JP2004236626A - 遺伝子導入鳥類及びそれを用いたタンパク質の生産方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】有用タンパク質を卵管特異的発現プロモーターにて発現する複製能欠失型レトロウイルスベクターによって遺伝子導入されたG0トランスジェニックキメラ鳥類及びトランスジェニック鳥類。
【選択図】 なし
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、トランスジェニック雌鳥類で効率的に卵中に有用タンパク質を蓄積させるため卵管特異的に発現させることに関する。またこの形質が子孫に効率的に伝播して作製されるトランスジェニック鳥類のベクター及び方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年数多くの医薬品タンパク製剤が開発されているが、活性に糖鎖が必要であるエリスロポエチン(EPO)などは、大腸菌などによる安価な生産システムでは生産できず、生産コストの高い動物細胞での生産に頼らざるを得ない現状である。糖鎖のついたタンパク質を安価に生産するために現在注目を集めているのがトランスジェニック動物である。
【0003】
トランスジェニックマウスが世界で初めて作製されて以来多くのトランスジェニック動物が作製されるようになった。この技術を応用して近年ではウシ、ブタなどでトランスジェニック動物を作製してさまざまな有用タンパク質を生産させる試みが世界各地で行われている。これがいわゆる動物工場である。
【0004】
実際に、イギリスではヒトα−アンチトリプシンをミルク中に分泌するヒツジがすでに作製されている。しかし大型哺乳類は成長速度が遅く、広い飼育スペースが必要であるなどの理由から工業的に有用タンパク質の生産に時間とコストがかかるという問題点がある。
【0005】
ウズラやニワトリに代表される家禽類は、食肉用、採卵用家畜として長年の飼育実績があり、また大型哺乳類と比べて成長速度が速く飼育スペースも小さくてすむというメリットもあることから安価に有用タンパク質を生産することが可能である。
【0006】
一般的にトランスジェニック動物作製においては、受精卵の前核へDNAをマイクロインジェクションする方法がとられている。しかし、鳥類でこの方法は応用できない。鳥類では1細胞期の胚を取得するために雌鳥を殺す必要があり、また卵内の核を見分けることが困難であるため、鳥類のトランスジェニック作製技術は他の哺乳類に比べ遅れていた。
【0007】
最近ではトランスジェニック鳥類の技術も進んできており、従来のトランスジェニック動物作製技術以外のウイルスを用いる方法でトランスジェニックキメラ鳥類を作製したという報告も数例でてきている。また、オボアルブミンプロモーターの一部を用いてβ−ガラクトシダーゼの発現を試ている例もある(特許文献1)。
【0008】
【特許文献1】
特表2000−512149号公報
【0009】
【発明が解決しようとする課題】
これらの報告されているトランスジェニック鳥類の発現プロモーターは、鳥類の全身で発現するものが多く、有用タンパク質の回収は、少量の血から回収するか、鳥を殺して組織又は血液から回収することになるが、この方法では非常に手間と時間がかかり不向きである。効率よく有用タンパク質を回収する方法として卵に蓄積させ回収する方法が有用タンパク質生産にとって不可欠である。そのための1つの方法は、全身で発現されたタンパク質が血中を回り卵中に蓄積したものを回収するという方法である。この方法は抗体などのFc領域を持つタンパク質では、Fcが卵黄中に移行するという特性があるため効率よく卵中に蓄積回収できる。
【0010】
しかしながらこの方法はFc領域を持つ抗体などのタンパク質に限られており、その他の有用タンパク質ではタンパク質の発現が全身で高くても卵中の蓄積量が必ずしも高くないという問題がある。また鳥類にとって毒性が強いものではこの方法を用いることができないという欠点もある。
【0011】
また、卵を作る器官である卵管特異的に発現するオボアルブミンプロモーターの一部を用いてβ−ガラクトシダーゼの発現を試みている例(特許文献1)では、具体性に欠けるところがあり、また、実際に卵管特異的にβ−ガラクトシダーゼが発現するかは疑問が残る。
【0012】
【課題を解決するための手段】
Fc領域のない有用タンパク質をいかに効率的に卵中に蓄積させるかという問題を克服するため、本発明者らは卵白のタンパク質に着目した。卵白は、30種類以上のタンパク質から成るが、主なものはオボアルブミン(54%)、オボトランスフェリン(コンアルブミン 12%)、オボムコイド(11%)、オボグロブリン(8%)、リゾチーム(3.5%)である。これらのタンパク質のプロモーターは卵管で特異的に発現し、その制御下に発現するタンパク質を卵白に蓄積させる。これらのタンパク質のプロモーターを有用タンパク質の発現プロモーターとして用いることにより、効率的に卵中に有用タンパク質を蓄積できるのではないかと考えた。
【0013】
