WO2010125872A1 - トランスジェニック金魚 - Google Patents
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- A01K2227/40—Fish
Definitions
- the present invention relates to a method for producing a transgenic goldfish and a transgenic goldfish obtained by the method.
- transgenic fish in which various genes are introduced into zebrafish and expressed have been produced (see, for example, Patent Document 1). These transgenic fish are used as model animals for examining the effects of introduced genes on fish, animals for producing useful proteins, and the like.
- zebrafish has been mainly used as the target fish.
- the zebrafish has many advantages such as a small body length of about 4 cm and easy breeding, and easy egg collection. On the other hand, since it was too small, it was difficult to collect blood, and there was a problem that serum could not be obtained even when antibodies were produced.
- the present inventors have focused on goldfish as fish that can be changed to zebrafish.
- Goldfish is larger than zebrafish and is easy to collect blood.
- Patent Document 1 it has been suggested to use a goldfish as one of the transgenic target fishes (see, for example, Patent Document 1), there is nothing specifically described, and a specific method for producing a transgenic goldfish and It is desired to provide a transgenic goldfish obtained by the method.
- a transgenic goldfish in which a target gene is expressed can be produced by introducing a gene expression vector in which the target gene is incorporated into the goldfish.
- the headline and the present invention were completed.
- the present invention relates to the following (1) to (10) transgenic goldfish, a method for producing the transgenic goldfish, and the like.
- (1) A transgenic goldfish introduced with a target gene.
- (2) The transgenic goldfish according to (1) above, wherein the gene of interest is incorporated into a gene expression vector, and the gene expression vector is introduced into a fertilized egg of a goldfish.
- (3) The transgenic goldfish according to (2) above, wherein the gene expression vector contains pXI, pZex or pZEF1 as a promoter.
- the gene expression vector contains any two or more of pXI, pZex and pZEF1 as promoters.
- transgenic goldfish according to (4) wherein any two or more of pXI, pZex, and pZEF1 are arranged in tandem.
- Goldfish is Ryukin, Wakin, Shubunkin, Comet, Tossakin, Dickin, Chow Tengan, Hanafusa, Pearl Scale, Osaka Collinsu, Chobi, Panda, Sakuranishiki, Demekin, Calico, Collinsu, Dutch Shigashi, Azumaniki, Ednisiki, Hamanishi,
- the transgenic goldfish according to any one of the above (1) to (6), which is any one selected from red-crowned cranes, seven-spotted fish, chakin, and nankin.
- a method for producing a transgenic goldfish comprising a step of introducing a gene expression vector incorporating a target gene into a fertilized egg of a goldfish.
- the present invention enables the production of transgenic goldfish.
- the transgenic goldfish of the present invention can be used as a model animal for examining the effect of the introduced gene on the goldfish or an animal for producing useful proteins.
- the “transgenic goldfish” of the present invention includes any goldfish as long as it is a transgenic goldfish obtained by introducing a target gene.
- a transgenic goldfish in which the target gene is expressed in a partial region of the body may be used, or a transgenic goldfish in which the target gene is expressed in the whole body may be used.
- the “target gene” refers to a gene targeted for expression.
- the specific gene is set as the “target gene”.
- a gene encoding the protein is set as a “target gene”.
- Specific examples include foreign genes derived from other than goldfish, and these genes are combined with genes encoding fluorescent substances such as EGFP and DsRed for confirming gene expression, etc. It can also be.
- the “transgenic goldfish” of the present invention can be produced by introducing a gene expression vector incorporating a target gene into fertilized eggs, unfertilized eggs, adult fish somatic cells, etc. of goldfish.
- the “gene expression vector” into which the gene of interest is incorporated may be any gene as long as the gene of interest can be expressed.
- pXI zebrafish hatching-ground-, which is the Xenopus elongation factor 1-alpha promoter
- Examples thereof include pZex which is an enzyme promoter (both refer to Reference 1) and a gene expression vector which includes pZEF1 which is a zebrafish elongation factor 1-alpha promoter, which was originally created by the present inventors.
- the “gene expression vector” of the present invention may contain one or more promoters for expressing the target gene, and may contain a plurality of promoters. Moreover, if it is a promoter which can express a target gene, it may be a part of the promoter. Examples thereof include a part of pZex shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. In the present invention, some of these promoters are also expressed as “promoters”. When a plurality of promoters are included, the promoters may be arranged in any way as long as the target gene can be expressed. For example, a gene expression vector in which the promoters are arranged in tandem can be used.
- Reference 1 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2007-143497
- the fertilized egg of the goldfish to which the gene expression vector is introduced is a mixture of naturally obtained ones or unfertilized eggs extracted from goldfish females and sperm extracted from males.
- those prepared by artificial insemination by a method such as the dry induction method (Reference 2) for promoting fertilization can be used.
- Unfertilized eggs and sperm can be used by artificial insemination immediately after squeezing, but by storing each under the breeding conditions of the parent goldfish, it is also possible to use even those that have elapsed after storage. it can.
- artificial insemination can be used even after 6 hours or more after storage under parent goldfish breeding conditions (about 15 to 26 ° C.) or viable water temperature (0 to 40 ° C.).
- the goldfish into which the target gene is introduced is a fish of the family Cyprididae, which is genetically derived from the crucian carp, and has a characteristic color and / or body shape that is different from that of the crucian carp. Any may be used. For example, it has body colors such as red, red and white, three colors, black, brown, blue, cherry, aurora, albino, transparent scales, red crowns, etc., and body shapes such as funa type, Ryukin type, Dutch lion head type, ranch type etc. Goldfish that has, and has other appearance features, such as carcass, appearance, apex, flower bunches, pearl scales, butterfly tails, peacock tails, etc.
- body colors such as red, red and white, three colors, black, brown, blue, cherry, aurora, albino, transparent scales, red crowns, etc.
- body shapes such as funa type, Ryukin type, Dutch lion head type, ranch type etc.
- Examples of such goldfish include Ryukin, Wakin, Shubunkin, Comet, Tossakin, Dickin, Chow Tengan, Hanafusa, Pearl Scale, Osaka Lanchu, Chobi, Panda, Sakuranishiki, Demekin, Calico, Collinsu, Dutch Shigashi, Azumaniki, Examples include ednisiki, hamanishiki, red-crowned cranes, seven-eyed geese, chakins, and nankins, as well as goldfish that are newly created by mating, mutating, and selective breeding.
- the “transgenic fish production method” of the present invention may be any production method as long as it includes a step of introducing a gene expression vector incorporating a target gene into a fertilized egg of a goldfish. Furthermore, the process etc. which confirm the expression of the introduce
- the gene expression vector can be introduced into a fertilized egg using a conventionally known method such as microinjection.
- pXI-EGFP-pZex-DsRed Vector This vector is a gene expression vector incorporating pXI and pZex as promoters.
- pXI-EGFP vector incorporating EGFP (SEQ ID NO: 2) downstream of pXI (SEQ ID NO: 1) and DsRed (SEQ ID NO: 5) downstream of pZex (SEQ ID NO: 4)
- the pZex-DsRed vector was ligated in tandem to prepare a gene expression vector.
