WO2010125656A1 - 外来性rnaを発現する抗病性トランスジェニック鳥類 - Google Patents

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裕幸 渡邉
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    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a transgenic bird that expresses an exogenous RNA, and a transgenic bird that is resistant to a pathogen transmitted between birds.
  • Influenza is a type of acute infection caused by the influenza virus that develops cold-like symptoms, but unlike normal colds, it often has rapid and severe symptoms, and even healthy adults have pneumonia and encephalopathy. It is a dangerous disease that can cause complications and even death.
  • influenza is prevalent every year, because the influenza virus has a feature that it is easily mutated, so it is skillfully escaped from the host immune system by repeating mutations continuously.
  • influenza viruses are one of the viruses that are continuously watched because of their ease of mutation and the magnitude of damage when they become popular.
  • influenza viruses mutate little by little in succession (continuous mutations)
  • genetic material is combined and mixed between different influenza virus strains over a period of several decades.
  • discontinuous mutation human beings have evolved into a type of influenza virus that has never been encountered before, that is, no one has immunity.
  • anti-influenza drugs amantadine, zanamivir, and oseltamivir have been developed and marketed, and have each demonstrated the effect of inhibiting the growth of influenza virus in the human body.
  • anti-influenza drugs amantadine, zanamivir, and oseltamivir have been developed and marketed, and have each demonstrated the effect of inhibiting the growth of influenza virus in the human body.
  • immunization against influenza virus in advance by vaccination it was possible to prevent infection and prevent it from becoming serious.
  • influenza virus has been mutated, and viruses with resistance to existing anti-influenza drugs have already emerged.
  • vaccines against new viruses are developed in anticipation of the type of influenza virus that is prevalent, so there is no way to confirm whether the new virus is effective, side effects, mass production, stockpiling methods, etc. Have various problems.
  • influenza viruses All types of influenza viruses that have been discovered so far are known to be infected with waterfowl such as ducks and geese, which are considered to be the original host of influenza viruses.
  • the new influenza virus infection route is thought to be toxic to avian influenza viruses that infect poultry such as chickens from water birds, and in some cases through livestock such as pigs, and further mutate to infect humans If the avian influenza virus can be suppressed in poultry, it will be possible to prevent human infection.
  • the poisoned avian influenza virus spreads rapidly in flocks of poultry and kills it at a mortality rate of almost 100%, so if you can make poultry resistant to avian influenza virus, It is also possible to reduce the risk of significant economic loss. Therefore, immunization of poultry with avian influenza vaccines and rearing in a breeding facility that prevents contact with wild birds are effective means for preventing poultry avian influenza.
  • vaccination of all domestic poultry is cumbersome and costly, and it is difficult to completely prevent contact between poultry and wild birds in countries where it is customary to raise poultry outdoors. As a result, there was no measure other than allowing the outbreak of avian influenza frequently and slaughtering, incinerating, and disinfecting all surrounding poultry with potential contact and distribution.
  • Non-patent Document 1 a method using a viral vector having a replication ability
  • Patent Document 1 a method using a virus vector having a replication ability deleted
  • Non-patent Document 2 RNA interference
  • RNA interference technology to transgenic poultry was also examined, and according to Patent Document 4, the production of transgenic chickens into which shRNA that suppresses the growth of avian influenza virus was introduced was studied. This transgenic chicken was resistant to avian influenza.
  • influenza virus is characterized by the speed of its mutation, and the RNA interference effect against avian influenza strains is drastically reduced or eliminated when the target sequence changes even with one base due to virus mutation. Therefore, it is a problem that not only allows the emergence of resistant viruses and prevents the spread of avian influenza virus, but also promotes the spread of mutant viruses.
  • the present invention aims to eradicate pathogenic viruses transmitted in birds including avian influenza virus, and uses anti-pathogenic transgenic birds that express functional RNA, particularly shRNA, using a replication-deficient vector not derived from birds. It is an object to produce.
  • transgenic birds that highly express functional RNA, particularly shRNA, that is, enhanced viral suppression effect, and anti-pathogenic trans that expresses functional RNA, especially shRNA, that is also effective against mutant viruses.
  • An object is to produce transgenic birds.
  • the present inventor has used a replication-deficient retrovirus vector not derived from birds, shRNA using a target sequence with a low mutation frequency, and a plurality of target sequences We have succeeded in producing transgenic birds that are highly resistant to avian pathogenic viruses by producing transgenic birds that highly express shRNA.
  • the present invention relates to a transgenic bird having resistance to an avian pathogenic virus obtained by introducing a polynucleotide encoding a functional RNA that induces an RNA interference effect into a bird by a non-avian virus vector. is there.
  • the present invention is a pre-transgenic bird characterized by expressing two or more types of functional RNAs that induce RNA interference effects.
  • the present invention is a transgenic bird having resistance to an avian pathogenic virus obtained by crossing the transgenic bird with the transgenic bird or other birds.
  • the present invention makes it possible to produce transgenic birds that suppress various avian pathogen viruses including avian influenza in birds.
  • avian pathogen viruses including avian influenza
  • the following two effects can be mentioned.
  • the first is that it is possible to prevent infection from birds with zoonotic diseases typified by avian influenza to humans and prevent a pandemic of serious viruses unknown to human beings typified by new influenza.
  • the present invention is characterized by producing transgenic birds having resistance to avian pathogenic viruses by the following steps.
  • (3) Transgenic birds are produced using the virus vector of (2).
  • a functional RNA for suppressing an avian pathogenic virus is selected.
  • the avian pathogenic virus is preferably a pathogenic virus transmitted in poultry or wild birds or a mutant strain thereof, particularly a pathogenic virus transmitted in chicken or a mutant strain thereof.
  • Such avian pathogenic viruses include influenza virus, Newcastle disease virus, chicken infectious bronchitis virus, chicken leukemia virus, chicken encephalomyelitis virus, chicken nephritis virus, chicken infectious pharyngeal tracheitis virus, reticuloendotheliosis Viruses transmitted in poultry such as viruses, Marek's disease virus, infectious bursal disease virus, avian reovirus, avian adenovirus, EDS-76 virus, chicken anemia virus, turkey rhinotracheitis virus, avian paramyxovirus, fowlpox virus or In addition to the mutants, viruses that can be transmitted in all birds including water birds and wild birds, or mutants thereof can be exemplified. Avian influenza virus, Marek's disease virus, Newcastle disease virus, etc. are more important because they spread widely in poultry and the damage is enormous, especially avian influenza virus, especially H5N1 type avian influenza virus or its mutant strain The
  • Pesttry here includes birds that can be raised by humans, such as chickens, quail, turkeys, geese, ducks, ducks.
  • the functional RNA for suppressing the avian pathogenic virus here refers to a functional RNA including RNA consisting of a base sequence that is somewhat complementary to the partial base sequence of the target avian pathogenic virus genome. .
  • RNA consisting of a somewhat complementary base sequence means that the RNA is 50% or more of the base sequence complementary to the partial base sequence of the target avian pathogenic virus genome, Preferably it means 80% or more, more preferably 85% or more, even more preferably 90% or more, most preferably 100% sequence identity.
  • RNA has a function of suppressing the growth of the target avian pathogenic virus in the cell
  • its length and structure are not particularly limited, but the length of the partial base sequence of the target viral genome is usually 5
  • the number of bases is preferably 10 bases or more, more preferably 15 bases or more, and particularly preferably 20 bases or more.
  • the region of the partial base sequence of the target avian pathogenic virus genome is preferably a region with a low mutation frequency.
  • the region having a low mutation frequency here refers to a DNA genome or RNA genome having a nucleotide sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90%, among a plurality of different strains of a certain avian pathogenic virus.
  • the region that is most preferably 100% is referred to, and a region functioning for virus replication and structure maintenance can be targeted.
  • there are 8 gene regions in influenza A virus but the region that replicates the viral RNA genome called PA, PB1, PB2, and NP, and the gene region that functions to maintain the structure of the virus called M are suitable targets. Can be.
  • the term “cell” as used herein refers to a cell or cell line derived from any organism such as birds, mammals and insects, and the function to suppress the growth of the virus here refers to a cell into which this RNA has been introduced.
