JP2008220224A - オボアルブミンプロモーターによる卵白特異的物質生産 - Google Patents
オボアルブミンプロモーターによる卵白特異的物質生産 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008220224A JP2008220224A JP2007061038A JP2007061038A JP2008220224A JP 2008220224 A JP2008220224 A JP 2008220224A JP 2007061038 A JP2007061038 A JP 2007061038A JP 2007061038 A JP2007061038 A JP 2007061038A JP 2008220224 A JP2008220224 A JP 2008220224A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- promoter
- oviduct
- transgenic
- target protein
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 title claims abstract description 44
- 239000000126 substance Substances 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 83
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 75
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 62
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 claims abstract description 44
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims abstract description 42
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 35
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 31
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 26
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 17
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 15
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 15
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 14
- 101000609762 Gallus gallus Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 9
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 9
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 6
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 claims description 5
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 4
- 108091006088 activator proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 3
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 claims description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 3
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 claims description 3
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 44
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 abstract description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 abstract description 6
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 abstract description 4
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 abstract description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 45
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 32
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 30
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 26
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 25
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 23
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 20
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 12
- 239000002585 base Substances 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 11
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 11
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241001068295 Replication defective viruses Species 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WMBWREPUVVBILR-WIYYLYMNSA-N (-)-Epigallocatechin-3-o-gallate Chemical compound O([C@@H]1CC2=C(O)C=C(C=C2O[C@@H]1C=1C=C(O)C(O)=C(O)C=1)O)C(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 WMBWREPUVVBILR-WIYYLYMNSA-N 0.000 description 1
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- SXAMGRAIZSSWIH-UHFFFAOYSA-N 2-[3-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-1,2,4-oxadiazol-5-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1=NOC(=N1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 SXAMGRAIZSSWIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- WMBWREPUVVBILR-UHFFFAOYSA-N GCG Natural products C=1C(O)=C(O)C(O)=CC=1C1OC2=CC(O)=CC(O)=C2CC1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 WMBWREPUVVBILR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- -1 antibodies Proteins 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 description 1
- 210000002976 pectoralis muscle Anatomy 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Abstract
【解決手段】鳥類卵管細胞で外来性目的タンパク質を高生産させるためにはオボアルブミンプロモーターを利用して卵管特異的な発現を実現することと、その転写活性を増強することにより達成される。オボアルブミンプロモーター配列を切り詰め、卵管特異的発現が可能な出来るだけ短い配列を得、転写活性化因子としてテトラサイクリン応答型のヘルペスウイルス由来VP16因子を組込み、オボアルブミンプロモーターの転写活性を増強するレトロウイルスベクターを作製し、トランスジェニックニワトリを作製したところ、卵管で高発現するトランスジェニックニワトリを作製することに成功した。
【選択図】なし
Description
だが近年の目ざましい研究成果により細胞内でのタンパク質動態がより詳細に明らかになるにつれ、医薬品として望まれるタンパク質の生産方法として翻訳後修飾やフォールディング、高次構造に注目した特異的、機能的なタンパク質を生産する技術が望まれている。高機能性タンパク質製剤の製造方法としては哺乳動物細胞を利用した系が主流となっているが、この生産方法はコストが高い、生産性が悪い、ウイルスの混入による感染症の恐れといったデメリットが存在する。
そこで我々はニワトリに着目した。トランスジェニックニワトリで有用タンパクを生産させる手法が開発され(特許文献1)、この卵から目的タンパク質を回収する手法では、広い飼育スペースを必要とせず、産卵までが6ヶ月と短い点、長年の食経験から安全性が確認されている点が有用である。このトランスジェニックニワトリでの生産方法として、従来は全身発現系のプロモーターを用いていたが、ニワトリに毒性を呈するタンパク質の生産には向いていない。そこでニワトリの卵特異的に目的タンパク質を発現、蓄積させる技術が必要とされている。
また特許文献3ではニワトリオボアルブミンプロモーターを利用したトランスジェニックニワトリ作製方法が開示されているが、生産性が低く実用向きではなかった。特許文献3では発現量は非常に低いながらも組織特異的な発現は実現できたことから、この発現量を向上するためには、転写活性を増強する遺伝子配列を導入する解決策が考えられる。しかし長い遺伝子配列を導入することができないウイルスベクターの特性上、長鎖のオボアルブミンプロモーターと目的遺伝子以外の配列を導入することは不可能である。
本発明は、トランスジェニック鳥類において外来目的タンパク質を鳥類の卵管細胞特異的に高発現させ、該鳥類によって産卵される卵に特異的に外来目的タンパク質を高度に蓄積させ、これを回収することによって得られる外来目的タンパク質の生産方法である。
鳥類卵管細胞で外来目的タンパク質を高生産させるには、オボアルブミンプロモーターを利用して卵管特異的な発現を実現することと、その転写活性を増強することにより達成される。特開2004−236626号公報に開示のオボアルブミンプロモーターは配列自体が長く、レトロウイルスベクターに用いられる長さから鑑みて、他の転写活性化配列を挿入することができない。