- the pXI-EGFP-pZex-DsRed vector of the present invention was prepared as follows. 1) pBSIISK ( ⁇ ) SK-Bgl / KS-Nde (FIG. 1) was prepared. pBSIISK ( ⁇ ) SK-Bgl / SK-Nde is a subcloning vector constructed for the production of a tandem vector. It was prepared by inserting BglII between NotI and XbaI of the multicloning site (MCS) of pBluescriptIISK (-) (Stratagene), and further inserting NdeI between XhoI and KpnI.
- MCS multicloning site
- pXI-EggE07F09 (SfiI) (FIG. 2) was produced.
- pXI-EggE07F09 (SfiI) is a vector in which two SfiI sites are inserted downstream of the ⁇ -globin intron of the research vector pXI-GFP (reference document 3), and the purpose is to provide two SfiI sites. It is hoped that gene recombination will be easier.
- Preparation of pXI-EggE07F09 (SfiI) was performed as follows. a. pBSII (SK-)-EggE07F09 was prepared.
- the restriction enzyme EcoRI and Sal7 were excised from the pTriplEx2-EggE07F09 with the restriction enzymes EcoRI and SalI from the multi-cloning site of the cloning vector pTripleEx2 (Takara Bio), which was cloned from the cDNA of zebrafish ribosomal protein protein L35 (NCBI accession no. NP775340). This was recombined into pBluescriptIISK ( ⁇ ) treated with restriction enzymes EcoRI and SalI via the EcoRI / SalI site to prepare pBSII (SK ⁇ )-EggE07F09. b. pZex-EGFP-His (B) was prepared.
- zHe1-1000 bp About 1000 bp of zebrafish zHe1 promoter (hereinafter referred to as zHe1-1000 bp, SEQ ID NO: 3) is recombined with the promoter of pXI-EGFP (reference document 3) via XhoI / BamHI, and further treated with XhoI / EcoRI and then Klenow Fragment PZex (SEQ ID NO: 4) from which the promoter region was deleted to about 300 bp was prepared by blunting the ends with (Takara Bio) and self-ligating. Furthermore, a His tag was added to the C-terminal of the amino acid sequence of EGFP to prepare pZex-EGFP-His (B). c.
- pZex-EggE07F09 (SfiI) (FIG. 3) was produced.
- a region containing EggE07F09 was cut out from pBSII (SK-)-EggE07F09 with BamHI / SalI. This was recombined into pZex-EGFP-His (B) via BamHI / SalI to prepare pZex-EggE07F09 (SfiI).
- pXI-EggE07F09 (SfiI) was produced.
- the polyA addition signal region derived from EggE07F09 and + SV40 of pZex-EggE07F09 (SfiI) was cut out with BamHI / NdeI. This was recombined into pXI-EGFP via BamHI / NdeI to prepare pXI-EggE07F09 (SfiI).
- pXI-1000pro-DsRed ( ⁇ BamHI) (FIG. 4) was prepared.
- pXI-1000pro-DsRed ( ⁇ BamHI) is a recombination of about 1000 bp of zebrafish zHe1 promoter via pXI-EGFP promoter and XhoI / BamHI, and EGFP is recombined with DsRed-Monomer (Clontech) and DsRed-Monomer / BomerHI. Vector. Further, the BamHI recognition sequence of the vector was deleted by treating with BamHI and then blunting the ends with Klenow Fragment (Takara Bio) and self-ligating.
- pZex-DsRed ( ⁇ BamHI) / pBSIISK ( ⁇ ) SK-Bgl / KS-Nde (FIG. 5) was prepared.
- pZex-DsRed ( ⁇ BamHI) / pBSIISK ( ⁇ ) SK-Bgl / KS-Nde is pBSIISK ( ⁇ ) SK-Bgl / SK prepared in pXI-1000pro-DsRed ( ⁇ BamHI) prepared in 3) above.
- -It was a vector recombined with Nde via EcoRI / NdeI.
- pXI-EggE07F09 (SfiI) -pZex-DsRed (FIG. 6) was produced.
- pXI-EggE07F09 (SfiI) -pZex-DsRed is the BglII / NdeI fragment of pXI-EggE07F09 (SfiI) prepared in 2) above and pZex-DsRed ( ⁇ BamHI) / pBSIISK (-) in the above 4).
- / KS-Nde BamHI / NdelI fragment was created by ligation.
- pXI-EGFP (SfiI) -pZex-DsRed (FIG. 7) was produced. This was a plasmid obtained by recombination of EGGE07F04 of PXI-EggE07F09 (SfiI) -pZex-DsRed prepared in 5) above with EGFP via SfiI.
- pZex-EGFP vector An expression vector in which EGFP (SEQ ID NO: 2) was incorporated downstream of pZex (SEQ ID NO: 4) was prepared. That is, zHe1-1000 bp (SEQ ID NO: 3) was recombined with the promoter of pXI-EGFP (Reference 3) via XhoI / BamHI, further treated with XhoI / EcoRI, and then blunted with Klenow Fragment (Takara Bio). PZex-EGFP having pZex (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing) from which the promoter region was deleted at about 300 bp was prepared by self-ligation.
- pZEF1-EGFP vector This vector replaces pZEF1 (SEQ ID NO: 6) as a promoter with the promoter region (pXI, SEQ ID NO: 1) of pXI-EGFP vector, and upstream of EGFP (SEQ ID NO: 2). It was an integrated gene expression vector.
- the pZEF1-EGFP vector of the present invention was prepared as follows. 1) Preparation of zebrafish genomic DNA According to Reference 4, zebrafish genomic DNA was prepared. That is, about 100 zebrafish (golden type) fry (14 dpf) after hatching (after 48 hpf) and Proteinase K (Wako 160-14001) 0.2 ⁇ g / ml (SET buffer (10 mM-Tris pH 7.5, 5 mM- Dissolved in EDTA, 1% SDS). Of these, 50 larvae were suspended in 1 ml of 0.2 ⁇ g Protease K solution 2 and incubated at 37 ° C. for 2 hours, and then incubated overnight at room temperature while shaking on a mild shaker.
- pZEF1 The base sequence of pZEF1 was isolated from the zebrafish genomic DNA prepared in 1) above by PCR. Using TAKARA PrimeSTAR, PCR was performed under the conditions described in Table 1 using the primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8. The base sequence of the amplified DNA fragment was determined using a DNA sequencer (manufactured by Beckman). The base sequence described in SEQ ID NO: 6 thus isolated was a promoter region (pZEF1) about 1 kb upstream of the EF1a gene. Both ends of the DNA fragment amplified by PCR have blunt ends, and the primer set forth in SEQ ID NO: 9 in the Sequence Listing has an Sse83871 (Takara Bio) site.
- the 5 ′ end of the DNA fragment amplified by this PCR becomes a blunt end, and the 3 ′ end can be prepared at the Sse83871 recognition site. Therefore, both ends can be incorporated into a vector prepared at the blunt end of Pmel and the Sse83871 site.
