JP2001520009A - 鳥の導入遺伝子についてのマグナム特異的プロモーターを含むベクター - Google Patents
鳥の導入遺伝子についてのマグナム特異的プロモーターを含むベクターInfo
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Abstract
Description
物質の発現のためのベクターおよび方法に関する。また、本発明は、ニワトリを
含むトランスジェニック鳥類および外因性タンパク質を含有する鳥の卵に関する
。
他の多くのタンパク質が開発中または臨床試験中である。タンパク質製造の最近
の方法は、天然由来の物からの単離、および細菌および哺乳動物の細胞中での組
換え製造を包含する。しかし、これらのタンパク質製造方法が複雑でかつ高いコ
ストであるために、別法を開発するための努力が続いている。例えば、ブタ、ヒ
ツジ、ヤギおよびウシのミルク中の外来タンパク質を製造するための方法が報告
されている。これらの手法は幾つかの制限を受ける。それは、起源物[ファウン ダー(founder)]と生成トランスジェニック群との間の長い世代時間、高価な育
種および家畜コスト、およびゲノム中の導入遺伝子挿入部位での位置効果のため
に変化する発現レベルなどである。また、タンパク質は、小麦およびライ麦から
製粉および麦芽製造過程を使用して製造される。しかし、植物の翻訳後修飾は、
脊椎動物の翻訳後修飾とは異なる。後者は、外来タンパク質の機能にしばしば重
大な影響を与える。
オリアクターとして役に立つ。高レベルの外来タンパク質が卵の中に分泌され、
含まれるような鳥遺伝物質を修飾するすばらしい方法は、安価な大量のタンパク
質の生成をもたらすであろう。そのような手法の幾つかの利点は、a)短い世代 時間(24週間)および人工受精によるトランスジェニック群の急速な確立;b
)生成のニーズに見合う群サイズを増加させることによる簡単に評価される生成
;c)発現したタンパク質の翻訳後の修飾;4)オートメーション化された給餌
および卵の収集;d)自然に無菌である卵白;e)卵白中のタンパク質の高濃度 によって低下した加工コストとなろう。
る際に、卵黄に分泌される幾つかの層から成る。卵の生成は、雌鶏の卵巣中で大
きな卵黄の形成によって始まる。次いで、不受精卵母細胞は、卵黄嚢の一番上に
位置づけられる。排卵、または卵巣からの卵黄の放出によって、卵母細胞は、精
子が存在する場合に受精される卵管の漏斗状器官に移る。次いで、管状腺細胞と
繋がった卵管のマグナムに移動する。これらの細胞は、卵白アルブミン、リゾチ
ーム、オボムコイド、コンアルブミンおよびオボムチンを包含する卵白タンパク
質を、タンパク質が鳥の胚および卵黄上に貯蔵されるマグナムの内腔中に分泌す
る。
5kDのタンパク質をコードする[Beato,Cell 56:335-344(1989)]。卵白アルブ ミンは、最も豊富な卵白タンパク質であって、管状腺細胞によって生成される全
タンパク質の50%以上または大きい等級Aの卵あたり約4gのタンパク質を含
む(Gilbert,"Egg albumen and its formation " in Phtsiology and biochemis
try of the Domestic Fowl, Bell and Freeman,eds.,Academic Press, London,
New York, pp. 1291-1329)。該卵白アルブミン遺伝子および20kb以上の各 フランキング領域は、クローンされ、分析されている[Lai et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 75: 2205-2209(1978);Gannon et al.,Natur e278 :428-424(197
9);Roop et al., Cell 19:63-68(1980);and Royal et al., Nature 279:125-132
(1975)]。
、ステロイドホルモン、例えばエストロゲン、グルココルチコイド、プロゲステ
ロンに応答し、このホルモンは、未熟なヒヨコにおいて、管状腺細胞あたり約7
0,000卵白アルブミンmRNA転写物、および成熟した雌鶏において100,00
0卵白アルブミンmRNA転写物の蓄積を誘導する[Palmiter; J. Biol.Chem.248:82
60-8270(1973);Palmiter, Cell 4:189-197(1975)]。トランスフェクトした管状 腺細胞においてDNAse過敏分析およびプロモーター・レポーター遺伝子アッセイ は、卵白アルブミン遺伝子発現に必要とされる配列を含有するものとして7.4kb 領域を定義した。5'フランキング領域は、転写開始部位から‐0.25、‐0.8、‐
3.2および‐6.0kbに集まった4つのDNAseI‐過敏部位を含有する。これらの部 位は、それぞれHS‐I、‐II、‐IIIおよび‐IVとよばれる。これらの領域は、ク
ロマチン構造中における変化を反映し、卵管細胞中の卵白アルブミン遺伝子発現
と特異的に相関する[(Kaye et al., EMBO 3:1137-1144(1984)]。HS‐IIおよび ‐IIIの過敏は、エストロゲンによって誘導され、卵白アルブミン遺伝子発現の ホルモン誘導においてこれらの領域に対する役割を果たす。
nd Mcknight, Biochemistry 27:6550-6557(1988)]。HS‐Iは、負の応答配列(NR
E)と呼ばれる。これは、HS−Iが、ホルモンの非存在下では卵白アルブミン発現
を抑える幾つかの負の調節配列を有するからである[Haekers et al., Mol. Endo
.9:1113-1126(1995)]。タンパク質ファクターは、これらの配列を結合し、組織 特異的発現における役割を示唆する卵管核酸中で唯一見出される幾つかのファク
ターを包含する。HS−IIは、ステロイド依存性の応答エレメント(SDRE)と呼ば
れる。これは、HS‐IIが転写のステロイド誘導を開始するために必要とされるた
めである。HS‐IIは、Chirp-Iとして知られるタンパク質またはタンパク質複合 体を結合する。Chirp-I は、エストロゲンによって誘導され、シクロヘキサミド
(cyclohexamide)の存在下で、急速にターンオーバーする[Dean et al., Mol C
ell. Bio. 16:2015-2024(1996)]。管状腺細胞培養系を用いる実験は、NFKB様フ ァクターを含むステロイド依存型においてSDREを結合する別の一組のファクター
を定義している[Nordstrom et al., J.Biol. Chem. 268:13193-13202(1993); Sc
hweers and Sanders, J. Biol. Chem. 266: 10490-10497(1991)]。
中へ共トランスフェクションしたときに、エストロゲン誘導性を卵白アルブミン
近接プロモーターまたは異種プロモーターどちらかに与える。これらのデータは
、HS‐IIIが卵白アルブミン遺伝子の全体的な調節において、機能的な役割を果 たし得るということを示唆する。HS‐IVの機能は、機能的エストロゲン応答エレ
メントを含有しないこと以外あまり知られていない[Kato et al., Cell 68:731-
742(1992)]。
ることによる真核生物のゲノムを修飾することが、大いに注目されてきている。
ある真核生物細胞は、外因性真核生物のタンパク質生成のための、より優れた宿
主であることを証明し得る。また、あるタンパク質をコードする遺伝子の導入は
、経済的価値が増加し得る新規表現型の創造を与える。さらに、幾つかの遺伝的
に生じる疾患状態は、遺伝的欠陥のある細胞が、そうでなければ、生成すること
ができないタンパク質を発現させる外来遺伝子の導入によって治療され得る。最
終的に、遺伝物質の挿入または除去による動物ゲノムの修飾は、遺伝子機能の基
礎研究を支持し、疾患状態を治療するのに使用されまたは改良された動物の表現
型をもたらす遺伝子の導入を与える。
いる。第一番に、マウス、ブタ、ヤギ、ヒツジおよびウシを含む哺乳動物におい
て、導入遺伝子を受精卵の前核中にミクロ注入し、次いで、それを養母の子宮中
に置くと、その生殖細胞系において導入遺伝子を運ぶ起源動物を生じる。導入遺
伝子は、ある特定の細胞型に外来タンパク質を発現させる特異的調節配列をプロ
モーターに運ぶために設計される。導入遺伝子をゲノム中にランダムに挿入する
と、ゲノム中への導入遺伝子の挿入部位での位置効果は、導入遺伝子発現のレベ
ルの低下を不定に引き起こすことがある。また、この手法は、所望の細胞型にお
いて導入遺伝子の発現を指示するために必要な配列が定義され、導入遺伝子ベク
ター中に包含されるような、プロモーターの特徴を明らかにすることを要する[H
ogan et al. Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory
, NY(1988)]。
そこでは、選択できるマーカー遺伝子をはさむ標的遺伝子配列を保持する標的ベ
クターが胚幹細胞(ES)に導入される。相同組換えによって、標的ベクターは、
染色体遺伝子座で標的遺伝子配列を置換するかまたは標的遺伝子産物の発現を妨
げる内部配列中へ挿入される。適切に崩壊した遺伝子を保持するES細胞のクロー
ンが選択され、次いでキメラの起源動物を発生させる初期段階の胚盤胞中に注入
され、その幾つかの動物は生殖細胞系中に導入遺伝子を保持するようになる。導
入遺伝子が標的の遺伝子座の欠損を引き起こす場合において、導入遺伝子は、導
入遺伝子ベクターで生じた外来DNAで標的遺伝子座を置換する。外来DNAは、培養
物においてトランスフェクションされたES細胞を検出するために有用な選択性を
持つマーカーをコードするDNAからなり、加えて、欠損遺伝子の代わりに挿入さ れる外来タンパク質をコードするDNA配列を含有し、標的遺伝子プロモーターが 外来遺伝子の発現をおこすようになる。[U.S. Patent Nos. 5,464,764および5,4
87,992(M.P.Capecchi and K.R. Thomas)]。この手法には、ES細胞がヤギ、ウシ
、ヒツジおよびブタを含む多くの哺乳動物に利用できないという制限がある。さ
らに、この方法は、欠損遺伝子が生物体または細胞型の生存または適当な発生の
ために必要であるときは有用でない。
生殖細胞系形質転換ニワトリは、複製欠陥性レトロウイルスを新く生まれた卵に
おけるヒヨコ胞胚葉の副胚腔中に注入することによって発生させ得る[U.S. Pate
nt Number 5, 162,215; Bosselman et al., Science243:533-543(1989);Thorava
l et al., Transgenic Research 4:369-36(1995)]。外来遺伝子を保持するレト ロウイルス核酸は、胚細胞の染色体にランダムに挿入されトランスジェニック動
物を生み出し、その一部は、生殖細胞系において導入遺伝子を保持するようにな
る。レトロウイルスベクターは、DNAの大きな断片を宿すことは不可能であり、 この方法を使用して導入し得る外来遺伝子および外来調節配列の大きさおよび数
を制限する。さらに、この方法は、相同組換えによって遺伝子の標的導入または
欠損をさせない。挿入部位での位置効果を克服するため、融合遺伝子構築物の5
’および3’領域で挿入された隔離エレメントの使用が、報告されている[Chim
et al., Cell 74:504-514(1993)]。
をF1世代に伝える安定なトランスジェニック起源鳥を作る[Lave et al. Bio/Tec
hnology 12:60-63(1994)]。しかし、この方法は幾つかの欠点を持つ。受精卵を 収集するために雌鶏を殺さねばならず、トランスジェニック起源物のフラクショ