  • the virus titer of the target pathogenic virus is 50% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, even more preferably 90% or more, most Preferably, the effect is to reduce by 100%.
  • the virus titer can be measured by a known method such as serum agglutination test, hemagglutination inhibition test, neutralization reaction, agar gel precipitation reaction, antigen-antibody reaction, fluorescent antibody method, and quantitative PCR method.
  • RNA As this functional RNA, a functional RNA that can take a two-dimensional or three-dimensional structure such as a loop or a hairpin can be preferably used.
  • functional RNA include shRNA and microRNA.
  • RNA may exist as a short double-stranded RNA dimer due to intracellular processing, and may be present in association with a biomolecule such as a protein or lipid to form a complex.
  • functional RNAs include siRNA (small interfering RNA). In particular, it often has a function of inducing an RNA interference effect, has a remarkable effect of degrading and suppressing the target virus genome, and can be preferably used in the present invention.
  • RNA interference effect means that a single-stranded or double-stranded RNA sequence having a sequence that is somewhat complementary to the base sequence of the target avian pathogenic virus genome is converted into RISC (RNA-induced silencing complex) in the cell. It is a phenomenon that forms a protein-RNA complex called a target and cleaves the genome of the target avian pathogenic virus. Inhibitory effect on certain avian pathogenic viruses by any known test method such as in vitro using animal cells such as in vitro or animal infection experiments using the target avian pathogenic virus or its viral genome High polynucleotide sequences can be selected.
  • Functional RNA expressed in transgenic birds can be expressed not only in one type but also in two or more types. It is possible to maintain resistance to viruses by expressing multiple types of functional RNA against viruses with a high mutation rate. In addition, by expressing a plurality of functional RNAs, it becomes possible to impart disease resistance to a plurality of viruses.
  • virus vector examples include a retrovirus vector. Although it does not specifically limit as a retrovirus vector, Retro derived from Moloney murine leukemia virus, Moloney murine sarcoma virus, avian leukemia virus (ALV), mouse hepatocyte virus (MSCV), mouse embryonic hepatocyte virus (MESV), etc. In addition to viral vectors, lentiviral vectors derived from human immunodeficiency virus (HIV) and the like can be mentioned.
  • retrovirus vector Retro derived from Moloney murine leukemia virus, Moloney murine sarcoma virus, avian leukemia virus (ALV), mouse hepatocyte virus (MSCV), mouse embryonic hepatocyte virus (MESV), etc.
  • AMV avian leukemia virus
  • MSCV mouse hepatocyte virus
  • MEV mouse embryonic hepatocyte virus
  • HIV human immunodeficiency virus
  • a replication-defective retrovirus vector is preferred.
  • non-bird-derived replication-defective retrovirus vectors are particularly preferred.
  • a replication-defective retrovirus vector that can be isolated from mammals, particularly rodents, can be preferably used.
  • the coat protein in order to efficiently infect avian cells with this viral vector, it is preferable to artificially use the coat protein as a VSV-G envelope protein derived from bovine vesicular stomatitis virus, but it is limited to this virus type. It is not something.
  • RNA that suppresses the avian pathogenic virus selected in (1)
  • a retroviral vector construct in which the RNA is incorporated into an expression cassette is constructed.
  • the polynucleotide encoded by the retroviral vector construct is not particularly limited, in addition to the above RNA sequence, such as a promoter, enhancer, regulatory factor, etc., but is appropriately designed for the functional RNA to be expressed in avian cells. Is preferably used.
  • a promoter is a region on DNA or RNA that determines the transcription start site of a gene and directly regulates its frequency. Although a promoter functions on DNA, even a corresponding RNA sequence on a vector used for introducing a base sequence that functions as a promoter is referred to as a promoter in the present specification.
  • the promoter is not limited as long as it is a promoter that functions effectively for RNA expression in birds, but polIII promoters such as U6 promoter and H1 promoter that are commonly used for RNA expression are short RNA Suitable for expression.
  • Other pol II promoters include EF1 ⁇ promoter, thymidine kinase promoter, simian virus 40 (SV40) promoter, murine phosphoglycerokinase (PGK) promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, Rous sarcoma virus (RSV) promoter
  • An inducible promoter such as a viral promoter such as tetracycline-inducible promoter can be used.
  • tissue-specific promoter a particularly strong expression of the introduced protein can be expected in specific tissues and cells of birds.
  • a promoter that can be expressed in the fallopian tube, such as the ovalbumin promoter, can also be used, but a promoter that functions in the mucosa and digestive organs is also preferable.
  • the most suitable is a ubiquitous expression promoter, such as the chicken ⁇ -actin promoter.
  • An enhancer is a sequence that promotes transcription from a promoter, but refers to a region on DNA or RNA that cannot cause transcription by itself.
  • An enhancer functions on DNA, but even a corresponding RNA sequence on a vector used for introducing a base sequence that functions as an enhancer is described as an enhancer in the present specification. Since it often functions even when linked to a promoter different from that originally functioning, the combination with the promoter is not limited.
  • the enhancer is not particularly limited, and examples thereof include SV40, CMV, thymidine kinase enhancer, steroid response element, lysozyme enhancer and the like.
  • Regulatory factors are regions on DNA or RNA that cannot contribute to transcription by themselves, contributing to transcriptional regulation and stabilization of RNA after transcription. Even a corresponding RNA sequence on a vector used for introducing a base sequence that functions as an enhancer is referred to as an enhancer in the present specification.
  • an enhancer Woodchuck hepatitis virus origin regulatory element (woodchuck (s) post-transcriptional (regulatory) element: WPRE, US Pat. No. 6,136,597 specification) etc. are mentioned.
  • the foreign gene, promoter, enhancer, regulatory factor and the like are preferably inserted between the 5 ′ end and 3 ′ end of the provirus.
  • the retroviral vector construct contains at least a part of a long terminal sequence (LTR) at the 5 'end and 3' end. Since LTR has a transcription promoter gene and a poly A addition signal, it can be used as a promoter gene or a terminator gene.
  • LTR has a transcription promoter gene and a poly A addition signal, it can be used as a promoter gene or a terminator gene.
  • the target protein coding sequence, promoter gene, transcription enhancer and / or regulatory element is contained between the 5'LTR and the 3'LTR.
  • the difference in using a promoter other than LTR preferably has a structure in which the coding sequence of the target protein is connected downstream of the promoter.
  • no terminator or polyA signal is included between the 5'LTR and the 3'LTR.
  • the expression unit containing the promoter and / or enhancer produced in this manner may be introduced alone or in combination of two or more. Expression units may be connected in tandem in the same direction or in both directions.
  • the replication-defective retrovirus vector used in the present invention is deficient in gag, pol and env genes required for replication.
  • a replication-deficient retrovirus vector construct capable of expressing a target useful protein and a VSV-G expression vector construct are co-introduced into a packaging cell carrying gag and pol genes, and the culture supernatant is used as a virus solution.
  • the VSV-G expression vector construct is introduced into the packaging cells infected with the virus solution, and the culture supernatant is used as the virus solution.
  • the virus solution is preferably concentrated as necessary.
  • the preparation of a replication-defective retrovirus vector is not limited to such a method.
  • the titer of the virus vector is preferably as high as possible, and is preferably 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 10 cfu / ml, and preferably 1 ⁇ 10 9 to 1 ⁇ 10 10 cfu / ml. Is more preferable.
  • the titer of the virus solution is NIH3T3 cells (ATCC CRL-1658) for retroviral vectors other than lentiviruses, and Hela cells (ATCC CCL-2) for lentiviral vectors. When virus solution is added to these cells, it is defined by the number of infected cells.
  • a virus solution diluted to a dilution ratio of 10 2 to 10 6 in 5 ⁇ 10 4 NIH3T3 cells or Hela cells present in each well (bottom area of about 1.9 cm 2 ) of a 24-well culture plate For example, by examining the proportion of cells expressing a fluorescent protein that is a marker gene, or by counting the number of colonies formed during culture in a drug selection medium using drug resistance as a marker. Measure the titer of the liquid.
  • a small hole is made in the eggshell of a bird fertilized egg.
