JP4995574B2 - 遺伝子導入鳥類作製法 - Google Patents

Description

本発明は、異種蛋白質などの異種蛋白質生産に応用可能な遺伝子導入（トランスジェニック）鳥類を、効率的に作製する方法に関する。

遺伝子組換え技術の発展により、異種蛋白質の大規模な工業生産が可能となった。しかし組換え生産に多用される大腸菌等の微生物は糖鎖付与能力がなく、また抗体・酵素のような複数のユニットからなる蛋白質を生産する能力がないため、その応用範囲は限られている。

現在糖鎖を必要とするエリスロポエチンや抗体医薬品などは、動物培養細胞リアクターによって生産されているが、このような動物細胞による生産法は微生物培養に比べコストが高く、患者や行政の負担増加が問題となっている。

こうした欠点を克服した新たな蛋白質生産法として、遺伝子導入動物（トランスジェニック動物）の利用が注目を浴びている。トランスジェニック哺乳類、鳥類が乳汁や血液、卵中に生産する蛋白質は糖鎖が付与されるうえ、その生産コストは動物培養細胞リアクターの１／１０〜１／１００との試算もある（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９，１８４ ２００１）。 なかでも家禽類を使ったトランスジェニックは、成熟までの期間が短い事や、飼育面積が少なくて済むとの利点があるため、実用化が嘱望されている。

このような利点を持つトランスジェニック鳥類を作製するには、レトロウイルスベクターを受精卵の初期胚に感染させる方法が最も有効な手段である。本発明者らは安全性の高い複製能欠失型ウイルスベクターを用い、鳥類受精卵の初期胚に遺伝子をマイクロインジェクションすることで、体細胞の一部に導入遺伝子を持つトランスジェニックキメラ（Ｇ０と呼ぶ）を効率的に作製することに成功した（特開２００２−１７６８８０号公報）。更に放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の時期にウイルスベクターを導入することで、宿主による蛋白質発現の抑制（サイレンシングと呼ばれる）が解除され、高い発現量が得られることも見出した。このように異種遺伝子の発現に導入時期依存性があることを明らかにし、この知見を基に高い蛋白質発現量をもつトランスジェニック鳥類の作製を可能にしたのは、当該方法が唯一のものである。

しかしこの方法で得られるトランスジェニック鳥類は、体細胞中に導入遺伝子をモザイク状にもつキメラである。トランスジェニック鳥類による蛋白質生産を、安定な工業的手法として実用化するためには、体細胞全体に導入遺伝子を均一にもつ完全体を生産母体とする必要がある。この完全体を得るには、これまでのところ、生殖細胞に導入遺伝子をもつトランスジェニックＧ０（生殖系列トランスジェニックキメラ体）を、別のトランスジェニックＧ０（生殖系列トランスジェニックキメラ体）または野生型と交配し、その子孫から高発現系統を選び出す（世代数に準じてＧ１〜Ｇ２〜Ｇ３と呼ばれる）方法がある。しかし、生殖系列トランスジェニックキメラ体の交配から完全体が生まれる率は３％程度であり、この発現頻度は決して高いとは言えない。

Ｓｉｍｋｉｓｓらは、レトロウイルスベクターを感染させた始原生殖細胞（Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ：以下ＰＧＣと略称する）を他の同種初期胚に移植することにより、異種遺伝子を導入したトランスジェニックニワトリを作製した例を報告している（Ｌｏｒｒａｉｎｅ Ｖｉｃｋ，Ｙｉｎｇ Ｌｉ ａｎｄ Ｋ．Ｓｉｍｋｉｓｓ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｂｉｒｄ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ， Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ（１９９３）２５１，１７９−１８２）。しかしＳｉｍｋｉｓｓらの方法は、導入したプロモーター以下の配列が蛋白発現を構成的に実現する配列ではない等の理由から、次世代のトランスジェニック鳥類における異種遺伝子の発現頻度は低い。

内藤らは、異なる系統のニワトリ間でＰＧＣの移植を行ったところ、その組み合わせにより後代として生まれるドナー（提供種）由来個体の比率が大きく変わることを見出している。すなわち、ドナーとして白色レグホン種のＰＧＣを横斑プリマスロック種初期胚に移植したところ、レシピエント（受容種）であるプリマスロック生殖巣で成熟した生殖細胞は、８０％以上がドナーである白色レグホン由来のものであることが確認されている（内藤充 鳥類胚の体外培養と操作法 蛋白質核酸酵素 Ｖｏｌ．４０ Ｎｏ．１４（１９９５））。

特開２００１−０４５９１５には、始原生殖前駆細胞に所望の異種遺伝子を導入し、これを鳥類胚に移植して発生、孵化させることを特徴とする方法により得られるトランスジェニック鳥類が開示されている。
特開２００２−１７６８８０号公報 特開２００１−０４５９１５号公報 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９，１８４ ２００１ Ｌｏｒｒａｉｎｅ Ｖｉｃｋ，Ｙｉｎｇ Ｌｉ ａｎｄ Ｋ．Ｓｉｍｋｉｓｓ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｂｉｒｄ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ， Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ（１９９３）２５１，１７９−１８２ 内藤充、鳥類胚の体外培養と操作法、蛋白質核酸酵素 Ｖｏｌ．４０ Ｎｏ．１４（１９９５）

トランスジェニック鳥類を、安全で効率のよい蛋白質生産系として応用するには、体細胞全体に導入遺伝子が入り、導入遺伝子に由来する蛋白質を高発現する効率のよいトランスジェニック鳥類作製法の確立が不可欠である。また、生殖細胞に異種遺伝子が導入されている生殖系列トランスジェニック鳥の効率的な生産方法を、確立する必要がある。

そこで本発明者は、より効率的に、完全体トランスジェニック鳥類、例えばＧ１完全体作製法を確立するため、ＰＧＣ移植法の応用を考案した。特に、高濃度（高タイター）のレトロウイルスベクターを作製することによって、効率よく始原生殖細胞に感染を行い、それによってトランスジェニック鳥を効率的に生産出来ること、またレトロウイルスによって導入された異種遺伝子が、宿主による蛋白質発現抑制を受けるのを、回避する方法を見出した。

これら方法により作製されたトランスジェニック鳥類は、医薬品等に利用可能な蛋白質の生産に利用できる。

本発明の、トランスジェニック鳥類作製法は、効率的に完全なＧ０トランスジェニック鳥類を生産し得る。本発明によれば、その子孫、例えば完全なＧ１トランスジェニックを効率的に、誕生させることができる。

本発明のＧ１、Ｇ２、Ｇ３〜トランスジェニック鳥類は、体細胞で異種遺伝子に由来する蛋白質を発現するので、血清、卵白、卵黄から回収、精製することで、これまで生産困難であった糖鎖が付与した蛋白質や抗体類の安価な生産系を供給することができる。