ンは少なく、注入卵について労働集約型の代用殻でのインビトロ培養を必要とす
る。
受容胚の副胚内腔中に導入される。トランスフェクトされたドナー細胞を、トラ
ンスジェニック胚を生じる受容胚中に導入すると、その中の幾つかは生殖系列導
入遺伝子を持つと考えられる。導入遺伝子は、非相同性組換えによってランダム
な染色体部位に挿入される。この方法は、所望の細胞型で導入遺伝子の直接的な
発現を必要とする配列が定義され、導入遺伝子ベクターに包含されるようなプロ
モーターの特徴を明確にすることを要する。しかし、トランスジェニック起源鳥
は、いまだこの方法によって生み出されていない。
る標的ベクターを用いた。しかし、これらの細胞が生殖系列に寄与し、このよう
にトランスジェニック胚を生み出し得るということは分かっていない。さらに、
この方法は、欠損遺伝子が生物体または細胞型の生存または適当な発生に対して
必要である場合に有用でない。
DNAを導入する方法に対する必要性があると思われる。鳥ゲノムの標的遺伝子の 必須でない部分に外来DNAを導入する方法を必要とする。標的遺伝子の調節配列 が、好ましくは標的遺伝子の機能を崩壊させずに外来遺伝子の発現を駆動するよ
うな方法である。また、鳥卵管内に組み込まれた導入遺伝子の発現を選択的にも
たらす能力が、望まれる。さらに、卵管内で外因性遺伝子を発現し、卵の中に発
現した外因性タンパク質を分泌する生殖系修飾のトランスジェニック鳥を創造す
る必要性がある。
ド配列を発現せしめて、所望のタンパク質をつくるかまたは鳥の表現型を変える
かする方法を提供する。本方法で有用なベクターも本発明で提供され、外因性タ
ンパク質を発現する鳥および外因性タンパク質を含有する鳥の卵が提供される。
つくる方法を提供する。特に、本発明は鳥卵管における外因性タンパク質の産生
方法を提供する。導入遺伝子が胞胚葉細胞に、好ましくは段階Xの近辺で、導入
されて、トランスジェニック鳥がつくられ、所望のタンパク質が卵管のマグナム
の管状腺で発現され、管腔中に分泌され、卵黄に保存される。このようにつくら
れたトランスジェニック鳥は、生殖系に導入遺伝子を保有する。こうして、外因
性遺伝子の鳥への移入が、外因性遺伝子の鳥胚細胞への人工的導入によって、お
よびメンデルのやり方で外因性遺伝子の鳥の子孫への安定的移入によってなすこ
とができる。
法は第1工程として、コード配列およびそのコード配列に操作可能的に連結した
プロモーターを含有するベクターを提供し、プロモーターによる核酸の発現が鳥
卵管のマグナムの管状腺でなされる。次いで、ベクターが鳥の胞胚葉細胞に導入
され、細胞は培養基または胚から新たに単離されるものであり、ベクター配列が
鳥のゲノム中にランダムに挿入される。最後に、卵管中で外因性タンパク質を発
現する成熟トランスジェニック鳥がトランスジェニック胞胚葉細胞から誘導され
る。外因性タンパク質を含有する鳥卵をつくるのにこの方法が用いられるのは、
管状腺細胞において、発現される外因性タンパク質が卵管腔に分泌され、卵黄に
保存されるときである。
トランスジェニック鳥をつくることは、胞胚葉細胞のDNAトランフェクトを行
い、次いでこの細胞を受容胚葉下の胚芽下空洞に注入してなされる。この方法で
使用されるベクターは、外因性コード配列と融合し、卵管の管状腺でのコード配
列の発現を指令するプロモーターを有する。
、胞胚葉細胞を、正当なレトロウイルスレクターの5’と3’のLTSの間の導
入遺伝子RNAを保持する複製欠損レトロウイルスまたは複製可能レトロウイル
スでもって形質導入することでなされる。例えば、1つの具体的態様において、
鳥白血症ウイルス(ALV)のレトロウイルスベクターが用いられるが、これは
、卵白アルブミン・プロモーター領域のセグメントの下流に挿入される外因性遺
伝子を含有する修飾pNLBフラスミドを含む。修飾レトロウイルスベクターの
RNA複写は、ウイルス粒子中に包括され、トランスジェニック鳥に成長する胞
胚葉を感染するのに用いられる。あるいは、レトロウイルス形質導入粒子をつく
るヘルパー細胞が胞胚葉に運ばれる。
ロモーターを含有する。この態様において、外因性コード配列の発現は卵管にお
いてのみ生じる。選択的に、この態様で用いられるプロモーターは卵白アルブミ
ンプロモーター領域のセグメントであり得る。本発明の1つの局面では、卵白ア
ルブミンプロモーターを切除すること、および/または卵白アルブミンプロモー
ターの重要な調節エレメントを縮めることが関与し、卵管マグナムの管状腺細胞
における高レベルの発現に要する配列を保持し、ベクター中に容易に組みこまれ
得るのに十分小さいものである。例えば、卵白アルブミンプロモーター領域のセ
グメントが用いられる。このセグメントは、卵白アルブミン遺伝子の5’フラン
キング領域を含む。卵白アルブミンプロモーター・セグメントの全長は、約0.
88kbから約7.4kbであり、好ましくは約0.88kbから約1.4kb
である。このセグメントは、好ましくは、卵白アルブミン遺伝子のステロイド依
存性調節エレメントと負調節エレメントとを含む。このセグメントはまた選択的
に、卵白アルブミン遺伝子の5’非翻訳領域(5’UTR)からの残基も含む。
配列に操作可能的に連結した構成プロモーターを含有する。 構成プロモーターが卵管中で発現されるべき外因性コード配列に操作可能的に
連結していると、本発明方法は、第2コード配列およびその第2コード配列に操
作可能的に連結したマグナム特異的プロモーターを含有する第2ベクターも所望
により提供する。この第2ベクターも成熟トランスジェニック鳥の管状腺細胞で
発現される。この態様において、マグナム中の第1コード配列の発現は、第2ベ
クターにより発現されるタンパク質の細胞中の存在に直接的または間接的に依存
している。このような方法は所望によりCre−loxP系の使用を含む。
体部位への相同的組換えによりなされる。外因性プロモーター欠損ミニ遺伝子が
標的部位すなわち内因性遺伝子に挿入され、ついでこの遺伝子の調節配列が外因
性コード配列の発現を支配する。この技術すなわちプロモーター欠損ミニ遺伝子
挿入法(PMGI)は、卵管特異的発現を指示する標的遺伝子での使用に限定さ
れないので、適当な部位に挿入されると、いかなる臓器での発現にも用いること
ができる。卵での外因性タンパク質の産生を可能にするのに加え、プロモーター
欠損ミニ遺伝子挿入法は、家禽の生産および卵生産の産業に用いるのに適してい
る。そこでは、遺伝子挿入によって鳥の重要な特性が高まる。脂のない肉、疾病
抵抗性、環境適応、低コレステロール卵などである。
ミニ遺伝子の挿入に使用される標的ベクターを提供する。このベクターは、コー
ド配列、少なくとも1つのマーカー遺伝子および標的核酸配列を含んでいる。マ
ーカー遺伝子は、Xenopus laevis ef−1αプロモーター、HSVtkプロ
モーター、CMVプロモーターおよびβアクチンプロモーターなどの構成プロモ
ーターに連結し、標的ベクターを統合した細胞を同定するのに用いられる。標的
核酸配列は、標的遺伝子における挿入点をはさむ配列に相当し、標的ベクターの
標的遺伝子への挿入を指令する。
る。この方法は、プロモーター欠損ミニ遺伝子を含有する標的ベクターを提供す
ることを含む。標的ベクターは、特殊な細胞で発現される内因性遺伝子を鳥の胞
胚葉細胞中で標的とするように設計される。トランスジェニック胞胚葉細胞は、
次いで受容胞胚葉下の胚芽下空胞に注入されるか、鳥の胞胚葉細胞中に導入され
る。標的ベクターが標的内因性遺伝子中に組込まれる。次いで、得た鳥が、所望
の鳥細胞中の標的遺伝子の調節エレメントの制御下に、外因性コード配列を発現
する。この方法の利用によってまた、成熟トランスジェニック鳥が最終的にトラ
ンスジェニック胞胚葉細胞から誘導されると、外因性タンパク質を含有する鳥卵
が生産される。トランスジェニック鳥において、コード配列が標的遺伝子の調節
配列の制御下にマグナムにおいて発現され、外因性タンパク質が卵管腔中に分泌
され、外因性タンパク質がその鳥の卵黄に保存される。
される遺伝子である。管状腺での選択的発現に好ましい標的内因性遺伝子は、卵
白アルブミン遺伝子(OV遺伝子)である。まず本発明の例には、標的内因性遺
伝子としての卵白アルブミン遺伝子の使用があるが、他の適当な内因性遺伝子も
使用される。例えば、コンアルブミン、オボムコイド、オボムチンおよびリゾチ
ームがすべて、本発明において鳥卵管の管状腺細胞における外因性タンパク質の
発現のための標的遺伝子として用いられる。
5’非翻訳域にある。あるいは、挿入に使用される標的ベクターがコード配列の
直接上流に内部リボソーム挿入エレメントを含有すると、挿入点は標的遺伝子の
3’非翻訳域であり得る。
。本発明を用いて、卵管中での外因性タンパク質の発現、タンパク質の卵管マグ
ナムの管腔への分泌、鳥卵黄への定着が可能となる。卵中に包含されたタンパク
質は1卵につき1g以上の量で存在する。
る。この鳥は生殖系の遺伝子物質中に導入遺伝子を保持する。1つの態様におい
て、導入遺伝子は、選択的にマグナム特異的であるプロモーターに操作可能的に
連結した外因性遺伝子を含む。このトランスジェニック鳥において外因性遺伝子
は卵管の管状腺細胞で発現される。他の態様において、導入遺伝子は代りに、内
因性遺伝子の5’非翻訳域または3’非翻訳域のいずれかに位置する外因性遺伝
子を含み、内因性遺伝子の調節配列が外因性遺伝子の発現を指令する。この態様
において、内因性遺伝子は、選択的に卵白アルブミン、リゾチーム、コンアルブ
ミン、オボムコイドまたはオボムチンである。
配列、外因性タンパク質Xをコードする遺伝子Xを含む卵白アルブミンプロモー
ター発現ベクターを表示する。
ター・セグメント、コード配列、外因性タンパク質Xをコードする遺伝子Xを含
む本発明のレトロウイルスベクターを表示する。 図2(e)は、2(a)および2(b)のベクター中への挿入のため外因性遺
伝子を増幅する方法を表示する。 図2(f)は、コード配列遺伝子X、の発現を制御する卵白アルブミンプロモ
ーター、第2コード配列、遺伝子Yの発現をなす内部リボソーム挿入部位(IR
ES)エレメントを含むレトロウイルスベクターを表示する。
CMV−BL夫々の模式図を示す。ベクターはニワトリゲノム中に組込まれてい
るのが表れるように示す。
ーゼ量についてβ−ラクタマーゼ活性アッセイにより測定した結果を示す。
ーゼの存在を表わすウエスタンブロットを示す。
する。図6(a)では、模式的creおよびβ−ラクタマーゼ導入遺伝子が非マ
グナム細胞中の雌鶏のゲノム中に統合されている。図6(b)では、模式的cr
eリコンビナーゼおよびβ−ラクタマーゼ導入遺伝子がマグナム中の雌鶏のゲノ
ム中に統合されている。
示する。ここでは、第1コドン(ATG)を有し停止コドン(TAA)をフレー
ム中ではさむ2つのloxP部位が、シグナルペプチドが崩壊されないようにβ
−ラクタマーゼシグナルペプチドコード配列中に挿入される。
伝子に挿入するのに用いられた標的ベクターを表示する。
挿入を検出するための標的ベクターを示す。
るものである。
真核mRNA、cDNA、ゲノムDNA、合成DNAおよびRNA配列であって
、天然のヌクレオチド塩基のアデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウ
ラシルを含む。この用語は1以上の修飾塩基を有する配列も含む。
配列の制御下に置かれたときに、インビトロまたはインビボでポリペプタイドへ
転写と翻訳(DNAの場合)または翻訳(mRNAの場合)され得るポリヌクレ
オチドまたは核酸配列を意味する。コード配列の境界は、5’(アミノ)末端の
開始コドンおよび3’(カルボキシ)末端の停止コドンにより決定される。転写
終末配列はコード配列の3’に通常は位置している。コード配列は5’および/
または3’末で非翻訳域によってはさまれている。
