JP5688849B2 - トランスジェニック金魚 - Google Patents
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Description
これらのトランスジェニック魚類の作製にあたり、主にゼブラフィッシュが対象魚として用いられてきた。ゼブラフィッシュは体長が約4cmと小さく飼育がしやすい、また、採卵がしやすい等の多くの利点がある。一方で小さすぎることから、血液を採取する等が難しく、抗体を産生させた場合でも血清が得られない等の問題があった。
トランスジェニックの対象魚の一つとして金魚を用いることは、示唆されてはいるものの(例えば、特許文献1参照)、具体的に記載されたものはなく、トランスジェニック金魚の具体的な作製方法および当該方法によって得られるトランスジェニック金魚の提供が望まれている。
(1)対象遺伝子を導入してなるトランスジェニック金魚。
(2)対象遺伝子が遺伝子発現ベクターに組み込まれ、かつ、当該遺伝子発現ベクターが金魚の受精卵に導入された上記(1)に記載のトランスジェニック金魚。
(3)遺伝子発現ベクターがpXI、pZexまたはpZEF1をプロモーターとして含む上記(2)に記載のトランスジェニック金魚。
(4)遺伝子発現ベクターがpXI、pZexおよびpZEF1のいずれか2つ以上をプロモーターとして含む上記(2)に記載のトランスジェニック金魚。
(5)pXI、pZexおよびpZEF1のいずれか2つ以上がタンデムに配列される上記(4)に記載のトランスジェニック金魚。
(6)対象遺伝子が全身に発現された上記(1)〜(5)のいずれかに記載のトランスジェニック金魚。
(7)金魚がリュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキンから選ばれるいずれかである上記(1)〜(6)のいずれかに記載のトランスジェニック金魚。
(8)対象遺伝子を組み込んだ遺伝子発現ベクターを金魚の受精卵に導入する工程を含むトランスジェニック金魚の作製方法。
(9)遺伝子発現ベクターがpXI、pZexまたはpZEF1をプロモーターとして含む上記(8)に記載のトランスジェニック金魚の作製方法。
(10)金魚がリュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキンから選ばれるいずれかである上記(8)または(9)に記載のトランスジェニック金魚の作製方法。
ここで、「対象遺伝子」とは、発現の目的とする遺伝子をいう。例えば、特定の遺伝子を導入することにより、その遺伝子が与える影響を調べることを目的とする場合には、その特定の遺伝子が「対象遺伝子」とされることになる。また、特定のタンパク質を製造することを目的とする場合には、そのタンパク質をコードする遺伝子が「対象遺伝子」とされることになる。具体的には、金魚以外を由来とする外来遺伝子等が挙げられ、これらの遺伝子は、遺伝子の発現を確認するためのEGFPやDsRed等の蛍光物質をコードする遺伝子等と組み合わせて「対象遺伝子」とすることもできる。
対象遺伝子を組み込む「遺伝子発現ベクター」は、対象遺伝子が発現できるものであればいずれのものであってもよいが、例えば、アフリカツメガエルelongation factor 1−alphaプロモーターであるpXI、ゼブラフィッシュhatching−grand−enzymeプロモーターであるpZex(いずれも参考文献1参照)や、本発明者らが独自に作成した、ゼブラフィッシュelongation factor 1−alphaプロモーターであるpZEF1をプロモーターとして含む遺伝子発現ベクター等が挙げられる。
プロモーターを複数含む場合、対象遺伝子が発現できればプロモーターはどのように配列されていてもよく、例えば、プロモーターがタンデムに配列された遺伝子発現ベクターを用いることもできる。
参考文献1:特開2007−143497号公報
未受精卵および精子は、搾出後のすぐのものを人工授精させて用いることもできるが、親金魚の飼育条件下でそれぞれを保存することにより、保存後時間が経過したものでも用いることができる。例えば、親金魚の飼育条件下(約15〜26℃)や生存可能水温(0〜40℃)で保存後6時間以上経過したもの等でも人工授精させて用いることができる。
従来使用されてきたゼブラフィッシュにおいても、金魚と同様に、成熟した雌雄親魚からお腹を圧迫して絞り出す搾出法によって未受精卵および精子を得て、乾導法(参考文献2)によって人工授精を行うことができる。しかし、ゼブラフィッシュから搾出した未受精卵および精子の受精可能時間が数分間と短いため、金魚のように、それぞれを保存して使用することができない。また、魚体が小さいために搾出時に魚体へのダメージが大きく、熟練した手技を持ってしても親魚を殺してしまうことがよくある。そのため、繰り返し採卵・採精できず、受精卵の生産性が自然産卵に比べて極めて悪かった。