そこでオボアルブミンプロモーター配列を切り詰め、卵管特異的発現が可能な出来るだけ短い配列を得、転写増強因子を組込むことにより卵管特異的な外来目的タンパク質発現を可能とするレトロウイルスベクターの作製と、該ベクターによるトランスジェニック鳥類作製を試みた。オボアルブミンプロモーターDNA配列は、ニワトリのオボアルブミン遺伝子の転写開始点を0(基準)とし、上流に、−3860〜−1568までの約2.3kbpを用いた(配列表配列番号2)。転写活性化因子としてテトラサイクリン応答型のヘルペスウイルス由来VP16因子を組込み、オボアルブミンプロモーターの転写活性を増強するレトロウイルスベクターを作製し、トランスジェニックニワトリを作製したところ卵管で高発現するトランスジェニックニワトリを作製することに成功した。
(1)
遺伝子発現用プロモーターであって、オボアルブミンプロモーターの、
a)ホルモン依存性DNaseI超感受性部位IIIの全部または一部を有し、
b)ホルモン依存性DNaseI超感受性部位I及び/またはホルモン依存性DNaseI超感受性部位IIを含まず、
c)鳥類において卵管特異的に機能し、3kbp以下でかつ1.0kbpを超え、
d)TATAボックスを含む、
部分領域からなるプロモーター。
(2)
オボアルブミンプロモーターが鳥類オボアルブミンプロモーターである(1)に記載のプロモーター。
(3)
鳥類オボアルブミンプロモーターがニワトリオボアルブミンプロモーターである(2)に記載のプロモーター。
(4)
ニワトリオボアルブミンプロモーターが配列表配列番号1に記載のニワトリオボアルブミンプロモーターである(3)に記載のプロモーター。
(5)
配列番号2に示す塩基配列からなるか、又は、配列番号2に示す塩基配列と80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ鳥類において卵管特異的に機能する活性を有するプロモーター。
(6)
配列番号3に示す塩基配列からなるか、又は、配列番号3に示す塩基配列と80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ鳥類において卵管特異的に機能する活性を有するプロモーター。
(7)
(1)から(6)のいずれか1項に記載のプロモーターを有するウイルスベクター。
(8)
レトロウイルスベクターである(7)記載のウイルスベクター。
(9)
更に外来目的タンパク質遺伝子が組込まれた(8)記載のウイルスベクター。
(10)
(1)〜(6)のいずれか1項に記載のプロモーターがアクチベータータンパク質の卵管特異的発現を誘導し、該アクチベータータンパク質によりシス及び/またはトランスに外来目的タンパク質遺伝子の発現を誘導する請求項9記載のウイルスベクター。
(11)
更にエンハンサー、シグナル配列、転写後調節因子を有する(10)記載のウイルスベクター。
(12)
(7)〜(11)のいずれか1項に記載のウイルスベクターにより作製されたトランスジェニック鳥類。
(13)
ウイルスベクターを鳥類受精卵の発生段階において胚胎の心臓にマイクロインジェクションし、孵化させることにより得られる(12)のトランスジェニック鳥類。
(14)
(12)又は(13)記載のトランスジェニック鳥類を他鳥類と交配し得られる後代トランスジェニック鳥類。
(15)
雌個体の卵管細胞で優位に外来目的タンパク質を発現する(14)記載の後代トランスジェニック鳥類。
(16)
(15)の後代トランスジェニック鳥類により産卵される、卵白または卵黄に外来目的タンパク質を含有する卵。
(17)
(12)又は(13)に記載のトランスジェニック鳥類、又は、(14)又は(15)に記載の後代トランスジェニック鳥類による外来目的タンパク質の生産方法。
(18)
外来目的タンパク質が、抗体、サイトカイン、インスリン、ホルモン、生理活性タンパク質又はこれらからなる融合タンパク質である(17)記載の外来目的タンパク質の生産方法。
(19)
トランスジェニック鳥類がトランスジェニックニワトリである(17)又は(18)記載の外来目的タンパク質の生産方法。
本発明の外来目的タンパク質の生産方法は、トランスジェニック鳥類において外来目的タンパク質を卵特異的に高発現させることよりなり、組織特異的な転写活性を示す鎖長まで切り詰めたオボアルブミンプロモーターを用いることを特徴とする。
切り詰めたオボアルブミンプロモーターとしては、ホルモン依存性DNaseI超感受性部位IIIの全部または一部を有し、ホルモン依存性DNaseI超感受性部位Iまたはホルモン依存性DNaseI超感受性部位IIを含まず、鳥類において卵管特異的に機能する3kbp以下でかつ1.0kbpを超え、TATAボックスを含む部分領域(フラグメント)であれば本発明の技術範囲に含まれる。
上記オボアルブミンプロモーターは、鳥類オボアルブミンプロモーターであることが好ましく、ニワトリオボアルブミンプロモーターであることがより好ましい。配列表配列番号1に、ニワトリオボアルブミンプロモーターの配列を示す。
本発明の切り詰めたオボアルブミンプロモーターの部分領域は、3kbp以下であり、1.4kbp以下であることが好ましい。この切り詰めたプロモーターは、1.1kbp以上であることが好ましい。
また、配列番号2または配列番号3に示す塩基配列と80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ鳥類において卵管特異的に機能する活性を有するプロモーターも、本発明のプロモーターに含まれる。より好ましくは、90%以上の同一性、更に好ましくは95%以上の同一性、特に好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列のプロモーターである。
ここで、「同一性(%)」とは、対比される2つのポリヌクレオチドを最適に整列させ、核酸塩基(例えば、A、T、C、G、U、またはI)が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に100を乗じた数値で表される。
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る:GCG Wisconsin Package(Program Manual for the Wisconsin Package、Version8、1994年9月、Genetics Computer Group、575 Science Drive Madison、Wisconsin、USA53711;Rice、P.(1996)Program Manual for EGCG Package、Peter Rice、The Sanger Centre、Hinxton Hall、Cambridge、CB10 1RQ、England)、および、the ExPASy World Wide Web分子生物学用サーバー(Geneva University Hospital and University of Geneva、Geneva、Switzerland)。