トロンすなわち介在配列が除去された後に、細胞質mRNA中で「発現」される
遺伝子部分を意味する。
プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終了配
列、上流調節ドメイン、エンハンサーなどの、一定の宿主細胞において所望のコ
ード配列を転写および翻訳するのに必要かつ十分なものを云う。真核細胞に適し
た制御配列の例としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハ
ンサーがある。これらの制御配列のすべてが組換えベクター中に存在しなければ
ならない必要性はない。所望の遺伝子の転写および翻訳がなされるのに必要かつ
十分な配列が存在しておればよい。
ード配列および制御配列が配置されることを意味する。こうして、コード配列に
操作可能的に連結した制御配列はコード配列の発現を行うことができる。コード
配列が転写調節領域に連結するか、または転写調節領域の制御下にあるときは、
DNAポリメラーゼが、プロモーター配列に結合し、コードタンパク質に翻訳さ
れ得るmRNAにコード配列を転写する。制御配列は、コード配列の発現を指令
する機能を発揮する限り必ずしもコード配列に隣接している必要はない。このよ
うに、例えば、介在非翻訳で転写されていない配列がプロモーター配列とコード
配列との間に存在することができ、このプロモーター配列はコード配列に「操作
可能的に連結した」となお考えることができる。 用語「異種」および「外因性」は、コード配列および制御配列などの核酸配列
に関し、組換え構成体の領域には通常関連しないか、および/または特定の細胞
に通常関連しない配列を意味する。従って核酸構成体の「異種」領域は、天然に
は他の分子と関連して見出されない他の核酸分子内にあるか、またはその分子に
接着している核酸の同定可能なセグメントである。例えば、構成体の異種領域は
、天然のコード配列に関連して見出されない配列によってはさまれたコード配列
を含み得る。異種コード配列の他の例は、コード配列自体が天然には見られない
構成体である(例えば、生来の遺伝子と異なるコドンを有する合成配列である)
。同様に、宿主細胞に通常は存在しない構成体で形質転換された宿主細胞があれ
ば、本発明の目的について異種と考えられる。「外因性遺伝子」または「外因性
コード配列」は、特定の組織または細胞に天然には存在しない核酸を意味する。
する。 「内因性遺伝子」は、特定の細胞に通常関連する自然発生の遺伝子およびその
断片を意味する。
なる。しかし、厳密な構造は、多くの因子、特にタンパク質に共通の化学的修飾
に依存する。例えば、すべてのタンパク質がイオン性のアミノおよびカルボキシ
ル基を含有しているので、タンパク質は酸性塩または塩基性塩の形、あるいは中
性の形で得ることがある。第1級アミノ酸配列は、糖分子(ブリコシル化)を用
いる誘導または他の化学的誘導でつくられる。この誘導は、例えば脂質、リン酸
塩、アセチル基などと共有結合またはイオン結合でなされ、しばしばサッカライ
ドとの結合を介して起きる。これらの修飾は、インビトロまたはインビボで起き
、後者は翻訳後の系を介して宿主細胞によってなされる。このような修飾は分子
の生物活性を増加または減少する。これらの化学的に修飾された分子も本発明の
範囲にある。
。代表的な方法は、Sambrook, Fritsch,Maniatis; Molecular Cloning,a Labo
ratory Manual, 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)に開示されて いる。
欠く遺伝子が相同組換えを介して標的遺伝子に挿入され、標的遺伝子の調節配列
が適当な組織における挿入遺伝子の発現を支配するようにする方法である。ミニ
遺伝子は、遺伝子の修飾体であって、しばしば適当なポリアデニル化シグナルを
有するcDNAであり、時に1つのイントロンである。ミニ遺伝子はゲノム遺伝
子のすべてのイントロンを通常は欠失している。
Aからなるポリヌクレオチドを意味する。典型的なベクターは、機能的遺伝子の
発現ができるように適当な距離で操作可能的に連結した下記のエレメントを含む
。複製源、プロモーター、エンハンサー、5’mRNAリーダー配列、リポソー
ム結合部位、核酸カセット、終末およびポリアデニル化部位、選択可能マーカー
配列である。具体的な使用において1以上のこれらのエレメントを除外できる。
核酸カセットは、発現されるべき核酸配列の挿入のための制限部位を含むことが
ある。機能的ベクターにおいて、核酸カセットは、翻訳の開始および終了の部位
を含み、発現すべき核酸配列を含有する。イントロンは選択的に構成体に含まれ
、好ましくは>100bp5’のコード配列にある。
、または他の配列で置換される。これらの配列には、天然配列、合成配列、およ
び合成と天然の配列の組合せである配列が含まれる。多くの真核プロモーターは
2種の認識配列を含有する。すなわち、TATAboxと上流プロモーターエレ
メントである。前者は、転写開始部位の局在上流にあり、RNAポリメラーゼを
指令して、正しい部位で転写を開始する。一方、後者は、転写速度を決定し、T
ATAboxの上流である。エンハンサー・エレメントも連結プロモーターから
の転写を推進するが、多くは特定の細胞型でのみ機能する。ウイルスから誘導さ
れた多くのエンハンサー/プロモーター・エレメント、例えばSV40、Rous サルコーマ・ウイルス(RSV)およびCMVプロモーターは、広範な細胞型で
活性であり、「構成的」または「偏在的」である。クローニング部位に挿入され
た核酸配列は、所望のポリペプチドをコードするオープン・リーディング・フレ
ームを有すことができ、コード配列が所望のポリペプチドをコードしていると、
適当なmRNA分子の生産を遮断するか、および/または異常スプライスまたは
異常なmRNA分子を生産する潜在性スプライスを欠いている。
1つである。終了領域は、所望の意図する核酸配列に生来のものであるか、他の
源から誘導される。
局在するようになされる。制御配列に対するコード配列の位置および方向は、コ
ード配列が制御または調節の配列の「制御」下で転写されるようになされる。所
望の特定タンパク質をコードする配列の修飾は、この目的を達成するのに望まし
い。例えば、いくつかの場合には、配列の修飾が必要であって、適当な方向を有
する制御配列に結合するように、またはリーディング・フレームを保持するよう
になされる。制御配列および他の調節配列は、ベクターへの挿入前にコード配列
に結合される。あるいは、コード配列は発現ベクターに直接クローンされ得る。
このベクターは、制御配列と、その調節的制御下にリーディング・フレームにあ
る適当な制限部位とをすでに含有しているものである。
を可能にするタンパク質をコードする遺伝子である。適当なマーカーには、限定
ではないが、緑色、黄色、青色の蛍光タンパク質遺伝子(夫々、GFP、YFP
、BFP)がある。他の適当なマーカーには、チミジンキナーゼ(tk)、ジヒ
ドロフォレート・レダクターゼ(DHFR)、アミノグルコシド・ホスホトラン
スフェラーゼ(APH)遺伝子がある。後者は、カナマイシン、ネオマイシン、
ゲネティシンなどのアミノグルコシド抗生物質に対して抵抗性を持つ。このよう
な遺伝子および他のマーカー遺伝子、例えばクロラムフェニコール・アセチルト
ランスフェラーゼ(CAT)、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ(β−
gal)は、所望のタンパク質を発現する遺伝子と共に主要な核酸カセット中に
組み込まれるか、あるいは、選択マーカーが単離ベクターに含有されそして共に
トランスフェクトされ得る。
中の遺伝子の活性を「知らせる」マーカー遺伝子である。
のDNAまたはRNAを細胞中に導入し得る複製欠損ウイルスまたは複製可能ウ
イルスを意味する。 「形質転換」「形質導入」「トランスフェクション」はすべて、ポリヌクレオ
チドの鳥胚葉細胞への導入を意味する。
成し分泌する管状腺細胞を含有している。 本明細書で用いる「マグナム特異的プロモーター」とは、主にまたは専らマグ
ナムの管状腺細胞において活性であるプロモーターを意味する。
ジェニックのニワトリまたは他の鳥種がつくられる。これらの鳥は、生殖系列組
織の遺伝物質中に導入遺伝子を有する。胞胚葉細胞は、典型的に段階VII-XII 細胞またはそれと同等な段階であり、好ましくは段階Xに近いものである。本発
明に有用な細胞には、胚生殖(EG)細胞、胚幹(ES)細胞および始原生殖細胞( PGC)を含む。胞胚葉細胞は、新たに単離するか、培養中に維持されており、 胚内部に存在している。
れらベクターは、鳥のゲノム中に外因性コーディング配列の安定な導入に使用し
得る。他の態様では、ベクターは、鳥の具体的な組織、特に卵管中での外来性タ
ンパク質の産生に使用し得る。また更なる態様では、ベクターは、外来性タンパ
ク質を含む鳥の卵を作成する方法に使用する。
か培養中の胞胚葉細胞で行う。次いで、トランスジェニック細胞を、典型的には
、卵中の受容胞胚葉の胚下腔に注入する。しかし、ある場合では、ベクターを直
接、胞胚葉の胚の細胞に送達する。
ランダムに安定した組込みに使用するベクターは、コーディング配列およびマグ
ナム特異的プロモーターを含み、操作および位置の関係において、鳥の卵管のマ
グナムの管状腺細胞でコーディング配列を発現する。マグナム特異的プロモータ
ーは、所望により卵白アルブミンプロモーター領域のセグメントであり得るが、
管状腺細胞中のコーディング配列の発現を指示するのに十分な大きさである。
す。遺伝子Xは外来性タンパク質をコードするコーディング配列である。曲がっ
た矢印は、転写開始部位を示す。ある例では、ベクターは、5'隣接領域である 卵白アルブミン遺伝子、1.4kbを含む(図1(a))。図1(a)の「−1.4k
bプロモーター」の配列は、卵白アルブミン転写開始部位の約1.4kb上流( −1.4kb)から始まる配列に相当し、卵白アルブミン遺伝子の5'非翻訳領域
へ約9残基伸びている。約1.4kb長のセグメントには、2つの重要な調節エ
レメントがあり、ステロイド依存性調節エレメント(SDRE)および負調節エレ
メント(NRE)である。NREは、ホルモンのない条件下で遺伝子の発現を阻害
するためそう呼ばれている。短い0.88kbセグメントがまた、両方のエレメ
ントを含む。他方の例では、ベクターは、約7.4kbの5'隣接領域である卵 白アルブミン遺伝子を含み、更に2つのエレメント(HS-IIIおよびHS-IV)を
有し、その1つは、エストロゲンにより遺伝子誘導できる機能性領域が含まれる
ことが知られている(図1(b))。短い6kbセグメントにはまた、4つすべての
エレメントを含み、所望により本発明に使用され得る。
β-グロブリン配座由来の少なくとも1つの1.2kbエレメントが含まれる。 このエレメントは、ゲノムへの導入部位において活性化および不活性化の両方か
ら内部遺伝子を隔離するものである。好ましい態様では、2つの隔離エレメント
を、卵白アルブミン遺伝子構成の一方の端に加える。β-グロブリン配座におい て、隔離エレメントは、グロブリン遺伝子ドメインより上流の遺伝子を遠位配座
調節領域(LCR)が活性化するのを防ぎ、トランスジェニックのハエにおける位
置効果を克服する。以上のことは、このエレメントが挿入部位で正および負の両
方の効果を防止できることを示唆する。隔離エレメントは、遺伝子の5'または 3'末端の何れかにおいてのみ必要であり、それは、導入遺伝子が多数組込まれ 、一列に並んだ複製が近隣導入遺伝子の隔離の隣接する一連の遺伝子を効果的に
作成するからである。他の態様では、隔離エレメントはベクターと連結しないが
、ベクターで共トランスフェクトされる。この場合、ベクターおよびエレメント
を細胞中で、ゲノムへランダムに組込む方法により一列に並べて連結する。