- pZHe1-1000pro-EGFP (SfiICB) (i), from the AsiSI site at position 2362 to the NotI site at position 111, zHe1-1000 bp (SEQ ID NO: 3), EGFP (SEQ ID NO: 2) And SV40 polyA signal (SEQ ID NO: 9) were arranged in this order to constitute a 2146 bp region (SEQ ID NO: 10).
- the PmeI site and the Sse83871 site, the SfiI site and the SfiI site, the ClaI site, and the XbaI site were present upstream and downstream of the zHe1-1000 bp, EGFP, and SV40 polyA signal, respectively.
- the promoter sequence (zebrafish zHe1 promoter, sequence listing SEQ ID NO: 3) linked to the PmeI-Sse83871 site of this vector was removed, and the promoter sequence amplified in 1) above was incorporated into the ZEF1-EGFP vector ( FIG. 9) was produced.
- Gene introduction was carried out by introducing these gene expression vectors by the microinjection method. That is, the gene expression vectors A and B were both prepared at 100 ng / ul, filled in a glass microinjection capillary, and microinjected into a fertilized egg immediately after fertilization.
- DsRed was expressed specifically in the hatching gland.
- B As shown in FIG. 12, in the early embryo introduced 24 hours after fertilization, EGFP is ubiquitously expressed in the whole body and hatched when 72 hours after fertilization, as shown in FIG. It was confirmed to express specifically in the gland. Furthermore, it was confirmed that the expression of EGFP in the hatched gland attenuated after 96 hours of fertilization. Furthermore, C.I. As shown in FIG. 13, it was confirmed that EGFP was ubiquitously expressed in the whole body in the early embryo introduced 48 hours after fertilization, in the case where the gene expression vector (pZEF1-EGFP vector) was introduced. From the above results, it was shown that transgenic goldfish can be produced by the production method of the present invention.
- transgenic goldfish of the present invention it is possible to produce a transgenic goldfish into which various genes have been introduced. By introducing a specific gene, the effect of the gene on goldfish can be examined, or a useful protein can be produced. Since the protein produced by the transgenic goldfish of the present invention can be easily extracted from serum, it can be obtained easily and in large quantities as compared with the case of using conventional transgenic fish.
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Abstract
トランスジェニック金魚の作製方法の提供、および当該方法によって得られるトランスジェニック金魚の提供。 対象遺伝子が組み込まれた遺伝子発現ベクターを金魚に導入する工程を含むことで、トランスジェニック金魚の作製方法を得た。また、当該方法によりトランスジェニック金魚を得た。
Description
本発明は、トランスジェニック金魚の作製方法および当該方法によって得られるトランスジェニック金魚に関する。
近年、ゼブラフィッシュ等に様々な遺伝子を導入して発現させたトランスジェニック魚類が作製されている(例えば、特許文献1参照)。これらのトランスジェニック魚類は、導入した遺伝子が魚類に与える影響を調べるためのモデル動物や、有用なタンパク質を製造させるための動物等として利用されている。
これらのトランスジェニック魚類の作製にあたり、主にゼブラフィッシュが対象魚として用いられてきた。ゼブラフィッシュは体長が約4cmと小さく飼育がしやすい、また、採卵がしやすい等の多くの利点がある。一方で小さすぎることから、血液を採取する等が難しく、抗体を産生させた場合でも血清が得られない等の問題があった。
これらのトランスジェニック魚類の作製にあたり、主にゼブラフィッシュが対象魚として用いられてきた。ゼブラフィッシュは体長が約4cmと小さく飼育がしやすい、また、採卵がしやすい等の多くの利点がある。一方で小さすぎることから、血液を採取する等が難しく、抗体を産生させた場合でも血清が得られない等の問題があった。
そこで、ゼブラフィッシュに変わり得る魚類として、本発明者らは金魚に着目した。金魚はゼブラフィッシュと比較して体が大きく、血液の採取も容易である。
トランスジェニックの対象魚の一つとして金魚を用いることは、示唆されてはいるものの(例えば、特許文献1参照)、具体的に記載されたものはなく、トランスジェニック金魚の具体的な作製方法および当該方法によって得られるトランスジェニック金魚の提供が望まれている。
トランスジェニックの対象魚の一つとして金魚を用いることは、示唆されてはいるものの(例えば、特許文献1参照)、具体的に記載されたものはなく、トランスジェニック金魚の具体的な作製方法および当該方法によって得られるトランスジェニック金魚の提供が望まれている。