以下に本発明を詳述する。

本発明は、第一の鳥受精卵および第二の鳥受精卵を準備し；第一の鳥受精卵の初期胚から始原生殖細胞（ＰＧＣ）を取得し；異種遺伝子を媒介したレトロウイルスベクターを該始原生殖細胞に感染させて、異種遺伝子を該始原生殖細胞に導入し；該始原生殖細胞を、第二の鳥受精卵の初期胚に移植し；該第二の鳥受精卵を孵化成長させる；ことを特徴とするトランスジェニック鳥類の作製法を提供する。

ここにいうＰＧＣは、鳥類において生殖細胞に分化する細胞であり、初期胚ではＰＡＳ染色で強く染められる細胞として最初に認められ、その後血管系の発達に伴って血流に乗り、生殖巣原基に達して生殖細胞になる。ここにいう受精卵初期胚とは、放卵直後の胚盤葉期（ステージＸ）から孵卵後９６時間程度までを指す。

本発明で使用するＰＧＣは、鳥受精卵初期胚血液中より取得され、密度勾配遠心分離法などにより、効率的に濃縮できる。ＰＧＣを取得する第一の鳥受精卵から、放卵直後を０時間とすると孵卵開始後４０時間以降６０時間までに、特に４８時間以降６０時間までに、ＰＧＣを取得するのが好ましい。ニワトリを例にとると、白色レグホンのような生殖細胞の増殖速度が速い種類からＰＧＣを調製することが好ましい。ＰＧＣの調製は、例えば鳥類受精卵の血液を採取することにより実施する。得られた血液を、密度勾配遠心法によってＰＧＣを濃縮することにより、より効率的にレトロウイルスベクターを該ＰＧＣに感染させて異種遺伝子を該ＰＧＣに導入することができる。

上記方法によれば、生殖系列トランスジェニック鳥類が高率に作製できる。ここで、生殖細胞に導入遺伝子が入っている、または入っていることが確実な個体を、生殖系列トランスジェニック鳥類と称する。生殖系列キメラの確認には、精巣、卵巣からゲノムを調製し、ＰＣＲ法により導入遺伝子を確認する方法がある。また成鳥から精子を採取し、ＰＣＲ法により確認することができる。より簡便には、蛍光蛋白マーカーを導入遺伝子に付加することで、蛍光により確認することが可能である。

本発明の作製法で、ＰＧＣ移植を受けた受精卵初期胚は、その生殖細胞にドナー由来ＰＧＣから分化した生殖細胞とレシピエント本来の生殖細胞がモザイク状になった生殖系列トランスジェニックキメラ鳥類として成長し得る。一般的に、一世代目のトランスジェニックキメラ鳥類は、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類と呼ばれる。また、その子孫は、Ｇ１、Ｇ２〜トランスジェニック鳥類と呼ばれる。ここで本発明の作製法を利用することで、それら子孫において、好ましくは、完全体トランスジェニック鳥類が作製できる。本明細書にいう完全体トランスジェニック鳥類とは、体細胞の実質的に全部に、異種遺伝子が導入されている鳥類をいう。本発明のＧ１、Ｇ２などの完全体トランスジェニック鳥類は、異種遺伝子をその体細胞に均等に含有し、その導入遺伝子に由来する蛋白質を、血中、卵白中あるいは卵黄中に安定に発現することを特徴とする。

本発明においてＰＧＣは、孵卵処理直後を除くそれ以降の時期に受精卵初期胚から取得され、レトロウイルスベクターによって異種遺伝子を導入されることを特徴とする。蛋白質発現量をより高くするために、ＰＧＣが受精卵初期胚から取得される時期は、そのＰＧＣの由来する鳥類種に特有の最適時間がある。例えばニワトリにおいてはＰＧＣ取得時期として、孵化処理後４８時間以降６４時間までが好ましく、より好ましくは孵化処理後４０時間以降６０時間まで、さらに好ましくは、孵化処理後５０時間以降６０時間までである。この異種遺伝子を導入されたＰＧＣおよびその製造方法も、本発明のひとつである。

異種遺伝子が導入されたＰＧＣを、他の受精卵初期胚に導入すべき時期は、種々の時期があり得る。具体的には、その時期は、例えば、孵化処理後１２時間以降９６時間まで、好ましくは孵化処理後２４時間以降７２時間まで、もっとも好ましくは孵化処理後４８時間以降約６４時間までである。

本発明者らは先にウズラでは孵卵開始後約４８時間後、ニワトリでは孵卵開始後約５５時間のＰＧＣにレトロウイルスによって導入された異種遺伝子は、宿主による不活性化を受けず、蛋白を高発現するトランスジェニック鳥類作製が可能であることを見出した。本発明においても、これら最適時間にＰＧＣを取得し、レトロウイルスを感染させることにより、蛋白発現量の高い生殖系列トランスジェニック鳥類を作製可能である。

異種遺伝子をＰＧＣに導入するために、本発明では異種遺伝子を媒介し得るレトロウイルスベクターを使用する。レトロウイルスベクターとしては、任意のレトロウイルスベクターが使用できる。例えばＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルスベクターであってもよい。好ましくは、本発明で使用されるレトロウイルスベクターとしては、例えばモロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、エビアン・ロイコシス・ウイルス（ＡＬＶ）等に由来するベクターや、レンチウイルスベクター等が挙げられる。なかでもＭｏＭＬＶに由来するものが好ましいが、本発明はこれらに限定されるものではない。

本明細書にいう異種遺伝子を媒介し得るレトロウイルスベクターは、真核細胞においてそのウイルスのＲＮＡ遺伝子情報が真核細胞のＤＮＡに組み込まれた場合、真核細胞にその異種遺伝子が提供されるものをいう。好ましくは、そのＲＮＡの塩基配列が、異種蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列と相補的な部分を有する。

安全性を考慮し、異種遺伝子を媒介し得るベクターとして用いられるレトロウイルスは、複製能欠失型であってもよい。複製能欠失型ウイルスとしては、通常ウイルス粒子の複製に必要な３種の遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖのうちいずれかまたは全てを欠くことにより、自己複製能を欠失したウイルスが用いられる。鳥類細胞にこのウイルスベクターを効率的に感染させるため、外皮タンパクを人工的にＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルス由来）シュードタイプとしたウイルスベクターが好ましいが、本発明はこのウイルスタイプに限定されるものではない。

レトロウイルスをＶＳＶ−Ｇシュード型とする利点としては、超遠心により濃縮可能である点も挙げられる。本ベクターに、ＧＦＰのような蛍光蛋白質発現遺伝子をマーカーとして組み込み、培養細胞に感染させることにより感染可能なウイルス濃度を定量することができる。本発明に使用するウイルスベクターは、遠心法により高濃度に濃縮されたものが効率の点から好ましい。