上記ウイルスベクターは、複製能欠失型ウイルスベクターであることが好ましい。複製能欠失型ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ボックスウイルス、ヘルペスウイルス等、宿主鳥類に目的遺伝子配列が導入可能なベクターであれば特に限定されない。
本発明において、上記ウイルスベクターは、トランスジェニック鳥類に外来目的タンパク質を生産させるため、更に外来目的タンパク質遺伝子が組込まれたものであることが好ましい。後述の実施例では、外来目的タンパク質遺伝子としてDsRedを用いた。
上記外来目的タンパク質としては、抗体、サイトカイン、インスリン、ホルモン、生理活性タンパク質又はこれらからなる融合タンパク質が好ましい。
さらに好ましいシステムとしては、テトラサイクリン応答配列およびヘルペスウイルス由来VP16トランスアクチベーターを利用した系が好ましいがこれに限定されることはなく、ガラクトース応答配列等も用いることができる。
本発明においては、外来目的タンパク質遺伝子を、切り詰めたオボアルブミンプロモーターを導入したウイルスベクターとは別のウイルスベクターに導入し、2種のウイルスベクターを宿主鳥類に導入してG0トランスジェニックキメラ鳥類を作製することもできる。
本発明で用いられるG0トランスジェニックキメラ鳥類の作製方法の一例としては、本発明者らにより実施された方法が挙げられるが(特開2002−176880号公報、特開2004−236626号公報および国際公開第2004/016081号パンフレット)、これに限定せず、特表2005−535331号公報および特開2006−262875号公報に開示される非ウイルス法によるトランスジェニック鳥類作製方法にも応用可能であるがこれらに限定されない。複製能欠失型ウイルスベクターを鳥類受精卵の胚胎、心臓または血管にマイクロインジェクションするあらゆる公知の手法は、後代取得効率が良い理由から好ましい。本発明においては、ウイルスベクターを鳥類受精卵の発生段階において胚胎の心臓にマイクロインジェクションし、孵化させることが好ましい。
本発明の外来目的タンパク質の生産方法においては、雌個体の卵管細胞で優位に外来目的タンパク質を発現するトランスジェニック鳥類を用いることが好ましい。
このG0またはG1以降の完全トランスジェニック鳥類の卵を回収し、該卵の卵白または卵黄より目的タンパク質を回収する。回収する方法としては特に限定されず、濾過、アフィニティークロマトグラフや陽イオン、陰イオン交換クロマトグラフ等あらゆる公知の精製または分離手法が用いられる。
このようにして得られた目的タンパク質は、医薬品用途等に用い得る。
(実施例1)切り詰め型オボアルブミンプロモーター配列の取得
1−1 pBlueOVA(d)の構築
特開2004−236626号公報に記載のベクターpLGOGを制限酵素EcoRV(TAKARA)、BamHI(TAKARA)で処理し、1%アガロース電気泳動により目的である2.4kbの断片を分離後、ゲルから切り出し、Mag Extractor −PCR&Gel Clean up−(TOYOBO)により精製した。この断片をインサートとした。また、pBluescript KS−(Novagen)を制限酵素EcoRV、BamHIで処理後、ゲルからの切り出し、Mag Extractor −PCR&Gel Clean up−による精製により出来た断片をベクターとした。
精製した各DNA断片の濃度及び精製度を1%アガロース電気泳動による確認後、Ligation、大腸菌DH5α(TAKARA)へのtransformationを行った。尚、Ligation反応は、LigaFast Rapid DNA Ligation System(登録商標、Promega)を用い、プロトコールに準じて行った。Transformationは、まず、液体窒素内で凍結しているコンピテントセルDH5αを融解し、その溶液に、上記のLigation反応後の溶液10μlを加え氷上で30分静置した。その後、heat shockを42℃で45秒行い、5分氷冷した。この菌体懸濁液に1mlのLB培地を加え、37℃で1時間振とうさせ、0.1mg/mlアンピシリン入りのLBプレートに播き、37℃で14時間培養した。その後、アルカリ法によりLBプレート上に培養したコロニーから目的プラスミドが得られた。
まず、特開2004/236626の実施例記載の手法により樹立されたウイルス生産パッケージング細胞pLGOGからMag Extractor −genome− (TOYOBO)によりgenome DNAを抽出した。パッケージング細胞pLGOGとは、gag、pol遺伝子を染色体上に持つGP293をウイルスプロデューサー細胞とし、そのGP293細胞に目的遺伝子であるウイルスベクターpLGOG(GFP、Ovalbumin promoter、hGH(cDNA))を遺伝子導入することで取得された安定に発現する細胞株のことである。
上記の方法で得られたgenome DNAを鋳型とし、以下のプライマーを用いてPCR反応を行った。
5’プライマー(配列表配列番号4)
3’プライマー(配列表配列番号5)
また、PCR反応の酵素としてはKOD−Plus−DNA Polymerase(TOYOBO)を用い、条件は次に示す通りに行った。
(1)94℃で15秒、(2)58℃で30秒、(3)68℃で15秒、(1)から(3)を35サイクル。
PCR反応後の溶液はフェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行い、さらにBglII(TAKARA)、XhoI(TAKARA)により制限酵素反応を行った。その後、1%アガロース電気泳動により目的である約220bpの断片を分離後、ゲルから切り出し、Mag Extractor −PCR&Gel Clean up−により精製した。