さらに、ゼブラフィッシュの受精卵は分離性沈下卵であるため、付着性沈下卵である金魚の受精卵とは異なり、植物、石、プラスティックなどの物質に粘着する生物学的な特性を有しておらず、対象遺伝子を導入しにくいという問題もあった。
参考文献2:緑書房「水産養殖学講座」4 水族繁殖学,隆島史夫,羽生功 編(ISBN4−89531−434−0) 「媒精方法」p182−183
このような金魚としては、例えば、リュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキン等が挙げられ、また、これらを交配、突然変異、選抜育種して新たに作出したキンギョ等も含まれる。
「対象遺伝子を組み込んだ遺伝子発現ベクターを金魚の受精卵に導入する工程」において、該遺伝子発現ベクターは、マイクロインジェクション等の従来知られている方法を用いて受精卵に導入することができる。
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
受精卵は金魚(リュウキン)の雌雄成魚から調製した受精卵を用いた。
2歳齢リュウキンの雌雄からそれぞれ搾出した未受精卵および精子を、乾導法にて人工授精させた後、付着性沈下卵である金魚受精卵の粘着性を利用して、直径90mmのプラスティックシャーレに付着させ飼育水と共に収容した。また、透明な金魚(リュウキン)の1歳齢の雌雄からそれぞれ搾出した未受精卵および精子についても同様に人工受精して、得られた受精卵を収容した。
3種類の遺伝子発現ベクターを作製した。
本ベクターはプロモーターとしてpXIおよびpZexを組み込んだ遺伝子発現ベクターである。pXI(配列表配列番号1)の下流にEGFP(配列表配列番号2)を組み込んだpXI−EGFPベクターと、pZex(配列表配列番号4)の下流にDsRed(配列表配列番号5)を組み込んだpZex−DsRedベクターを、タンデムに連結して遺伝子発現ベクターを作製した。
1)pBSIISK(−)SK−Bgl/KS−Nde(図1)を作製した。
pBSIISK(−)SK−Bgl/SK−Ndeは,タンデムベクター作製用に構築したサブクローニング用のベクターである。pBluescriptIISK(−)(Stratagene)のマルチクローニングサイト(MCS)のNotIとXbaIの間にBglIIを挿入し,さらに,XhoIとKpnIの間にNdeIを挿入する事により作製した。
pXI−EggE07F09(SfiI)は,研究用ベクターpXI−GFP(参考文献3)のβ−globinイントロンの下流に、2個のSfiIサイトを挿入したベクターであり、2個のSfiIサイトを設けることで目的遺伝子の組換え作業がより簡便になることを期待したものである。pXI−EggE07F09(SfiI)の作製は次のように行った。
a.pBSII(SK−)−EggE07F09を作製した。
クローニング用ベクターpTripleEx2(タカラバイオ)のマルチクローニングサイトにゼブラフィッシュribosomal protein L35(NCBI accession no.NP775340)のcDNAをクローニングしたpTriplEx2−EggE07F09から制限酵素EcoRIおよびSalIでEggE07F09 cDNA領域を切り出した。これを制限酵素EcoRIおよびSalIで処理したpBluescriptIISK(−)へEcoRI/SalIサイトを介して組み換えてpBSII(SK−)−EggE07F09を作製した。
b.pZex−EGFP−His(B)を作製した。
ゼブラフィッシュzHe1プロモーター約1000bp(以下、zHe1−1000bpとする、配列表配列番号3)をXhoI/BamHIを介してpXI−EGFP(参考文献3)のプロモーターと組み換え,さらにXhoI/EcoRIで処理後Klenow Fragment(タカラバイオ)によって末端を平滑化しセルフライゲーションする事によりプロモーター領域を約300bpに削除したpZex(配列表配列番号4)を調製した。さらに,EGFPのアミノ酸配列のC末端へHis tagを付加してpZex−EGFP−His(B)を作製した。
c.pZex−EggE07F09(SfiI)(図3)を作製した。
pBSII(SK−)−EggE07F09からBamHI/SalIでEggE07F09を含む領域を切り出した。これをpZex−EGFP−His(B)へBamHI/SalIを介して組み換えてpZex−EggE07F09(SfiI)を作製した。
d.pXI−EggE07F09(SfiI)を作製した。
pZex−EggE07F09(SfiI)のEggE07F09および+SV40由来のpolyA付加シグナル領域をBamHI/NdeIで切り出した。これをBamHI/NdeIを介してpXI−EGFPへ組み換えてpXI−EggE07F09(SfiI)を作製した。