本発明の作製法では好ましくは、高タイターのレトロウイルスベクターを使用してもよい。高タイターとは、例えば１×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌ以上、１×１０¹⁰ｃｆｕ／ｍｌ以下、好ましくは１×１０⁸ｃｆｕ／ｍｌ以上、１×１０¹⁰ｃｆｕ／ｍｌ以下、より好ましくは１×１０⁹ｃｆｕ／ｍｌ以上、１×１０¹⁰ｃｆｕ／ｍｌ以下のタイターであってもよい。高タイターを持つ複製能欠失型レトロウイルスベクターをＰＧＣに感染させることが、遺伝子を効率よく導入できる点で好ましい。したがって、本発明は、高タイターのレトロウイルスベクターをＰＧＣに感染させることによる、異種遺伝子を媒介したＰＧＣの生産あるいは増加させる方法にも関する。

高タイターのレトロウイルスベクターを作製するには、高タイターのウイルスパッケージング細胞の選別が必要であるが、そのためには蛍光蛋白マーカーを、フローサイトメーターにより選別する方法によってもよい。また遺伝子組換え技法により、外皮をＶＳＶ−Ｇシュード型等に変えることで、超遠心法による濃縮に耐えるレトロウイルスベクターの作製が可能になる。一度超遠心で濃縮したウイルス液を、再度超遠心法で濃縮する方法は、不要蛋白の混入増大の観点からインジェクション法に使用するには好ましくはないが、ＰＧＣに感染させる手法としては有効である。

ウイルスタイターの測定は、例えば、以下のように行う。測定の前日にＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を直径３５ｍｍのディッシュに約７×１０⁴細胞植え培養する。蛍光マーカーを付与したウイルスの、約１０²から１０⁶倍に希釈した溶液を各ディッシュに１ｍｌ加え、約４８時間後に蛍光顕微鏡によりＧＦＰを発現している細胞の割合（１００％を１とする）を測定し、以下の計算式によりタイターを決定する。

ウイルスタイター＝細胞数×希釈率×発現割合
レトロウイルスベクターに異種遺伝子を導入するには、パッケージングシグナル配列を有するプラスミドを、パッケージング細胞にリポフェクション、エレクトロポレーション法等により導入する方法がある。

異種遺伝子を媒介したレトロウイルスベクターを、受精卵初期胚に導入するには、リポフェクション法、エレクトロポレーション法や、マイクロインジェクション法によって受精卵初期胚に感染させる方法がある。好ましくはマイクロインジェクション法を使用し得る。

ここにいう異種遺伝子とは、特定の宿主細胞に対して外来のソースから起源する遺伝子、あるいは、同じソースであっても、本来の形態から修飾されている遺伝子を意味する。よって、宿主細胞中の異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して外来性であるか、例えば、ＤＮＡシャッフリングの使用によって修飾された遺伝子を含む。該用語はまた、天然には多重コピーが存在しない天然に存在する遺伝子を含む。なお、本明細書では、異種（性）、外来（性）、外部（性）遺伝子または蛋白質の語は、相互交換的に使用されることもある。

本発明により鳥類に導入される異種遺伝子は特に限定されないが、レトロウイルスに由来しない遺伝子としては、マーカー遺伝子や、目的蛋白質を発現するための構造遺伝子、これらの遺伝子発現をコントロールするプロモーター遺伝子、分泌シグナル遺伝子等から適宜選ばれる。

上記マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、β―ガラクトシダーゼ遺伝子、蛍光蛋白質例えばＧＦＰ（グリーン・フルオレッセント・プロテイン）等をコードした遺伝子が挙げられる。

上記目的蛋白質を発現するための構造遺伝子としては特に限定されず、ヒトモノクローナル抗体、キメラ抗体、１本鎖化等の修飾を施した人工抗体、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、インターフェロンなどの遺伝子産業上有用な抗体、酵素等をコードした遺伝子などが挙げられる。

トランスジェニック鳥類に導入する有用蛋白質遺伝子としては、エリスロポエチンの構成遺伝子のように、発現したタンパクの活性、安定性維持に糖鎖が必要なものや、抗体遺伝子などが挙げられる。

また、その他の有用生理活性物質の遺伝子を用いることもできる。特に、卵中での蓄積がよいことから、ヒトＩｇＧクラスの定常領域をもつ抗体の遺伝子や、ヒトＩｇＧ１，ウズラＩｇＧ２，ニワトリＩｇＧ２やマウスＩｇＧ２のサブクラスの定常領域をもつ抗体の遺伝子など外来性抗体の構造遺伝子が好ましい。

また好ましい上記構造遺伝子としては、キメラ抗体の構造遺伝子が挙げられる。キメラ抗体とは、２種以上の異なる遺伝形質から構成される抗体のことをいう。従来マウスハイブリドーマによって作製された医療用抗体は、マウス由来であるためヒト体内に投与されると免疫系による拒絶反応が引き起こされるという問題があった。この欠点を解消するため、例えばマウス抗体を組換え手法によってＦｃ部等をヒト化することにより、拒絶反応のリスクを大幅に軽減することができる。

上記キメラ抗体としては、例えば抗ヒトＣＤ２抗体、抗ＣＤ２０受容体抗体、抗ＴＮＦ抗体などが挙げられ、すでに医薬品として上市されているものもある。

さらに好ましい上記構造遺伝子としては、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体の構造遺伝子が挙げられる。医療用の組換え抗体には、この他に低分子抗体と称される一群がある。免疫グロブリンＩｇＧには直接抗原と結合する可変領域（Ｆｖ：Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｅｏｎ）と呼ばれるＶＨ，ＶＬのヘテロ二量体からなるドメインがあり、このＦｖドメインはＩｇＧの約５分の１の分子量でありながら、単独で充分な抗原結合能を持つ。ＶＨ、ＶＬドメイン間を人工的にペプチドリンカーで結合したものが１本鎖抗体（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ）と呼ばれる低分子抗体で、ＶＨ，ＶＬ単独よりも安定性が向上することが知られている。

Ｐｏｗｅｒｓら（Ｐｏｗｅｒｓ，Ｄ．Ｂら（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄ．２５１，１２３）は、このｓｃＦｖにヒトＩｇＧ１に由来するＦｃ部を融合させることで、血中での安定性が増すことを見出した。このｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体は医療用として有用と考えられるが、安価な大量生産システムである大腸菌では生産されない。

上記プロモーター遺伝子としては、任意のプロモーター、例えば構成的プロモーターとしてＲＳＶプロモーター；部位特異的プロモーター、例えばβ−アクチンプロモーター；時期特異的プロモーター、例えばオボアルブミンプロモーターなどが挙げられる。好ましくは、構成的なプロモーターを使用する。抗体遺伝子が構成的なプロモーターにより制御されている場合、抗体遺伝子発現が安定してよいので好ましい。より好ましい構成的なプロモーターとして、ニワトリβアクチンプロモーターが挙げられる。βアクチンプロモーターで発現制御した場合、目的タンパクは血中に発現される特徴がある。