そこで本発明者らはトランスジェニック鳥類作製に用いられている複製能欠失型レトロウイルスベクターであるモロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルスをベクターに用いた。オボアルブミンプロモーターの中で卵管特異的に発現させる領域を用いて医薬品として有用なヒト成長ホルモンを発現するウイルスベクターをコードするプラスミドを構築した後、このウイルスベクターを生産するためのパッケージング細胞を作製した。このパッケージング細胞を用いてウイルスベクターを生産し、ウイルスベクターを産卵直後のウズラ及びニワトリの胚にマイクロインジェクションすることによりG0トランスジェニックキメラ鳥類を作製した。このG0トランスジェニックキメラ鳥類のゲノムにおいてPCR法にて導入遺伝子を確認した。作製したG0トランスジェニックキメラウズラを非トランスジェニックのウズラと交配して得られたG1トランスジェニックウズラ雌の性成熟後に解析を行った。ヒト成長ホルモンの発現をみるためにRT−PCRを行ったところヒト成長ホルモンの発現は卵管特異的であることが分かった。また、卵白中にヒト成長ホルモンを数ng/mlの濃度で蓄積していることを発見し本発明に至った。
【0014】
本発明によりトランスジェニック鳥類において卵白中にあるオボアルブミンのプロモーターの卵管特異的に発現させる領域を用いてヒト成長ホルモンを生産することで卵管特異的に発現させることが可能であるということを証明した。これにより効率的に卵中に目的タンパク質を蓄積させることができるようになり、Fc領域を持たない有用タンパク質を卵中に蓄積する上で極めて優れた方法を提供するものである。
【0015】
本発明は、有用タンパク質の生産において卵管特異的発現プロモーターを用いて発現するトランスジェニック鳥類で、有用タンパク質を卵中に蓄積するための方法であり、この方法により作製されたG0トランスジェニックキメラ鳥類及びG1トランスジェニック鳥類とその子孫である。
【0016】
即ち、本発明は、卵管特異的に発現可能なプロモーターによってコントロールされたタンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターを
a)鳥類の受精卵に導入し、
b)孵化によりG0トランスジェニックキメラ鳥類を得、
c)該G0トランスジェニックキメラ鳥類を該G0トランスジェニックキメラ鳥類又は野生型鳥類と交配することにより得られる、
雌G1トランスジェニック鳥類若しくはその子孫の雌トランスジェニック鳥類、又は、雌G0トランスジェニックキメラ鳥類が生産する卵中へのタンパク質の生産方法である。
また、本発明は、卵管特異的に発現可能なプロモーターによってコントロールされたタンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターを鳥類の受精卵に導入し、孵化させることにより得られたG0トランスジェニックキメラ鳥類、及び、このG0トランスジェニックキメラ鳥類を該トランスジェニック鳥類又は野生型鳥類と交配することにより得られるG1トランスジェニック鳥類又はその子孫でもある。
【0017】
【発明の実施の形態】
本発明のG0トランスジェニックキメラ鳥類及びG1トランスジェニック鳥類は、複製能欠失型レトロウイルスベクターによって外来性タンパク質の遺伝子が導入された鳥類であって導入遺伝子に由来するタンパク質を卵中に生産することを特徴とする。
【0018】
本発明におけるG0トランスジェニックキメラ鳥類及びG1トランスジェニック鳥類の作製方法は本発明者らが以前開発した方法(特開2002−176880)を用いることができるがその方法に限られたものではない。
【0019】
本発明において鳥類に導入される遺伝子は特に限定されないが、レトロウイルスに由来しない遺伝子であることが望ましい。レトロウイルスに由来しない遺伝子としては特に限定されず、グリーン・フルオレッセント・プロテイン(GFP)などのマーカーとして用いられるタンパク質をコードする遺伝子又はヒト成長ホルモン、エリスロポエチン(EPO)、抗体等の有用タンパク質をコードする遺伝子などが挙げられる。
【0020】
上記の導入遺伝子は、ベクターコンストラクトでプロウイルスの5’末端及び3’末端の間に挿入される。これらの導入遺伝子産物を効率的に卵中に蓄積させるためには、卵管特異的に発現される遺伝子のプロモーター配列を用いる。本発明でいう卵管特異的に発現可能なプロモーターは、卵白に含まれるタンパク質の発現調節を担っている遺伝子配列の意味であり、例えばオボアルブミンプロモーターなどが挙げられ、なかでもニワトリ由来のオボアルブミンプロモーターが、その解析が進んでおり発現をコントロールする領域がより解明されているため好適に用いられるが、卵管特異的に発現する遺伝子のプロモーターであればこれに限定されるのものではない。
【0021】
本発明で用いられる複製能欠失型レトロウイルスベクターとしては、複製能が欠失していれば特に限定されるものではないが、モロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス(MoMLV)、エビアンロイコシス・ウイルス(ALV)に由来するものが好ましい。
【0022】
安全性を考慮し、遺伝子導入ベクターとして用いられるレトロウイルスベクターは、複製に必要なgag,pol,envのうちのいずれかか又は全てを欠くことにより、自己複製能を欠失したウイルスが用いられる。