トランスジェニック金魚の作製方法の提供、および当該方法によって得られるトランスジェニック金魚の提供を課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、対象遺伝子が組み込まれた遺伝子発現ベクターを金魚に導入することで、対象遺伝子が発現されたトランスジェニック金魚が作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は次の(1)~(10)のトランスジェニック金魚、トランスジェニック金魚の作製方法等に関する。
(1)対象遺伝子を導入してなるトランスジェニック金魚。
(2)対象遺伝子が遺伝子発現ベクターに組み込まれ、かつ、当該遺伝子発現ベクターが金魚の受精卵に導入された上記(1)に記載のトランスジェニック金魚。
(3)遺伝子発現ベクターがpXI、pZexまたはpZEF1をプロモーターとして含む上記(2)に記載のトランスジェニック金魚。
(4)遺伝子発現ベクターがpXI、pZexおよびpZEF1のいずれか2つ以上をプロモーターとして含む上記(2)に記載のトランスジェニック金魚。
(5)pXI、pZexおよびpZEF1のいずれか2つ以上がタンデムに配列される上記(4)に記載のトランスジェニック金魚。
(6)対象遺伝子が全身に発現された上記(1)~(5)のいずれかに記載のトランスジェニック金魚。
(7)金魚がリュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキンから選ばれるいずれかである上記(1)~(6)のいずれかに記載のトランスジェニック金魚。
(8)対象遺伝子を組み込んだ遺伝子発現ベクターを金魚の受精卵に導入する工程を含むトランスジェニック金魚の作製方法。
(9)遺伝子発現ベクターがpXI、pZexまたはpZEF1をプロモーターとして含む上記(8)に記載のトランスジェニック金魚の作製方法。
(10)金魚がリュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキンから選ばれるいずれかである上記(8)または(9)に記載のトランスジェニック金魚の作製方法。
(1)対象遺伝子を導入してなるトランスジェニック金魚。
(2)対象遺伝子が遺伝子発現ベクターに組み込まれ、かつ、当該遺伝子発現ベクターが金魚の受精卵に導入された上記(1)に記載のトランスジェニック金魚。
(3)遺伝子発現ベクターがpXI、pZexまたはpZEF1をプロモーターとして含む上記(2)に記載のトランスジェニック金魚。
(4)遺伝子発現ベクターがpXI、pZexおよびpZEF1のいずれか2つ以上をプロモーターとして含む上記(2)に記載のトランスジェニック金魚。
(5)pXI、pZexおよびpZEF1のいずれか2つ以上がタンデムに配列される上記(4)に記載のトランスジェニック金魚。
(6)対象遺伝子が全身に発現された上記(1)~(5)のいずれかに記載のトランスジェニック金魚。
(7)金魚がリュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキンから選ばれるいずれかである上記(1)~(6)のいずれかに記載のトランスジェニック金魚。
(8)対象遺伝子を組み込んだ遺伝子発現ベクターを金魚の受精卵に導入する工程を含むトランスジェニック金魚の作製方法。
(9)遺伝子発現ベクターがpXI、pZexまたはpZEF1をプロモーターとして含む上記(8)に記載のトランスジェニック金魚の作製方法。
(10)金魚がリュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキンから選ばれるいずれかである上記(8)または(9)に記載のトランスジェニック金魚の作製方法。
本発明により、トランスジェニック金魚の作製が可能となった。本発明のトランスジェニック金魚は、導入した遺伝子が金魚に与える影響を調べるためのモデル動物や、有用なタンパク質を製造させるための動物として利用できる。
本発明の「トランスジェニック金魚」とは、対象遺伝子を導入して得られるトランスジェニック金魚であればいずれの金魚も含まれる。対象遺伝子が体の一部の領域に発現されたトランスジェニック金魚でもよく、対象遺伝子が全身に発現されたトランスジェニック金魚であってもよい。
ここで、「対象遺伝子」とは、発現の目的とする遺伝子をいう。例えば、特定の遺伝子を導入することにより、その遺伝子が与える影響を調べることを目的とする場合には、その特定の遺伝子が「対象遺伝子」とされることになる。また、特定のタンパク質を製造することを目的とする場合には、そのタンパク質をコードする遺伝子が「対象遺伝子」とされることになる。具体的には、金魚以外を由来とする外来遺伝子等が挙げられ、これらの遺伝子は、遺伝子の発現を確認するためのEGFPやDsRed等の蛍光物質をコードする遺伝子等と組み合わせて「対象遺伝子」とすることもできる。
ここで、「対象遺伝子」とは、発現の目的とする遺伝子をいう。例えば、特定の遺伝子を導入することにより、その遺伝子が与える影響を調べることを目的とする場合には、その特定の遺伝子が「対象遺伝子」とされることになる。また、特定のタンパク質を製造することを目的とする場合には、そのタンパク質をコードする遺伝子が「対象遺伝子」とされることになる。具体的には、金魚以外を由来とする外来遺伝子等が挙げられ、これらの遺伝子は、遺伝子の発現を確認するためのEGFPやDsRed等の蛍光物質をコードする遺伝子等と組み合わせて「対象遺伝子」とすることもできる。
本発明の「トランスジェニック金魚」は、対象遺伝子を組み込んだ遺伝子発現ベクターを金魚の受精卵、未受精卵や成魚体細胞等に導入することによって作製することができる。
対象遺伝子を組み込む「遺伝子発現ベクター」は、対象遺伝子が発現できるものであればいずれのものであってもよいが、例えば、アフリカツメガエルelongation factor 1−alphaプロモーターであるpXI、ゼブラフィッシュhatching−grand−enzymeプロモーターであるpZex(いずれも参考文献1参照)や、本発明者らが独自に作成した、ゼブラフィッシュelongation factor 1−alphaプロモーターであるpZEF1をプロモーターとして含む遺伝子発現ベクター等が挙げられる。
対象遺伝子を組み込む「遺伝子発現ベクター」は、対象遺伝子が発現できるものであればいずれのものであってもよいが、例えば、アフリカツメガエルelongation factor 1−alphaプロモーターであるpXI、ゼブラフィッシュhatching−grand−enzymeプロモーターであるpZex(いずれも参考文献1参照)や、本発明者らが独自に作成した、ゼブラフィッシュelongation factor 1−alphaプロモーターであるpZEF1をプロモーターとして含む遺伝子発現ベクター等が挙げられる。
本発明の「遺伝子発現ベクター」は、対象遺伝子を発現させるためのプロモーターを1つ以上含んでいればよく、複数含んでいてもよい。また、対象遺伝子が発現できるプロモーターであれば、そのプロモーターの一部であってもよい。例えば、配列表配列番号4に示したpZexの一部等が挙げられる。本発明においては、これらのプロモーターの一部も、「プロモーター」として表す。
プロモーターを複数含む場合、対象遺伝子が発現できればプロモーターはどのように配列されていてもよく、例えば、プロモーターがタンデムに配列された遺伝子発現ベクターを用いることもできる。
参考文献1:特開2007−143497号公報
プロモーターを複数含む場合、対象遺伝子が発現できればプロモーターはどのように配列されていてもよく、例えば、プロモーターがタンデムに配列された遺伝子発現ベクターを用いることもできる。
参考文献1:特開2007−143497号公報
遺伝子発現ベクターを導入する金魚の受精卵は、自然に得られたものや、金魚の雌から搾出した未受精卵と雄から搾出した精子とを予め混合しておき、そこに飼育水を加えて受精を促す乾導法(参考文献2)等の方法で人工授精することによって調製したものを用いることができる。
未受精卵および精子は、搾出後のすぐのものを人工授精させて用いることもできるが、親金魚の飼育条件下でそれぞれを保存することにより、保存後時間が経過したものでも用いることができる。例えば、親金魚の飼育条件下(約15~26℃)や生存可能水温(0~40℃)で保存後6時間以上経過したもの等でも人工授精させて用いることができる。