ーが安定して組込まれた細胞クローンを同定および促進できる。マーカー遺伝子
の発現は、種々の細胞型で高レベルの発現をする偏在性プロモーターにより駆動
される。好ましい態様では、緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子(Zol
otukhin et al., J. Virol 70: 4646-4654 (1995))は、Xenopus伸張因子1-α( ef-1α)プロモーター(Johnson and Krieg, Gene 147:223-26 (1994))により 駆動される。Xenopus ef-1αプロモーターは、種々の細胞型で発現する強力 なプロモーターである。GFPは、蛍光の促進および人体に適応するための変異
を含むか、ヒト遺伝子のコドン用法プロフィールにコドンをマッチさせるために
修飾される。鳥のコドン用法は、事実上、ヒトのコドン用法と同じであり、人体
に適応した遺伝子型はまた、鳥の胞胚葉細胞において高発現する。他の態様では
、マーカー遺伝子を、操作可能的に、偏在性プロモーターであるHSV tk、 CMVまたはβ-アクチンの1つと連結させる。
導入遺伝子中のコーディング配列として使用する場合、非脊椎動物遺伝子配列は
、コドン用法がヒトおよび鳥のものに類似するように、修飾され、適当なコドン
に変換される。
得る。ベクターの細胞への導入は、細胞膜の通過促進を容易にするポリリシンま
たは陽イオン性脂質と核酸とを最初に混合することで進められる。しかし、ベク
ターの細胞への導入は、好ましくは、リポソームまたはウイルスのような送達伝
播体の使用より実施される。本発明のベクターを胞胚葉細胞への導入に使用し得
るウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘル
ペス単体ウイルスおよびワクシニアウイルスが含まれるが、これらに限らない。
イルスを基にしたベクターを、ベクターを鳥ゲノム中に組込むため、胞胚葉細胞
中へのベクターの送達に用いる。
ロウイルスを作成するヘルパー細胞が胞胚葉に送達され得る。
、複製欠損ALVレトロウイルスである。適当なALVレトロウイルスベクター
を作成するため、pNLBベクターを、レトロウイルスゲノムの5'と3'の長い
末端反復体(LTR)の間の卵白アルブミンプロモーターおよび1以上の外因性遺
伝子の領域に挿入することにより修飾する。卵白アルブミンプロモーターの下流
に位置する任意のコーディング配列が、高レベルで、卵管マグナムの管状腺細胞
中においてのみ発現する。卵白アルブミンプロモーターにより、高レベル発現の
卵白アルブミンタンパク質が駆動され、卵管管状腺細胞中のみで活性があるから
である。培養した卵管管状腺細胞中でアッセイするときに、7.4kb 卵白ア ルブミンプロモーターによる最も活性な構成体の作成が見られるが、卵白アルブ
ミンプロモーターは、レトロウイルスベクター中で使用するためには短くしなけ
ればならない。好ましい態様では、レトロウイルスベクターは、1.4kbセグ
メントである卵白アルブミンプロモーターを含む。0.88kbセグメントであ
っても十分である。
グ配列を所望により含み得、そのシグナルペプチドは卵管の管状腺細胞由来のベ
クターのコーディング配列が発現するタンパク質の分泌を指示する。本発明のこ
の態様により、本発明の方法を用い鳥の卵中に存在し得る外因性タンパク質のス
ペクトルが効果的に広げられる。仮に外因性タンパク質が分泌しない場合、コー
ディング配列を生ずるベクターは、リゾチーム遺伝子由来のシグナルペプチドを
コードする約60bpを含むDNA配列を含むよう修飾される。シグナルペプチ
ドをコードするDNA配列は、cDNAがコードするタンパク質のN末端に位置
するようにベクター中に挿入される。
oはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。曲がった矢印は、転
写開始部位を示す。図2(a)および2(b)は、LTRおよび卵管転写産物を示し
、リゾチームシグナルペプチド(LSP)をコードする配列を有する。その一方、
図2(c)および2(d)は、その配列を有しない転写産物を示す。レトロウイルス
ベクターストラテジーは2つある。真核性シグナルペプチドを含む何れかのタン
パク質は、図2(b)および2(d)に示すベクターにクローニングし得る。通常分
泌しない任意のタンパク質は、図2(a)および2(b)に示すベクター中にクロー
ニングすると、管状腺細胞から分泌し得る。
ニングするためのストラテジーを示す。ポリメラーゼ連鎖反応を使用し、コーデ
ィング配列、遺伝子Xの複製を増幅する。その増幅には、2つの酵素による消化
後の増幅遺伝子をプラスミドに挿入することができる制限酵素部位を含む一対の
オリゴヌクレオチドプライマーを用いる。5'および3'オリゴヌクレオチドには
、それぞれ、Bsu36IおよびXbaI制限酵素部位が含まれている。
入部位(IRES)の使用を含み、ジ-またはポリシストロン性mRNAから2以 上のタンパク質を翻訳することができる。IRES単位は、1以上の追加のコー
ディング配列の5'末端と融合し、次いで、ベクター中のオリジナルコーディン グ配列の末端に挿入されて、コーディング配列はIRESにより互いに分離され
る。本発明のこの態様によって、産物の翻訳後修飾が促進される。1つのコーデ
ィング配列が他のコーディング配列産物を修飾することができる酵素をコードし
得るからである。例えば、第一のコーディング配列は、第二のコーディング配列
によりコードされる酵素によりヒドロキシル化され、活性化されるコラーゲンを
コードし得る。
位(IRES)エレメントは、2つの外来性コーディング配列(遺伝子Xおよび遺 伝子Y)の間に位置する。IRESにより、タンパク質Xおよびタンパク質Yの 両方が、卵白アルブミンプロモーターにより指示される同一転写産物から翻訳さ
れ得る。曲がった矢印は、転写開始部位を示す。遺伝子Xによりコードされるタ
ンパク質の発現は、特異的に発現するが分泌しない場合、管状腺細胞中で最も高
くなると予想される。遺伝子Yによりコードされるタンパク質はまた、管状腺細
胞に特異的に発現するが、効率よく分泌するため、タンパク質Yが卵中にパッケ
ージされる。
ング配列により、生じたRNAを安定化する3'非翻訳領域(3'UTR)が提供さ
れる。3'UTRをレトロウイルスベクターに付加したとき、融合卵白アルブミ ンプロモーター、遺伝子Xおよび3'UTRの方向が、構成中逆向きでなければ ならない。それは、3'UTRの付加が全長ゲノムRNAの転写産物で妨げられ るためである。本発明の好ましい態様では、3'UTRは、卵白アルブミンもし くはリゾチーム遺伝子の非翻訳領域、あるいはマグナム細胞中で機能的であるな
んらかの3'UTR、即ちSV40後半領域である。
導入遺伝子のコーディング配列を発現する。この場合、発現はマグナムだけに限
られず、発現はまた鳥の他の組織内でも生ずる。しかし、このような導入遺伝子
の使用は、発現されるタンパク質がその鳥に非毒性でさえあれば、卵管における
タンパク質の発現および続く卵白中へのタンパク質の分泌を効果的にするのに適
当である。
白血病ウイルス(ALV)に基づくベクターpNLBの模式図を示す。pNLBベ
クターにおいて、殆どのALVゲノムはネオマイシン耐性遺伝子(Neo)および
β−ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子により置きかえられる。図3
(b)は、lacZがCMVプロモーターおよびβ−ラクタマーゼコード配列(β −LaまたはBL)により置換されているベクターpNLB−CMV−BLを示 す。ベクターの構築は、具体的例である下記実施例1に報告する。β−ラクタマ
ーゼは、CMVプロモーターから発現され、3'末端反復配列(LTR)にポリア デニル化シグナル(pA)を利用する。β−ラクタマーゼは、天然シグナルペプチ
ドである;従って、それは血液および卵白に発見される。
を含むことが判明した(具体的な例である下記実施例4および5参照)。
が、導入遺伝子は、導入遺伝子の発現が有効にマグナム特異的になるように操作
される。このように、本発明により提供される鳥卵管に外因性タンパク質を産生
させる方法は、その管状腺細胞に二つの導入遺伝子を担持するトランスジェニッ
ク鳥の産生を含む。一つの導入遺伝子は、構造プロモーターに操作可能に結合し
た第1コード配列を含む。第2の導入遺伝子は、マグナム特異的プロモーターに
操作可能的に結合した第2コード配列を含み、第1コード配列の発現が直接的ま
たは間接的に第2コード配列により発現されるタンパク質の細胞での存在に依存
している。
異的組換えシステムを、操作した構造プロモーターのマグナム特異的活性化の実
行に利用する。一つの態様において、第1の導入遺伝子はFRT結合遮断配列を
含み、それはFTP非存在下で第1コード配列の発現およびFTPをコードする
第2コード配列の発現を遮断する。他の態様において、第1導入遺伝子は、Cr
e酵素非存在下で第1コード配列の発現およびCreをコードする第2コード配
列の発現を遮断するloxP結合遮断配列を含む。loxP結合遮断配列は、第
1コード配列の5'非翻訳領域に位置し得、loxP結合配列は、所望によりオ ープン・リーディング・フレームを含み得る。
パク質のコード配列(CDS)にサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを結
合させることにより、構成導入遺伝子上に付与される(図6(a)および6(b))。
コード配列の5'非翻訳領域(UTR)はloxP結合遮断配列を含む。loxP 結合遮断配列は二つのloxP部位を含み、その間は停止コドンに続く開始コド
ン(ATG)であり、短いナンセンスオープン・リーディング・フレーム(ORF)
を創製する。loxP配列は二つの開始コドンを同じ配向で含むことは注目であ
る。従って、それらがloxP摘出後のコード配列の翻訳によって妨害されない
ために、loxP部位はATGが逆の鎖にあるように配向すべきである。
リーディング・フレーム(ORFの)発現を駆動する。リボザイムは、ORFの開
始コドンである第1ATGで開始し、そしてコード配列の開始コドンで翻訳を再
開始できずに終わる。コード配列が翻訳されないことを確実にするために、第1
ATGをコード配列ATGと共にフレームから外す。Cre酵素が、CMV−c
DNA導入遺伝子を含む細胞内で発現された場合、Cre酵素はloxP部位を
結合し直し、介在ORFを摘出する(図6(b))。ここで、翻訳はコード配列の開
始コドンから始まり、所望のタンパク質の合成をもたらす。
ド配列導入遺伝子と同じ細胞内で、マグナム特異的卵白アルブミンプロモーター
のような組織特異的プロモーターの制御下に発現させる(図6(b))。切断卵白ア
ルブミンプロモーターは実際に弱い可能性があるが、まだ組織特異的であり、有
効な介在ORFの摘出を誘導するのに十分な量のCre酵素を発現する。実際、
低レベルのリコンビナーゼは、翻訳装置のためのコード配列転写に対して競合し
ないため、組換えタンパク質の高い発現を可能にする。
ルおよび/またはスプライシングシグナルの挿入を含む。これらは、遮断ORF
と共にまたは単独で挿入できる。本発明の他の態様において、停止コドンはコー
ド配列のシグナルペプチドのloxP部位の間に挿入できる(図7参照)。リコン
ビナーゼが発現される前は、ペプチドはコード配列の前で停止する。リコンビナ
ーゼが発現された後(組織特異的プロモーターの支配の下)、停止コドンが摘出さ
れ、コード配列の翻訳が可能になる。loxP部位およびコード配列は、それら
がフレーム内であり、loxP停止コドンがフレームの外であるように並列され
る。シグナルペプチドが更なる配列を許容できるため(Brown et al., Mol. Gen.