pXI−1000pro−DsRed(ΔBamHI)は,ゼブラフィッシュzHe1プロモーター約1000bpをpXI−EGFPのプロモーターとXhoI/BamHIを介して組み換え,さらにEGFPをpDsRed−Monomer(Clontech)のDsRed−MonomerとBamHI/NotIを組み換えたベクターである。さらにBamHIで処理後Klenow Fragment(タカラバイオ)によって末端を平滑化しセルフライゲーションする事により,ベクターのBamHI認識配列を消去した。
pZex−DsRed(ΔBamHI)/pBSIISK(−)SK−Bgl/KS−Ndeは,上記3)で作製したpXI−1000pro−DsRed(ΔBamHI)を上記1)で作製したpBSIISK(−)SK−Bgl/SK−NdeへEcoRI/NdeIを介して組み換えたベクターであった。
pXI−EggE07F09(SfiI)−pZex−DsRedは,上記2)で作製したpXI−EggE07F09(SfiI)のBglII/NdeI断片と上記4)で作製したpZex−DsRed(ΔBamHI)/pBSIISK(−)SK−Bgl/KS−NdeのBamHI/NdelI断片を繋いで作製した。
上記5)で作製したPXI−EggE07F09(SfiI)−pZex−DsRedのEggE07F04を,SfiIを介してEGFPと組換えたプラスミドであった。
pZex(配列表配列番号4)の下流にEGFP(配列表配列番号2)を組み込んだ発現ベクターを作製した。
すなわち、zHe1−1000bp(配列表配列番号3)をXhoI/BamHIを介してpXI−EGFP(参考文献3)のプロモーターと組み換え,さらにXhoI/EcoRIで処理後Klenow Fragment(タカラバイオ)によって末端を平滑化しセルフライゲーションする事によりプロモーター領域を約300bpに削除したpZex(配列表配列番号4)を有するpZex−EGFPを調製した。
本ベクターはプロモーターとしてpZEF1(配列表配列番号6)を、pXI−EGFPベクターのプロモーター領域(pXI、配列表配列番号1)に置換してEGFP(配列表配列番号2)の上流に組み込んだ遺伝子発現ベクターであった。
1)ゼブラフィッシュゲノムDNAの調製
参考文献4に従い、ゼブラフィッシュゲノムDNAを調製した。即ち、孵化後(48hpf以降)のゼブラフィッシュ(ゴールデンタイプ)の稚魚(14dpf)100匹程度およびProteinase K(Wako 160−14001)0.2μg/ml(SET バッファー(10mM−Tris pH7.5,5mM−EDTA,1%SDS)に溶解したもの)を用意した。このうち、稚魚50匹を2の0.2μg Protenase K溶液1mlに懸濁し、37℃で2時間保温した後、マイルドシェーカーで振とうしながら室温で一晩保温した。
上記で調製されたゼブラフィッシュ酵素分解サンプル(500μl)に対して同量のPCI(クロロホルム:イソミルアルコールの混合物=25:24:1)を加えてマイルドシェーカーで混合した。これを室温,20000xgで20分間遠心し、300μlの上清を広口のチップを用いて回収した。これに30μlの3M酢酸ナトリウムと825μlの100%エタノールを加えて混合し、−80℃で30分間静置した後、4℃,20000xgで40分間遠心した。得られたペレットを冷却70%エタノールで2回洗浄した後、100μlの0.1xTEに溶解してゼブラフィッシュゲノムDNAを調製した。
参考文献4:Development 103.403−412(1988)
上記1)で調製したゼブラフィッシュゲノムDNAより、PCRによってpZEF1の塩基配列を単離した。TAKARA PrimeSTARを用い、配列表配列番号7及び配列番号8のプライマーを用いて表1に記載の条件でPCRを行った。
増幅されたDNA断片の塩基配列は、DNAシークエンサー(ベックマン製)を用いて決定した。これによって単離された配列表配列番号6に記載の塩基配列が、EF1a遺伝子の約1kb上流のプロモーター領域(pZEF1)であった。
PCRによって増幅されたDNA断片の両端は平滑末端となり、さらに配列表配列番号9に記載のプライマーはSse83871(タカラバイオ製)サイトを有する。このPCRによって増幅されたDNA断片の5’末端は平滑末端となり、3’末端はSse83871認識サイトに調製できる。したがって、その両端をPmeIの平滑末端およびSse83871サイトに調製したベクターに組み込むことができる。
研究用ベクターpzHe1−1000pro−EGFP(SfiICB)(i)(図8)はpXI−EGFPをベースにして構築した。