【0023】
パッケージング細胞作製方法としては細胞にgag,pol,env遺伝子とレトロウイルスベクターをコードするプラスミドを導入することにより作製できる。上記のレトロウイルスベクターをコードするプラスミドをgag、polを構成的に発現するGP293細胞に導入する方法としては特に限定されないが、例えばリポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。鳥類の細胞にこの複製能欠失型レトロウイルスを効率的に感染させるための外被タンパク質(env)は、水疱性口内炎ウイルス(Vesicular stomatitis virus:VSV)の外被タンパク質(VSV−G)シュードタイプを用いることが望ましいがこれに限定されるものではない。上記のVSV−Gタンパク質を発現するGP293細胞としては、gag、polを構成的に発現するGP293細胞に、VSV−Gタンパク質の発現ベクターをトランスフェクションと同時にレトロウイルスベクターをコードするプラスミドをトランスフェクトしてもよいがこの方法に限られたものではない。
【0024】
パッケージング細胞等により生産されたシュードタイプのウイルスは通常マイクロインジェクション法(Bosselam、R.Aら(1989)Science 243,533)により導入される。ウイルス導入法としてはこの他にリポフェクション法、エレクトロポレーション法などが実施可能である。また、導入は胚が好ましいが限定されるものではなく分化後の血管内、心臓へも導入される。
【0025】
本発明のG0トランスジェニックキメラ鳥類を作製する方法としては特に限定されないが、例えば、VSV−Gタンパク質を含む膜を有する複製能欠失型レトロウイルスベクターに上記のプロモーターと導入遺伝子を挿入したものを鳥類の胚盤葉又は分化後の血管、心臓に導入し、その胚盤葉を孵化させることにより作製することができる。孵化の方法として本発明者らが開発した人工卵殻による方法(Kamihira,M.ら(1998)Develop,Growth Differ.,40,449)等が用いられる。
【0026】
本発明で使用する鳥類としては、特に限定されるものではなく、例えばニワトリ、ウズラ、七面鳥、カモなどがあげられる。なかでもニワトリやウズラは入手が容易で産卵種としても多産であり、長年の飼育経験により安全性が認められている点が好ましい。
【0027】
本発明の作製法で遺伝子を導入された鳥類は、その体細胞にモザイクキメラ状に遺伝子が導入されたものでありこの一世代目をG0トランスジェニックキメラ鳥類と呼ぶ。またその子孫である導入遺伝子をもった鳥類をG1,G2,G3〜トランスジェニック鳥類と称する。
【0028】
G0トランスジェニックキメラ鳥類を成体まで成長させ、非トランスジェニック鳥類(野生型鳥類)又はG0トランスジェニックキメラ鳥類と交配を行うことによりG0トランスジェニックキメラ鳥類に導入した遺伝子を子孫G1トランスジェニック鳥類へ伝播することができる。遺伝子伝播の成否は、得られたG1トランスジェニック鳥類の血液または細胞などからDNAを抽出し、PCR法又はハイブリダイゼーション法などにより遺伝子導入を検定することができる。
【0029】
作製したG0トランスジェニックキメラ鳥類及びG1トランスジェニック鳥類での卵管特異的発現は、卵管とその他の組織又は血液からmRNAをとり、RT−PCR法又はノーザンブロット法などでの比較により調べることができる。
【0030】
本発明において、卵中へのタンパク質の生産としては、卵黄中であっても卵白中であってもよいが、なかでも卵白中へのタンパク質への生産であることが好ましい。卵管特異的に発現するプロモーターを用いて発現させると卵白中にタンパク質を蓄積させることができると推測される。
例えば、ヒト成長ホルモン遺伝子をオボアルブミンプロモーターで発現させたG1トランスジェニック鳥類の場合、卵白中のヒト成長ホルモンの含有量は好ましくは0.1ng/ml以上、より好ましくは1ng/ml以上である。卵白中のヒト成長ホルモンの含有量の測定方法としては特に限定されないが、例えば、市販のヒト成長ホルモン測定用キットhGH ELISA(ロッシュ社製)等を用いることができる。
【0031】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【0032】
(実施例1)ヒト成長ホルモンをオボアルブミンプロモーターを用いて発現させるレトロウイルスベクターを作製した。
1.ニワトリ繊維芽細胞からのゲノムDNAの抽出
まず、ニワトリゲノムを抽出するにあたりニワトリの有精卵を10日間孵卵した。その後ニワトリ胚を取り出し、ハサミで細かく切断した。切断した胚を0.5g/lコラゲナーゼ(和光純薬社製)溶液で5−10分処理した。PBSで2回洗浄した後ピペッティングして細かくし、DMEM(ダルベッコズ・モディファイド・イーグルス・メディウム シグマ社製)培地38.5℃で2日間培養した。細胞を回収後PBSで洗浄した後ペレットを1mlのTNE(Tris(pH8.0)、150mMNaCl、10mMEDTA)に懸濁した。0.1mlの10%SDS、0.05mlの20mg/mlProteinaseKを加え55℃1時間インキュベートしその後37℃で一晩インキュベートした。この溶液をフェノールクロロホルム処理を数回行った後エタノール沈殿を行いゲノムを抽出した。
