGTGCTGAACATCATCTTCTCTGTGCTGATAGCCGTCGGTGTGTTGTCCACCATCACCATTGCCATCATGTTCATCACCGCGATCAGCAGATAG
配列番号6:
caccgggctgcggggaaacgaaaccagttccctccgtcctcccgtcccggcgccgccccc
aagcctcatagcccccgagccccgggatggagcgggtacgcgcttcgggtccgggagtcc
caccgtatgaacccctgatggacgggatggacatggaggggaagacccgcagcacggtgg
tgacggtggagacgcccctggtgcctcctccccgcgaccacctggcctggtcgctgtgca
ccacgctgtacgccaacgtctgctgcctcggcttcctggcgctcgtcttctccgtgaagt
ccagggatcgcaaagtcctgggtgactacagcggggcgctcagctatggctccactgcga
agtacctgaacatcacggcccatctgatcaacgtcttcctcatcatcctcatcatcgccc
tggttgccagtggcaccatcatggtggccaacatcttcaaccaccagcagcaacaccccg
aattcattggacccacttagctccattccatgggcagagcttcgcttggggccatgcttt
ccttgcttcttccaatcccctctccggtcagcatatggaaaagcacctcaagacacccct
tgctctggcaggaacccgaaaaactggctgtagtgcagactttgctgcttgccacctcac
tctgcctttctgctattgctccaagtgccctgagggcagcacctcattggtaaaaaacac
aataaaggtatctttcacttttgtcccac
配列番号7:
ggaccccccgagccccgggatggagcgggtacgcgcttcgggtccgggagtcccaccgta
tgaacccctgatggacgggatggacatggaggggaagacccgcagcacggtggtgacggt
ggagacgcccctggtgcctcctccccgcgaccacctggcctggtcgctgtgcaccacgct
gtacgccaacgtctgctgcctcggcttcctggcgctcgtcttctccgtgaagtccaggga
tcgcaaagtcctgggtgactacagcggggcgctcagctatggctccactgcgaagtacct
gaacatcacggcccatctgatcaacgtcttcctcatcatcctcatcatcgccctggttgc
cagtggcaccatcatggtggccaacatcttcaaccaccagcagcaacaccccgaattcat
tggacccacttagctccattccatgggcagagcttcgcttggggccatgctttccttgct
tcttccaatcccctctccggtcagcatatggaaaagcacctcaagacaccccttgctctg
gcaggaacccgaaaaactggctgtagtgcagactttgctgcttgccacctcactctgcct
ttctgctattgctccaagtgccctgagggcagcacctcattggtaaaaaacacaataaag
gtatctttcacttttgtcccac
用語「ホモログ」とは、配列番号1、配列番号2および配列番号3からなる群から選択されるアミノ酸配列と等価な機能を有する別のトリ動物由来のポリペプチドをいう。トリIFITMホモログは、関連種(すなわちキジ目の科由来の別のトリ動物)由来または同種の異なる系統(例えばニワトリの別の系統)由来であり得る。
本発明は、トリ細胞をウイルスで形質導入し、そのウイルスを増殖させるためにその細胞を継代することによりウイルスを増殖させるための方法を提供する。
(i)第1の態様によるトリ細胞をウイルスで形質導入するステップ、および、
(ii)ウイルスが複数回の感染を完了し、弱毒化されるようにトリ細胞を継代するステップ
を含む弱毒化ウイルスを生成するための方法を提供する。
本発明の方法によって増殖および/または弱毒化されたウイルスは、ワクチンに組み込まれ得る。
本発明は、次のポリペプチド:ニワトリIFITM1(配列番号1)、ニワトリIFITM2(配列番号2)およびニワトリIFITM3(配列番号3)またはそのホモログのうちの1個または複数をコードするヌクレオチド配列ならびに/またはそのコピー数を調査するステップを含む、ウイルス感染へのトリ動物の生得的な耐性を調査するための方法を提供する。
用語「ウイルス感染を抑制する」とは、ポリペプチドが、細胞へのウイルスの侵入、細胞内での複製または細胞からの放出のレベルを減少させる、抑制するまたは低下させる能力をいう。ウイルス感染を抑制できるポリペプチドを発現しているトリ動物は、したがってウイルス感染への耐性に関連する。