  • Birds are not particularly limited, and fertilized eggs from poultry such as chickens and quails, pets such as parakeets, wild birds such as swans and sparrows, and large birds such as ostriches can be used.
  • the fertilized egg released by the hen is incubated at an appropriate temperature. For example, in the case of a chicken, it may be better to advance the development by warming for 24 hours or more. It is.
  • the temperature to be warmed is not particularly problematic as long as it is within the temperature range where a fertilized egg can be generated.
  • the method of making a hole in the eggshell is not particularly limited as long as the fertilized egg is not damaged, and the tip may be cut with a cutter or a tool such as a drill.
  • a cutter or a tool such as a drill.
  • the virus vector described in (2) is injected there. Many attempts have been made to inject virus vectors so far, and any known method can be used. However, the microinjection method is preferably simple.
  • the amount of injection is not particularly limited, and the amount of the injection can be arbitrarily adjusted as long as the fertilized egg or embryo is not significantly damaged and the desired expression effect is expected.
  • the eggshell After the injection of the viral vector into the fertilized egg or embryo, the eggshell is closed and incubated to hatch.
  • the method of closing the eggshell is not limited as long as it can be hatched, but it may be sufficient to just cover the saran wrap.
  • the incubation method is not limited as long as it can be hatched.
  • transgenic birds that express a desired transgene with a viral vector.
  • the average number of copies of DNA encoding functional RNA that induces RNA interference effects present in the genome of transgenic birds is preferably 0.01 or more, more preferably 0.1 or more, and even more preferably 1 or more. Even more preferably, it is 2 or more.
  • Any known method can be used as a method for evaluating the transgenic birds thus prepared.
  • a method for detecting an RNA sequence for expression as an in vitro test and a virus resistance test in in vivo. Etc. can be evaluated in combination.
  • RNA can be extracted from transgenic avian cells and the target RNA can be detected by Northern blotting or qRT-PCR.
  • the avian pathogenic virus is evaluated by infecting the avian pathogenic virus with transgenic birds expressing the target RNA in this manner, and examining the survival rate and the presence or absence of antibody production.
  • transgenic birds having the property of suppressing or reducing the growth, division, and replication of avian pathogenic viruses by 50% or more can be preferably used in the transgenic bird cells. More preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more, transgenic birds having the property of suppressing or reducing can be suitably used.
  • transgenic birds in which functional RNA is expressed in the cell by 0.001 nM or more can be suitably used.
  • the expression level is 0.01 nM or more, more preferably 0.1 nM or more, still more preferably 1 nM or more, even more preferably 10 nM or more, ideally 100 nM or more, and even more ideal Specifically, it is 1000 nM or more.
  • the transgenic birds produced in this way can obtain offspring having disease resistance by mating with other transgenic birds or other birds.
  • vector or “vector construct” refers to a circular double-stranded DNA (so-called plasmid-type vector), and “retroviral vector” refers to a virus for gene transfer. .
  • DNA sequences encoding three kinds of shRNA targeting NP, PA, and PB1 of influenza A virus were synthesized.
  • the DNA fragments represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 were respectively synthesized.
  • Each sequence has a restriction enzyme BamHI on the 5 ′ side and a recognition site for the restriction enzyme HindIII on the 3 ′ side.
  • Synthesis of hU6 promoter The oligo DNA sequences of SEQ ID NOs: 4 to 17 were synthesized (SIGMA Genosys), and the sequence obtained by connecting them was set to SEQ ID NO: 18. This sequence has a restriction enzyme EcoRI on the 5 ′ side and a recognition sequence for the restriction enzyme BamHI on the 3 ′ side.
  • SEQ ID NO: 18 was digested with restriction enzyme EcoRI and restriction enzyme BamHI, and incorporated into EcoRI and BamHI sites of pMSCVneobactfEPOwpre vector published in Patent Literature (JP 2007-89578 A, Example 6) .
  • This vector was designated as pMSCVneoU6wpre.
  • the DNA fragments of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 were digested with restriction enzymes BamHI and HindIII, respectively, and incorporated into the BamHI and HindIII sites of pMSCVneoU6wpre.
  • the vectors were designated as pMSCVneoU6NPwpre, pMSCVneoU6PAwpre, and pMSCVneoU6PB1wpre, respectively.
  • a schematic diagram of each vector is shown in FIG.
  • Example 2 Preparation of retroviral vector and production of transgenic chicken 2-1: Preparation of transient retroviral vector
  • the vector construct (pMSCVneoU6NPwpre) prepared in Example 1 was transformed into E. coli DH5 ⁇ (TAKARA), A single colony was cultured with shaking in 100 ml of LB medium at 37 ° C. for 16 hours, and the cells were collected by centrifugation and purified endotoxin-free (EndoFree-plasmid Maxi Kit: QIAGEN).
  • the culture supernatant was passed through a 0.45 ⁇ m cellulose acetate filter (manufactured by Advantech), and the filtrate was collected in a centrifuge tube.
  • the retrovirus expressed transiently by ultracentrifugation (50000 G, 1.5 hours, 4 ° C.) was concentrated using an ultracentrifuge CS100GXL (manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.). The concentrated retrovirus was suspended in 20 ⁇ l of TE to prepare a transient retrovirus preparation.
  • GP293 cells were seeded at 1 ⁇ 10 4 cells / well in a 96-well collagen-coated plate (IWAKI), polybrene was added at a final concentration of 8 ⁇ g / ml, and then 20 ⁇ l of a transient retrovirus preparation was added. In addition, it was infected.
  • packaging cell line GP293 cells infected with 2-1 were limit-diluted with D-MEM medium so as to be 0.5 cells / well on a 96-well collagen-coated plate (IWAKI).
  • Drug selection was carried out with D-MEM High-Glucose (GIBCO) (containing 10% FBS) to which G418 (SIGMA) was added to a final concentration of 1 mg / mg. The same medium was changed once every three days, and colony formation was observed in the plate.
  • G418 G418
  • a clone having a high cell growth rate was selected and selected as a packaging cell line (pMSCVneoU6NPwpre / GP293).
  • packaging cell lines were selected in the same manner as described above. These were designated as pMSCVneoU6PAwpre / GP293 and pMSCVneoU6PB1wpre / GP293, respectively.
  • the culture supernatant was passed through a 0.45 ⁇ m cellulose acetate filter (manufactured by Advantech), and the filtrate was collected in a centrifuge tube.
  • the retrovirus expressed transiently by ultracentrifugation (50000G, 1.5 hours, 4 ° C.) was concentrated using an ultracentrifuge CS100GXL (manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.).
  • the concentrated retrovirus was suspended in 20 ⁇ l of TE and used as a concentrated virus solution in 2-4 injection experiments.
  • Chicken fertilized eggs (Shiroyama breeding ground: Kakogawa) were incubated for 55 hours at 38 ° C. and humidity of 50% or more. At that time, 90-degree turning was performed every 1 hour (Showa Franchi Incubator).
  • the number of introduced copies was calculated using a real-time PCR apparatus (LightCycler: Roche) and kit (LightCycler First Start DNA Masterhybprobe: Roche), amplification primers (SEQ ID NOs: 19 and 20), and fluorescently labeled probes (SEQ ID NOs: 21 and 22). Measured according to kit protocol.
  • Table 2 shows the results of calculating the transgene copy number for each hatched individual of the produced transgenic chicken.
  • Example 3 Expression analysis of transgenic chicken Whole blood was collected from the transgenic chicken prepared in Example 2 by blood sampling under the wing. Citric acid was used as an anticoagulant. Total RNA was extracted with RNAiso (TAKARA) (the procedure followed the attached manual). 1 ⁇ g of this total RNA was fractionated by 15% denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, and Northern blot analysis was performed using Dig Labeling & Detection Kit (Roche). As a result, it was confirmed that active 20 base pair RNA was expressed. .
  • TAKARA RNAiso
  • the present invention it is possible to prevent an infection from a zoonotic bird represented by avian influenza to humans and prevent a pandemic of a serious virus unknown to human beings represented by new influenza.
  • the spread of pathogenic viruses in poultry can be suppressed and the risk of enormous loss at poultry farms can be reduced.