【0033】
2.ニワトリゲノムDNAのファージライブラリーの作製
調製したニワトリゲノムをMboIで部分分解を行い、ショ糖密度勾配遠心を行い23Kb付近を回収してファージベクターEMBL3(STRATAGENE社製)につないだ。これをパッケージングキットGigapackIII Gold(STRATAGENE社製)を用いてマニュアルに従いパッケージングし、ファージライブラリーとした。
【0034】
3.プラークハイブリダイゼーション
希釈したライブラリーを宿主細胞である大腸菌LE392細胞に感染させトップアガーに懸濁後、LBプレートに重層させ一晩37℃で培養してプラークを形成させた。プラークを形成させたプレートにナイロンメンブレンフィルターHybond−N(アマシャムバイオサイエンス社製)をのせファージをトランスファーした。トランスファーしたメンブレンを変性溶液(1.5M NaCl、0.5M NaOH)に浸して変性した後中和溶液(1.5M NaCl、0.5MTris−HCl(pH7.5))に浸し中和した。その後2×SSC(1.75%NaCl,0.88% C6H5O7Na3・2H2O(pH7.0))で洗浄した後80℃で2時間ベーキングした。プラークハイブリダイゼーションを行うためのプローブは、オボアルブミンのTATAbox直前を約1Kb増幅する化学合成オリゴヌクレオチド(OVApro5)5’−ctgtggtgtagacatccagca−3’(配列番号1)と(OVApro3)5’−tttgacctttgacgccatag−3’(配列番号2)をプライマーとしてPCRを行い得た。得られたPCR産物をランダムプライマーラベリングキット(BcaBEST Labeling Kit TaKaRa社製)を用いてプローブをラベルした。ファージをトランスファーしたメンブレンをこのプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションで約10万個のプラークを解析した結果、ポジティブなプラーク(15’−A)をクローニングした。
【0035】
4.クローニングしたファージDNAの解析
このファージからDNAを抽出し、解析したところ17Kbの断片が含まれていることが確認された。確認するためオボアルブミンエキソン1の卵管特異的発現に必要といわれるTATAbox上流3.5Kbにプライマーを化学合成した(OVA−3.5kb5; 5’−cacatccaaaggagcttgacc−3’(配列番号3)、OVA−3.5kb3;5’−cagttggaaggttacctggga−3’(配列番号4))。これらのプライマー及びOVApro5、OVApro3を用いて15’−AファージDNAを鋳型としてPCRを行ったところ、それぞれ約0.6Kb、1.1Kbの増幅が見られた。次にEMBL3ベクターの両端にそれぞれアニールするプライマーを化学合成した(5’−actcgtgaaaggtaggcggatctg−3 ’(配列番号5)、5’−cgtccgagaataacgagtggatctg−3’(配列番号6))。このプライマーを用いてインサートDNAの両端の塩基配列を決定した。その結果EMBL3の右のアームにオボアルブミン遺伝子のエキソン1の上流3847bpからクローニングされていることが確認できた。しかし、EMBL3の左のアームから塩基配列を決定した結果はその遺伝子を特定することができなかった。このことから15’−Aクローンは2個以上のインサートがクローニングされたものと考えられた。そこで、オボアルブミンプロモータを利用するに際し必要であるオボアルブミン開始コドンを含むかどうか、制限酵素及びPCR法を用いて確認を行うこととした。オボアルブミン開始コドンの下流に存在するKpnIがクローニングされているかを確認するためにKpnIで切断した結果7Kbの断片を確認した。また、開始コドンの下流約60bpにプライマー(OVA3060)5’−cattggcatggtggacttt−3 ’(配列番号7)を化学合成した。OVApro5とOVA3060で15’−AファージDNAを鋳型としてPCRを行った。その結果約3KbのDNAが増幅された。制限酵素KpnIとPCR法の結果より15’−AファージDNAにはオボアルブミン開始コドン及びその下流1.9Kbが含まれていることが確認された。以上の結果を総合すると15’−AファージDNAにはオボアルブミン遺伝子のエキソン1上流3.8Kbからオボアルブミン開始コドンを含み少なくとも開始コドンの下流約1.9Kbの制限酵素KpnIサイトを含む全長約7.4Kbがクローニングされていることが確認された。
【0036】
5.ヒト成長ホルモンcDNAの調製
