JPWO2005065450A1 - 遺伝子導入鳥類及びその作製法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、
b)孵化によりG0トランスジェニックキメラ鳥類を得、
c)該G0トランスジェニックキメラ鳥類を、該G0トランスジェニックキメラ鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配することにより、G1トランスジェニック鳥類として得られる。
つまり、本発明は、また、G1トランスジェニック鳥類を、G0トランスジェニック鳥類、該G1トランスジェニック鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配することにより得られる、G2トランスジェニック鳥類又はその子孫であることを特徴とするトランスジェニック鳥類である。
a)目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、
b)孵化によりG0トランスジェニックキメラ鳥類を得、
c)該G0トランスジェニックキメラ鳥類を、該G0トランスジェニックキメラ鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配することよりなるG1トランスジェニック鳥類の作製法である。
本発明は、また、上述の方法で作製されたトランスジェニック鳥類である。
この方法により作製されたトランスジェニック鳥類は、医薬品等に利用可能なタンパク質の生産に利用できる。
本発明のG1トランスジェニック鳥類及び/又はその子孫は、複製能欠失型レトロウイルスベクターによって外来遺伝子が導入された鳥類であって、外来遺伝子をその体細胞に均等に含有し、その導入遺伝子に由来する目的タンパク質を、血中、卵白中あるいは卵黄中に安定に発現することを特徴とする。
なお本発明の作製法において、「レトロウイルスに由来しない遺伝子」としては、上述した構造遺伝子、プロモーター遺伝子、分泌シグナル遺伝子等が挙げられる。
上記レトロウイルスに由来しない遺伝子は、ニワトリβ−アクチンプロモーターにより制御されている遺伝子であることが好ましい。また、上記レトロウイルスに由来しない遺伝子は、抗体をコードする遺伝子であることが好ましい。
また、G1トランスジェニック鳥類、G2トランスジェニック鳥類やその子孫のオスの精子を採取し、同様にして精子中の遺伝子を検定する生殖系列キメラの選別法もまた本発明の1つである。
scFv−Fc抗体発現ベクターコンストラクトは、以下のように作製した。
このように作製した複製能欠失型レトロウイルスベクターのベクターコンストラクトpMSCV/GΔAscFv−Fcの構造を図1に示した。
実施例1で作製したベクターコンストラクトpMSCV/GΔAscFv−Fcよりレトロウイルスベクターを調製するため、パッケージング細胞GP293(クロンテック社製)を直径100mmの培養ディッシュに5×106細胞植え、培養した。培地を新鮮なDMEM(ダルベッコ変法イーグル培地)に交換し、pVSV−Gベクター(クロンテック社製)8μgとpMSCV/GΔAscFv−Fc8μgをリポフェクション法により前記GP293細胞に導入した。48時間後、ウイルス粒子を含む培養上清を回収し、0.45μm酢酸セルロースフィルター(アドバンテック社製)を通して夾雑物を除去した。得られた溶液にポリブレン(シグマ社製)を10μg/mlとなるように加えウイルス液とした。
ウイルスタイター=細胞数×希釈率×発現割合(cfu/ml)
ニワトリ受精卵(日本生物化学研究所)を使用した。この受精卵を自動転卵装置が内蔵された孵卵器(昭和フランキ社製P−008型)内で37.9℃、湿度65%環境に置いた時刻を孵卵開始時刻(0時間)とし、以後15分毎に90度転卵しながら孵卵を行った。
実施例3により誕生したG0トランスジェニックキメラニワトリを飼育して雛を成長させた。一週間後、成長した雄性雛(個体識別番号#1111、#3108、#4102)の翼下静脈より採血を行い、血液サンプルを得た。得られた血液を15,000rpmで10分間遠心し、上清として得られる血清からscFv−Fc抗体量の測定を行った。
標準検量線作製のための標準抗体(コスモバイオ社製)は、50%卵黄−PBS(W/V)で希釈した。
実施例3で誕生した3羽(個体識別番号#1111、#3108、#4102)の雄性G0トランスジェニックキメラニワトリ雛を飼育成長させ、性成熟を待った。6ヵ月後、生育した雄性トランスジェニックキメラニワトリから、腹部マッサージ法により0.2mLの精子を採取した。
実施例5により、精子中に導入遺伝子を検出した雄性G0トランスジェニックキメラニワトリ(#4102)を3羽の野生型メス(白色レグホン)と交配し、有精卵を得た。
実施例6により作製され、血液より抽出したゲノム中に導入遺伝子が確認されたG1個体のうち1羽が偶発的に死亡したため、胃、肝臓、腎臓、腸、筋肉を摘出して実施例6の方法によりゲノムを抽出し、PCR法により導入遺伝子を確認した(図2)。
実施例6により孵化した77番目のニワトリ雛は、実施例6のPCR法による検定により、G1トランスジェニックニワトリ(メス)であることがわかった。このG1の個体番号を#77とする。同様に103番目の雛もPCR法により、G1トランスジェニックニワトリ(オス)だった(個体番号#103)。
このようにして解析した#77と#103のFISH解析結果を、図3に示す。このFISH解析結果から、#77個体はマイクロ染色体に2個の導入遺伝子が挿入されたG1であり、#103は第3染色体長腕部に導入遺伝子が1コピー挿入されたG1トランスジェニックニワトリであることがわかった。
実施例8のG1#77個体(メス)を野生型オス(白色レグホン)、#103個体(オス)を野生型メス(白色レグホン)とそれぞれ交配し、有精卵を取得・孵化させた。この雛の血漿から実施例5の方法によりゲノム抽出し、PCR法で導入遺伝子の有無を解析してG2トランスジェニックニワトリであるかどうか検定した。
同様にG1#103と野生型の交配によって生まれた雛を、PCR法により検定した。#103は導入遺伝子を1コピーもつG1であるため、G2は1/2の確率で出現することが予測される。実際の検定結果は43羽中22羽がG2トランスジェニックであり、本発明により作製されたトランスジェニックG1ニワトリからは、確率的に期待できる通りのG2が誕生することがわかった。
[図2]G1トランスジェニックニワトリの各臓器からの抽出ゲノム中の導入遺伝子のPCR解析結果を示す。Mはマーカー、C1は陽性コントロール、C2は陰性コントロールを示す。L、K、H、MU及びIはそれぞれ肝臓、腎臓、心臓、筋肉、腸を示す。GFPはグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子を示し、OVAはオボアルブミン遺伝子を示す。
[図3]G1トランスジェニックニワトリ#77、#103のFISH解析結果を示す。矢印は導入遺伝子(pMSCV/scFv−FcΔBamH1)を示す。
Claims (30)
- 鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に、
a)目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、
b)孵化によりG0トランスジェニックキメラ鳥類を得、