従来使用されてきたゼブラフィッシュにおいても、金魚と同様に、成熟した雌雄親魚からお腹を圧迫して絞り出す搾出法によって未受精卵および精子を得て、乾導法(参考文献2)によって人工授精を行うことができる。しかし、ゼブラフィッシュから搾出した未受精卵および精子の受精可能時間が数分間と短いため、金魚のように、それぞれを保存して使用することができない。また、魚体が小さいために搾出時に魚体へのダメージが大きく、熟練した手技を持ってしても親魚を殺してしまうことがよくある。そのため、繰り返し採卵・採精できず、受精卵の生産性が自然産卵に比べて極めて悪かった。
さらに、ゼブラフィッシュの受精卵は分離性沈下卵であるため、付着性沈下卵である金魚の受精卵とは異なり、植物、石、プラスティックなどの物質に粘着する生物学的な特性を有しておらず、対象遺伝子を導入しにくいという問題もあった。
参考文献2:緑書房「水産養殖学講座」4 水族繁殖学,隆島史夫,羽生功 編(ISBN4−89531−434−0) 「媒精方法」p182−183
未受精卵および精子は、搾出後のすぐのものを人工授精させて用いることもできるが、親金魚の飼育条件下でそれぞれを保存することにより、保存後時間が経過したものでも用いることができる。例えば、親金魚の飼育条件下(約15~26℃)や生存可能水温(0~40℃)で保存後6時間以上経過したもの等でも人工授精させて用いることができる。
従来使用されてきたゼブラフィッシュにおいても、金魚と同様に、成熟した雌雄親魚からお腹を圧迫して絞り出す搾出法によって未受精卵および精子を得て、乾導法(参考文献2)によって人工授精を行うことができる。しかし、ゼブラフィッシュから搾出した未受精卵および精子の受精可能時間が数分間と短いため、金魚のように、それぞれを保存して使用することができない。また、魚体が小さいために搾出時に魚体へのダメージが大きく、熟練した手技を持ってしても親魚を殺してしまうことがよくある。そのため、繰り返し採卵・採精できず、受精卵の生産性が自然産卵に比べて極めて悪かった。
さらに、ゼブラフィッシュの受精卵は分離性沈下卵であるため、付着性沈下卵である金魚の受精卵とは異なり、植物、石、プラスティックなどの物質に粘着する生物学的な特性を有しておらず、対象遺伝子を導入しにくいという問題もあった。
参考文献2:緑書房「水産養殖学講座」4 水族繁殖学,隆島史夫,羽生功 編(ISBN4−89531−434−0) 「媒精方法」p182−183
本発明の「トランスジェニック金魚」において、対象遺伝子を導入する金魚は遺伝学的にフナから派生したコイ目コイ科の魚類で、体色および/または体型がフナと異なる外見的特徴を有する魚類であればいずれであってもよい。例えば、赤、紅白、三色、黒、茶、青文、桜、オーロラ、アルビノ、透明鱗、丹頂などの体色を有し、フナ型、リュウキン型、オランダ獅子頭型、らんちゅう型などの体型を有し、その他の外見的特徴として肉瘤、出目、頂天眼、花房、パール鱗、蝶尾、孔雀尾、などを有する金魚であって、これらの特徴を単独または複数同時に発現している金魚等が挙げられる。
このような金魚としては、例えば、リュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキン等が挙げられ、また、これらを交配、突然変異、選抜育種して新たに作出したキンギョ等も含まれる。
このような金魚としては、例えば、リュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキン等が挙げられ、また、これらを交配、突然変異、選抜育種して新たに作出したキンギョ等も含まれる。
本発明の「トランスジェニック魚類の作製方法」は、対象遺伝子を組み込んだ遺伝子発現ベクターを金魚の受精卵に導入する工程を含む作製方法であれば、いずれの作製方法であってもよい。さらに導入した対象遺伝子の発現を確認する工程等を含んでいてもよい。
「対象遺伝子を組み込んだ遺伝子発現ベクターを金魚の受精卵に導入する工程」において、該遺伝子発現ベクターは、マイクロインジェクション等の従来知られている方法を用いて受精卵に導入することができる。
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
「対象遺伝子を組み込んだ遺伝子発現ベクターを金魚の受精卵に導入する工程」において、該遺伝子発現ベクターは、マイクロインジェクション等の従来知られている方法を用いて受精卵に導入することができる。
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
1.金魚受精卵の調製
受精卵は金魚(リュウキン)の雌雄成魚から調製した受精卵を用いた。
2歳齢リュウキンの雌雄からそれぞれ搾出した未受精卵および精子を、乾導法にて人工授精させた後、付着性沈下卵である金魚受精卵の粘着性を利用して、直径90mmのプラスティックシャーレに付着させ飼育水と共に収容した。また、透明な金魚(リュウキン)の1歳齢の雌雄からそれぞれ搾出した未受精卵および精子についても同様に人工受精して、得られた受精卵を収容した。
受精卵は金魚(リュウキン)の雌雄成魚から調製した受精卵を用いた。
2歳齢リュウキンの雌雄からそれぞれ搾出した未受精卵および精子を、乾導法にて人工授精させた後、付着性沈下卵である金魚受精卵の粘着性を利用して、直径90mmのプラスティックシャーレに付着させ飼育水と共に収容した。また、透明な金魚(リュウキン)の1歳齢の雌雄からそれぞれ搾出した未受精卵および精子についても同様に人工受精して、得られた受精卵を収容した。
2.遺伝子発現ベクターの作製
3種類の遺伝子発現ベクターを作製した。
3種類の遺伝子発現ベクターを作製した。
A.pXI−EGFP−pZex−DsRedベクター
本ベクターはプロモーターとしてpXIおよびpZexを組み込んだ遺伝子発現ベクターである。pXI(配列表配列番号1)の下流にEGFP(配列表配列番号2)を組み込んだpXI−EGFPベクターと、pZex(配列表配列番号4)の下流にDsRed(配列表配列番号5)を組み込んだpZex−DsRedベクターを、タンデムに連結して遺伝子発現ベクターを作製した。
本ベクターはプロモーターとしてpXIおよびpZexを組み込んだ遺伝子発現ベクターである。pXI(配列表配列番号1)の下流にEGFP(配列表配列番号2)を組み込んだpXI−EGFPベクターと、pZex(配列表配列番号4)の下流にDsRed(配列表配列番号5)を組み込んだpZex−DsRedベクターを、タンデムに連結して遺伝子発現ベクターを作製した。
本発明のpXI−EGFP−pZex−DsRedベクターは次のように作製した。
1)pBSIISK(−)SK−Bgl/KS−Nde(図1)を作製した。
pBSIISK(−)SK−Bgl/SK−Ndeは,タンデムベクター作製用に構築したサブクローニング用のベクターである。pBluescriptIISK(−)(Stratagene)のマルチクローニングサイト(MCS)のNotIとXbaIの間にBglIIを挿入し,さらに,XhoIとKpnIの間にNdeIを挿入する事により作製した。
1)pBSIISK(−)SK−Bgl/KS−Nde(図1)を作製した。
pBSIISK(−)SK−Bgl/SK−Ndeは,タンデムベクター作製用に構築したサブクローニング用のベクターである。pBluescriptIISK(−)(Stratagene)のマルチクローニングサイト(MCS)のNotIとXbaIの間にBglIIを挿入し,さらに,XhoIとKpnIの間にNdeIを挿入する事により作製した。
2)pXI−EggE07F09(SfiI)(図2)を作製した。
pXI−EggE07F09(SfiI)は,研究用ベクターpXI−GFP(参考文献3)のβ−globinイントロンの下流に、2個のSfiIサイトを挿入したベクターであり、2個のSfiIサイトを設けることで目的遺伝子の組換え作業がより簡便になることを期待したものである。pXI−EggE07F09(SfiI)の作製は次のように行った。