ヒト成長ホルモンはHUVECs(Human Umbilical VeinEndothelial Cells)から調製した。調製した方法は、まずHUCECsを10%FCSと30μg/mlのEndothelial Cell Growth Supplement(ECGS;Becton Dickinson Labware社製)を含むTCM199培地で培養した。培養後回収した細胞からMagExtractor Genome(東洋紡社製)を用いてゲノムを調製した。この調製したゲノムを鋳型として化学合成したプライマー5’−cagctcaaggatcccaaggccc−3’ (配列番号8)、5’−ggacacctagtcagacaaaatgatgcaac−3’(配列番号9)を用いてPCRを行った。このPCR産物を鋳型として化学合成したプライマー5’−atactcgaggttcaccatggctacaggtaagcgcc−3’(配列番号10;下線部はXhoI制限酵素サイト)、5’−aatctcgagacgcgtggacacctagtcagacaaa−3’(配列番号11;下線部はXhoI,MluI制限酵素サイト)を用い再びPCRを行った。PCRにより増幅した断片をXhoIで切断し、プラスミドpZeoSV2(+)(インビトロジェン社製)のXhoIサイトに挿入してヒト成長ホルモンゲノム遺伝子を持つプラスミドpZeogGHを作製した。染色体由来のこのヒト成長ホルモン遺伝子はイントロンを含んでいるためイントロンを含まないcDNAを取得することとした。作製したこのプラスミドpZeogGHをリポフェクション法にてCHO細胞(理化学研究所のCELL BANKより入手)にトランスフェクトした。このトランスフェクトしたCHO細胞をF12培地にて培養後、mRNA isolation Kit(ロッシュ社製)を用いてmRNAを取得し、得られたmRNAから化学合成したプライマー 5’−atggctacaggctcccggacgtccct−3’(配列番号12)、5’−cagctagaagccacagctgccctccacag−3 ’(配列番号13)にてRT−PCRをRT−PCR Beads(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いて行った。得られたRT−PCR産物を化学合成プライマー5‘−atactcgagaccatggctacaggctcccg−3’(配列番号14;下線部はXhoI制限酵素サイト)、5‘−aatctcgagacgcgtagctagaagccacagctgc−3’(配列番号15;下線部はXhoI,MluI制限酵素サイト)を用いてPCRを行い、ヒト成長ホルモンのcDNAを得た。このcDNAをXhoIで処理して、pBluescriptSK+(STRATAGENE社製)のXhoIサイトに挿入してプラスミドpBluecGHを作製した。
【0037】
6.オボアルブミンプロモーターによるヒト成長ホルモン発現レトロウイルスベクターの構築
オボアルブミンプロモーターによるヒト成長ホルモン発現レトロウイルスベクターをコードするプラスミドpLGOGは以下のようにして作製した。
まず、オボアルブミンプロモーターをクローニングしたファージDNAをSalI−KpnIで切断し、7Kbを切り出し、pUC19のSalI−KpnIサイトに挿入しプラスミドp19OVA−3.5Kbを作製した。オボアルブミン開始コドンの直前にXhoI制限酵素サイトを付加するために、5’−atcaagcttctcctagactacatgaccccata−3’(配列番号16;下線部はHindIII制限酵素サイト)、5’−atcctcgagttgtctagagcaaacagcaga−3’(配列番号17下線部はXhoI制限酵素サイト)を化学合成した。p19OVA−3.5Kbを鋳型としてPCRを行い増幅した。この増幅した断片を、HpaI、XhoIで処理し、120bpを回収した。また、グリーン・フルオロレッセント・プロテイン(GFP)をつなぐためにプライマーを化学合成した(5’−atgctcgaggttcaccatgagcaagggcgagg−3’(配列番号18;下線部はXhoI制限酵素サイト)、5’−atcggtaccgcatgcacgcgtcgatccagacatgataagata−3’(配列番号19;下線部はKpnI,SphI,MluI制限酵素サイト))。このプライマーを用いてプラスミドpGREEN LANTERN−1(GIBCO社製)を鋳型としてPCRを行った。この断片をXhoI、KpnIで処理した。この二つの調製した断片をp19OVA−3.5KbのHpaI、KpnIサイトに同時に挿入してpOVA−GFPを作製した。ヒト成長ホルモンゲノムDNAを含むプラスミドpZeogGHをXhoI及びMluIで切り出した断片をpOVA−GFPのXhoI、MluIサイトに挿入してプラスミドpOVA−gGHを作製した。レトロウイルスベクターpLGRN(特開2002−176880)を鋳型としてプライマー5’−catacgcgttcttcggaccctgcattc−3’(配列番号20;下線部は,MluI制限酵素サイト)、5’−tgcggtattttctccttacgcatc−3 ’(配列番号21)を化学合成し、PCR産物が平滑末端で得られるPyrobest DNA Polymeraseを用いてPCRを行った。この増幅した断片をXbaIで処理した後pBluescriptSK(+)のSmaI,XbaIサイトに挿入してプラスミドpBlue3’LTRMluXbaを作製した。このプラスミドpBlue3’LTRMluXbaからXhoI及びXbaI断片を切り出しpLGRNのXhoI、XbaIサイトに挿入してプラスミドpLGを作製した。オボアルブミンプロモーター及びヒト成長ホルモンゲノムDNAが含まれるプラスミドpOVA−gGHをSalI及びMluIで切り出した断片をpLGのXhoI、MluIサイトに挿入してpLGOgGを作製した。ヒト成長ホルモンcDNAを含むプラスミドpBluecGHをXhoI及びMluIで切り出した断片をpLGOgGのXhoI、MluIサイトに挿入してヒト成長ホルモンをオボアルブミンプロモーターで発現させる複製能欠失型レトロウイルスベクターをコードするプラスミドpLGOGを作製した。このプラスミド地図を図1に示した。