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Abstract

　機能性RNA特にshRNAを発現する抗病性トランスジェニック鳥類を作製することを課題とした。また、ウイルス抑制効果を増強したトランスジェニック鳥類、変異ウイルスにも効果のある機能性RNA特にshRNAを発現する抗病性トランスジェニック鳥類を作製することを課題とした。　非鳥類由来の複製能欠失型レトロウイルスベクターを用いて鳥類病原性ウイルスに抵抗性を持つトランスジェニック鳥類を作製した。

Description

外来性RNAを発現する抗病性トランスジェニック鳥類
　本発明は、外来性RNAを発現するトランスジェニック鳥類を作製し、鳥類間で伝播する病原体に抵抗性をもつトランスジェニック鳥類を作製する方法に関する。
　インフルエンザは、インフルエンザウイルスによって引き起こされる急性感染症の一種で、風邪様の症状を発症するが、通常の風邪と異なり、急速かつ重篤な症状を伴うことが多く、健全な成人でさえ肺炎や脳症といった合併症を引き起こし、死に至るケースもある危険な病気である。
　また、インフルエンザは毎年のように流行するが、これはインフルエンザウイルスが変異しやすいという特徴をもつことから連続的に変異を繰り返すことにより巧みに宿主の免疫システムから逃れているためである。
　このように、インフルエンザウイルスは変異のしやすさと流行したときの被害の大きさから、継続的に注視されているウイルスの一つとなっている。
　近年、新型インフルエンザの大流行が危惧されている。1918年から1919年にかけて、人類は初めてインフルエンザの世界的大流行（後にスペインかぜと呼ばれる）に遭遇したが、この時の感染者数は６億人、死者は４千万人以上という大惨事となった。その後、1957年にアジアかぜ、1968年に香港かぜ、1977年にソ連かぜと20世紀は数度にわたりインフルエンザの世界的大流行（パンデミック）に見舞われた。
　このようにたびたび世界的な大流行を引き起こすのは、インフルエンザウイルスが連続的に少しずつ変異する（連続変異）のに加えて、数十年の周期で異なるインフルエンザウイルス株間で遺伝物質の結合や混合（不連続変異）することによって、人類がこれまで遭遇したことのない、すなわち誰も免疫を持たないタイプのインフルエンザウイルスへと進化するためである。
　1997年、香港でH5N1亜型という新型の高病原性トリインフルエンザウイルスが、トリからヒトに直接感染し、死者が出るという驚くべき事態が報じられた。インフルエンザウイルスがトリからヒトへ種の壁を越えて感染することはないというそれまでの定説が覆され、人類があらゆるタイプのインフルエンザウイルスの脅威にさらされていることが明らかとなったのである。特にトリインフルエンザウイルスがヒトに感染し、パンデミックとなることは時間の問題と考えられている。
　人類はこれまでこのインフルエンザウイルスに対し、抗インフルエンザ薬やワクチンを開発して対抗してきた。抗インフルエンザ薬としては、アマンタジン、ザナミビル、オセルタミビルが開発、上市され、それぞれ人体内でのインフルエンザウイルスの増殖を阻害する効果を発揮してきた。また、ワクチンの接種により、インフルエンザウイルスに対する免疫をあらかじめ獲得させることで、感染の予防や、重症化を防ぐことを可能とした。
　ところが、インフルエンザウイルスが変異し、早くも既存の抗インフルエンザ薬に耐性を持ったウイルスが出現してきた。また、新型ウイルスに対するワクチン（プレパンデミックワクチン）は、流行するインフルエンザウイルスのタイプを予測して開発するため、未知の新型ウイルスに効果があるか確認する術はなく、副作用や大量製造、備蓄方法等の諸問題を抱えている。
　新型インフルエンザウイルスの流行後にウイルスを分離、同定し、ワクチン（パンデミックワクチン）開発を行う対策は最も確実であるが、ワクチン開発に６ヶ月もの期間を必要とし、その間被害は拡大し、社会は深刻な打撃をうけることになる。
　このように、未知の新型インフルエンザウイルスに対する予防策は未だ充分ではなく、進化を続けるインフルエンザウイルスに対抗する画期的な対策が望まれている。このような状況の中、予防手段としてのワクチン、治療手段としての抗インフルエンザ薬の開発とは異なるアプローチで新型インフルエンザウイルスのパンデミックを予防する試みが為された。それは、家禽においてトリインフルエンザの蔓延を阻止する試みである。
　これまで発見されているインフルエンザウイルスの全てのタイプはカモやガチョウといった水鳥が感染していることが分かっており、水鳥はインフルエンザウイルスの本来の宿主であると考えられている。新型インフルエンザウイルスの感染経路は、水鳥からニワトリなどの家禽に感染したトリインフルエンザウイルスが強毒化し、場合によってはブタなどの家畜を介し、さらにヒトへ感染するように変異すると考えられていることから、家禽でトリインフルエンザウイルスを抑制することができればヒトへの感染を防ぐことが可能となる。
　また強毒化したトリインフルエンザウイルスは家禽の群れで急速に感染を広げ、ほぼ１００％の致死率で死滅させることから、トリインフルエンザウイルスに抵抗性を持つ家禽を作製することができれば家禽飼育場での甚大な経済的損失リスクを抑えることも可能となる。そのため、家禽にトリインフルエンザワクチンを予防接種することや、野鳥との接触を防止した飼育施設で飼育することは家禽のトリインフルエンザ予防にとって有効な手段である。ところが、飼育している全ての家禽へのワクチン接種は煩雑でコストがかかり、家禽を屋外で飼育することが慣習化されている国々で家禽と野鳥との接触を完全に防止することは困難であることから、たびたびトリインフルエンザの発生を許し、接触、流通の可能性のある家禽類を全て殺処分、焼却と周囲の消毒をして封じ込める以外に対策はなかった。
　そこで、トリインフルエンザを含む病原体に耐性をもつトランスジェニック家禽を作製するという別のアプローチが検討された。トランスジェニック家禽の作製方法はすでに確立しており、複製能を有するウイルスベクターによる方法（非特許文献１）や複製能を欠失させたウイルスベクターを用いる方法（特許文献１）等の成功例が存在する。
　あとは、如何にしてウイルス抵抗性を付与させるかに技術的課題があったが、この課題は、RNA干渉（RNA interference：RNAi）技術の利用が検討された。２本鎖のRNA配列が標的RNAを分解するRNAiのメカニズムが明らかとなり（非特許文献２）、遺伝子組み換え生物で短鎖ヘアピンRNA（short hairpin RNA：shRNA）を発現させることにより、特定ウイルスに対して抵抗性のトランスジェニック動物の作製が検討された（特許文献２および特許文献３）。
　RNA干渉技術はトランスジェニック家禽への応用も検討され、特許文献４によればトリインフルエンザウイルスの増殖を抑制するshRNAを導入したトランスジェニックニワトリの作製が検討された。このトランスジェニックニワトリはトリインフルエンザに抵抗性を示した。
　しかし、このようにして作製されたトリインフルエンザに抵抗性をもつトランスジェニック家禽であっても、未だ２つの問題点が残されていた。1つ目は前述の通り、インフルエンザウイルスの特徴はその変異の早さにあり、あるトリインフルエンザ株に対するRNA干渉効果は、ウイルスの変異によって標的配列が１塩基でも変わると効果が激減もしくは無くなる。そのため、耐性ウイルスの出現を容易に許容し、トリインフルエンザウイルスの蔓延を阻止することができないばかりか、変異ウイルスの蔓延を助長する問題点である。
　そして２つ目は、鳥類由来の複製能欠失ウイルスベクターで作製されたトランスジェニック家禽が他の鳥類由来のウイルスに感染した場合に、ウイルスの結合や組換えによって複製能を獲得した未知のウイルスが出来る危険性を持っている点である。
　これらの問題点を克服し、トリインフルエンザウイルスあるいは家禽に感染する病原性ウイルスに耐性を持ったトランスジェニック家禽の作製が望まれていた。
国際公開公報WO2004-016081 国際公開公報WO2005-003348 国際公開公報WO2006-102461 米国公開公報US2008-0222743
Salter,D.W.ら　Virology 157,235 1987 Fire ら　Nature 391, 806-811 (19 February 1998)
　本発明は、トリインフルエンザウイルスを含む鳥類で伝播する病原性ウイルスの根絶を目的とし、鳥類に由来しない複製能欠失型ベクターを用いて機能性RNA、特にshRNAを発現する抗病性トランスジェニック鳥類を作製することを課題とする。また、機能性RNA、特にshRNAを高発現する、すなわち、ウイルス抑制効果を増強したトランスジェニック鳥類の作製技術確立と、変異ウイルスにも効果のある機能性RNA、特にshRNAを発現する抗病性トランスジェニック鳥類を作製することを課題とする。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、鳥類に由来しない複製能欠失型レトロウイルスベクターを用いて、変異頻度の少ない標的配列を利用したshRNAや、複数の標的配列を同時に攻撃するshRNAを高発現するトランスジェニック鳥類を作製し、鳥類病原性ウイルスに抵抗性を持ったトランスジェニック鳥類を作製することに成功した。