pET Blue2(Novagen)も同様に、BglII、XhoIによる制限酵素反応後、1%アガロース電気泳動により目的断片を分離後、ゲルから切り出し、Mag Extractor −PCR&Gel Clean up−により精製した。精製した各DNA断片の濃度及び精製度を1%アガロース電気泳動による確認後、Ligation、大腸菌DH5αへのtransformationを行った。インサートとしては上記PCRで増幅後調製した約220bpの断片、ベクターとしては上記pET Blue2の断片を用いた。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
pETOVA(BglII−XhoI)及びpBlue OVA(d)を BglII、XhoIにより制限酵素処理し、1%アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Mag Extractor −PCR&Gel Clean up−による精製を行った。pETOVA(BglII−XhoI)から得られた約220bpの断片をインサートとし、また、制限酵素処理されたpBlue OVA(d)をベクターとして、Ligation、transformationを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
pBlueOVA(d)及びpBlueOVA(d)ΔBglIIをそれぞれBglIIにより制限酵素処理し、1%アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Mag Extractor −PCR&Gel Clean up−による精製を行った。pBlueOVA(d)から得られた断片1.2kbをインサート、pBlueOVA(d)ΔBglIIから得られた断片をベクターとして、Ligation、transformationを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
pBlueOVA及びpET Blue2をそれぞれNotI(TAKARA)、XhoIで制限酵素処理し、1%アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Mag Extractor −PCR&Gel Clean up−による精製を行った。pBlue OVA(complete)から得られた断片をインサート、pET Blue2から得られた断片をベクターとして、Ligation、transformationを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
クローニングした約2.3kbのovalbumin配列を下記のプライマーを用いて塩基配列を確認した。鋳型はpBlueOVAとして用いた。
OVA−1(5’プライマー)(配列表配列番号6)
OVA−2(5’プライマー)(配列表配列番号7)
OVA−3(5’プライマー)(配列表配列番号8)
OVA−4(5’プライマー)(配列表配列番号9)
OVA−5(5’プライマー)(配列表配列番号10)
OVA−6(5’プライマー)(配列表配列番号11)
OVA−7(3’プライマー)(配列表配列番号12)
2−1 pMSCVeGTREGItTAWの構築
2−1−1 pMSCVeGTREGの構築
pIRES2−EGFP(Clontech)よりEGFP配列をPCRで増幅し、制限酵素EcoRIおよびBamHIで処理した後、pBluescript KS−(Novagen)のEcoRIおよびBamHIサイトに組み込んだベクターをpBlue/eGとした。pBlue/eGを制限酵素EcoRIおよびXhoIで処理した断片をインサートとし、pMSCVneo(Clontech)のEcoRI、XhoIサイトに組込んだベクターをpMSCV/eGとした。pTRE2(Clontech)よりTRE配列を制限酵素XhoI、HindIIIで処理した断片をインサートとし、pMSCV/eGのXhoI、HindIIIサイトに組込んだベクターをpMSCV/eGTREとした。
pCEP4(invitrogen)の制限酵素BamHI、MluIサイトに、特開2004−236626号公報でクローニングしたhGH(cDNA)を組込んだpCEP4−hGH(cDNA)をBamHI、MluIで切り出した断片をインサートとし、ベクターとしてpMSCV/eGTREをBamHI、MluIで制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動(1%)により目的バンドを分離し、切り出し、Mag Extractor−PCR&Gel Clean up−で回収した。回収したDNA濃度をアガロース電気泳動(1%)で確認後、Ligation、形質転換、アルカリ法により得られたプラスミドをpMSCVeGTREGとした。
細胞性IRESの配列の5’側に制限酵素MluIサイト、3’側に制限酵素EcoRIサイトをつけた5’DNA配列(配列表配列番号13)、細胞性IRESの配列の3’側に制限酵素MluIサイト、5’側に制限酵素EcoRIサイトをつけた3’DNA配列(配列表配列番号14)を合成DNA配列とした。ただし、この合成DNAを通常の5’側の制限酵素MluIサイト、3’側の制限酵素EcoRIサイトにLigationしたとき、制限酵素EcoRIでは切れない塩基配列になっている。
ベクターとしてpET Blue2(Novagen)を制限酵素MluI、制限酵素EcoRIで制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動(1%)により目的バンドを分離し、切り出し、Mag Extractor−PCR&Gel Clean up−で回収した。回収したDNA濃度をアガロース電気泳動(1%)で確認後、ベクターDNAと2−1−2で合成により作った細胞性IRESをインサートとしてLigation、形質転換、アルカリ法により得られたプラスミドをpET−IRES(r)とした。
pIRES2−EGFP (Clontech)よりIRESをPCRにて増幅、制限酵素BamHIおよびPstIで処理した断片をインサートとし、pBluescript KS−(Novagen)のBamHIおよびPstIサイトに組込んだベクターをpBlue/Iとした。