【0038】
(実施例2)オボアルブミンプロモーターによるヒト成長ホルモン発現ウイルスベクターの調製
実施例1で作製したベクターコンストラクトpLGOGよりレトロウイルスを調製するため、GP293細胞(クローンテック社製)を直径100mmの培養ディッシュにてDMEM培地を用いて培養した。90%コンフレントになるように前日にまき直しリポフェクション法によりプラスミドpLGOGを11μg及びプラスミドpVSV−G(クローンテック社製)11μgをGP293細胞にトランスフェクトした。48時間後、上清を0.45μm酢酸セルロースフィルター(アドバンテック社製)を通して夾雑物を除いた後、25,000rpm、4℃で1.5時間超遠心分離した。上清を捨て沈殿をTNE(50mM Tris−HCl(pH7.8)、130mM NaCl、1mM EDTA)に溶解しウイルス液とした。このウイルス液をDMEMにポリブレン(シグマ社製)10μg/mlになるように加えたもので希釈した。別に24wellマイクロプレートで培養したGP293細胞の培地をこのウイルスを希釈したポリブレン入りDMEMと培地交換した。培養して増殖させた後この細胞を回収して、DMEMを用いて13.3cell/mlになるよう希釈し96wellマイクロプレートに150μlずつ分注した。2週間後コロニーを形成したところで24wellマイクロプレートに植え継いだ。この中からタイターの高いものを選択し、パッケージング細胞とした。このパッケージング細胞を培養し、pVSV−Gプラスミドをリポフェクション法でトランスフェクトした。48時間後上清を0.45μm酢酸セルロースフィルター(アドバンテック社製)を通して夾雑物を除いた後、25,000rpm、4℃で1.5時間超遠心分離した。上清を捨て沈殿をTNE(50mM Tris−HCl(pH7.8)、130mM NaCl、1mM EDTA)に溶解しウイルス液とした。このようにして得られた高タイターウイルス溶液は1×108〜8×108cfu/mlであった。
【0039】
ウイルスタイターの測定は、以下のように行った。測定の前日にNIH3T3細胞(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手)を24wellディッシュに1.5×104細胞植え培養した。102〜106倍に10μg/mlポリブレン入りDMEMで希釈したウイルス溶液1mlを細胞の培地と交感し、48時間後に蛍光顕微鏡によりGFP(グリーン・フルオレッセント・プロテイン)を発現している細胞の割合を測定し、以下の計算式によりタイターを決定した。
ウイルスタイター=細胞数×希釈率×発現割合 (cfu/ml)
【0040】
(実施例3)ウズラ胚へのレトロウイルスのインジェクション及び胚培養
WE系統のウズラ受精卵(日本生物科学研究所)を使用した。産卵直後の受精卵の卵殻を70%エタノールで消毒し、鋭端部を直径2cmの円形にダイヤモンドカッター(MINIMO7C710,ミニター社製)で切り取り、胚を露出させた。胚盤葉を実体顕微鏡で観察しながら、ガラス管(GD−1、ナリシゲ社製)をマイクロピペット製作機(PC−10,ナリシゲ社製)で加工し、実施例2で調製したウイルス溶液をガラス管内に入れ、外形約20μmとなるように先端を折って作製した針を刺しマイクロインジェクター(Transjector5246、エッペンドルフ社製)を用いて胚盤下腔の中央に2μlを注入した。この卵殻に切り口まで卵白を満たした後卵白を糊としてPTFE膜(ミリラップ、ミリポア社製)とポリ塩化ビニリデンラップ(サランラップ、旭化成社製)とで蓋をした。このウイルスをインジェクションした、受精卵を自動転卵装置が内蔵された孵卵器(昭和フランキ社製P−008型)で15分ごとに90度転卵しながら孵卵を行った。孵卵開始2日後、ニワトリのS卵を70%エタノールで消毒し、鈍端部を直径3.5cmの円形にダイヤモンドカッターで切り取り中身を取り除いた殻にウイルスをインジェクションしたウズラの卵白と卵黄を移し、濃度50mg/mlで卵白に懸濁した乳酸カルシウム溶液を0.5ml添加後、卵白を糊としてポリ塩化ビニリデンラップ(サランラップ、旭化成社製)とで蓋をした。ニワトリS卵に移した胚を自動転卵装置が内蔵された孵卵器で15分ごとに30度転卵しながら孵卵を行った。
【0041】
(実施例4)ニワトリ胚へのレトロウイルスのインジェクション及び胚培養