一般的なトランスジェニック動物による蛋白質生産では、乳汁、あるいは卵中に目的蛋白質を生産させる時、性成熟によって乳汁分泌、あるいは産卵等が開始されるまでその生産量がどれくらいか見当がつかないとの欠点がある。生物種によっては性成熟には数年かかる場合もあり、産業的に目的タンパクを計画生産する時の大きな不安定要素となっている。この点、βアクチンプロモーターで発現制御したトランスジェニック鳥類においては、幼鳥類の段階で血液中のタンパク発現量を調べる事で、性成熟後の卵中タンパク発現量を予見的に把握することが可能であり、計画生産には大きなプラス要因となる。

本発明で使用する鳥類としては特に限定されず、例えばニワトリ、七面鳥類、カモ、ダチョウ、ウズラなど、食肉、採卵目的で家畜化されている家禽鳥類や愛玩用鳥類を挙げることができる。なかでもニワトリやウズラは入手が容易で、産卵種としても多産である点が好ましい。

本発明において、受精卵初期胚を取得するための第一の鳥類と、異種遺伝子が導入された始原生殖細胞を移植すべき受精卵初期胚の由来となる第二の鳥類とは、同一種でも異なる種でも可能である。同一種、または同一種かつ同一系統を採用する場合、同一個体でも異なる個体でも可能である。簡便には、異なる個体を使用する。また、例えばニワトリのＰＧＣをウズラに移植することも可能である。しかし移植効率の観点から、同一種間の移植が好ましい。

同一種の中では同じ系統間の移植でもよいが、異なる系統間の移植が可能である。具体的には、第一の鳥受精卵初期胚が取得される鳥の系統と、第二の受精卵初期胚が取得される鳥の系統が異なってもよい。このとき、第一の鳥受精卵初期胚における生殖細胞の増殖速度と、第二の受精卵初期胚における生殖細胞の増殖速度が異なる場合がある。好ましくは、第一の受精卵初期胚における生殖細胞の増殖速度の方が、第二の受精卵初期胚における生殖細胞の増殖速度よりも大きい場合である。例えば、ニワトリ白色レグホン由来のＰＧＣにレトロウイルスで異種遺伝子を導入し、ニワトリ横斑プリマスロックの受精卵に移植することが可能である。この場合、ＰＧＣ提供系統である白色レグホンのほうが生殖細胞の増殖速度において勝るため、異種遺伝子を導入された白色レグホンの生殖細胞のほうがプリマスロック体内で優位に生成するとの点で好ましい。またこの場合、羽毛色によってドナーの子孫を簡便に見分ける事ができる点が好ましい。本例のように羽毛色の異なる種間でＰＧＣ移植を行なう利点として、異種遺伝子を導入したドナーＰＧＣ由来のトランスジェニック鳥類を、目視により簡便に選別できる。

上記異種遺伝子が導入された初期胚を有する受精卵を通常の家禽飼育法にしたがって孵化成長させ、トランスジェニック鳥類を生産する。該トランスジェニック鳥類に、通常の繁殖法、伝統的育種法または遺伝子工学的手法を適用して、その子孫を生産する。

Ｇ０生殖系列トランスジェニックキメラ鳥類と非トランスジェニック鳥類、例えば野生型鳥類、あるいはＧ０生殖系列トランスジェニックキメラ鳥類同士を交配させて誕生する子孫、例えば二世代目、三世代目は、これらが導入遺伝子を染色体にもつ生殖細胞から発生した場合、全身の体細胞に導入遺伝子を含有する完全体個体として成長する。この生殖系列トランスジェニックキメラ個体から導入遺伝子を受け継ぐ子孫を、代々Ｇ１〜Ｇ２〜Ｇ３トランスジェニック鳥類と称する。交配は自然交配でも人工交配でもよいが、生産を人為的に調整できる観点から人工交配が好ましい。

また交配する相手は、ドナー系統、レシピエント系統または別個の第三系統でもよく、他の種でも受精可能ならば交配できるが、受精効率の点からドナー系統との交配が好ましい。交配型としてはＧ０トランスジェニックオスと野生型メス、Ｇ０トランスジェニックメスと野生型オス、Ｇ０トランスジェニックのオスとメス等が考えられ、更に子孫とその親による戻し交配も可能である。中でもＧ０オスと野生型メスの交配型は、１羽のＧ０オスに対し、野生型メス３羽から１０羽を交配させることができるため、効率の点から好ましい。

本発明によるＧ０生殖系列トランスジェニックキメラ鳥類を、先に述べたごとく交配させることにより、導入遺伝子を子孫に伝播させることができるとともに、全身の体細胞に導入遺伝子をもつ完全なトランスジェニック鳥類を作製できる。レトロウイルスを受精卵に直接インジェクションする方法でＧ０トランスジェニック鳥類を作製した場合、生殖系列トランスジェニックキメラ体Ｇ０の選別を行う必要があり、更にその交配によって導入遺伝子をもつトランスジェニック完全体Ｇ１が誕生する頻度が３％程度と低いとの問題があったが、本発明によるＰＧＣ移植法では、高い頻度で生殖系列トランスジェニック鳥類Ｇ０が得られ、その結果高い頻度でＧ１完全体が誕生することが可能である。また、第一の受精卵初期胚における生殖細胞の増殖速度の方が、第二の受精卵初期胚における生殖細胞の増殖速度よりも大きい場合、Ｇ０個体において、導入遺伝子を有するドナー側の生殖細胞が、レシピエント側の生殖細胞より存在比が高くなるため、結果としてＧ１やＧ２などの子孫における完全体の割合をより高めることが可能である。こうして作製した完全体の系統保存には、精子凍結保存法の応用が可能である。

本発明は、このように蛋白質生産に有利な完全体としてのトランスジェニック鳥類作製法を開示する。また該作製法による遺伝子導入鳥類を開示する。

このように、安定的に導入遺伝子を伝播するトランスジェニック鳥類の系統を確立することで、蛋白質産生システムとしての品質の安定化が可能である。更に完全なトランスジェニック鳥類は、導入遺伝子をもつ体細胞の割合が多いことから、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類に比べ、導入遺伝子に由来する組換え蛋白質の産生量が増加することが可能である。

本発明のタンパク生産法は、上記トランスジェニックキメラ鳥類から抗体を抽出し、必要により精製することを特徴とする。上記トランスジェニック鳥類は、Ｇ０であってもよく、あるいはその子孫例えば、Ｇ１、Ｇ２またはそれ以降の世代のトランスジェニック鳥類子孫であってよい。より詳細には、作製されたトランスジェニックキメラ鳥類の血中及び／又は卵中から抗体を回収、精製する抗体の生産法である。抗体の抽出は、硫安沈殿等による不用蛋白除去、プロテインＡ等の吸着カラム、イオン交換カラムや、限外濾過膜等による分別処理の組み合わせにより行う。