　すなわち、本発明は、RNA干渉効果を誘導する機能性RNAをコードするポリヌクレオチドを、非鳥類由来のウイルスベクターによって鳥類に導入して得られる、鳥類病原性ウイルスに抵抗性を持つトランスジェニック鳥類である。
　また、本発明は、RNA干渉効果を誘導する機能性RNAを２種類以上発現することを特徴とする前期トランスジェニック鳥類である。
　さらに、本発明は、前記トランスジェニック鳥類を、前記トランスジェニック鳥類またはそれ以外の鳥類と交配することによって得られる、鳥類病原性ウイルスに抵抗性を持つトランスジェニック鳥類である。
　本発明により、鳥類におけるトリインフルエンザを含む各種鳥類病原体ウイルスを抑制したトランスジェニック鳥類の作製が可能となった。ニワトリに代表される家禽に応用した場合には、以下の２つの効果が挙げられる。
　１つ目は、トリインフルエンザに代表される人畜共通感染症の鳥類からヒトへの感染を予防し、新型インフルエンザに代表される人類にとって未知の恐るべきウイルスのパンデミックを予防できるという点であり、２つ目は、家禽に病原性ウイルスに対する抵抗性を持たせることによって、家禽での病原性ウイルスの蔓延を抑止し、家禽飼育場での甚大な損失リスクを低減させることができることが可能となる。
本発明の実施例１に係る各ベクターコンストラクトの模式図である。
　以下、本発明を実施する好ましい形態について述べるが、本発明の本質は記載の内容によって限定されるものではない。
　本発明は、以下の工程によって鳥類病原性ウイルスに抵抗性を有するトランスジェニック鳥類を作製することを特徴とする。
（１）鳥類病原性ウイルスを抑制する機能性RNAを選択する。
（２）鳥類細胞で（１）の機能性RNAの発現を可能とするウイルスベクターを構築する。
（３）（２）のウイルスベクターを用いてトランスジェニック鳥類を作製する。
　それぞれの工程について以下に詳述する。
　（１）まず、鳥類病原性ウイルスを抑制するための機能性RNAを選択する。鳥類病原性ウイルスとしては、家禽または野鳥で伝播する病原性ウイルスまたはその変異株、特にニワトリで伝播する病原性ウイルスまたはその変異株を対象とすることが好ましい。
　そのような鳥類病原性ウイルスとしては、インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、鶏伝染性気管支炎ウイルス、鶏白血病ウイルス、鶏脳脊髄炎ウイルス、鶏腎炎ウイルス、鶏伝染性咽頭気管炎ウイルス、細網内皮症ウイルス、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、トリレオウイルス、トリアデノウイルス、ＥＤＳ－７６ウイルス、鶏貧血ウイルス、七面鳥鼻気管炎ウイルス、トリパラミクソウイルス、鶏痘ウイルスといった家禽で伝播するウイルスまたはその変異株のほか、水鳥、野鳥を含むあらゆる鳥類で伝播可能なウイルスまたはその変異株が例示できる。トリインフルエンザウイルスやマレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルスなどは、家禽で広範に拡大し、被害が甚大である点からより重視され、中でもトリインフルエンザウイルス、特にH5N1型トリインフルエンザウイルスまたはその変異株が重視される。
　ここでいう家禽とは、鶏、ウズラ、七面鳥、ガチョウ、カモ、アヒル等、人間によって飼養され得る鳥類が含まれる。
　ここでいう鳥類病原性ウイルスを抑制するための機能性RNAとは、標的となる鳥類病原性ウイルスのゲノムの部分塩基配列と多少なりとも相補的な塩基配列からなるRNAを含む機能性RNAを指す。
　ここで、「多少なりとも相補的な塩基配列からなるRNA」とは、当該RNAが、標的となる鳥類病原性ウイルスのゲノムの部分塩基配列と相補的な塩基配列に対して、５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％の配列同一性を示すことを意味する。
　このRNAは、細胞において標的となる鳥類病原性ウイルスの増殖を抑制する機能を有する限り、その長さや構造において特に限定はされないが、標的とするウイルスゲノムの部分塩基配列の長さは、通常５塩基以上、好ましくは１０塩基以上、さらに好ましくは１５塩基以上、特に好ましくは２０塩基以上である。
　また、標的となる鳥類病原性ウイルスのゲノムの部分塩基配列の領域としては、変異頻度の低い領域が好ましい。ここでいう変異頻度の低い領域とは、ある鳥類病原性ウイルスの複数の異なる株間において、そのDNAゲノムまたはRNAゲノムの塩基配列同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％である領域のことをいい、ウイルスの複製や構造維持に機能している領域などが標的となり得る。例えばＡ型インフルエンザウイルスでは８つの遺伝子領域が存在するが、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰと呼ばれるウイルスのRNAゲノムを複製する領域や、Ｍと呼ばれるウイルスの構造維持に機能する遺伝子領域は好適な標的となり得る。
　なお、ここでいう細胞とは、鳥類、哺乳類、昆虫等のあらゆる生物由来の細胞または株化細胞のことをいい、ここでいうウイルスの増殖を抑制する機能とは、このRNAを導入された細胞群が非操作対照の細胞群との比較において、標的とする病原性ウイルスのウイルス力価が５０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％減少する効果を示すことである。ウイルス力価の測定方法は、血清凝集試験、赤血球凝集抑制試験、中和反応、寒天ゲル内沈降反応、抗原抗体反応、蛍光抗体法、定量ＰＣＲ法等の公知の手法で測定できる。
　この機能性RNAはループ、ヘアピン等の２次元的あるいは３次元的な構造をとりうる機能性RNAを好適に用いることができる。このような機能性RNAとしては、たとえばshRNAやマイクロRNAを例示することができる。細胞内においては、RNAは細胞内でのプロセッシングにより、短い二本鎖のRNAダイマーとして存在することもあり、タンパク質や脂質などの生体分子と会合し、複合体を形成して存在しうる。このような機能性RNAとしては、たとえばsiRNA（small interfering RNA）を例示することができる。とりわけRNA干渉効果を誘導する機能をもつことが多く、顕著に標的ウイルスゲノムの分解、抑制効果があり、本発明で好ましく用いることができる。
　RNA干渉効果とは、標的とする鳥類病原性ウイルスのゲノムの塩基配列とある程度相補的な配列を有する１本鎖または２本鎖のRNA配列が、細胞内でRISC（RNA-induced silencing complex）と呼ばれるタンパク質－RNA複合体を形成し、標的とする鳥類病原性ウイルスのゲノムを切断する現象である。標的とする鳥類病原性ウイルスまたは、そのウイルスゲノムを用いて、培養細胞を用いるなどしたin vitroまたは動物感染実験などのin vivo試験など公知のあらゆる試験法によって、ある鳥類病原性ウイルスにとって抑制効果の高いポリヌクレオチド配列を選択することができる。
　トランスジェニック鳥類で発現させる機能性RNAは１種類のみならず２種類以上発現させることも可能である。変異速度の速いウイルスに対しては複数種の機能性RNAを発現させることで、ウイルスへの抵抗性を持続させることが可能になる。また、複数の機能性RNAを発現させることで、複数のウイルスに対する耐病性を付与することが可能になる。
　（２）次に、このようにして得られた鳥類病原性ウイルスを抑制する機能性RNAを鳥類細胞で発現させるためのウイルスベクターを作製する。
　上記ウイルスベクターとしては、例えばレトロウイルスベクターが挙げられる。レトロウイルスベクターとしては特に限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス、モロニーマウス肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス（ALV）、マウス肝細胞ウイルス（MSCV）、マウス胚性肝細胞ウイルス（MESV）等を由来とするレトロウイルスベクターの他、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）等を由来とするレンチウイルスベクターが挙げられる。