a.pBSII(SK−)−EggE07F09を作製した。
クローニング用ベクターpTripleEx2(タカラバイオ)のマルチクローニングサイトにゼブラフィッシュribosomal protein L35(NCBI accession no.NP775340)のcDNAをクローニングしたpTriplEx2−EggE07F09から制限酵素EcoRIおよびSalIでEggE07F09 cDNA領域を切り出した。これを制限酵素EcoRIおよびSalIで処理したpBluescriptIISK(−)へEcoRI/SalIサイトを介して組み換えてpBSII(SK−)−EggE07F09を作製した。
b.pZex−EGFP−His(B)を作製した。
ゼブラフィッシュzHe1プロモーター約1000bp(以下、zHe1−1000bpとする、配列表配列番号3)をXhoI/BamHIを介してpXI−EGFP(参考文献3)のプロモーターと組み換え,さらにXhoI/EcoRIで処理後Klenow Fragment(タカラバイオ)によって末端を平滑化しセルフライゲーションする事によりプロモーター領域を約300bpに削除したpZex(配列表配列番号4)を調製した。さらに,EGFPのアミノ酸配列のC末端へHis tagを付加してpZex−EGFP−His(B)を作製した。
c.pZex−EggE07F09(SfiI)(図3)を作製した。
pBSII(SK−)−EggE07F09からBamHI/SalIでEggE07F09を含む領域を切り出した。これをpZex−EGFP−His(B)へBamHI/SalIを介して組み換えてpZex−EggE07F09(SfiI)を作製した。
d.pXI−EggE07F09(SfiI)を作製した。
pZex−EggE07F09(SfiI)のEggE07F09および+SV40由来のpolyA付加シグナル領域をBamHI/NdeIで切り出した。これをBamHI/NdeIを介してpXI−EGFPへ組み換えてpXI−EggE07F09(SfiI)を作製した。
pXI−EggE07F09(SfiI)は,研究用ベクターpXI−GFP(参考文献3)のβ−globinイントロンの下流に、2個のSfiIサイトを挿入したベクターであり、2個のSfiIサイトを設けることで目的遺伝子の組換え作業がより簡便になることを期待したものである。pXI−EggE07F09(SfiI)の作製は次のように行った。
a.pBSII(SK−)−EggE07F09を作製した。
クローニング用ベクターpTripleEx2(タカラバイオ)のマルチクローニングサイトにゼブラフィッシュribosomal protein L35(NCBI accession no.NP775340)のcDNAをクローニングしたpTriplEx2−EggE07F09から制限酵素EcoRIおよびSalIでEggE07F09 cDNA領域を切り出した。これを制限酵素EcoRIおよびSalIで処理したpBluescriptIISK(−)へEcoRI/SalIサイトを介して組み換えてpBSII(SK−)−EggE07F09を作製した。
b.pZex−EGFP−His(B)を作製した。
ゼブラフィッシュzHe1プロモーター約1000bp(以下、zHe1−1000bpとする、配列表配列番号3)をXhoI/BamHIを介してpXI−EGFP(参考文献3)のプロモーターと組み換え,さらにXhoI/EcoRIで処理後Klenow Fragment(タカラバイオ)によって末端を平滑化しセルフライゲーションする事によりプロモーター領域を約300bpに削除したpZex(配列表配列番号4)を調製した。さらに,EGFPのアミノ酸配列のC末端へHis tagを付加してpZex−EGFP−His(B)を作製した。
c.pZex−EggE07F09(SfiI)(図3)を作製した。
pBSII(SK−)−EggE07F09からBamHI/SalIでEggE07F09を含む領域を切り出した。これをpZex−EGFP−His(B)へBamHI/SalIを介して組み換えてpZex−EggE07F09(SfiI)を作製した。
d.pXI−EggE07F09(SfiI)を作製した。
pZex−EggE07F09(SfiI)のEggE07F09および+SV40由来のpolyA付加シグナル領域をBamHI/NdeIで切り出した。これをBamHI/NdeIを介してpXI−EGFPへ組み換えてpXI−EggE07F09(SfiI)を作製した。
3)pXI−1000pro−DsRed(ΔBamHI)(図4)を作製した。
pXI−1000pro−DsRed(ΔBamHI)は,ゼブラフィッシュzHe1プロモーター約1000bpをpXI−EGFPのプロモーターとXhoI/BamHIを介して組み換え,さらにEGFPをpDsRed−Monomer(Clontech)のDsRed−MonomerとBamHI/NotIを組み換えたベクターである。さらにBamHIで処理後Klenow Fragment(タカラバイオ)によって末端を平滑化しセルフライゲーションする事により,ベクターのBamHI認識配列を消去した。
pXI−1000pro−DsRed(ΔBamHI)は,ゼブラフィッシュzHe1プロモーター約1000bpをpXI−EGFPのプロモーターとXhoI/BamHIを介して組み換え,さらにEGFPをpDsRed−Monomer(Clontech)のDsRed−MonomerとBamHI/NotIを組み換えたベクターである。さらにBamHIで処理後Klenow Fragment(タカラバイオ)によって末端を平滑化しセルフライゲーションする事により,ベクターのBamHI認識配列を消去した。
4)pZex−DsRed(ΔBamHI)/pBSIISK(−)SK−Bgl/KS−Nde(図5)を作製した。
pZex−DsRed(ΔBamHI)/pBSIISK(−)SK−Bgl/KS−Ndeは,上記3)で作製したpXI−1000pro−DsRed(ΔBamHI)を上記1)で作製したpBSIISK(−)SK−Bgl/SK−NdeへEcoRI/NdeIを介して組み換えたベクターであった。
pZex−DsRed(ΔBamHI)/pBSIISK(−)SK−Bgl/KS−Ndeは,上記3)で作製したpXI−1000pro−DsRed(ΔBamHI)を上記1)で作製したpBSIISK(−)SK−Bgl/SK−NdeへEcoRI/NdeIを介して組み換えたベクターであった。
5)pXI−EggE07F09(SfiI)−pZex−DsRed(図6)を作製した。
pXI−EggE07F09(SfiI)−pZex−DsRedは,上記2)で作製したpXI−EggE07F09(SfiI)のBglII/NdeI断片と上記4)で作製したpZex−DsRed(ΔBamHI)/pBSIISK(−)SK−Bgl/KS−NdeのBamHI/NdelI断片を繋いで作製した。
pXI−EggE07F09(SfiI)−pZex−DsRedは,上記2)で作製したpXI−EggE07F09(SfiI)のBglII/NdeI断片と上記4)で作製したpZex−DsRed(ΔBamHI)/pBSIISK(−)SK−Bgl/KS−NdeのBamHI/NdelI断片を繋いで作製した。
6)pXI−EGFP(SfiI)−pZex−DsRed(図7)を作製した。
上記5)で作製したPXI−EggE07F09(SfiI)−pZex−DsRedのEggE07F04を,SfiIを介してEGFPと組換えたプラスミドであった。
上記5)で作製したPXI−EggE07F09(SfiI)−pZex−DsRedのEggE07F04を,SfiIを介してEGFPと組換えたプラスミドであった。
B.pZex−EGFPベクター
pZex(配列表配列番号4)の下流にEGFP(配列表配列番号2)を組み込んだ発現ベクターを作製した。