c)該G0トランスジェニックキメラ鳥類を、該G0トランスジェニックキメラ鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配することにより得られる、
G1トランスジェニック鳥類又はその子孫であることを特徴とするトランスジェニック鳥類。 - 初期胚が、孵卵開始から24時間以降のものである請求項1に記載のトランスジェニック鳥類。
- 初期胚が、孵卵開始から48時間以降のものである請求項2に記載のトランスジェニック鳥類。
- 目的タンパク質が、抗体である請求項1〜3のいずれか1項記載のトランスジェニック鳥類。
- 鳥類が、ニワトリ又はウズラである請求項1〜4のいずれか1項記載のトランスジェニック鳥類。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載のG1トランスジェニック鳥類を、G0トランスジェニック鳥類、該G1トランスジェニック鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配することにより得られる、G2トランスジェニック鳥類又はその子孫であることを特徴とするトランスジェニック鳥類。
- 鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に、
a)目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、
b)孵化によりG0トランスジェニックキメラ鳥類を得、
c)該G0トランスジェニックキメラ鳥類を、該G0トランスジェニックキメラ鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配することよりなるG1トランスジェニック鳥類の作製法 - 初期胚が、孵卵開始から24時間以降のものである請求項7に記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
- 初期胚が、孵卵開始から48時間以降のものである請求項8に記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
- 目的タンパク質が、抗体である請求項7〜9のいずれか1項記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
- 鳥類が、ニワトリ又はウズラである請求項7〜10のいずれか1項記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
- 1×107cfu/mL以上のタイターをもつ複製能欠失型レトロウイルスベクターをインジェクションすることを特徴とする請求項7〜11のいずれか1項記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
- 1×109cfu/mL以上のタイターをもつ複製能欠失型レトロウイルスベクターをインジェクションすることを特徴とする請求項12記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載のG1トランスジェニック鳥類を、G0トランスジェニック鳥類、該G1トランスジェニック鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配することにより、G2トランスジェニック鳥類又はその子孫を作製することを特徴とするトランスジェニック鳥類の作製法。
- 請求項7〜14のいずれか1項記載の方法で作製されたトランスジェニック鳥類の体細胞、血液又は卵から目的タンパク質を抽出することよりなるタンパク質の生産法。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載のトランスジェニック鳥類の精子を採取し、該精子中の遺伝子を検定することよりなる生殖系列トランスジェニックキメラ鳥類の選別法。
- 複製能欠失型レトロウイルスベクターがモロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス由来ベクターであることを特徴とする請求項7〜14のいずれか1項記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
- 複製能欠失型レトロウイルスベクターがVSV−Gシュードタイプであることを特徴とする請求項7〜14のいずれか1項記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
- レトロウイルスに由来しない遺伝子が複製能欠失型レトロウイルスベクターに含有されている請求項7〜14、17及び18のいずれか1項記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
- レトロウイルスに由来しない遺伝子は、ニワトリβ−アクチンプロモーターにより制御されている遺伝子である請求項19記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
- レトロウイルスに由来しない遺伝子は、抗体をコードする遺伝子である請求項19又は20記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
- 抗体がキメラ抗体である請求項21記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
- キメラ抗体がscFv−Fc抗体である請求項22記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
- 請求項7〜14及び17〜23のいずれか1項記載の方法で作製されたトランスジェニック鳥類。
- 目的タンパク質を1mg/100g以上含有することを特徴とする、請求項24記載のトランスジェニック鳥類が産んだ卵。
- 目的タンパク質を20mg/100g以上含有することを特徴とする、請求項24記載のトランスジェニック鳥類が産んだ卵。
- 目的タンパク質を100mg/100g以上含有することを特徴とする、請求項24記載のトランスジェニック鳥類が産んだ卵。
- 鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に、目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、孵化することにより得られた雄性G0トランスジェニック鳥類の、精子中の目的タンパク質をコードする遺伝子を確認することによる生殖系列トランスジェニックキメラ鳥類の選別法。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載のトランスジェニック鳥類の血中における、目的タンパク質の発現を確認することによる、トランスジェニック鳥類の選別法。
- 鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に、目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、孵化することにより得られたG0トランスジェニック鳥類の血中における、目的タンパク質の発現を確認することによる、G0トランスジェニックキメラ鳥類の選別法。
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