Genet. 197:351-7 (1984))、loxPまたは他のリコンビナーゼ標的配列(即ち
、FRT)の挿入は、所望のコード配列の分泌を妨害しそうにない。図7に示す ベクターの発現において、loxP部位は、loxPによりコードされるアミノ
酸が成熟、分泌タンパク質に存在しないように、シグナルペプチド内に存在する
。Cre酵素が発現される前に、翻訳は停止コドンで停止し、β−ラクタマーゼ
の発現を防止する。リコンビナーゼが発現された後(マグナム細胞中のみで)、l
oxP部位は再結合し、第1停止コドンを摘出する。従って、β−ラクタマーゼ
は選択的にマグナム細胞内でのみ発現される。
遮断ORFは、またALV形質導入粒子および/またはトランスジェニック鳥の
産生に有用である遺伝子であり得る。一つの態様において、遮断ORFはマーカ
ー遺伝子である。
である。導入遺伝子がチキンゲノムに統合されたら、ネオマイシン耐性遺伝子は
必要が無くなり、摘出できる。
ーであるため、遮断ORFとして使用できる。(トランスジェニック鳥内のマー カーとしてのβ−ラクタマーゼの使用の具体的例は、下記実施例4参照)。実施 例として、図6(a)の遮断ORFはβ−ラクタマーゼにより置換され、下流コー
ド配列はここで分泌生物薬剤をコードする。β−ラクタマーゼは、血液および他
の組織に発現される;Creのマグナム特異的発現およびβ−ラクタマーゼの組
換え介在摘出の後、マグナムでは発現されず、所望のタンパク質の発現を可能に
する。
入遺伝子を介して挿入される。チキンゲノムへの安定な統合をもたらすトランス
ジェネシスの方法が適当である。卵白アルブミンプロモーターリコンビナーゼお
よびCMV−loxP−CDS導入遺伝子の両方が同時にチキンに挿入される。
しかし、トランスジェネシスの有効性は低く、従って、両方の導入遺伝子のチキ
ンゲノム内での獲得は同時に低い。別の好ましい方法において、一つの群れを、
マグナム特異的プロモーター/リコンビナーゼ導入遺伝子を担持するように産生
し、第2の群れを、CMV−loxP−CDS導入遺伝子を担持するように産生
する。群れを次いで互いに交配する。この異系交配から得られた雌鶏は、そのマ
グナム内のみにコード配列を発現する。
ト法において、標的ベクターを標的遺伝子内へのプロモーター欠損ミニ遺伝子挿
入(PMGI)に使用する。標的ベクターは、コード配列、構成プロモーターに操
作可能に結合した少なくとも一つのマーカー遺伝子、および所望の標的遺伝子内
の所望の挿入点にフランキングな配列と適合する標的核酸配列を含む。標的核酸
配列は、標的遺伝子への標的ベクターの挿入を支配する。マーカー遺伝子は、標
的ベクターを統合している細胞の同定を可能にする。
。例えば、標的遺伝子は卵白アルブミン、リソザイム、コンアルブミン、オボム
コイドおよびオボムチンからなる群から選択し得る。(リソザイム遺伝子は、卵 管細胞に加えてマクロファージで発現されるため、発現の卵管細胞のみへの限定
が望ましい場合、適当な標的遺伝子でないことに注意すべきである。)
子と共に使用する。 ベクターが支配する挿入点は、標的遺伝子の5'または3'非翻訳領域であり得
る。3'非翻訳領域が標的の場合、標的ベクターは、更に、ベクターのコード配 列の直ぐ上流に位置する内部リボソーム挿入部位エレメントを含む。
領域(UTR)へのPMGIの挿入を説明する。図8(a)に説明する態様において
、プロモーター欠損ミニ遺伝子(PMG)は、卵白アルブミン標的遺伝子の5'U TRに挿入される。外因性タンパク質および卵白アルブミンの両方をコードする
ジシストロン性mRNAは、矢印で示す転写開始部位から転写される。リボゾー
ムはジシストロン性mRNAの5'末端に結合し、外因性遺伝子を翻訳し、次い で卵白アルブミンコード領域の前で停止する。多シストロン性転写の卵白アルブ
ミン部分が翻訳されないことは注意する。従って、産生される卵白アルブミンの
レベルは、卵白アルブミン遺伝子の一つのコピーの翻訳が中断されるため、正常
レベルの約半分である。図8(b)に説明する態様において、PMGは3'UTR に挿入される。外因性遺伝子の翻訳は、リボゾームが結合し、下流コード領域を
翻訳するIRESエレメントの存在により開始される。
ーンおよび集団の同定および富化を可能にするマーカーを含む。適当な同定遺伝
子は、G418に対する耐性を付与されたタンパク質をコードするneo、また
は緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするGFPを含むが、これらに限定され
ない。好ましい態様において、GFP発現は均質に緑色の蛍光を発し、従って、
安定に統合された標的ベクターを含むクローンの同定に使用する。マーカー遺伝
子は、HSV tk、β−アクチン、CMV、またはef−1aのプロモーター
を含むが、これらに限定されない遍在プロモーターから発現される。現在好まし
い態様において、ef−1aプロモーターはGFPの発現を駆動する。
ベクターを提供し、それは上記の標的ベクターのエレメントを含むが、第2構成
プロモーターに操作可能に結合した第2マーカー遺伝子も含む。第2マーカー遺
伝子は標的ベクターの標的核酸配列の外側に位置し、標的遺伝子へのプロモータ
ー欠損ミニ遺伝子の挿入に際し、第2マーカー遺伝子は挿入されない。
パク質(BFP)およびGFPをコードするマーカー遺伝子の使用が含まれる(図 9)。この方法は、正−負の選択方法の変形であり(米国特許第5,464,764
号および同第5,487,992(Capecchiら))、この方法では、BFPを使用
して、プロモーターを欠くミニ遺伝子(PMG)が標的遺伝子に正しく挿入された
稀有細胞を同定する。BFP遺伝子を元の標的ベクターの3'末端に挿入する(図
9を参照)。標的ベクターおよび標的が相同的組換えを正しく受けている場合に は、GFP遺伝子のみを挿入する。そうすると、正しく挿入されたPMGを含む
コロニーは、緑色の蛍光を発する。これとは対照的に、大多数の細胞では、BF
P遺伝子が含まれる完全なベクターを、ゲノムにおけるランダムな位置に挿入す
る。ランダムな挿入が行われたコロニーは、GFPおよびBFPの存在により、
青色および緑色の蛍光を発する。
ニル化部位を含む3'UTRを有して、製造したRNAに安定性を与え得る。好 ましい態様において、3'UTRは、外因性遺伝子のものであり得るか、または 卵白アルブミン、リゾチーム、もしくはSV40後期領域よりなる群から選択さ
れ得る。しかしながら、PMGIベクターへの卵白アルブミン配列の付加は、適
切な標的化を妨げるであろうことから、卵白アルブミンの3'UTRは、内因性 卵白アルブミン遺伝子に挿入すべきPMGIベクターにおいて適当ではない。
産生を与える本発明の方法には、適当なベクターを与えて、ベクターが鳥ゲノム
に統合されるよう、ベクターを胚の胞胚葉細胞に導入した後に、さらなる段階が
含まれる。その後の段階には、先の段階で製造したトランスジェニック胞胚葉細
胞から、成熟したトランスジェニック鳥を誘導することが含まれる。成熟したト
ランスジェニック鳥を胞胚葉細胞から誘導することには、場合により、トランス
ジェニック胞胚葉細胞を胚に移入して、胚を十分に発達させることが含まれ、胚
の発達につれて、細胞が鳥に取り込まれるようになる。次いで、その結果得られ
たヒヨコを成熟するまで育てる。別の態様において、胞胚葉細胞を胚の内部にベ
クターで直接トランスフェクトするか、または導入する。その結果得られた胚を
発達させて、ヒヨコを成熟させる。
スジェニック鳥は、起源物として知られている。幾つかの起源物は、卵管のマグ
ナムにおける管状腺細胞に導入遺伝子を持つ。これらの鳥は、卵管において、導
入遺伝子によりコードされる外因性タンパク質を発現させる。外因性タンパク質
が適当なシグナル配列を含むと、卵管の管腔および卵の卵黄に分泌される。
織の遺伝物質中に導入遺伝子を持つ起源物であって、外因性タンパク質を発現さ
せる卵管マグナム管状腺細胞にも導入遺伝子を持ち得る。それゆえに、本発明に
従って、トランスジェニック鳥は、外因性タンパク質を発現させる管状腺細胞を
有することになり、トランスジェニック鳥の子孫もまた、外因性タンパク質を発
現させる卵管マグナム管状腺細胞を有する。(あるいはまた、子孫は、鳥の特定 組織における外因性遺伝子の発現により決定される表現型を発現させる。)
として使用されるタンパク質を含む広範囲な所望のタンパク質を、高収率かつ低
コストで発現させることができる。ヒト成長ホルモン、インターフェロンおよび
β−カゼインといったようなタンパク質は、本発明により、望ましくは卵管にお
いて発現し、卵に沈着するタンパク質の例である。製造することが可能な他のタ
ンパク質には、限定されるものではないが、アルブミン、α−1アンチトリプシ
ン、アンチトロンビンIII、コラーゲン、VIII、IX、X因子(等)、フィブリノー ゲン、ヒアルロン酸、インシュリン、ラクトフェリン、プロテインC、エリスロ
ポエチン(EPO)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球マクロファー
ジコロニー刺激因子(GM−CSF)、組織型プラスミノーゲン活性化因子(tPA
)、飼料添加酵素、ソマトトロピンおよびキモトリプシンが含まれる。ヒト腫瘍 細胞の表面抗原に結合して、それらを破壊する免疫毒素のような、遺伝的に操作
された抗体もまた、医薬品または診断藥としての使用のために発現させることが
できる。
を限定するものではない。
)であるpNLBのlacZ遺伝子を、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター 、およびリポーター遺伝子であるβ−ラクタマーゼ(β−LaまたはBL)よりな る発現カセットで置換した。pNLBおよびpNLB−CMV−BLベクターの構
成物を各々、図3(a)および3(b)に示す。
プラスミドとなるpNLBアダプターを最初に作成した。pNLBアダプターは、
pNLBのチュード・バック(chewed back)ApaI/ApaIフラグメント(Cosset
ら,J. Virol. 65:3388−94(1991))(pNLBにおいて、5'A
paIは、lacZの289bp上流にあり、そして3'ApaIは、3'LTRおよびGa