本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類において、鳥類に導入される遺伝子として、これらヒトモノクローナル抗体遺伝子、キメラ抗体遺伝子、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体遺伝子、１本鎖化等の修飾を施した人工抗体、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、インターフェロンなどの遺伝子産業上有用な抗体、生理活性蛋白、酵素等をコードした遺伝子を使用する。従来生産が困難だった抗体などの医薬品を安価に大量生産することができる。

例えば、キメラ抗体遺伝子を導入したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の場合、血液中の抗体含有量の例は、好ましくは約０．５μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約５μｇ／ｍｌ以上である。また、卵白中の抗体含有量の例は、好ましくは約０．１μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約１μｇ／ｍｌ以上であり、卵黄中の抗体含有量の例は、好ましくは約０．１μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約１μｇ／ｍｌ以上である。

また、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体遺伝子を導入したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の場合、血液中の抗体含有量の例は、好ましくは約２０μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約２０００μｇ／ｍｌ以上である。また、卵白中の抗体含有量の例は、好ましくは約５μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約５００μｇ／ｍｌ以上である。

さらに、本発明によれば、本発明のトランスジェニック鳥類の作製法によって、畜産用または愛玩用の鳥類の品種改良も行い得る。

以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

（実施例１）抗ＣＤ２抗体発現ベクターコンストラクトの作製
抗ＣＤ２抗体発現用ベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＨ、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬ及びｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨは、以下のように作製した。

ヒト抗体（ＩｇＭ）産生ハイブリドーマ細胞Ｄ２５３−１５−６（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＨＢ−８７８９）からＱｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）を用いてｍＲＮＡを取得し、得られたｍＲＮＡからＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）を用いてｃＤＮＡライブラリを調製した。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｔｃｃｔｃｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇ−３’（下線部はＸｈｏＩ制限酵素サイト）及び５’−ｃｃｃｇｇａｔｃｃｃｔａａｃａｃｔｃｔｃｃｃｃｔｇｔｔｇａａｇｃｔ−３’（下線部はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１分→５０℃／１分→７２℃／１分３０秒：２５サイクル；Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー社製））により上記ｃＤＮＡライブラリからヒト抗体Ｌ鎖κ定常領域（ｈＣκ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩによって切り出し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）（ストラタジーン社製）のＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＣκを作製した。

同様にして、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｇｃｇｇｃｃｇｃｔａｃａｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｇａｃａｔｃｇｔｇａｔｇａｃｃｃａｇｔｃｔｃｃ−３’（下線部はＮｏｔＩ制限酵素サイト）及び５’−ｃｃｔｃｔｃｇａｇｇａｔａｇａａｇｔｔａｔｔｃａｇｃａｇｇｃａｃａｃ−３’（下線部はＸｈｏＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲにより上記ｃＤＮＡライブラリからヒト抗体Ｌ鎖可変領域（ｈＶＬ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）のＮｏｔＩ、ＸｈｏＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＶＬを作製した。

同様にして、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｃｃｔｃｇａｇｃｇｔｇｇｃｃｇｔｔｇｇｃｔｇｃｃｔｃｇｃａｃａ−３’（下線部はＸｈｏＩ制限酵素サイト）及び５’−ａｃｔａａｇｃｔｔａｃｇｔｔｇｔａｃａｇｇｇｔｇｇｇｔｔｔａｃｃ−３’（下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲにより上記ｃＤＮＡライブラリからヒト抗体Ｈ鎖μ定常領域（ｈＣμ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）のＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＣμを作製した。

同様にして、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｇｃｇｇｃｃｇｃｔａｃａｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａｇｔｃｔｇｇ−３’（下線部はＮｏｔＩ制限酵素サイト）及び５’−ｃａｃｇｃｔｃｇａｇｇｔａｔｃｃｇａｃｇｇｇｇａａｔｔｃｔｃａｃａｇｇａ−３’（下線部はＸｈｏＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲにより上記ｃＤＮＡライブラリからヒト抗体Ｈ鎖可変領域（ｈＶＨ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）のＮｏｔＩ、ＸｈｏＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＶＨを作製した。

ｐＢｌｕｅ／ｈＣκからｈＣκ遺伝子断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩによって切り出し、プラスミドｐＣＥＰ４（インビトロジェン社製）のＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＣＥＰ４／ｈＣκを作製した。

２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃｃｃａａｇｃｔｔｇａｔｃｔｃｃａｃｔｇｇｇａｔｇｇｔｇｇｇｇｇｃｃｃｔｃｃｔｃｔｔｇｃｔｇｃｔｇ−３’（下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイト）及び５’−ｃｃｃｇｇａｔｃｃｔｃａｇｔｃａａｇｇｃｇｃｃｔｔｃｇｃａｔｇａａｇａｇｇｃｃｇａｔｃｃｃｃａｇｇｇｃｃａｃｃａｃｃａｇｃａｇｃａａｇａｇｇａｇｇｇｃｃｃｃ−３’（下線部はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）を２１ｂｐｓにわたって相補的な３’末端でアニールさせ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いたＤＮＡ２重鎖合成反応によって上皮増殖因子受容体膜貫通領域（ＴＭ）の遺伝子断片を調製した。得られたＴＭ遺伝子断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによって処理後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）のＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩサイトに挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ＴＭを作製した。

ｐＢｌｕｅ／ｈＣμからｈＣμ遺伝子断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅ／ＴＭのＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＣμＴＭを作製した。

ｐＢｌｕｅ／ｈＣμＴＭから一連のｈＣμ遺伝子及びＴＭ遺伝子を含む断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩによって切り出し、ｐＣＥＰ４のＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＣＥＰ４／ｈＣμＴＭを作製した。

ｐＣＥＰ４／ｈＣμＴＭを制限酵素ＢａｍＨＩによって切断し、末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによって平滑処理後、セルフライゲーションによりプラスミドｐＣＥＰ４／ｈＣμＴＭΔＢを作製した。

化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｔｇａａｇａｃａｇａｔｇｇｃｇｃｃｇｃｃａｃａｇｔｔｃｇｔｔｔ−３’（ 下線部はＮａｒＩ制限酵素サイト）を用いた部位特異的変異導入によりｐＢｌｕｅ／ｈＶＬが保有するｈＶＬの３’末端にアミノ酸暗号の変更を伴わずに制限酵素ＮａｒＩサイトを導入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＶＬＮを作製した。

化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｔｇｇｇｇｃｇｇａｔｇｃｇｇａｔｃｃｔｇａｇｇａｇａｃｇｇｔ−３’（ 下線部はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）を用いた部位特異的変異導入によりｐＢｌｕｅ／ｈＶＨが保有するｈＶＨの３’末端にアミノ酸暗号の変更を伴わずに制限酵素ＢａｍＨＩサイトを導入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＶＨＢを作製した。