すなわち、zHe1−1000bp(配列表配列番号3)をXhoI/BamHIを介してpXI−EGFP(参考文献3)のプロモーターと組み換え,さらにXhoI/EcoRIで処理後Klenow Fragment(タカラバイオ)によって末端を平滑化しセルフライゲーションする事によりプロモーター領域を約300bpに削除したpZex(配列表配列番号4)を有するpZex−EGFPを調製した。
pZex(配列表配列番号4)の下流にEGFP(配列表配列番号2)を組み込んだ発現ベクターを作製した。
すなわち、zHe1−1000bp(配列表配列番号3)をXhoI/BamHIを介してpXI−EGFP(参考文献3)のプロモーターと組み換え,さらにXhoI/EcoRIで処理後Klenow Fragment(タカラバイオ)によって末端を平滑化しセルフライゲーションする事によりプロモーター領域を約300bpに削除したpZex(配列表配列番号4)を有するpZex−EGFPを調製した。
C.pZEF1−EGFPベクター
本ベクターはプロモーターとしてpZEF1(配列表配列番号6)を、pXI−EGFPベクターのプロモーター領域(pXI、配列表配列番号1)に置換してEGFP(配列表配列番号2)の上流に組み込んだ遺伝子発現ベクターであった。
本ベクターはプロモーターとしてpZEF1(配列表配列番号6)を、pXI−EGFPベクターのプロモーター領域(pXI、配列表配列番号1)に置換してEGFP(配列表配列番号2)の上流に組み込んだ遺伝子発現ベクターであった。
本発明のpZEF1−EGFPベクターは次のように作製した。
1)ゼブラフィッシュゲノムDNAの調製
参考文献4に従い、ゼブラフィッシュゲノムDNAを調製した。即ち、孵化後(48hpf以降)のゼブラフィッシュ(ゴールデンタイプ)の稚魚(14dpf)100匹程度およびProteinase K(Wako 160−14001)0.2μg/ml(SET バッファー(10mM−Tris pH7.5,5mM−EDTA,1%SDS)に溶解したもの)を用意した。このうち、稚魚50匹を2の0.2μg Protenase K溶液1mlに懸濁し、37℃で2時間保温した後、マイルドシェーカーで振とうしながら室温で一晩保温した。
上記で調製されたゼブラフィッシュ酵素分解サンプル(500μl)に対して同量のPCI(クロロホルム:イソミルアルコールの混合物=25:24:1)を加えてマイルドシェーカーで混合した。これを室温,20000xgで20分間遠心し、300μlの上清を広口のチップを用いて回収した。これに30μlの3M酢酸ナトリウムと825μlの100%エタノールを加えて混合し、−80℃で30分間静置した後、4℃,20000xgで40分間遠心した。得られたペレットを冷却70%エタノールで2回洗浄した後、100μlの0.1xTEに溶解してゼブラフィッシュゲノムDNAを調製した。
参考文献4:Development 103.403−412(1988)
1)ゼブラフィッシュゲノムDNAの調製
参考文献4に従い、ゼブラフィッシュゲノムDNAを調製した。即ち、孵化後(48hpf以降)のゼブラフィッシュ(ゴールデンタイプ)の稚魚(14dpf)100匹程度およびProteinase K(Wako 160−14001)0.2μg/ml(SET バッファー(10mM−Tris pH7.5,5mM−EDTA,1%SDS)に溶解したもの)を用意した。このうち、稚魚50匹を2の0.2μg Protenase K溶液1mlに懸濁し、37℃で2時間保温した後、マイルドシェーカーで振とうしながら室温で一晩保温した。
上記で調製されたゼブラフィッシュ酵素分解サンプル(500μl)に対して同量のPCI(クロロホルム:イソミルアルコールの混合物=25:24:1)を加えてマイルドシェーカーで混合した。これを室温,20000xgで20分間遠心し、300μlの上清を広口のチップを用いて回収した。これに30μlの3M酢酸ナトリウムと825μlの100%エタノールを加えて混合し、−80℃で30分間静置した後、4℃,20000xgで40分間遠心した。得られたペレットを冷却70%エタノールで2回洗浄した後、100μlの0.1xTEに溶解してゼブラフィッシュゲノムDNAを調製した。
参考文献4:Development 103.403−412(1988)
2)プロモーター配列の調製
上記1)で調製したゼブラフィッシュゲノムDNAより、PCRによってpZEF1の塩基配列を単離した。TAKARA PrimeSTARを用い、配列表配列番号7及び配列番号8のプライマーを用いて表1に記載の条件でPCRを行った。
増幅されたDNA断片の塩基配列は、DNAシークエンサー(ベックマン製)を用いて決定した。これによって単離された配列表配列番号6に記載の塩基配列が、EF1a遺伝子の約1kb上流のプロモーター領域(pZEF1)であった。
PCRによって増幅されたDNA断片の両端は平滑末端となり、さらに配列表配列番号9に記載のプライマーはSse83871(タカラバイオ製)サイトを有する。このPCRによって増幅されたDNA断片の5’末端は平滑末端となり、3’末端はSse83871認識サイトに調製できる。したがって、その両端をPmeIの平滑末端およびSse83871サイトに調製したベクターに組み込むことができる。
上記1)で調製したゼブラフィッシュゲノムDNAより、PCRによってpZEF1の塩基配列を単離した。TAKARA PrimeSTARを用い、配列表配列番号7及び配列番号8のプライマーを用いて表1に記載の条件でPCRを行った。
増幅されたDNA断片の塩基配列は、DNAシークエンサー(ベックマン製)を用いて決定した。これによって単離された配列表配列番号6に記載の塩基配列が、EF1a遺伝子の約1kb上流のプロモーター領域(pZEF1)であった。
PCRによって増幅されたDNA断片の両端は平滑末端となり、さらに配列表配列番号9に記載のプライマーはSse83871(タカラバイオ製)サイトを有する。このPCRによって増幅されたDNA断片の5’末端は平滑末端となり、3’末端はSse83871認識サイトに調製できる。したがって、その両端をPmeIの平滑末端およびSse83871サイトに調製したベクターに組み込むことができる。
3)ベクターの作製
研究用ベクターpzHe1−1000pro−EGFP(SfiICB)(i)(図8)はpXI−EGFPをベースにして構築した。
pzHe1−1000pro−EGFP(SfiICB)(i)の塩基配列111位のNotIサイトから塩基配列2362位のAsiSIサイト間の塩基配列はpXI−EGFPと同じであった。pzHe1−1000pro−EGFP(SfiICB)(i)の塩基配列2362位のAsiSIサイトから塩基配列111位のNotIサイトまで間にはzHe1−1000bp(配列表配列番号3)、EGFP(配列表配列番号2)およびSV40 polyA signal(配列表配列番号9)をこの順に配置し、2146bpの領域(配列表配列番号10)を構成した。なお、zHe1−1000bp、EGFPおよびSV40 polyA signalの上流および下流には、それぞれPmeIサイトおよびSse83871サイト、SfiIサイトおよびSfiIサイト、ClaIサイトおよびXbaIサイトが存在した。
そして、このベクターのPmeI−Sse83871サイトに連結されていたプロモーター配列(ゼブラフィッシュzHe1のプロモーター、配列表配列番号3)を取り除き、上記1)で増幅したプロモーター配列を組み込むことで、ZEF1−EGFPベクター(図9)を作製した。
研究用ベクターpzHe1−1000pro−EGFP(SfiICB)(i)(図8)はpXI−EGFPをベースにして構築した。