gセグメントの3'にある)をpBluescriptKS(−)のチュード・バックKpnI/ SacI部位に挿入することにより作成した。pCMV−BLのフィルド−イン(fi
lled-in)MluI/XbaIフラグメント(Mooreら,Anal. Biochem. 247:2
03−9(1997))をpNLBアダプターのチュード・バックKpnI/NdeI
部位に挿入し、lacZをCMVプロモーターおよびBL遺伝子(pNLBにおいて 、KpnIはlacZの67bp上流にあり、そしてNdeIはlacZ終止コドンの100
bp上流にある)で置換し、それによって、pNLBアダプターCMV−BLを作成
した。pNLB−CMV−BLを作成するために、pNLBのHindIII/BlpI挿
入断片(lacZを含む)をpNLBアダプターCMV−BLのHindIII/BlpI挿入
断片で置換した。pNLBのHindIII/BlpI部位への平滑断片フラグメントの 直接ライゲーションは、理由は解明されていないが、大部分が再配列サブクロー
ンを与えることから、この二段階クローニングが必要であった。
% ニワトリ血清(Gibco)、50μg/ml フレオマイシン(Cayla Laboratories
)、および50μg/ml ハイグロマイシン(Sigma)中で培養した。次のことを除 き、Cossetら,1993(この文献に記載されている内容は、本発明の一部を構
成する)に記載されているようにして、形質導入粒子を製造した。9×105 Se
ntasへのレトロウイルスベクターpNLB−CMV−BL(上の実施例1から得ら
れた)のトランスフェクションから2日後、ウイルスを新たな培地で6−16時 間収集して、濾過した。全ての培地を使用して、ポリブレンを最終濃度が4μg /mlとなるまで加えた100mmのプレート3枚に、3×106 Isoldesを導入し
た。翌日、培地を、50μg/ml フレオマイシン、50μg/ml ハイグロマイシ
ンおよび200μg/ml G418(Sigma)を含む培地で置換した。10−12日
後、単一G418rコロニーを単離して、24ウェルのプレートに移した。7− 10日後、Sentasの形質導入、続いて、G418選択により、各々のコロニー から得られる力価を測定した。典型的には、60コロニーのうち2つが力価を1
−3×105で与えた。それらのコロニーを広げ、Allioliら,Dev. Biol. 1
65:30−7(1994)(この文献に記載されている内容は、本発明の一部 を構成する)に記載されているようにして、ウイルスを2−7×107まで濃縮し
た。NLB−CMV−BL形質導入粒子で導入した細胞の培地中でβ−ラクタマ
ーゼをアッセイすることにより、CMV−BL発現カセットの完全性を確かめた
。
覆うことを除き、Thoravalら,Transgenic Res. 4:369−377(19 95)(この文献に記載されている内容は、本発明の一部を構成する)に記載され
ているようにして、新たに産まれた卵における第X期の胚をNLB−CMV−B
L形質導入粒子(上の実施例2から得られた)で導入した。
0のWhite Leghornsを製造した。これらの鳥は、キメラ起源物であって、完全
にトランスジェニック鳥となるわけではない。形質導入したニワトリから得られ
る血液および精液中の大規模なDNA分析は、いずれの与えられた組織において
も、僅か10−20%しか検出可能なレベルの導入遺伝子を有していないことを
示す。それらの鳥のうち、実際には、いずれの与えられた組織における細胞の僅
か2−15%しかトランスジェニックではなかった。
クタマーゼの存在に関してアッセイした。次の変更を伴い、Mooreら,Anal. Biochem. 247:203−9(1997)(この文献に記載されている内容は 、本発明の一部を構成する)に記載されているようにして、β−ラクタマーゼア ッセイを行った。
スで刺した。血液50μlをヘパリン添加した毛細管(Fisher)に集め、このうち
25μlを96ウェルのプレート中のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)100μlに
移した。精製β−ラクタマーゼ(Calbiochem)の様々な希釈溶液を幾つかのウェ ルに加えた後、対照の(形質導入していない)ヒヨコから得られた血液を加えて、
β−ラクタマーゼ標準曲線を確立した。4℃で1日後、プレートを730×gで
10分間遠心分離した。上澄み25μlをPBS75μlに加えた。PBS中の2
0μM 7−(チエニル−2−アセトアミド)−3−[2−(4−N,N−ジメチルア
ミノフェニルアゾ)ピリジニウムメチル]−3−セフェム−4−カルボン酸(PA DAC、Calbiochem社製)100μlを加えて、ウェルを560nmで10分の動 態学的読み取りにてプレート読み取り装置で直ちに読み取り、または暗所に室温
で一晩放置した。ウェルが紫色から黄色に変わったら、ウェルを陽性と記録した
。もう少し成長した鳥から得られる血液をアッセイするために、ヘパリン(Sigm
a)50μlを注入した注射器を使用して、血液200−300μlを羽の静脈から
採取することを除き、同じ手順に従った。
中に有意なレベルのβ−ラクタマーゼを有することを示した。これらのニワトリ
のうち3羽は雄であって、PCR分析(以下の実施例10を参照)により測定する
と、これらは精液中に有意なレベルのNLB−CMV−BL導入遺伝子を有する
唯一の3羽の雄であった。従って、これらは、トランスジェニックG1子孫を完 全に得るための非近交系であるべき雄である。他の6羽のニワトリは、マグナム
組織においてβ−ラクタマーゼを発現する雌鶏であった(以下を参照)。他の鳥は
、血液中に低レベル(検出レベルより少し上)のβ−ラクタマーゼを有していたが
、β−ラクタマーゼを含むトランスジェニック精液または卵は有していなかった
。従って、血液中でのβ−ラクタマーゼの発現は、ニワトリが上手く形質導入さ
れたかどうかの有力な指標である。
のうちに4℃の冷蔵庫に移し、この時点で、β−ラクタマーゼは、少なくとも1
ヶ月間安定である。(卵白に加えた、細菌により発現する精製β−ラクタマーゼ は、最小活性を4℃では数週間で失うことが測定され、卵白中のβ−ラクタマー
ゼの安定性が確かめられた。)卵白試料を集めるために、卵をプラスチック製ラ ップの上で割った。卵白をピペットで数回吸い上げ下げして、濃厚および希薄な
卵白を混合した。卵白試料を96ウェルのプレートに移した。1ウェルにつき1
M NaH2PO4(pH 5.5)1.5μlを補ったPBS100μlを含む96ウェル
のプレートに、卵白試料10μlを移した。20μM PADAC100μlを加 えた後、ウェルを560nmで10分または12時間の動態学読み取りにてプレー
ト読み取り装置で直ちに読み取った。精製β−ラクタマーゼの様々な希釈溶液を
、対照の(形質導入していない)雌鶏から得られた卵白10μlと一緒に、幾つか のウェルに加えて、β−ラクタマーゼ標準曲線を確立した。未処置の雌鶏および
NLB−CMV−BLを導入した雌鶏の両方から得られる卵白をβ−ラクタマー
ゼの存在に関してアッセイした。
の雌鶏の卵白において検出した。卵における発現を実証するための最初の雌鶏で
あるHen 1522(「Betty Lu」)が産んだ卵は、卵1個あたり0.3mgまたは
それ以上の活性β−ラクタマーゼを有する。他の3羽のNLB−CMV−BLを
導入した雌鶏(Hen 1549、Hen 1790、およびHen 1593)からのβ −ラクタマーゼの製造もまた示す。β−ラクタマーゼを含む卵を産んだ雌鶏はい
ずれもまた、その血液中に有意なレベルのβ−ラクタマーゼを有していた。
、(卵1個あたり卵白40ミリリットルであると仮定すると)卵1個あたり0.1 〜1.3mgの範囲となる。しかしながら、この量は、ウェスタンブロットアッセ イ(以下の実施例5を参照)により得られる量から考えると著しく低く、真の値よ
り低く誤って測定された。酵素活性のアッセイとウェスタンブロットアッセイ( 実施例5)との間の結果の相違は、卵白におけるβ−ラクタマーゼ阻害剤の存在 によるものであることが分かった。精製β−ラクタマーゼの活性は、反応200
ml中の卵白50mlによりほぼ100%阻害されたが、反応200ml中の卵白10
mlによっては穏やかな阻害しかされなかったことから、卵白により阻害されるこ
とが分かる。さらにまた、アッセイ工程中に酵素基質であるPADACが自発的
に分解することもまた、β−ラクタマーゼ濃度の間違った低い計算値の原因であ
った。
ッセイ中にPADACの自発的分解がおこるためである。他の雌鶏にNLB-C MV-BLを実施例3で述べたとおり形質導入した。それぞれの卵白を3回アッ セイした。
デシル硫酸ナトリウム(SDS)、10% グリセロール、1.43M 2-メルカプ
トエタノール、0.001% ブロモフェノールブルー 30μlに加えた。サンプ
ルを95℃で5分間加熱し、12%SDS-PAGEで分離し、イモビロンP膜(
Millipore)で転写した。β-ラクタマーゼを、ウサギ抗-β-ラクタマーゼ(5末端
-3末端)の1:500希釈物およびヤギ 抗-ウサギIgG HRPコンジュゲート
(Promega)の1:5000希釈物で検出した。強化化学ルミネセンス(ECL)ウエ
スタンブロット法システム(Amersham)で、イムノブロットを可視化した。
-ラクタマーゼ抗体で分析した。これらの結果を図5に示す。ブロットのレーン 1-4はそれぞれ5.2、1.3、0.325および0.08μgの細菌性発現を含む
:精製したβ-ラクタマーゼを対照の卵白に加え、標準曲線を形成する。レーン 5は処置していない雌鶏の卵白を含む。レーン6はHen1552(Betty Lu)の
卵白 2μlである。レーン7-8はそれぞれHen1790の卵白 1および2μ
lを含む。レーン9-10はそれぞれHen1793の卵白 1および2μlを含む
。レーン11-12はHen1549の卵白の1および2μlアリコートを含む。
レーン13-14はそれぞれHen1581の卵白 1および2μlを示す。レー ン15はHen1587の卵白 2μlを示す。
1kDaの帯はβ-ラクタマーゼである。卵白中のβ-ラクタマーゼの分子量は精製
したβ-ラクタマーゼの分子量とほぼ等しい。卵白β-ラクタマーゼも単一分子種
であり、さらにこの合成はβ-ラクタマーゼコード配列に正確であり、このβ-ラ