pTET−OFF(Clontech)をBamHIで消化し、Klenow(TAKARA)で平滑化後、EcoRIで処理した断片をインサートとし、pBlue/IのEcoRI、EcoRvサイトに組込んだベクターをpBlue/ItTAとした。インサートとしてpBlue/I tTAを制限酵素EcoRI、HindIIIで、ベクターとしてpBluescript KS−(Novagen)を制限酵素EcoRI、HindIIIで、それぞれ制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動(1%)により目的バンドを分離し、切り出し、Mag Extractor−PCR&Gel Clean up−で回収した。回収したDNA濃度をアガロース電気泳動(1%)で確認後、Ligation、形質転換、アルカリ法により得られたプラスミドをpBlue−tTAとした。
インサートとしてpBlue−tTAを制限酵素BamHI、PvuIIで、ベクターとしてpET−IRES(r)を制限酵素BamHI、EcoRVで制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動(1%)により目的バンドを分離し、切り出し、Mag Extractor−PCR&Gel Clean up−で回収した。回収したDNA濃度をアガロース電気泳動(1%)で確認後、Ligation、形質転換、アルカリ法により得られたプラスミドをpET−ItTAとした。
インサートとしてpET−ItTAを制限酵素MluI、HindIIIで、ベクターとしてpMSCVeGTREGを制限酵素MluI、HindIIIで制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動(1%)により目的バンドを分離し、切り出し、Mag Extractor−PCR&Gel Clean up−で回収した。回収したDNA濃度をアガロース電気泳動(1%)で確認後、Ligation、形質転換、アルカリ法により得られたプラスミドをpMSCVeGTREGItTAとした。
インサートとして特開2006/271266に記載のpBlue/WPREを制限酵素ClaIで、ベクターとしてpMSCVeGTREGItTAを制限酵素ClaIで制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動(1%)により目的バンドを分離し、切り出し、Mag Extractor−PCR&Gel Clean up−で回収した。回収したDNA濃度をアガロース電気泳動(1%)で確認後、Ligation、形質転換、アルカリ法により得られたプラスミドをpMSCVeGTREGItTAWとした。
実施例1で構築されたpETOVAをSalI(TAKARA)、XhoIで、また、pMSCVeGTREGItTAWをXhoIで制限酵素処理し、1%アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Mag Extractor −PCR&Gel Clean up−による精製を行った。pETOVAから得られた約2.3kbの断片をインサートとし、また、制限酵素処理されたpMSCVeGTREGItTAWをベクターとして、Ligation、transformationを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
2−2で構築されたウイルスベクタープラスミドpMSCVeGOVATREGItTAW及びpET Blue2をそれぞれEcoRIで制限酵素処理し、1%アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Mag Extractor −PCR&Gel Clean up−による精製を行った。pMSCVeGOVATREGItTAWから得られた約1.7kbの断片をインサートとし、また、制限酵素処理されたpET Blue2をベクターとして、Ligation、transformationを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
2−3で構築されたpETtTAW及びpQCXIN(Clontech)をそれぞれKpnIで制限酵素処理し、1%アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Mag Extractor −PCR&Gel Clean up−による精製を行った。pET tTA Wの断片をインサート、また、制限酵素処理されたpET Blue2をベクターとして、Ligation、transformationを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
2−2で構築されたpMSCVeGOVATREGItTAW及び2−4で構築されたpQtTAWをそれぞれEcoRIで制限酵素処理し、1%アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Mag Extractor −PCR&Gel Clean up−による精製を行った。pMSCVeGOVATREGItTAWから得られた約1.5kbの断片をインサートとし、また、pQtTA Wをベクターとして、Ligation、transformationを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
2−5で構築されたpQeGTREtTAW及び実施例1で構築されたpETOVAをそれぞれXhoIで制限酵素処理し、1%アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Mag Extractor −PCR&Gel Clean up−による精製を行った。pET OVAから得られた約2.3kbの断片をインサートとし、また、制限酵素処理されたpQeGTREtTAWをベクターとして、Ligation、transformationを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