抗ヒトＣＤ２マウス抗体産生ハイブリドーマ細胞ＴＳ２／１８．１．１（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＨＢ−１９５）からＱｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてｍＲＮＡを取得し、得られたｍＲＮＡからＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いてｃＤＮＡライブラリを調製した。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃｇｃｇｇｃｃｇｃｃｔｃａｇｇｇａａａｇｔｔｔｇａａｇａｔｇ−３’（下線部はＮｏｔＩ制限酵素サイト）及び５’−ｃｇｇｃｇｃｃｇｃｃａｃａｇｔｃｃｇｔｔｔｔａｔｔｔｃｃａｇｃｔｔｇｇｔ−３’（下線部はＮａｒＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲにより上記ｃＤＮＡライブラリからマウス抗体Ｌ鎖可変領域（ｍＶＬ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＮａｒＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅ／ｈＶＬＮのＮｏｔＩ、ＮａｒＩサイトへ挿入してプラスミドｐＢｌｕｅ／ｍＶＬを作製した。

同様にして、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃｇｃｇｇｃｃｇｃｇａａｃａｃｇｇａｍｃｃｃｔｃａｃｃａｔｇ−３’（下線部はＮｏｔＩ制限酵素サイト）及び５’−ｃｇｇａｔｃｃｔｇｃａｇａｇａｃａｇｔｇａｃｃａｇａｇｔ−３’（下線部はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲにより上記ｃＤＮＡライブラリからマウス抗体Ｈ鎖可変領域（ｍＶＨ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）のＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｍＶＨを作製した。

ｐＢｌｕｅ／ｍＶＬからｍＶＬ遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、ｐＣＥＰ４／ｈＣκのＮｏｔＩ、ＸｈｏＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＣＥＰ４／ＩｇＬκを作製した。

ｐＢｌｕｅ／ｈＶＨＢからｈＶＨ遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、ｐＣＥＰ４／ｈＣμＴＭΔＢのＮｏｔＩ、ＸｈｏＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＣＥＰ４／ｈＩｇＨμＴＭを作製した。

ｐＢｌｕｅ／ｍＶＨからｍＶＨ遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩによって切り出し、制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩによって処理したｐＣＥＰ４／ｈＩｇＨμＴＭのベクター断片に連結し、プラスミドｐＣＥＰ４／ＩｇＨμＴＭを作製した。

ｐＭＳＣＶｎｅｏは公知文献（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９４ ＭＡＲ；１(２)：１３６−８．）とインターネットの情報を元に全合成した（東洋紡績社製）。ｐＭＳＣＶｎｅｏから一連のミューリン・ホスホグリセレート・キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター及びＮｅｏｒ遺伝子を含む断片を制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩによって除去し、残ったベクター断片のセルフライゲーションによりプラスミドｐＭＳＣＶを作製した。

ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ−１からＧＦＰ遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩによって切り出し、ｐＺｅｏＳＶ２（＋）のＮｏｔＩサイトに挿入した。Ｔ７プロモーターと同方向にＧＦＰ遺伝子が挿入された構造のプラスミドをｐＺｅｏ／ＧＦＰとした。

ｐＺｅｏ／ＧＦＰからＧＦＰ遺伝子断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩによって処理したｐＭＳＣＶのベクター断片に連結し、プラスミドｐＭＳＣＶ／Ｇを作製した。

ヒト抗体（ＩｇＧ１）産生ミエローマ細胞ＩＭ−９（ジャパニーズ・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリソーシズ ００２４）からｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ロッシュ社製）を用いてｍＲＮＡを取得し、得られたｍＲＮＡからＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡライブラリを調製した。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃａａｇｃｔｔｃａａｇｇｇｃｃｃａｔ−３’及び５’−ａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇａ−３’をプライマーとするＰＣＲ（９５℃／２分→５２℃／３０秒→７４℃／３分：３０サイクル；Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ社製））により上記ｃＤＮＡライブラリからヒト抗体Ｈ鎖γ１定常領域（ｈＣγ１）の遺伝子断片を増幅した。さらに、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｔａｇｇａｔｃｃｇｃｔａｇｃｔｔｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｇ−３’（下線部はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）及び５’−ａｇｃａａｇｃｔｔｔｃａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇａ−３’（下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１５秒→５８℃／３０秒→６８℃／１分：３０サイクル；ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ）により上記ＰＣＲ産物からｈＣγ１遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＣγ１を作製した。

ｐＣＥＰ４／ＩｇＨμＴＭからｍＶＨ遺伝子断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによって切り出した。ｐＢｌｕｅ／ｈＣγ１からｈＣγ１遺伝子断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出した。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって処理したプラスミドｐＥＴＢｌｕｅ−２（ノバジェン社製）のベクター断片に上記切り出した２断片を連結し、プラスミドｐＥＴＢｌｕｅ／ＩｇＨγ１を作製した。
２２．ｐＥＴＢｌｕｅ／ＩｇＨγ１から抗体Ｈ鎖γ１（ＩｇＨγ１）の遺伝子断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧのＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入した。ＧＦＰ遺伝子と同方向にＩｇＨγ１遺伝子が挿入された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧＨとした。

２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｃｇｃｇｔｃｇａｃｇｔｇｃａｔｇｃａｃｇｃｔｃａｔｔｇ−３’（下線部はＳａｌＩ制限酵素サイト）及び５’−ａｃｇｃｇｔｃｇａｃａａｃｇｃａｇｃｇａｃｔｃｃｃｇ−３’（下線部はＳａｌＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１５秒→５０℃／３０秒→６８℃／１分：１０サイクル；９４℃／１５秒→６２℃／３０秒→６８℃／１分：３０サイクル）によりｐＭｉｗＺからΔＡｃｔプロモーター断片を増幅後、制限酵素ＳａｌＩによってΔＡｃｔプロモーター断片を切り出し、ｐＥＴＢｌｕｅ−２のＳａｌＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＥＴＢｌｕｅ／ΔＡｃｔを作製した。

ｐＥＴＢｌｕｅ／ΔＡｃｔからΔＡｃｔプロモーター断片を制限酵素ＳａｌＩによって切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧＨのＸｈｏＩサイトへ挿入した。ＩｇＨγ１遺伝子と同方向にΔＡｃｔプロモーターが挿入された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＨとした。

２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａａｔｇｔｃｇａｃａｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｔｃｔｃａｇｃｔｃ−３’（下線部はＳａｌＩ制限酵素サイト）及び５’−ｔｔｃｇｔｃｇａｃｃｔａａｃａｃｔｃｔｃｃｃｃｔｇｔｔｇａａ−３’（下線部はＳａｌＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９５℃／３０秒→５０℃／３０秒→７４℃／２分：１０サイクル；９５℃／３０秒→６０℃／３０秒→７４℃／２分：３０サイクル；Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ）によりｐＣＥＰ４／ＩｇＬκから抗体Ｌ鎖κ（ＩｇＬκ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＳａｌＩによって切り出し、ｐＥＴＢｌｕｅ−２のＳａｌＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＥＴＢｌｕｅ／ＩｇＬκを作製した。