クタマーゼは卵白と同様にマグナム細胞中で非常に安定である。13kDaの帯は
、抗-β-ラクタマーゼ抗体と架橋反応する卵白タンパク質である。
22のもの、Betty Lu)を、卵に対して120ngまたは2.4mgの量(卵毎の卵白
を40mlとする)で評価する。レーン9のβ-ラクタマーゼ(Hen1793のも
の)を325ng(卵に対して13mgである)で評価する。ウエスタンブロット分 析評価による、卵に対するβ-ラクタマーゼのレベルは、実施例4のβ-ラクタマ
ーゼ酵素アッセイの評価のレベルと比べて相当高い(10倍程の高さ)。上述の通
り、タンパク質評価における食い違いは、卵白による酵素活性阻害および基質分
解によって引き起こされていると考えられる。
である。上述のとおり、キメラ起源物で得られた何れかの組織細胞のうちほんの
2-15%のみが実際にトランスジェニックであった。このモザイク現象の程度 を考慮してマグナム組織に適用すると、β-ラクタマーゼ卵陽性雌鶏 6体のマグ
ナムのみが部分的にトランスジェニックであった。そのため、完全なトランシジ
ェニック鳥(G1子孫)が、さらに高いレベルで、あるいは200mg/卵ほど高いレ
ベルで発現することが期待できる。この推定は有意である。それは、CMVなど
の非マグナム特異的プロモーターが、卵白タンパク質合成機構の卵白アルブミン
およびリゾチームなどのマグナム特異的遺伝子に匹敵するからである。
スフェクトする。 本方法で、供与胞胚葉細胞を、Barred Plymouth Rock雌鶏の受精卵から、立体
環状リングのWhatman濾紙を使用して(胞胚葉の上に置き、リングの卵黄膜を貫通
して切断した後持ち上げる)単離する。付着した胞胚葉がついているリングを、 リン酸緩衝食塩水(PBS)が入ったペトリ皿の側面上方に移し、次いで付着した
卵黄をピペットで丁寧に取り出す。暗域をヘアーループで切り離し、半透明期X
胞胚葉を大量運搬ピペットチップでマイクロチューブへ移す。胞胚葉に対して約
30,000−40,000の細胞が単離される。特定実験用に胞胚葉 10つを 集める。
0ml,BRL)を介した線状プラスミドで、室温で3時間トランスフェクトする 。図1、3または4に示すベクターは、ここで適切な発現構成体として働く。細
胞を洗浄して媒体を有するリポフェクチンを取り除き、次いで、400−600
の細胞をアテーナ-カナディアンランダムブレッドライン(ACライン)からg-照 射した(650rad)受容段階X胚中へ注入する。注入は、小窓(〜0.5cm)を介し
て受容胞胚葉の副胚腔下部へ行なう。小窓を新鮮な卵殻膜とデューコプラスティ
ックセメントで封じる。卵を、加湿インキュベーター中で2時間おきに90o回 転させながら39.1℃でインキュベートする。
ヨコのうち、Barred Plymouth Rock羽モザイク現象を発現しているもののみを確
保する。導入遺伝子中にレポーター遺伝子が存在しなくても、トランスジェニッ
クモザイクはPCRアッセイで同定することができる。
よびブラックフェザーパルプを、導入遺伝子の存在下で導入遺伝子に特異なプラ
イマー対を使用してPCRアッセイする(Love et al., Bio/Technology 12:60-6
3(1994))。導入遺伝子キメラを誘導し、取り除き、ジエチルスチルベストロール
(DES)ペレットと共に再導入し、レポーター活性発現で分析したマグナムを摘
出する。血液と肝臓をアッセイし、組織特異性をモニターする。
発したDNA抽出の新規高処理量方法を使用して、DNAを血液から抽出する。
本方法は、血液を羽静脈からヘパリン凝血防止したシリンジへ抜き取り、一滴を
、細胞膜のみを溶解する緩衝液含有の平底96ウェルシャーレの1ウェルの中へ
すばやく入れる。このプレートを短時間遠心分離すると、核がペレット化する。
上清を取り除き、第二の溶解緩衝液を加えて核からゲノムDNAを取り出し、ヌ
クレアーゼで分解する。このDNAをプレート中でエタノール沈殿化し、70%
エタノールで洗浄し、乾燥し、水 100μl(1ウェルに対して)に再懸濁する 。ヒヨコの血液1滴(8μl)から80μgほどのDNAを得ることができる。一人
の人間で一日に少なくとも768種のサンプルについて処理することができ、こ
のDNAはPCRおよびTaqman(登録商標)(Perkin Elmer/Applied Biosystems) 分析での使用に適当である。
験し、胚形質導入工程の有効性を評価する。Taqman配列検出システムで特定配列
の直接検出を行なう。目的のPCR産物の内部領域に相補的な蛍光標識オリゴヌ
クレオチドプローブのみが、目的PCR産物をアニールするときに蛍光を発する
。このPCR産物は本事例では導入遺伝子と相補的である。サイクリング工程中
にすべての検出をPCRチューブ中で行なうので、Taqmanシステムは配列検出ア
ナログと同様に高処理PCR(ゲル電気泳動を必要としない)となり、さらにサザ
ン分析と同程度の感度をもつ。単離したDNA 1μl(DNA600-800ngを
含む)をTaqman反応に使用する。それぞれの反応は2セットのプライマー対とTaq
manプローブとを含む。第一セットはニワトリのグリセルアルデヒド-3-ホスフ ェートデヒドロゲナーゼ遺伝子(GAPDH)を検出する。これをゲノムDNA特
性の内部標準とし、また導入遺伝子投与量の標準としても使用する。第二セット
は目的の導入遺伝子に特異的である。落射蛍光発光検出器を備えた立体顕微鏡で
精査して、蛍光を検出する。2つのTaqmanプローブを、独特の波長を有する異な
る染料につける:両方のPCR産物をABI/PE 7700配列検出器で同時に検出する 。180羽以上の鳥が孵化し、このうち20%(36羽)は血液中に導入遺伝子を
有する。
胚葉細胞の同定 図8に示すPMGI標的ベクターによるトランスフェクトで、条件を整えた媒
体中のフィーダーライン上で細胞培養し、すべてまたはほぼ半分の細胞が蛍光中
一様に緑色であるコロニーをつくる。落射蛍光発光検出器を備えた立体顕微鏡で
蛍光を検出する。一様な蛍光によって、ベクターがゲノム中に安定に組込まれた
ことが分かる。これらの細胞クローンのうち、ほんの小さな部分集合が、標的遺
伝子中に正しく挿入されたPMGを実際に有する。クローン細胞のほとんどは、
ゲノム中にランダムに挿入されたPMGを有する。正しく挿入されたPMGを有
するクローン細胞を同定するために、TaqManPCRアッセイを使用して上述のと
おりコロニーをスクリーンする。2つのプライマーを使用して、組込部位の導入
遺伝子セグメントを増幅する。プライマーの1つは遺伝子X(卵管で発現する外 因遺伝子)中にあり、他方はちょうど5'標的配列の外部にある。そのため、この
断片は標的遺伝子中に正しく挿入されることによってのみ増幅される。正しく組
込まれた遺伝子を含むコロニーを、分化しない成長を促進する種々のサイトカイ
ンを用いて、フィーダー細胞上の培地で制限継代にかける。細胞を受容胚に注入
する。あるいは、緑色コロニーをプールし、受容胚に注入する。続いて、孵化し
たヒヨコを、正しく挿入された遺伝子があるかについてスクリーンする。
胞をフィーダー層非存在下で1日生育させ、翌日、蛍光活性化セルソーターを使
用して青色/緑色細胞から緑色細胞を分離する。次いで緑色細胞を受容胚に注入
する前に、フィーダーセルを簡単に通過させる。緑色細胞を正確な挿入に関して
も上記のようにスクリーニングする。
加する。スルファメタジンは、健康または繁殖能力に影響せずに、20−22週
齢ではなく10−12週齢で精子を産生できるように、雄の性的成熟を加速する
(Speksnijder and Ivarie, 非公開データ)。
収し、DNAをChelex-100を使用して抽出する。簡単に、3μlの精子および2 00μlの5%Chelex-100を混ぜ、続いて2μlの10mg/mlプロテイナーゼKお
よび7μlの2M DTTを添加する。サンプルを56℃で30−60分インキ ュベートする。サンプルを8分沸騰させ、10秒間激しくボルテックス処理する
。10から15kGで2−3分遠心後、上清についてPCRまたはTaqman分析が
直ぐにできる。DNAを、導入遺伝子に相補的なTaqmanプローブおよびプライマ
ーを使用してTaqmanアッセイで分析する。90羽のG0雄のうち5%、または4 羽から5羽が、その精子DNAに導入遺伝子を有すると概算される。
精子内に有意なレベルのNLB-CMV-BL導入遺伝子を有する3羽の雄を含む(実施例 10参照)。従って、これらの雄を完全なトランスジェニックG1子孫を得るため
の更なる繁殖に選択する。
白色レグホーン雌との繁殖により、1週間当り16羽のG1子孫が得られると概 算される。孵化したヒヨコを肛門性別判定し、血液DNA中の導入遺伝子の存在
に関して、Taqmanアッセイでスクリーニングする。雄および雌各20羽、計40
羽のG1遺伝子導入が得られるが、それに3週かかる。 雄は更なる繁殖のためにおき、雌は卵内への導入遺伝子の発現に関して試験す
る。
発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の種々の修飾および変形が
、当業者には明らかである。本発明は、具体的な好ましい態様に関連して記載し
ているが、請求している本発明は、このような具体的態様に不当に限定されるべ
きではないことは理解されるべきである。実際、当業者には明白な、本発明の実
施のための記載の形態の種々の変形は、特許請求の範囲の範囲内であると解釈さ
れる。
配列、外因性タンパク質Xをコードする遺伝子Xを含む卵白アルブミンプロモー
ター発現ベクターを表示する。
ター・セグメント、コード配列、外因性タンパク質Xをコードする遺伝子Xを含
む本発明のレトロウイルスベクターを表示する。
伝子を増幅する方法を表示する。
ーター、第2コード配列、遺伝子Yの発現をなす内部リボソーム挿入部位(IR
ES)エレメントを含むレトロウイルスベクターを表示する。
CMV−BL夫々の模式図を示す。ベクターはニワトリゲノム中に組込まれてい
るのが表れるように示す。
ーゼ量についてβ−ラクタマーゼ活性アッセイにより測定した結果を示す。
ーゼの存在を表わすウエスタンブロットを示す。
する。図6(a)では、模式的creおよびβ−ラクタマーゼ導入遺伝子が非マ
グナム細胞中の雌鶏のゲノム中に統合されている。図6(b)では、模式的cr