ニワトリ受精卵(日本生物科学研究所)を使用した。産卵直後の卵殻を70%エタノールで消毒し、鋭端部を直径3.5cmの円形にダイヤモンドカッター(MINIMO7C710,ミニター社製)で切り取り、胚を露出させた。胚盤葉を実体顕微鏡で観察しながら、ガラス管(GD−1、ナリシゲ社製)をマイクロピペット製作機(PC−10,ナリシゲ社製)で加工し、実施例2で調製したウイルス溶液をガラス管内に入れ、外形約20μmとなるように先端を折って作製した針を刺しマイクロインジェクター(Transjector5246、エッペンドルフ社製)を用いて胚盤下腔の中央に2μlを注入した。この卵殻に切り口まで卵白を満たした後卵白を糊としてPTFE膜(ミリラップ、ミリポア社製)とポリ塩化ビニリデンラップ(サランラップ、旭化成社製)とで蓋をした。このウイルスをインジェクションした受精卵を自動転卵装置が内蔵された孵卵器(昭和フランキ社製P−008型)で15分ごとに90度転卵しながら孵卵を行った。孵卵開始2日後、ニワトリのLL卵を70%エタノールで消毒し、鈍端部を直径4.5cmの円形にダイヤモンドカッターで切り取り中身を取り除いた殻にニワトリの卵白と卵黄を移し、濃度50mg/mlで卵白に懸濁した乳酸カルシウム溶液を0.5ml添加後、卵白を糊としてポリ塩化ビニリデンラップ(サランラップ、旭化成社製)とで蓋をした。ニワトリLL卵に移した胚を自動転卵装置が内蔵された孵卵器で15分ごとに30度転卵しながら孵卵を行った。
【0042】
(実験例5)遺伝子導入鳥類胚の孵化率
ウズラにウイルス導入胚操作を2回、計96胚行い、複製能欠失型レトロウイルスベクターにより導入した胚及びニワトリにウイルス導入胚操作を4回、計140胚行い、複製欠失型レトロウイルスベクターにより導入した胚を実施例4で示した方法により孵化させた。ウズラでは平均19.8%、ニワトリでは平均17.1%の孵化率で遺伝子導入鳥類胚を孵化させることができた。図2に遺伝子導入ウズラ胚の孵化率を示した。
【0043】
(実験例6)孵化胚より採取したゲノムDNAのPCR解析
孵化したニワトリ及びウズラの卵殻の漿尿膜を採取し、MagExtractor Genome(東洋紡社製)を用いてトランスジェニックキメラ鳥類ゲノムDNAを調製した。調製したゲノムDNAをGFP内でPCRにて増幅可能な化学合成したプライマー5’−tggtgaatagaatcgagctgaagggcatt−3’(配列番号22)5’−aactccagcaggaccatgtggtctctctt−3 ’(配列番号23)を用いてPCRを行った。この結果を図3に示した。この結果より、ウズラでは検定した全ての個体から導入遺伝子を検出することができた。また、ニワトリでも70%の導入効率であった。このことにより本発明者らは高い効率でG0トランスジェニック鳥類を作製したことが確認された。
【0044】
(実施例7)G1トランスジェニックウズラ作製及び伝播効率
G0トランスジェニックキメラ鳥類は遺伝子導入を行った際すでに多くの細胞からなる胚であるため、遺伝子が導入されている細胞と導入されていない細胞のモザイクになっていると考えられ、ここでG1トランスジェニックウズラの作製を試みた。G0トランスジェニックキメラウズラを非トランスジェニックウズラと自然交配させ、生まれたG1ウズラの導入遺伝子伝播効率を実施例6記載のトランスジェニックキメラウズラに対して検定した方法を用いて求めた。その結果5羽のG0トランスジェニックキメラウズラから生まれたヒナ合計175羽を解析し、18羽から導入遺伝子を検出し伝播効率は約10%であった。このG0トランスジェニックキメラウズラからG1ウズラへの伝播効率を図4に示した。
【0045】
(実施例8)G1トランスジェニックウズラでのヒト成長ホルモンの発現解析
作製したG1トランスジェニックウズラでのヒト成長ホルモンの発現が卵管特異的であるかの確認を行った。成熟した雌の各組織を採取し、mRNA isolation Kit(ロッシュ社製)を用いてmRNAを取得し、得られたmRNAから化学合成したプライマー 5’−agtattcattcctgcagaacccccagacc−3’(配列番号24)、5’−ctgttggcgaagacactcctgaggaactg−3 ’(配列番号25)にてRT−PCRをRT−PCRBeads(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いて行った。この結果を図5に示した。この結果より卵管で導入したヒト成長ホルモンが発現している一方、他の組織では発現が認められなかった。このことより導入したオボアルブミンプロモーターが卵管特異的に働いていることが確認された。
【0046】
(実施例9)G1トランスジェニックウズラ及びG0トランスジェニックキメラニワトリの卵白中でのヒト成長ホルモン蓄積の解析
G1トランスジェニックウズラ雌が成熟後産卵した卵を採取後ヒト成長ホルモンの卵白中の濃度をELISA法で測定した。定量には市販のヒト成長ホルモン測定用キットhGH ELISA(ロッシュ社製)を用いて測定した。このキットでは数十pg/mlのヒト成長ホルモンを測定することが可能である。ELISAでヒト成長ホルモンの卵白中の濃度を測定した結果を図6に示した。この結果いずれのG1トランスジェニックウズラにおいても卵白中に数ng/mlの濃度でヒト成長ホルモンが生産されていることが明らかとなった。また、G0トランスジェニックキメラニワトリ雌の卵白を測定した結果でも、1.1ng/mlの濃度であった。
【0047】
【発明の効果】