pzHe1−1000pro−EGFP(SfiICB)(i)の塩基配列111位のNotIサイトから塩基配列2362位のAsiSIサイト間の塩基配列はpXI−EGFPと同じであった。pzHe1−1000pro−EGFP(SfiICB)(i)の塩基配列2362位のAsiSIサイトから塩基配列111位のNotIサイトまで間にはzHe1−1000bp(配列表配列番号3)、EGFP(配列表配列番号2)およびSV40 polyA signal(配列表配列番号9)をこの順に配置し、2146bpの領域(配列表配列番号10)を構成した。なお、zHe1−1000bp、EGFPおよびSV40 polyA signalの上流および下流には、それぞれPmeIサイトおよびSse83871サイト、SfiIサイトおよびSfiIサイト、ClaIサイトおよびXbaIサイトが存在した。
そして、このベクターのPmeI−Sse83871サイトに連結されていたプロモーター配列(ゼブラフィッシュzHe1のプロモーター、配列表配列番号3)を取り除き、上記1)で増幅したプロモーター配列を組み込むことで、ZEF1−EGFPベクター(図9)を作製した。
マイクロインジェクション法により、これらの遺伝子発現ベクターを導入することで、遺伝子導入を行った。すなわち、上記AおよびBの遺伝子発現ベクターをいずれも100ng/ulに調製して、ガラス製マイクロインジェクションキャピラリーに充填し、受精直後の受精卵に微量注入した。
マイクロインジェクション後の受精卵を、20℃下で培養し、適宜、蛍光顕微鏡を用いて蛍光タンパク質の発現を観察した。
その結果、A.の遺伝子発現ベクター(pXI−EGFP−pZex−DsRedベクター)を導入したものは、図10に示したように、受精72時間後の導入初期胚において、全身にEGFPがユビキタスに発現すること、および、孵化腺特異的にDsRedが発現することが確認された。また、透明な金魚由来の受精卵に、A.の遺伝子発現ベクター(pXI−EGFP−pZex−DsRedベクター)を導入したものも、図11に示したように、受精72時間後の導入初期胚において、全身にEGFPがユビキタスに発現すること、および、孵化腺特異的にDsRedが発現することが確認された。
また、B.の遺伝子発現ベクター(pZex−EGFPベクター)を導入したものは、図12に示したように、受精24時間後の導入初期胚において、全身にEGFPがユビキタスに発現し、受精後72時間になると孵化腺特異的に発現することが確認された。さらに、受精96時間後になると孵化腺でのEGFPの発現が減衰することが確認された。
さらに、C.の遺伝子発現ベクター(pZEF1−EGFPベクター)を導入したものは、図13に示したように、受精48時間後の導入初期胚において、全身にEGFPがユビキタスに発現することが確認された。
以上の結果より、本発明の作製方法により、トランスジェニック金魚が作製できることが示された。
[配列表]
Claims (8)
- 対象遺伝子が遺伝子発現ベクターに組み込まれ、かつ、当該遺伝子発現ベクターが金魚の受精卵に導入されたトランスジェニック金魚であって、遺伝子発現ベクターがpXI(配列番号1)、pZex(配列番号4)またはpZEF1(配列番号6)をプロモーターとして含むトランスジェニック金魚。
- 遺伝子発現ベクターがpXI(配列番号1)、pZex(配列番号4)およびpZEF1(配列番号6)のいずれか2つ以上をプロモーターとして含む請求項1に記載のトランスジェニック金魚。
- pXI(配列番号1)、pZex(配列番号4)およびpZEF1(配列番号6)のいずれか2つ以上がタンデムに配列される請求項2に記載のトランスジェニック金魚。
- 遺伝子発現ベクターがpXI(配列番号1)およびpZex(配列番号4)をプロモーターとして含むか、pZEF1(配列番号6)を少なくともプロモーターとして含む請求項1に記載のトランスジェニック金魚。
- 金魚がリュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキンから選ばれるいずれかである請求項1〜4のいずれかに記載のトランスジェニック金魚。
- 対象遺伝子を組み込んだ遺伝子発現ベクターを金魚の受精卵に導入する工程を含むトランスジェニック金魚の作製方法であって、遺伝子発現ベクターがpXI(配列番号1)、pZex(配列番号4)またはpZEF1(配列番号6)をプロモーターとして含むトランスジェニック金魚の作製方法。
- 遺伝子発現ベクターがpXI(配列番号1)およびpZex(配列番号4)をプロモーターとして含むか、pZEF1(配列番号6)を少なくともプロモーターとして含む請求項6に記載のトランスジェニック金魚の作製方法。
- 金魚がリュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキンから選ばれるいずれかである請求項6または7に記載のトランスジェニック金魚の作製方法。
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