eリコンビナーゼおよびβ−ラクタマーゼ導入遺伝子がマグナム中の雌鶏のゲノ
ム中に統合されている。
示する。ここでは、第1コドン(ATG)を有し停止コドン(TAA)をフレー
ム中ではさむ2つのloxP部位が、シグナルペプチドが崩壊されないようにβ
−ラクタマーゼシグナルペプチドコード配列中に挿入される。
のに用いられた標的ベクターを表示する。
のに用いられた標的ベクターを表示する。
挿入を検出するための標的ベクターを示す。
Claims (39)
- 【請求項1】 コード配列およびマグナム特異的プロモーターを含むベクタ
ーであって、操作的および位置的関係において、該コード配列を鳥卵管の管状腺
で発現するベクター。 - 【請求項2】 該マグナム特異的プロモーターが卵白アルブミンプロモータ
ー領域のセグメントであり、該セグメントが該コード配列を鳥卵管の管状腺で発
現するのに十分である、請求項1のベクター。 - 【請求項3】 卵白アルブミンプロモーター領域のセグメントが卵白アルブ
ミン遺伝子の5’フランキング領域のセグメントであり、この遺伝子は長さが約
0.88kbから約1.4kbであり、ステロイド依存性調節エレメントと負の
調節エレメントの両方を含有しているものである、請求項3のベクター。 - 【請求項4】 ベクターがレトロウイルスであり、該コード配列および該マ
グナム特異的プロモーターの両方がレトロウイルスベクターの5’と3’のLT
Rの間に位置する、請求項1のベクター。 - 【請求項5】 レトロウイルスが鳥の白血症ウイルスから誘導される、請求
項4のベクター。 - 【請求項6】 さらに第2コード配列および内部リボソーム挿入部位エレメ
ントを含み、該内部リボソーム挿入部位エレメントが第1と第2のコード配列の
間に位置する、請求項1のベクター。 - 【請求項7】 第2コード配列によりコードされたタンパク質が、第1コー
ド配列によりコードされたタンパク質の翻訳後修飾を提供し得る、請求項6のベ
クター。 - 【請求項8】 さらに該コード配列に操作可能的に連結したシグナルペプチ
ドコード配列を含み、細胞中での翻訳に際して、シグナルペプチドがベクターに
より発現されたタンパク質の分泌を指令する、請求項1のベクター。 - 【請求項9】 さらにマーカー遺伝子を含み、該マーカー遺伝子が、Xenopu
s laevis ef−1αプロモーター、HSVtkプロモーター、CMVプロモ ーターおよびβ−アクチンプロモーターからなる群より選ばれる構成プロモータ
ーに操作可能的に連結している、請求項1のベクター。 - 【請求項10】 鳥において標的遺伝子中にプロモーター欠損ミニ遺伝子を
挿入するための標的ベクターであって、 コード配列; 少なくとも1つのマーカー遺伝子、うち該マーカー遺伝子は構成プロモーター
に操作可能的に連結し、標的ベクターを組みこむ細胞の同定に用いることができ
る; 標的遺伝子中の挿入点をはさむ配列に相当する標的核酸配列、うち該標的核酸
配列は標的ベクターの標的遺伝子中への挿入を指令する; ことを含む標的ベクター。 - 【請求項11】 該標的遺伝子が鳥卵管中で発現される内因性遺伝子である
、請求項10の標的ベクター。 - 【請求項12】 標的遺伝子が卵白アルブミン、リゾチーム、コンアルブミ
ン、オボヌコイドおよびオボムチンよりなる群から選ばれる、請求項11の標的
ベクター。 - 【請求項13】 挿入点が標的遺伝子の5’非翻訳領域にある、請求項10
の標的ベクター。 - 【請求項14】 挿入点が標的遺伝子の3’非翻訳領域にあり、標的ベクタ
ーがさらに該コード配列の上流に直接位置する内部リボソーム挿入部位エレメン
トを含む、請求項10の標的ベクター。 - 【請求項15】 さらに該コード配列に操作可能的に連結したシグナルペプ
チド・コード配列を含み、細胞中での翻訳に際して、シグナルペプチドが第1コ
ード配列により発現されたタンパク質の分泌を指令する、請求項10の標的ベク
ター。 - 【請求項16】 さらに第2コード配列および内部リボソーム挿入部位エレ
メントを含み、該内部リボソーム挿入部位エレメントが第1と第2のコード配列
の間に位置する、請求項10の標的ベクター。 - 【請求項17】 第2コード配列によりコードされたタンパク質が、第1コ
ード配列によりコードされたタンパク質の翻訳後修飾を提供し得る、請求項16
の標的ベクター。 - 【請求項18】 プロモーター欠損ミニ遺伝子を標的遺伝子に挿入するため
のベクターであって、請求項10の標的ベクターを含み、該標的ベクターがさら
に第2構成プロモーターに操作可能的に連結した第2マーカー遺伝子を含み、該
第2マーカー遺伝子が該標的核酸配列の外側に位置し、プロモーター欠損ミニ遺
伝子の標的遺伝子への挿入に際して第2マーカー遺伝子が挿入されないベクター
。 - 【請求項19】 鳥生殖組織の遺伝子物質中に導入遺伝子を保有するトラン
スジェニック鳥であって、導入遺伝子が外因性遺伝子およびプロモーターを含み
、操作的および位置的関係において、該コード配列を鳥卵管の管状腺で発現する
トランスジェニック鳥。、 - 【請求項20】 プロモーターがマグナム特異的プロモーターである、請求
項19のトランスジェニック鳥。 - 【請求項21】 トランスジェニック鳥がニワトリおよび七面鳥からなる群
から選ばれる請求項19のトランスジェニック鳥。 - 【請求項22】 鳥生殖組織の遺伝子物質中に導入遺伝子を保有するトラン
スジェニック鳥であって、導入遺伝子が内因性遺伝子の5’非翻訳領域または3
’非翻訳領域のいずれかに位置し、内因性遺伝子の調節配列が外因性遺伝子の発
現を指令するトランスジェニック鳥。 - 【請求項23】 該内因性遺伝子が卵白アルブミン、リゾチーム、コンアル
ブミン、オボヌコイドおよびオボムチンよりなる群から選ばれる、請求項22の
トランスジェニック鳥。 - 【請求項24】 トランスジェニック鳥がニワトリおよび七面鳥からなる群
から選ばれる、請求項22のトランスジェニック鳥。 - 【請求項25】 鳥種にとって外因性タンパク質を含有する鳥種の卵。
- 【請求項26】 外因性コード配列を鳥のゲノムに安定的に導入する方法で
あって、 請求項1のベクターを鳥胞胚葉細胞に導入し、ベクターが鳥ゲノムにランダム
に挿入される、 ことを含む方法。 - 【請求項27】 鳥卵管中に外因性タンパク質を産生する方法であって、 コード配列および該コード配列に操作可能的に連結したプロモーターを提供し
、該プロモーターが鳥卵管中の管状腺細胞でコード配列の発現を行い得; 該ベクターを鳥胞胚葉細胞中に導入することによりトランスジェニック細胞を
つくり、ベクター配列を鳥ゲノム中にランダムに挿入し; 該トランスジェニック細胞から成熟トランスジェニック鳥を誘導し、うちトラ
ンスジェニック鳥の管状腺がタンパク質を発現する; ことを含む方法。 - 【請求項28】 該プロモーターがマグナム特異的にプロモーターである、
請求項27の方法。 - 【請求項29】 該プロモーターが構成プロモーターである、請求項27の
方法。 - 【請求項30】 さらに、 第2ベクターを提供し、該第2ベクターが第2コード配列および該第2コード
配列に操作可能的に連結したマグナム特異的プロモーターを含み; 該第2ベクターをトランスジェニック鳥の管状腺細胞中で発現し; うち、該第1コード配列の発現が第2コード配列により発現されたタンパク質
の細胞内存在に直接的または間接的に依存する; 請求項29の方法。 - 【請求項31】 該第2コード配列がCreをコードし、第1ベクターが、
Creの不存在で第1タンパク質コード核酸配列の発現を防止するloxP結合
遮断配列をさらに含む、請求項30の方法。 - 【請求項32】 該第2コード配列がFLPリコンビナーゼをコードし、第
1ベクターが、FLPリコンビナーゼの不存在で第1コード配列の発現を防止す
るFRT結合遮断配列をさらに含む、請求項30の方法。 - 【請求項33】 ベクターの胞胚葉細胞への導入がレトロウイルスにより仲
介される、請求項27の方法。 - 【請求項34】 該ベクターの胞胚葉への導入工程が、ヘルパー細胞を胞胚
葉に与えることを含み、該ヘルパー細胞がレトロウイルスを産生する、請求項3
3の方法。 - 【請求項35】 外因性タンパク質を含有する鳥卵を産生する方法であって
、 コード配列および該コード配列に操作可能的に連結したプロモーターを含むベ
クターを提供し、該プロモーターが鳥卵管の管状腺でコード配列の発現を行うこ
とができ、 該ベクターを鳥胞胚葉細胞に導入することによりトランスジェニック細胞をつ
くり、ベクター配列は鳥ゲノムのランダムに挿入されている; 該トランスジェニック細胞から成熟トランスジェニック鳥を誘導し、トランス
ジェニック鳥の管状腺細胞がコード配列を発現し、得たタンパク質が卵管腔中に
分泌され、タンパク質が卵黄に保存される; ことを含む方法。 - 【請求項36】 外因性核酸配列を鳥ゲノム中の標的内因性遺伝子に導入す
る方法であって、 請求項10のベクターを鳥胞胚葉細胞に導入し、該ベクターが標的内因性遺伝
子に組込まれる、 ことを含む方法。 - 【請求項37】 鳥の特殊な細胞における外因性タンパク質を産生する方法
であって、 請求項10のベクターを鳥胞胚葉細胞に導入することによりトランスジェニッ
ク細胞をつくり、該標的遺伝子は該特殊な細胞中で発現する内因性遺伝子であり
、該ベクターは胞胚葉細胞の標的内因性遺伝子に組込まれている; 該トランスジェニック細胞から成熟トランスジェニック鳥を誘導し、コード配
列が標的遺伝子の調節エレメントの制御下にトランスジェニック鳥の特殊な細胞
中で発現される; ことを含む方法。 - 【請求項38】 該特殊な細胞が管状腺細胞である、請求項38の方法。
- 【請求項39】 外因性タンパク質を含有する鳥卵を産生する方法であって
、 請求項10のベクターを鳥胞胚葉細胞に導入することによりトランスジェニ
ック細胞をつくり、該標的遺伝子は管状腺細胞中で発現する内因性遺伝子であり
、該ベクターは標的内因性遺伝子に組込まれている; 該トランスジェニック細胞から成熟トランスジェニック鳥を誘導し、コード配
列が標的遺伝子の調節エレメントの制御下にマグナム中で発現され、外因性タン
パク質が卵管腔中に分泌され、外因性タンパク質が卵黄に保存される; ことを含む方法。
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