本発明により卵管特異的に発現可能なプロモーターを用いて外来タンパク質の発現をコントロールすることにより卵管特異的に発現することが可能であり、効率的に外来タンパク質を卵中に蓄積できることが示された。更に、本発明のG0トランスジェニックキメラウズラは導入遺伝子をG1ウズラに伝播し、G1トランスジェニックウズラも作製可能であることも示している。このことから有用タンパク質の生産において効率的に卵中に蓄積させることができるようになり、これを回収することにより安価に有用タンパク質を生産することが可能となった。
【0048】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】複製能欠失型レトロウイルスベクターのベクターコンストラクトpLGOGの構造を示す。ψはパッケージングシグナル配列を示す。GFPはグリーン・フルオロレッセント・プロテイン遺伝子を示す。OVAproはオボアルブミンプロモーター遺伝子を示す。hGHはヒト成長ホルモンcDNAを示す。5’LTR及び3’LTRはそれぞれMoMLVのロングターミナルリピートを示す。Amprはアンピシリン耐性遺伝子を示す。
【図2】遺伝子導入胚の孵化効率を示す。遺伝子導入胚数に対してどれだけ孵化したかを孵化効率で示した。
【図3】孵化胚より採取したゲノムDNAのPCRによる解析を示した。Mは分子量マーカーを示した。番号は孵化したG0の番号を示した。GFPはグリーン・フルオロレッセント・プロテイン遺伝子を示した。
【図4】導入遺伝子のG1への伝播効率を示した。G0 No.はG0の番号を示した。検定したG1のうち導入遺伝子をもっているG1の割合を伝播効率(%)で表した。
【図5】オボアルブミンプロモーターによりコントロールされたヒト成長ホルモン遺伝子の組織特異的発現を示した。Mはマーカー、Bは脳、Hは心臓、Lは肝臓、Sは脾臓、Oは卵管を示した。NCはネガティブコントロールとしてPCRの鋳型なし、PCはポジティブコントロールとしてpLGOGを鋳型としてPCRを行った。
【図6】G1ウズラ及びG0ニワトリが産んだ卵の卵白中におけるヒト成長ホルモン濃度(ng/ml)の測定を行った。
Claims (16)
- 卵管特異的に発現可能なプロモーターによってコントロールされたタンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターを
a)鳥類の受精卵に導入し、
b)孵化によりG0トランスジェニックキメラ鳥類を得、
c)該G0トランスジェニックキメラ鳥類を該G0トランスジェニックキメラ鳥類又は野生型鳥類と交配することにより得られる、
雌G1トランスジェニック鳥類若しくはその子孫の雌トランスジェニック鳥類、又は、雌G0トランスジェニックキメラ鳥類が生産する卵中へのタンパク質の生産方法。 - 複製能欠失型レトロウイルスベクターの導入箇所が受精卵の胚、血管、又は心臓のいずれかであることを特徴とする請求項1記載の生産方法。
- 複製能欠失型レトロウイルスベクターの導入箇所が受精卵の胚であることを特徴とする請求項1又は2記載の生産方法。
- 複製能欠失型レトロウイルスベクターの導入法がマイクロインジェクション法、リポフェクション法、又はエレクトロポレーション法のいずれかであることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項記載の生産方法。
- 複製能欠失型レトロウイルスベクターの導入法がマイクロインジェクション法であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項記載の生産方法。
- 雌G0トランスジェニックキメラ鳥類が生産する卵中へのタンパク質の生産が卵白中である請求項1〜5のいずれか1項記載の生産方法。
- 雌G1トランスジェニック鳥類又はその子孫が生産する卵中へのタンパク質の生産が卵白中である請求項1〜5のいずれか1項記載の生産方法。
- 卵管特異的に発現可能なプロモーターがニワトリ・オボアルブミンプロモーターである請求項1〜7のいずれか1項記載の生産方法。
- タンパク質がヒト成長ホルモンである請求項1〜8のいずれか1項記載の生産方法。
- 卵管特異的に発現可能なプロモーターによってコントロールされたタンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターを鳥類の受精卵に導入し、孵化させることにより得られたG0トランスジェニックキメラ鳥類であるトランスジェニック鳥類。
- G0トランスジェニックキメラ鳥類である請求項10記載のトランスジェニック鳥類を該トランスジェニック鳥類又は野生型鳥類と交配することにより得られるG1トランスジェニック鳥類又はその子孫であるトランスジェニック鳥類。
- 鳥類がニワトリ又はウズラである請求項10又は11記載のトランスジェニック鳥類。
- タンパク質がヒト成長ホルモンである請求項10又は11記載のトランスジェニック鳥類。
- ヒト成長ホルモンを卵中に生産し、雌トランスジェニックキメラ鳥類又は雌トランスジェニック鳥類である請求項13記載のトランスジェニック鳥類。
- 卵白中にヒト成長ホルモンを0.1ng/ml以上含む請求項14記載のトランスジェニック鳥類。
- 卵白中にヒト成長ホルモンを1ng/ml以上含む請求項14記載のトランスジェニック鳥類。
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