　安全性の観点から複製能欠失型レトロウイルスベクターが好ましい。また、鳥類での複製能復帰の危険性を考慮すると、非鳥類由来の複製能欠失型レトロウイルスベクターが特に好ましい。このような複製能欠失型レトロウイルスベクターとしては、哺乳類、特に、げっ歯類から分離しうる複製能欠失型レトロウイルスベクターを好適に用いることができる。
　本発明においては、鳥類細胞にこのウイルスベクターを効率的に感染させるため、外皮タンパクを人為的にウシ水疱性口内炎ウイルス由来のVSV-Gエンベロープタンパク質とすることが好ましいが、このウイルスタイプに限定されるものではない。
　（１）で選択した鳥類病原性ウイルスを抑制する機能性RNAを鳥類で発現可能とするため、当該RNAを発現カセットに組込んだレトロウイルスベクターコンストラクトを構築する。レトロウイルスベクターコンストラクトにコードされるポリヌクレオチドは、上記RNA配列のほかにプロモーター、エンハンサー、調節因子等、特に限定されないが、鳥類細胞で該機能性RNAが発現するために、適切にデザインされたものを用いることが好ましい。
　プロモーターとは遺伝子の転写開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節する、DNA又はRNA上の領域のことである。プロモーターはDNA上で機能するものであるが、プロモーターとして機能する塩基配列を導入するために用いるベクター上の対応するRNA配列であっても、本願明細書においてはプロモーターと記載する。
　プロモーターとしては鳥類でRNAの発現に有効に機能するプロモーターであれば限定されないが、一般的にRNAの発現によく用いられているU6プロモーターやH1プロモーターのようなpolIII系のプロモーターは、短いRNAの発現に好適である。その他、polII系のプロモーターとして、EF1αプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、シミアンウイルス４０（SV40）プロモーター、ミューリン・フォスフォグリセロキナーゼ（PGK）プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、ラウスザルコーマウイルス（RSV）プロモーター等のウイルスプロモーター、テトラサイクリン誘導型プロモーターのような誘導型プロモーターを用いることができる。また、組織特異的なプロモーターを用いて、鳥類の特定の組織・細胞で特に強い導入タンパク質の発現が望める。オボアルブミンプロモーターのように卵管で発現させるプロモーターも用いることが出来るが、特に粘膜や消化器官で機能するようなプロモーターも好ましい。
　最も好適と考えられるのは、ユビキタス発現プロモーターであり、例えばニワトリβアクチンプロモーターがあげられる。
　エンハンサーとは、プロモーターからの転写を促進する配列であるが、単独では転写を起こせないDNA又はRNA上の領域を指す。エンハンサーはDNA上で機能するものであるが、エンハンサーとして機能する塩基配列を導入するために用いるベクター上の対応するRNA配列であっても、本願明細書においてはエンハンサーと記載する。本来機能しているものとは異なるプロモーターに連結した場合にも機能することが多いので、プロモーターとの組み合わせについては限定しない。エンハンサーとしては、特に限定されないが、SV40、CMV、チミジンキナーゼエンハンサー、ステロイド応答エレメントやリゾチームエンハンサー等が挙げられる。
　調節因子は転写調節や、転写後のRNAの安定化に寄与する、単独では転写を起こせないDNAまたはRNA上の領域のことである。エンハンサーとして機能する塩基配列を導入するために用いるベクター上の対応するRNA配列であっても、本願明細書においてはエンハンサーと記載する。調節因子としては特に限定されないが、ウッドチャック肝炎ウイルス由来調節エレメント（woodchuck post-transcriptional regulatory element：WPRE、米国特許６１３６５９７号明細書）等が挙げられる。上記外来遺伝子、プロモーター、エンハンサー、調節因子等はプロウイルスの５´末端および３´末端の間に挿入されることが望ましい。
　上記レトロウイルスベクターコンストラクトは、５’末端、３’末端に長い反復配列（long terminal repeat：LTR）の少なくとも一部を含む。LTRは転写プロモーター遺伝子やpoly A付加シグナルを持つことから、プロモーター遺伝子やターミネーター遺伝子として利用し得る。レトロウイルスベクターコンストラクトにおいて、目的タンパク質のコード配列、プロモーター遺伝子、転写エンハンサー及び／又は調節エレメントは、5’LTRと3’LTRの間に含まれる。LTR以外のプロモーターを用いる差異は、プロモーターの下流に目的タンパク質のコード配列を接続した構造を有することが好ましい。ウイルスベクターが転写され、ウイルス粒子が作製されるためには、5’LTRから3’LTRの間にターミネーターやpoly Aシグナルを含まないことが好ましい。
　このようにして作製される、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む発現ユニットは、単独で導入しても良いし、２以上導入しても良い。発現ユニットは同一方向にタンデムに連結しても良いし、双方向に配置しても良い。
　次に、本発明で好適に用いられる複製能欠失型レトロウイルスベクターの調製法について、好ましい一態様を説明する。本発明で用いられる複製能欠失型レトロウイルスベクターは、複製に必要とされるgag、polおよびenv遺伝子を欠失している。gag、pol遺伝子を保有するパッケージング細胞に目的とする有用タンパク質を発現可能な複製能欠失型レトロウイルスベクターコンストラクトとＶＳＶ－Ｇ発現ベクターコンストラクトを共導入し、培養上清をウイルス液とする。あるいは、望ましくは、上記ウイルス液を感染させたパッケージング細胞にＶＳＶ－Ｇ発現ベクターコンストラクトを導入し、培養上清をウイルス液とする。ウイルス液は、必要に応じて濃縮することが好ましい。
　複製能欠失型レトロウイルスベクターの調製は、このような方法に限定されるものではない。上記ウイルス液において、ウイルスベクターの力価（タイター）は、高力価であるほど好ましく、１×１０８～１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌが好ましく、１×１０９～１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌがより好ましい。上記ウイルス液の力価は、レンチウイルス以外のレトロウイルスベクターの場合、NIH3T3細胞（ATCC　CRL-1658）を使用し、レンチウイルスベクターの場合は、Hela細胞（ATCC　CCL-2）を使用して、これら細胞にウイルス液を添加したとき、感染した細胞の数によって定義する。具体的には、２４ウェル培養プレートの各ウェル（底面積約１．９ｃｍ２）に存在する５×１０４のNIH3T3細胞またはHela細胞に、１０２から１０６倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を１ｍｌ加え、例えばマーカー遺伝子である蛍光タンパク質を発現している細胞の割合を調べることや、薬剤耐性をマーカーとして、薬剤選択培地中で培養中に形成されてくるコロニー数をカウントすることによってウイルス液の力価を測定する。
　（３）上記ウイルスベクターによってトランスジェニック鳥類を作製する手法について詳述する。まず、鳥類受精卵の卵殻に小さな穴を開ける。鳥類は特に限定することはなく、ニワトリ、ウズラのような家禽から、インコのような愛玩鳥類、白鳥やスズメのようなあらゆる野鳥やダチョウのような大型鳥類の受精卵も用いることができ、作製目的のトランスジェニック鳥類の受精卵を用いる。好ましくは、雌鳥が放卵した受精卵を適温でインキュベートした状態がよく、例えばニワトリの場合は２４時間以上温めることにより発生を進めた方がよい場合もあり、最も好適なのは、５５時間温めた場合である。
　温める温度としては、受精卵が発生できる温度範囲ならば特に問題なく、例えばニワトリの場合は３８℃くらいがよい。
　必要に応じて転卵したり、加湿したりしても問題ない。
　卵殻に穴を開ける手法も受精卵が損傷しなければ特に限定することはなく、カッターで先端を切断しても、ドリルのような工具によって穴を開けても良い。例えばニワトリの場合には、鈍端を直径２ｃｍから４ｃｍ程度にカッターで切断すると操作がしやすい。
　卵殻に穴を開けたら、受精卵あるいは受精卵が発生した胚胎を確認する。そこに（２）で説明したウイルスベクターを注入する。ウイルスベクターの注入法はこれまで多くの試みがなされており、あらゆる公知の手法を用いることができるが、好ましくは、マイクロインジェクション法が簡便でよい。
　注入量も特に限定はなく、受精卵または胚胎に大きな損傷がなく、目的とする発現効果が期待される限りにおいて注入液量は任意に調整可能である。