pzHe1−1000pro−EGFP(SfiICB)(i)の塩基配列111位のNotIサイトから塩基配列2362位のAsiSIサイト間の塩基配列はpXI−EGFPと同じであった。pzHe1−1000pro−EGFP(SfiICB)(i)の塩基配列2362位のAsiSIサイトから塩基配列111位のNotIサイトまで間にはzHe1−1000bp(配列表配列番号3)、EGFP(配列表配列番号2)およびSV40 polyA signal(配列表配列番号9)をこの順に配置し、2146bpの領域(配列表配列番号10)を構成した。なお、zHe1−1000bp、EGFPおよびSV40 polyA signalの上流および下流には、それぞれPmeIサイトおよびSse83871サイト、SfiIサイトおよびSfiIサイト、ClaIサイトおよびXbaIサイトが存在した。
そして、このベクターのPmeI−Sse83871サイトに連結されていたプロモーター配列(ゼブラフィッシュzHe1のプロモーター、配列表配列番号3)を取り除き、上記1)で増幅したプロモーター配列を組み込むことで、ZEF1−EGFPベクター(図9)を作製した。
上記で作製されたA~Cの3種のベクターはゼブラフィッシュ初期胚において発現することが確認されている。
3.遺伝子導入
マイクロインジェクション法により、これらの遺伝子発現ベクターを導入することで、遺伝子導入を行った。すなわち、上記AおよびBの遺伝子発現ベクターをいずれも100ng/ulに調製して、ガラス製マイクロインジェクションキャピラリーに充填し、受精直後の受精卵に微量注入した。
マイクロインジェクション法により、これらの遺伝子発現ベクターを導入することで、遺伝子導入を行った。すなわち、上記AおよびBの遺伝子発現ベクターをいずれも100ng/ulに調製して、ガラス製マイクロインジェクションキャピラリーに充填し、受精直後の受精卵に微量注入した。
4.遺伝子発現の確認
マイクロインジェクション後の受精卵を、20℃下で培養し、適宜、蛍光顕微鏡を用いて蛍光タンパク質の発現を観察した。
その結果、A.の遺伝子発現ベクター(pXI−EGFP−pZex−DsRedベクター)を導入したものは、図10に示したように、受精72時間後の導入初期胚において、全身にEGFPがユビキタスに発現すること、および、孵化腺特異的にDsRedが発現することが確認された。また、透明な金魚由来の受精卵に、A.の遺伝子発現ベクター(pXI−EGFP−pZex−DsRedベクター)を導入したものも、図11に示したように、受精72時間後の導入初期胚において、全身にEGFPがユビキタスに発現すること、および、孵化腺特異的にDsRedが発現することが確認された。
また、B.の遺伝子発現ベクター(pZex−EGFPベクター)を導入したものは、図12に示したように、受精24時間後の導入初期胚において、全身にEGFPがユビキタスに発現し、受精後72時間になると孵化腺特異的に発現することが確認された。さらに、受精96時間後になると孵化腺でのEGFPの発現が減衰することが確認された。
さらに、C.の遺伝子発現ベクター(pZEF1−EGFPベクター)を導入したものは、図13に示したように、受精48時間後の導入初期胚において、全身にEGFPがユビキタスに発現することが確認された。
以上の結果より、本発明の作製方法により、トランスジェニック金魚が作製できることが示された。
マイクロインジェクション後の受精卵を、20℃下で培養し、適宜、蛍光顕微鏡を用いて蛍光タンパク質の発現を観察した。
その結果、A.の遺伝子発現ベクター(pXI−EGFP−pZex−DsRedベクター)を導入したものは、図10に示したように、受精72時間後の導入初期胚において、全身にEGFPがユビキタスに発現すること、および、孵化腺特異的にDsRedが発現することが確認された。また、透明な金魚由来の受精卵に、A.の遺伝子発現ベクター(pXI−EGFP−pZex−DsRedベクター)を導入したものも、図11に示したように、受精72時間後の導入初期胚において、全身にEGFPがユビキタスに発現すること、および、孵化腺特異的にDsRedが発現することが確認された。
また、B.の遺伝子発現ベクター(pZex−EGFPベクター)を導入したものは、図12に示したように、受精24時間後の導入初期胚において、全身にEGFPがユビキタスに発現し、受精後72時間になると孵化腺特異的に発現することが確認された。さらに、受精96時間後になると孵化腺でのEGFPの発現が減衰することが確認された。
さらに、C.の遺伝子発現ベクター(pZEF1−EGFPベクター)を導入したものは、図13に示したように、受精48時間後の導入初期胚において、全身にEGFPがユビキタスに発現することが確認された。
以上の結果より、本発明の作製方法により、トランスジェニック金魚が作製できることが示された。
本発明のトランスジェニック金魚の作製方法により、様々な遺伝子を導入したトランスジェニック金魚の作製が可能となった。特定の遺伝子を導入することによって、その遺伝子が金魚に与える影響を調べたり、有用なタンパク質を製造したりすることができる。本発明のトランスジェニック金魚が製造するタンパク質は、血清から容易に抽出できるため、従来のトランスジェニック魚類を用いた場合と比較して容易かつ多量に得ることができる。
Claims (10)
- 対象遺伝子を導入してなるトランスジェニック金魚。
- 対象遺伝子が遺伝子発現ベクターに組み込まれ、かつ、当該遺伝子発現ベクターが金魚の受精卵に導入された請求項1に記載のトランスジェニック金魚。
- 遺伝子発現ベクターがpXI、pZexまたはpZEF1をプロモーターとして含む請求項2に記載のトランスジェニック金魚。
- 遺伝子発現ベクターがpXI、pZexおよびpZEF1のいずれか2つ以上をプロモーターとして含む請求項2に記載のトランスジェニック金魚。
- pXI、pZexおよびpZEF1のいずれか2つ以上がタンデムに配列される請求項4に記載のトランスジェニック金魚。
- 対象遺伝子が全身に発現された請求項1~5のいずれかに記載のトランスジェニック金魚。
- 金魚がリュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキンから選ばれるいずれかである請求項1~6のいずれかに記載のトランスジェニック金魚。
- 対象遺伝子を組み込んだ遺伝子発現ベクターを金魚の受精卵に導入する工程を含むトランスジェニック金魚の作製方法。
- 遺伝子発現ベクターがpXI、pZexまたはpZEF1をプロモーターとして含む請求項8に記載のトランスジェニック金魚の作製方法。
- 金魚がリュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキンから選ばれるいずれかである請求項8または9に記載のトランスジェニック金魚の作製方法。
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CN104304119A (zh) * | 2014-10-25 | 2015-01-28 | 长沙湘实观赏鱼科技有限公司 | 一种泰国兰寿的培育方法 |
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TW200422403A (en) * | 2003-04-23 | 2004-11-01 | Taikong Corp | Recombinant plasmid expressing two fluorescence genes |
JP2006262708A (ja) * | 2005-03-22 | 2006-10-05 | Japan Science & Technology Agency | α−アクチンプロモーター遺伝子、発現ベクター及び遺伝子導入魚類 |
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WO2008022208A2 (en) * | 2006-08-16 | 2008-02-21 | Yorktown Technologies, L.P. | Recombinant constructs and transgenic fluorescent ornamental fish therefrom |
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