2−6で構築されたpQeGOVATREtTAWをBglIIで制限酵素処理し、1%アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Mag Extractor −PCR&Gel Clean up−による精製を行った。pQeGOVATREtTAWから得られた約8.7kbの断片をベクターとして、self−ligation、transformationを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
3−1 pET DsRedの構築
pIRES2−DsRed−Express(Clontech)よりDsRedをPCR法により増幅した。
5’プライマー(配列表配列番号15)
3’プライマー(配列表配列番号16)
PCR反応の酵素としてはKOD−Plus−DNA Polymeraseを用い、条件は次に示す通りに行った。
(1)94℃で15秒、(2)56℃で30秒、(3)68℃で45秒、(1)から(3)を30サイクル。
PCR反応後の溶液は、フェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行った。
その後、PCRにより増幅したDsRed及びpET Blue2をそれぞれBamHI、MluIで制限酵素処理し、1%アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Mag Extractor −PCR&Gel Clean up−による精製を行った。DsRedの断片をインサート、また、制限酵素処理されたpET Blue2をベクターとして、Ligation、transformationを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
3−1で構築されたpETDsRed及び2−5で構築されたpQeGTREtTAWをそれぞれBamHI、MluIで制限酵素処理し、1%アガロース電気泳動により目的断片の分画、切り出し、Mag Extractor −PCR&Gel Clean up−による精製を行った。DsRedの断片をインサート、また、制限酵素処理されたpQeGTREtTAWをベクターとして、Ligation、transformationを行った。その後、アルカリ法により目的プラスミドを取得した。
まず、ウイルス産出細胞であるGP−293細胞を24well collagen−coated tissue culture dish(IWAKI)に播種した。播種24時間後、細胞密度90〜95%の状態のときに、Lipofectamine2000(インビトロジェン社製)を用いて、2−5で構築されたウイルスベクタープラスミドpQeGTREtTAWとpVSV−Gのコトランスフェクションを行った。トランスフェクションはLipofectamine2000のプロトコールに準じて行い、トランスフェクション時の培地としては10mM HEPES入りのDMEMを用いた。その後、超遠心によりウイルスを濃縮し、インジェクション実験に用いた。また、2−6で構築したpQeGOVAtTAWと3−2で構築したpQeGTREDsRedWの各ベクターに関しても上記と同様にpVSV−Gとのコトランスフェクションを行い、ウイルス濃縮を行った。
マイクロインジェクションによるトランスジェニックニワトリの作製は、国際公開第2004/016081号パンフレットおよび特開2004−236626号公報で実施の手法に従った。
インジェクションに用いたウイルスベクターは組織特異的にtTA遺伝子の発現を解析するため、実施例4記載の手法により得られたpQeGOVATREtTAレトロウイルスベクターをニワトリ受精卵55時間孵卵胚の心臓にマイクロインジェクションしてG0トランスジェニックニワトリを作製した。またコントロールとしてOVA配列を持たないpQeGTREtTAWレトロウイルスを同様に用いてG0トランスジェニックニワトリを作製した。
またターゲット遺伝子として蛍光タンパク質をコードするDsRedを組みこんだpQeGTREDsRedWとpQeGOVATREtTAWの2つのウイルスベクターを混合してインジェクションし、卵管特異的に発現するtTAにより増強されたDsRedタンパク質発現の組織特異性を解析した。
インジェクション後の胚体外培養法は同様に国際公開第2004/016081号パンフレットおよび特開2004−236626号公報で実施の手法に従い、G0トランスジェニックニワトリを孵化させた。
6−1 ステロイドホルモンによる誘導
マイクロインジェクション及び胚体外培養により得られたトランスジェニックニワトリ(G0個体)2週齢の筋肉、特に胸筋に100%エタノールに溶かしたdiethylstilbestrol(DES:Sigma)10mg/mlを0.1ml/dayで10日間、連続投与を行うことで、Estrogen誘導により輸卵管の膨大部を肥大させた。その後、5日以上何も処理しない状態を経て再び1週間以上DESのインジェクションを行い、解剖を行った。
ホルモン処理の済んだ野生型のニワトリ及びトランスジェニックニワトリを解剖し、各組織のサンプリングを行った。サンプリングされた組織からtotal RNA及びgenome DNAを取得し、real−time PCRにより目的遺伝子の発現解析を行った。
PBSでよく血を洗い流した各組織から極少量の組織を切り取り、それをハサミで出来るだけ細かく切った。それから、QuickPrep Total RNA Extraction Kit(登録商標、TAKARA社製)を用いて得られたtotal RNAの濃度をBioPhotometer(eppendorf)で測定し、一定濃度に希釈をし、逆転写反応を行った。RNA取得の操作はプロトコールに準じた。また、逆転写反応にはReverTra Ace(TOYOBO)を用いた。一定濃度に合わせたtotal RNAと10pmol/μl Oligo(dT)1μlを混ぜた計12μlを70℃で10分間反応させ、氷上で15分静置した。その溶液に5×Bufferを4μl、2mM dNTPsを5μl加え、よく懸濁し、42℃で5分間反応させた。その後、ReverTra Aceを1μl加え42℃で50分間の逆転写反応を行い、70℃で15分酵素の失活処理を行い、氷上で10分静置した。