ｐＥＴＢｌｕｅ／ΔＡｃｔからΔＡｃｔプロモーター断片を制限酵素ＳａｌＩによって切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧのＸｈｏＩサイトへ挿入した。ＧＦＰ遺伝子と同方向にΔＡｃｔプロモーターが挿入された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡとした。
２７．ｐＥＴＢｌｕｅ／ＩｇＬκからＩｇＬκ遺伝子断片を制限酵素ＳａｌＩによって切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡのＳａｌＩサイトへ挿入した。ΔＡｃｔプロモーターと同方向にＩｇＬκ遺伝子断片が挿入された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬとした。

２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｃｇｃｇｔｃｇａｃｃｇｃｃｃｃｔｃｔｃｃｃｔｃｃｃｃｃ−３’（下線部はＳａｌＩ制限酵素サイト）及び５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇａｔｔａｔｃａｔｃｇｔｇｔｔｔｔｔｃａａａｇｇａａａａｃｃａｃｇｔｃ−３’（下線部はＸｈｏＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１５秒→６０℃／３０秒→６８℃／１分：３０サイクル）によりプラスミドｐＬＸＩＮ（クロンテック社製）からＩＲＥＳ断片を増幅後、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、ｐＥＴＢｌｕｅ−２のＳａｌＩ、ＸｈｏＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＥＴＢｌｕｅ／ＩＲＥＳを作製した。

ｐＥＴＢｌｕｅ／ＩＲＥＳからＩＲＥＳ断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＨのＳａｌＩサイトへ挿入した。ＩｇＨγ１遺伝子と同方向にＩＲＥＳが挿入された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＩＨとした。

ｐＥＴＢｌｕｅ／ＩｇＬκからＩｇＬκ遺伝子断片を制限酵素ＳａｌＩによって切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＩＨのＳａｌＩサイトへ挿入した。ΔＡｃｔプロモーターと同方向にＩｇＬκ遺伝子断片が挿入された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨとした。

このように作製した複製能欠失型レトロウイルスベクターのベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨの構造を図１に示した。

（実施例２）抗ＣＤ２抗体発現レトロウイルスベクターの調製
実施例１で作製したベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨよりレトウイルスベクターを調製するため、パッケージング細胞ＧＰ２９３（クロンテック社製）を直径１００ｍｍの培養ディッシュに５×１０⁶細胞植え、培養した。培地を新鮮なＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）に交換し、ｐ−ＶＳＶ−Ｇベクター（クロンテック社製）８μｇとｐＭＳＣＶＮΔＡβ８μｇをリポフェクション法により前記ＧＰ２９３細胞に導入した。４８時間後、ウイルス粒子を含む培養上清を回収し、０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（アドバンテック社製）を通して夾雑物を除去した。得られた溶液にポリブレン（シグマ社製）を１０μｇ／ｍｌとなるように加えウイルス液とした。

調製したウイルス液を別に培養したＧＰ２９３細胞に加え、４８時間培養後６００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を含む培養液で植え継ぎ、安定なＧ４１８安定形質転換ＧＰ２９３株を取得した。

得られた安定形質転換株を８０％コンフルエントとなるよう直径１００ｍｍディッシュに培養し、１６μｇのｐＶＳＶ−Ｇをリポフェクション法で導入した。４８時間後ウイルス粒子を含む培養上清１２ｍｌを回収した。

この培養上清を５０，０００×ｇ、４℃で１．５時間遠心を行い、ウイルスを沈殿させた。上清を除き、ウイルス粒子を含む沈殿物に５０μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加え、４℃で一晩放置後、よく懸濁してウイルス溶液を回収した。このようにして得られた高タイターウイルスベクターは、１０⁸ｃｆｕ／ｍｌであった。

ウイルスタイターの測定は、以下のように行った。測定の前日にＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を直径３５ｍｍのディッシュに７×１０⁴細胞植え培養した。１０²から１０⁶倍に希釈したウイルス溶液を各ディッシュに１ｍｌ加え、４８時間後に蛍光顕微鏡によりＧＦＰを発現している細胞の割合を測定し、以下の計算式によりタイターを決定した。

ウイルスタイター＝細胞数×希釈率×発現割合 （ｃｆｕ／ｍｌ）

（実施例３）ＰＧＣの調製
ニワトリの受精卵由来ＰＧＣは、以下のように調製した。

孵卵開始後５０時間目（ステージＸＩＩＩ〜ＸＶ）のニワトリ受精卵（城山種鶏場産）を横置きにして、１分間以上静置した。静置することにより胚が上部に移動するため、この状態を保って静かに卵を割り、シャーレに移した。

卵黄の上部に胚体があることを確認し、血管より０．５〜１．０ｃｍ外側を血管に沿ってハサミで切り取り、ヘラとピンセットですくいあげてリン酸緩衝液（１Ｎ塩酸にてｐＨ７．４に調製）を満たしたシャーレに移した。この胚体をピンセットでつまみ、リン酸緩衝液で卵黄を洗い落とした。洗浄後の胚体を３８℃に熱したリン酸緩衝液を満たしたシャーレに移し、ピンセットで広げた。

実体顕微鏡下に観察しながら、胚体の腹部動脈血管を、切断用針を用いて切断した。この操作によって流出した血液が胚体に溜まるので、先を細くしたパスツールピペットを使ってこの血液を吸引し、ダルベッコ変法最小必須培地（Ｄ−ＭＥＭ インビトロジェン社製）に懸濁した。

集めたＰＧＣを含む血液を遠心分離によって培地から分離し、３００μｌの６．３％Ｆｉｃｏｌｌ４００（シグマ社製）に懸濁し、６００μｌの１６％Ｆｉｃｏｌｌ４００に重層後、１５００ｒｐｍで３０分間遠心した。

遠心処理により、Ｆｉｃｏｌｌの境界付近に集められたＰＧＣを回収し、ダルベッコ変法最小必須培地で３回洗浄後、同培地１ｍｌに懸濁後遠心濃縮した。

実施例２で調製した抗ＣＤ２抗体発現レトロウイルスベクターを、同量のＰＧＣ懸濁液とともに３７℃で４時間インキュベートし、抗ＣＤ２抗体発現のための遺伝子が導入されたＰＧＣを得た。

（実施例４）ＰＣＲ法によるＰＧＣ中導入遺伝子の確認
実施例３で調製した抗ＣＤ２抗体発現のための遺伝子が導入されたＰＧＣから、キット（東洋紡社製 ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ｇｅｎｏｍｅ−）を用いて抽出したゲノムＤＮＡ５０ｎｇを使い、ＰＣＲ法で抗ＣＤ２抗体発現用遺伝子が導入されていることを確認した。