　受精卵または胚胎へのウイルスベクターの注入が終われば、卵殻を閉じてインキュベートし、孵化させる。卵殻の閉じ方も、孵化できる限り限定しないが、サランラップを被せるのみでも十分な場合もある。インキュベートの方法に関しても孵化できる限り限定しない。
　このようにしてウイルスベクターによって所望の導入遺伝子を発現するトランスジェニック鳥類を得ることが可能である。
　トランスジェニック鳥類のゲノムあたりに存在するRNA干渉効果を誘導する機能性RNAをコードするDNAの平均コピー数は０．０１以上であることが好ましく、より好ましくは０．１以上、さらに好ましくは１以上、さらにより好ましくは２以上である。
　このようにして作製されたトランスジェニック鳥類の評価法としては、公知のあらゆる手法を用いることが可能であるが、in vitro試験として発現目的のRNA配列を検出する方法とin vivoでのウイルス耐性試験等を組み合わせて評価ができる。
　In vitro試験としては、トランスジェニック鳥類細胞からRNAを抽出し、ノーザンブロット法やqRT-PCRで目的のRNAを検出することが可能である。このようにして目的とするRNAを発現したトランスジェニック鳥類を鳥類病原性ウイルスに感染させ、生存率や抗体産生の有無を調べることにより、鳥類病原性ウイルスへの抵抗性を評価する。
　作製したトランスジェニック鳥類のうち、該トランスジェニック鳥類細胞内において、鳥類病原性ウイルスの増殖、分裂、複製を５０％以上抑制または減少させる性質を有するトランスジェニック鳥類を好適に用いることができる。より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上抑制又は減少させる性質を有するトランスジェニック鳥類を好適に用いることができる。
　作製したトランスジェニック鳥類のうち、細胞中に機能性RNAが０．００１ｎＭ以上発現しているトランスジェニック鳥類を好適に用いることができる。好ましくは発現量が０．０１ｎＭ以上であり、より好ましくは０．１ｎＭ以上であり、さらに好ましくは１ｎＭ以上であり、さらにより好ましくは１０ｎＭ以上であり、理想的には１００ｎＭ以上であり、さらに理想的には１０００ｎＭ以上である。
　このようにして作製したトランスジェニック鳥類は、トランスジェニック鳥類同士で、あるいは、それ以外の鳥類を交配することによって、耐病性を有する子孫を得ることができる。
　以下実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。遺伝子操作手法等について特に記述のないものについては代表的な方法に従った（J. Sambrook, E. F. Fritsch,T. Maniatis；Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory）。細胞培養については特に記述のないものについては代表的な手法に従った（小山秀機編集「細胞培養ラボマニュアル」 Springer-Verlag Tokyo 1999）。商品名もしくはメーカーを記載しているものに関しては特に記載のない限り添付の説明書の指示に従った。ここで文言として用いる“ベクター”または“ベクターコンストラクト”とは、環状２本鎖DNA（いわゆるプラスミド型ベクター）のことをいい、“レトロウイルスベクター”とは、遺伝子導入のためのウイルスのことをいう。
　（実施例１）shRNA発現ベクターコンストラクトの構築
　H5N1型トリインフルエンザウイルスの抑制効果のあるshRNAの発現ベクターを構築した。
　Ａ型インフルエンザウイルスのNP、PA、PB1を標的とした３種のshRNAをコードするDNA配列を合成した。
配列番号１、配列番号２、配列番号３で示されるDNA断片をそれぞれ合成した。それぞれの配列については、５’側に制限酵素BamHI、３’側に制限酵素HindIIIの認識サイトが付加してある。
　hU6プロモーターの合成
　配列番号４から１７までのオリゴDNA配列を合成（SIGMA Genosys）し、これらをつなげた配列を配列番号１８とした。この配列には５’側に制限酵素EcoRI、３’側に制限酵素BamHIの認識配列が付加してある。
　shRNA発現ベクターコンストラクトの構築
　配列番号１８を制限酵素EcoRI、制限酵素BamHIで消化し、特許文献（特開２００７－８９５７８号公報実施例６）に公開されているpMSCVneobactfEPOwpreベクターのEcoRI、BamHIサイトに組み込んだ。このベクターをpMSCVneoU6wpreとした。配列番号１、配列番号２、配列番号３のDNA断片をそれぞれ制限酵素BamHIおよびHindIIIで消化し、pMSCVneoU6wpreのBamHIおよびHindIIIサイトに組み込んだ。このベクターをそれぞれpMSCVneoU6NPwpre、pMSCVneoU6PAwpre、pMSCVneoU6PB1wpreとした。それぞれのベクターの模式図を図１に示す。
　（実施例２）レトロウイルスベクターの調製およびトランスジェニックニワトリの作製
　２－１：一過性レトロウイルスベクターの調製
　実施例１で作製したベクターコンストラクト（pMSCVneoU6NPwpre）を大腸菌DH5α（TAKARA）に形質転換し、シングルコロニーを１００ｍｌのＬＢ培地で３７℃１６時間振とう培養した後、遠心分離により菌体を回収し、エンドトキシンフリーで精製した（EndoFree-plasmid Maxi Kit：QIAGEN）。
　GP293細胞（Clontech）を１００ｍｍコラーゲンコートした培養ディッシュ（IWAKI）に５×１０６細胞まき、D-MEM High-Glucose（GIBCO）（10% FBS含）で２４時間培養した後、上記のベクターコンストラクトとpVSVGプラスミド（Clontech）それぞれ２４μｇをLipofectamine 2000（Invitrogen）でトランスフェクトした。トランスフェクトの条件はLipofectamine 2000のマニュアルに従った。６時間後に培養ディッシュから培養上清を吸引し、あらたに９ｍｌのD-MEM（10% FBS含）と２００μｌの１Ｍ　HEPES Buffer Solution（GIBCO）を加えてさらに２４時間培養を継続した。
　培養上清を０．４５μｍのセルロースアセテートフィルター（アドバンテック社製）に通し、ろ液を遠心管に集めた。超遠心機CS100GXL（日立工機社製）を用いて超遠心（５００００Ｇ、１．５時間、４℃）によって一過性発現させたレトロウイルスを濃縮した。濃縮したレトロウイルスを２０μｌのＴＥに懸濁し、一過性レトロウイルス調製液とした。
　前日に９６ウェルコラーゲンコートプレート（IWAKI）に１×１０４細胞／ウェルとなるようＧＰ２９３細胞を播種しておき、ポリブレンを終濃度８μｇ／ｍｌで加えた後、一過性レトロウイルス調製液２０μｌを加えて感染させた。
　２－２：パッケージング細胞株の選抜　２－１で感染させたGP293細胞を９６ウェルコラーゲンコートプレート（IWAKI）上で０．５細胞／ウェルとなるようにＤ－ＭＥＭ培地で限界希釈した。終濃度１ｍｇ／ｍｇとなるようにG418（SIGMA）を加えたD-MEM High-Glucose（GIBCO）（10% FBS含）で薬剤選択を行った。同培地を３日に一度交換し、プレート内でコロニー形成の観察を行い、細胞増殖速度が速いクローンを選抜してパッケージング細胞株（pMSCVneoU6NPwpre/GP293）として選抜した。
　実施例１で作製したpMSCVneoU6PAwpre、pMSCVneoU6PB1wpreのベクターコンストラクトに関しても上記と同様にパッケージング細胞株を選抜した。それぞれ、pMSCVneoU6PAwpre/GP293、および、pMSCVneoU6PB1wpre/GP293とした。
　２－３：高力価レトロウイルスベクターの調製
　前記２－２で作製したパッケージング細胞株（pMSCVneoU6NPwpre/GP293）を１００ｍｍコラーゲンコートディッシュ（IWAKI）に５×１０６細胞播き、一晩培養した（10% FBSを含むD-MEM培地）。Lipofectamine 2000を用いてpVSVGプラスミド２４μｇをトランスフェクトし、６時間後に培地を交換（10% FBSを含むD-MEM培地）し、２００μｌの１Ｍ　HEPES Buffer Solution（GIBCO）を加えてさらに２４時間培養した。
　培養上清を０．４５μｍのセルロースアセテートフィルター（アドバンテック社製）に通し、ろ液を遠心管に集めた。超遠心機CS100GXL（日立工機社製）を用いて超遠心（５００００Ｇ、１．５時間、４℃）によって一過性発現させたレトロウイルスを濃縮させた。濃縮したレトロウイルスを２０μｌのＴＥに懸濁し、濃縮ウイルス液として２－４のインジェクション実験に用いた。
　２－４：トランスジェニックニワトリの作製