本発明のポリペプチドは、ウイルス感染を抑制できる。
本発明は、次のポリペプチド:ニワトリIFITM1(配列番号1)、ニワトリIFITM2(配列番号2)およびニワトリIFITM3(配列番号3)またはそのホモログのうちの1つまたは複数の発現をトリ動物において増加させるステップを含む、トリ動物においてウイルス感染を予防するまたは処置するための方法を提供する。
上述のとおりIFITMポリペプチドの配列変異体は、ウイルス感染を抑制するそれらの能力が変化する場合がある。加えてIFITMの増大した発現レベルは、ウイルス感染に対する増大した防御と関連する場合がある。そのように本発明は、ウイルス感染への増大した耐性を有するトリ動物を産生するための方法にも関し、前記方法はトリIFITM1、トリIFITM2およびトリIFITM3のうちの1個、2個もしくは3個の発現をトリ動物において増加させること、またはその活性変異体の発現もしくは過剰発現を誘導すること、またはゲノム上のそのコピー数を増加させることを含む。
ニワトリIFITM配列マイニング(Mining)
ニワトリIFITM遺伝子のアノテート
偽型ウイルスでのIFITM発現細胞株の感染
IFITMタンパク質の細胞内局在
DF−1ニワトリ細胞における構成的IFITM発現ノックダウン
RNA組織パネルにおけるchIFITM発現
Claims (16)
- ニワトリIFITM2(配列番号2)もしくは配列番号2に少なくとも90%の配列同一性を有する変異体の、同等の未改変または未処置の野生型細胞と比較して低下した発現および/または活性を有するトリ細胞であって、前記変異体が、ニワトリIFITM2(配列番号2)と等価な機能を有する、トリ細胞。
- トリ胚内にあるか、トリ胚由来であるか、またはトリ細胞株である、請求項1に記載のトリ細胞。
- ニワトリ胚性線維芽細胞(CEF)である、請求項2に記載のトリ細胞。
- 前記トリ細胞において、前記ニワトリIFITM2(配列番号2)もしくは配列番号2に少なくとも90%の配列同一性を有する前記変異体をコードするヌクレオチド配列がそのゲノム中に存在しない、請求項1から3のいずれかに記載のトリ細胞。
- 前記ニワトリIFITM2(配列番号2)もしくは配列番号2に少なくとも90%の配列同一性を有する前記変異体の発現がRNA干渉(RNAi)によって低下されている、請求項1から3のいずれかに記載のトリ細胞。
- 次のステップ:
(i)請求項1から5のいずれかに記載のトリ細胞をウイルスで形質導入するステップ、および、
(ii)前記ウイルスを増殖させるために前記細胞を継代するステップ
を含むウイルスを増殖させるための方法。 - 次のステップ:
(i)請求項6にしたがってウイルスを増殖させるステップ、および、
(ii)増殖させた前記ウイルスをワクチンに組み込むステップ
を含むワクチンを産生するための方法。 - 次のステップ:
(i)請求項1から5のいずれかに記載のトリ細胞をウイルスで形質導入するステップ、および、
(ii)前記ウイルスが複数回の感染を完了し、弱毒化するように前記トリ細胞を継代するステップ
を含む弱毒化ウイルスを生成するための方法。 - 次のステップ:
(i)請求項8にしたがってウイルスを弱毒化するステップ、
(ii)弱毒化した前記ウイルスを増殖させるステップ、および
(iii)(ii)において生成された前記ウイルスをワクチンに組み込むステップ
を含むワクチンを産生するための方法。 - 前記ウイルスが酸性エンドソームを通って前記トリ細胞に入る、請求項6から9のいずれかに記載の方法。
- ニワトリIFITM2(配列番号2)もしくは配列番号2に少なくとも90%の配列同一性を有する変異体の発現および/または活性が同等の未改変または未処置の野生型動物と比較して低下、ノックダウンまたはノックアウトされているトランスジェニックトリ動物であって、前記変異体が、ニワトリIFITM2(配列番号2)と等価な機能を有する、トランスジェニックトリ動物。
- ニワトリIFITM2(配列番号2)もしくは配列番号2に少なくとも90%の配列同一性を有する変異体をコードする遺伝子のコピー数が増加しているトランスジェニックトリ動物であって、前記変異体が、ニワトリIFITM2(配列番号2)と等価な機能を有する、トランスジェニックトリ動物。
- 前記トリ動物が、家禽動物である、請求項11または12のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
- 前記トリ動物が、ニワトリである、請求項13に記載のトランスジェニック動物。
- 請求項11から14のいずれかに記載のトランスジェニックトリ動物に由来する、請求項1に記載のトリ細胞。
- トリ動物においてウイルス感染を予防または処置するための方法であって、前記動物において、ニワトリIFITM2(配列番号2)もしくは配列番号2に少なくとも90%の配列同一性を有する変異体の発現を増加させるステップを含み、前記変異体が、ニワトリIFITM2(配列番号2)と等価な機能を有する、方法。
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