ＰＣＲ法には、導入遺伝子に含まれるＧＦＰ遺伝子の一部３５５ｂｐを増幅可能なプライマーセット：５’−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＴＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＡＴＧ−３’／５’−ＡＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＣＴＣＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣ−３’を用いた。内部標準として、ニワトリゲノムに含まれるオボアルブミン遺伝子の一部３１７ｂｐを増幅可能なプライマーセット：５’−ＣＧＣＴＴＴＧＡＴＡＡＡＣＴＴＣＣＡＧＧＡＴＴＣＧＧ−３’／５’−ＣＡＴＣＴＡＧＣＴＧＴＣＴＴＧＣＴＴＡＡＧＣＧＴＡＣＡ−３’を用いた。

結果を図２に示した。

（実施例５）ニワトリ胚へのレトロウイルスベクター感染ＰＧＣのインジェクション
実施例１とは別のニワトリ受精卵を用意し、自動転卵装置が内蔵された孵卵器（昭和フランキ社製Ｐ−００８型）内で３７．９℃、湿度６５％環境に置いた時刻を孵卵開始時刻（０時間）とし、以後１５分毎に９０度転卵しながら孵卵を行なった。

孵卵開始後、受精卵の卵殻を７０％エタノールで消毒し、鋭端部を直径３．５ｃｍの円形にダイヤモンドカッター（ＭＩＮＯＭＯ７Ｃ７１０、ミニター社製）で切り取り、胚を露出させた。胚盤葉を実体顕微鏡で観察しながら、ガラス管（ＣＤ−１、オリンパス社製）をマイクロピペット製作器（ＰＣ−１０，オリンパス社製）で加工し、外径約２０μｍとなるよう先端を折って作製した針を刺し、マイクロインジェクター（Ｔｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ５２４６、エッペンドルフ社製）を用いて胚盤下腔の中央に、実施例３で調製した抗ＣＤ２抗体発現のための遺伝子が導入されたＰＣＧ懸濁液を２μl注入した。この卵殻の切り口まで卵白を満たした後、卵白を糊としてテフロン（登録商標）膜（ミリラップ、ミリポア社製）とポリ塩化ビニリデンラップ（サランラップ、旭化成社製）とで蓋をし、１５分毎に９０度転卵しながら孵卵を行なった。

以上の操作を、それぞれ、孵卵後５０時間、５５時間、６０時間の受精卵に対して実施した結果、インジェクションに最も好ましいのは、ニワトリの場合孵卵処理後５５時間の受精卵であることがわかった。

本発明の、トランスジェニック鳥類作製法は、効率的に完全なＧ０トランスジェニック鳥類を生産し得る。本発明によれば、その子孫、例えば完全なＧ１トランスジェニックを効率的に、誕生させることができる。

本発明のＧ１、Ｇ２、Ｇ３〜トランスジェニック鳥類は、体細胞で異種遺伝子に由来する蛋白質を発現するので、血清、卵白、卵黄から回収、精製することで、これまで生産困難であった糖鎖が付与した蛋白質や抗体類の安価な生産系を供給することができる。

抗ＣＤ２抗体発現ベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＨ、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬ及びｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨの構造を示す。Ａｍｐ^rはアンピシリン耐性遺伝子を示す。PΔａｃｔはβ−アクチンプロモーター遺伝子を示す。Ψ＋はパッケージングシグナル配列を示す。 ＧＦＰはグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子を示す。Ｌは抗ＣＤ２抗体軽鎖遺伝子を示す。Ｈは抗ＣＤ２抗体重鎖遺伝子を示す。５‘ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはそれぞれＭｏＭＬＶのロングターミナルリピート配列を示す。 抗ＣＤ２抗体発現遺伝子を、レトロウイルスベクターにより導入したＰＧＣのＰＣＲ結果である。レーン１は無処理のＰＧＣ。レーン２は抗ＣＤ２発現遺伝子を導入したＰＧＣを表す。矢印は導入遺伝子を示す。

符号の説明

１ レーン１を示す。

２ レーン２を示す。

Claims (14)

1. 第一の鳥受精卵および第二の鳥受精卵を準備し、
   第一の鳥受精卵の初期胚から始原生殖細胞を取得し、
   異種遺伝子を媒介した１×１０ ^７ ｃｆｕ／ｍＬ以上、１×１０ ^１０ ｃｆｕ／ｍＬ以下のタイターをもつモロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルスに由来するレトロウイルスベクターを該始原生殖細胞に体外で感染させて、異種遺伝子を該始原生殖細胞に導入させ、
   該始原生殖細胞を第二の鳥受精卵の初期胚に移植し、そして
   該第二の鳥受精卵を孵化成長させることを特徴とする、
   トランスジェニック鳥類の作製法。
2. トランスジェニック鳥類が、生殖系列トランスジェニック鳥である、請求項１記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
3. 始原生殖細胞の取得が、第一の鳥受精卵の孵卵開始から４０時間以降６０時間までに行われることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
4. 始原生殖細胞の第二の鳥受精卵初期胚への移植が、第二の鳥受精卵の孵卵開始から２４時間以降７２時間までに行われることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
5. 始原生殖細胞の第二の鳥受精卵初期胚への移植が、第二の鳥受精卵の孵卵開始から４８時間以降６４時間までに行われることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
6. 第一の鳥の系統と第二の鳥の系統とが異なることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
7. 第一の鳥の系統がニワトリ白色レグホンであり、かつ、第二の鳥の系統がニワトリ横斑プリマスロックであることを特徴とする、請求項６記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
8. 請求項１記載の作製法にしたがってトランスジェニック鳥類を作製し、
   得られたトランスジェニック鳥類を、野生型又は他のトランスジェニック鳥類と交配させることを特徴とするトランスジェニック鳥類の子孫の作製法。
9. トランスジェニック鳥類の子孫が完全体トランスジェニック鳥類である、請求項８記載のトランスジェニック鳥類の子孫の作製法。
10. 請求項１記載の作製法にしたがってトランスジェニック鳥類を作製し、そしてその体細胞、体液又は卵から異種蛋白質を抽出することを特徴とする、異種蛋白質の生産法。
11. 請求項８または９記載の作製法にしたがってトランスジェニック鳥類の子孫を作製し、そしてその体細胞、体液又は卵から異種蛋白質を抽出することを特徴とする、異種蛋白質の生産法。
12. 鳥始原生殖細胞に、１×１０^７ｃｆｕ／ｍＬ以上、１×１０^１０ｃｆｕ／ｍＬ以下のタイターをもつモロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルスに由来するレトロウイルスベクターを体外で感染させることを特徴とする、異種遺伝子が導入された生殖細胞の生産方法。
13. 鳥始原生殖細胞が、孵卵開始から４０時間以降６０時間までの鳥受精卵の初期胚から取得されたものであることを特徴とする、請求項１２記載の始原生殖細胞の生産方法。
14. 請求項１記載の作製法にしたがってトランスジェニック鳥を作製することを特徴とする、畜産用または愛玩用の鳥類の品種を改良する方法。