　特許文献（特開２００７－８９５７８、実施例７）の内容と同様の手法にて、ニワトリ受精卵へのレトロウイルスのマイクロインジェクションを行った。
　ニワトリ受精卵（城山種鶏場：加古川）を３８℃、湿度５０％以上の条件下で５５時間インキュベートした。その際９０度の転卵を１時間おきに行った（昭和フランキ社製孵卵機）。
　ダイアモンドカッターを付けたミニルーター（プロクソン社製）を用いて鈍端部を開口し、同様に鈍端部を直径４．５ｃｍ切り取り、中身を捨てたニワトリ二黄卵（城山種鶏場：加古川）に移し替えた。胚体が上にくるよう調整し、実体顕微鏡システムSZX12（オリンパス社製）下でフェムトチップII（エッペンドルフ社製）にウイルス液を注入し、マイクロインジェクター（フェムトジェット：エッペンドルフ社製）を用いて２－３で調製したレトロウイルスを２μｌずつマイクロインジェクションした。
　インジェクション後、卵白を糊としてサランラップ（旭化成）で開口部を覆い、３８℃、一時間に３０度転卵の条件で再びインキュベートし、孵化させた（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　２－５：トランスジェニックニワトリの導入遺伝子の検出と導入遺伝子コピー数測定
　２－４で作製したトランスジェニックニワトリより全血を翼下採血により採取した。抗凝固剤としてクエン酸を使用した。小型遠心機にてフラッシュし、上清を２０μｌ分取し、Mag-Extractor Genome（TOYOBO）のキットを用いてゲノムDNAを抽出した。J Virol. 2005 Sep;79(17):10864-74.に記載のトランスジェニックニワトリ（１コピーの導入遺伝子を全身に持つ完全トランスジェニックニワトリ）のゲノムをスタンダードとして導入コピー数を算出した。導入コピー数の算出は、リアルタイムＰＣＲ装置（LightCycler：Roche）およびキット（LightCycler First Start DNA Masterhybprobe：Roche）、増幅プライマー（配列番号１９および２０）、蛍光標識プローブ（配列番号２１および２２）を用いてキットのプロトコルに従い測定した。作製したトランスジェニックニワトリの各孵化個体について導入遺伝子コピー数を算出した結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（実施例３）トランスジェニックニワトリの発現解析
　実施例２で作製したトランスジェニックニワトリより全血を翼下採血により採取した。抗凝固剤としてクエン酸を使用した。RNAiso（TAKARA）によりtotal RNAを抽出した（手法は添付マニュアルに従った。）。このtotal　RNA　1μｇを１５％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、Dig Labeling&Detection Kit（Roche）によりノーザンブロット解析を行ったところ、活性型の２０塩基対のRNAが発現していることを確認した。
　本発明によれば、トリインフルエンザに代表される人畜共通感染症の鳥類からヒトへの感染を予防し、新型インフルエンザに代表される人類にとって未知の恐るべきウイルスのパンデミックを予防できる。また、家禽での病原性ウイルスの蔓延を抑止し、家禽飼育場での甚大な損失リスクを低減させることができる。

Claims (22)

  1. 　非鳥類由来のウイルスベクターによって作製された鳥類病原性ウイルスに抵抗性を持つトランスジェニック鳥類。
  2. 　ウイルスベクターが、哺乳類から分離しうる複製能欠失型レトロウイルスベクターであることを特徴とする、請求項１に記載のトランスジェニック鳥類。
  3. 　ウイルスベクターが、複製能欠失型レンチウイルスベクターであることを特徴とする、請求項１または２に記載のトランスジェニック鳥類。
  4. 　RNA干渉効果を誘導する機能性RNAをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを鳥類受精卵に導入して得られる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
  5. 　RNA干渉効果を誘導する機能性RNAのポリヌクレオチドの塩基配列が、標的とする鳥類病原性ウイルスのゲノムの部分塩基配列と相補的な塩基配列と５０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなるRNAを含むことを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
  6. 　標的とする鳥類病原性ウイルスのゲノム部分塩基配列が、５塩基以上であることを特徴とする、請求項５に記載のトランスジェニック鳥類。
  7. 　RNA干渉効果を誘導する機能性RNAを細胞中で発現することを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
  8. 　細胞内において、鳥類病原性ウイルスの増殖、分裂、複製が５０％以上抑制または減少させる性質を有することを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
  9. 　鳥類病原性ウイルスが、家禽または野鳥で伝播する病原性ウイルスまたはその変異株であることを特徴とする、請求項１ないし８に記載のトランスジェニック鳥類。
  10. 　家禽または野鳥で伝播する病原性ウイルスまたはその変異株が、ニワトリで伝播する病原性ウイルスまたはその変異株であることを特徴とする、請求項９に記載のトランスジェニック鳥類。
  11. 　家禽または野鳥で伝播する病原性ウイルスまたはその変異株が、インフルエンザウイルスまたはその変異株であることを特徴とする、請求項９に記載のトランスジェニック鳥類。
  12. 　家禽または野鳥で伝播する病原性ウイルスまたはその変異株が、トリインフルエンザウイルスまたはその変異株であることを特徴とする、請求項９に記載のトランスジェニック鳥類。
  13. 　トリインフルエンザウイルスまたはその変異株が、H5N1型トリインフルエンザウイルスまたはその変異株であることを特徴とする、請求項１２に記載のトランスジェニック鳥類。
  14. 　RNA干渉効果を誘導する機能性RNAが、shRNA、マイクロRNAおよびsiRNAからなる群から選ばれる１以上の機能性RNAであることを特徴とする、請求項４ないし１３のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
  15. 　機能性RNAが、細胞内でループ構造を形成することを特徴とする、請求項４ないし１４のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
  16. 　RNA干渉効果を誘導する機能性RNAを２種類以上発現することを特徴とする、請求項４ないし１５のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
  17. 　２以上のプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む発現ユニットによりRNA干渉効果を誘導する機能性RNAを２種類以上発現することを特徴とする、請求項１６に記載のトランスジェニック鳥類。
  18. 　２以上のプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む発現ユニットが同一方向にタンデムに連結していることを特徴とする、請求項１７に記載のトランスジェニック鳥類。
  19. 　２以上のプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む発現ユニットが双方向に配置することを特徴とする、請求項１７に記載のトランスジェニック鳥類。
  20. 　RNA干渉効果を誘導する機能性RNAをコードするDNAのゲノムあたりの平均コピー数が０．０１以上であることを特徴とする、請求項４ないし１９のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
  21. 　細胞中に機能性RNAが０．００１ｎＭ以上存在していることを特徴とする、請求項４ないし２０のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類。
  22. 　請求項１ないし２１のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類と、前記トランスジェニック鳥類またはそれ以外の鳥類を交配することによって得られることを特徴とする、鳥類病原性ウイルスに抵抗性を持つトランスジェニック鳥類。
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