まず、PBSでよく血を洗い流した各組織から極少量の組織を切り取り、それをハサミで出来るだけ細かく切った。MagExtactor−Genome−を用いてgenome DNAを取得した。操作はプロトコールに従った。尚、MagExtactor−Genome−の溶解・吸着液を組織に加えた後、22Gテルモ注射針(TERUMO)及び1mlツベルクリン用26G注射針付テルモシリンジを用いて組織の塊を非常に細かくすることでgenome DNAの収量を増加させた。genome DNA濃度はBioPhotometerで測定した。
LightCycler FastStart DNA Master HybProbe(登録商標、Roche)を用いて、6−2−1、6−2−2で取得したcDNA及びgenome DNAそれぞれのreal−time PCRを行った。操作はプロトコールに準じた。使用したチップ、エッペンチューブ、希釈用のMilliQ水は2回オートクレーブにより滅菌し、一晩以上UV滅菌しておいた。ピペットマンはプラスミドを扱っていないgenome DNA専用のものを用いた。尚、cDNAの定量にはtTAプライマー及びプローブのセット、genome DNAの定量にはパッケージングシグナルを検出可能なパッケージングシグナルプライマー及びプローブのセットを用いた。
Mg2+濃度は4mM、アニーリング温度は58℃のときLightCyclerによる特異的かつ効果的な増幅が見られたため、この条件でreal−time PCRを行った。どちらのプローブを用いた時も下記の条件で行った。
95℃、10min、20℃/s 1cycle
(区分1)95℃、10s、20℃/s(区分2)58℃、15s、20℃/s(区分3)72℃、5s、20℃/s 45cycle
40℃、30s、20℃/s 1cycle
5’プライマー(配列表配列番号17)
3’プライマー(配列表配列番号18)
3’FITC (配列表配列番号19)5’LCRed640 (配列表配列番号20)
7−1 pET−OVA△PvuIIの構築
実施例1によって得られた約2.3kbpのオボアルブミンプロモーター配列をさらに切り詰め、組織特異性を示しつつさらに短くするべく以下のベクターを構築した。実施例1−5で得られたpET−OVAを制限酵素PvuII(TaKaRa)で消化し、切断したベクターをセルフライゲーションした。このベクターを再度、制限酵素PvuIIで消化後、pET−OVAを制限酵素PvuIIで消化して得られる200bpの断片をインサートとしてライゲーションした。このベクターをpET−OVA△PvuIIとした。
実施例1−5で得られたpET−OVAを制限酵素BglII(TaKaRa)と制限酵素XhoI(TaKaRa)で消化した後、Klenow(TaKaRa)を用いてブラントエンドとした後セルフライゲーションした。このベクターをpET−OVA△BglIIXhoIとした。
実施例2と同様の手法により、上記7−1で得られたpET−OVA△PvuII、および上記7−2で得られたpET−OVA△BglIIXhoIをウイルスベクター化した。このベクターをそれぞれpQeGOVA(ΔPvuII)TREtTAW、pQeGOVA(ΔBglIIXhoI)TREtTAWとした。
実施例4と同様にpQeGOVA(ΔPvuII)TREtTAWおよびpQeGOVA(ΔBglIIXhoI)TREtTAWレトロウイルスベクターを産生させた。
上記7−4で得られたレトロウイルスベクターを用いて実施例5と同様にトランスジェニックニワトリを作製した。
実施例6と同様に、ホルモン処理した個体より卵管組織を摘出し、total RNA抽出およびgenome DNAを抽出し、リアルタイムPCRによりtetR/mosaicを算出した(図7)。
Claims (19)
- 遺伝子発現用プロモーターであって、オボアルブミンプロモーターの、
a)ホルモン依存性DNaseI超感受性部位IIIの全部または一部を有し、
b)ホルモン依存性DNaseI超感受性部位I及び/またはホルモン依存性DNaseI超感受性部位IIを含まず、
c)鳥類において卵管特異的に機能し、3kbp以下でかつ1.0kbpを超え、
d)TATAボックスを含む、
部分領域からなるプロモーター。 - オボアルブミンプロモーターが鳥類オボアルブミンプロモーターである請求項1に記載のプロモーター。
- 鳥類オボアルブミンプロモーターがニワトリオボアルブミンプロモーターである請求項2に記載のプロモーター。
- ニワトリオボアルブミンプロモーターが配列表配列番号1に記載のニワトリオボアルブミンプロモーターである請求項3に記載のプロモーター。
- 配列番号2に示す塩基配列からなるか、又は、配列番号2に示す塩基配列と80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ鳥類において卵管特異的に機能する活性を有するプロモーター。
- 配列番号3に示す塩基配列からなるか、又は、配列番号3に示す塩基配列と80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ鳥類において卵管特異的に機能する活性を有するプロモーター。
- 請求項1から6のいずれか1項に記載のプロモーターを有するウイルスベクター。
- レトロウイルスベクターである請求項7記載のウイルスベクター。
- 更に外来目的タンパク質遺伝子が組込まれた請求項8記載のウイルスベクター。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のプロモーターがアクチベータータンパク質の卵管特異的発現を誘導し、該アクチベータータンパク質によりシス及び/またはトランスに外来目的タンパク質遺伝子の発現を誘導する請求項9記載のウイルスベクター。
- 更にエンハンサー、シグナル配列、転写後調節因子を有する請求項10記載のウイルスベクター。
- 請求項7〜11のいずれか1項に記載のウイルスベクターにより作製されたトランスジェニック鳥類。
- ウイルスベクターを鳥類受精卵の発生段階において胚胎の心臓にマイクロインジェクションし、孵化させることにより得られる請求項12のトランスジェニック鳥類。
- 請求項12又は13記載のトランスジェニック鳥類を他鳥類と交配し得られる後代トランスジェニック鳥類。
- 雌個体の卵管細胞で優位に外来目的タンパク質を発現する請求項14記載の後代トランスジェニック鳥類。
- 請求項15の後代トランスジェニック鳥類により産卵される、卵白または卵黄に外来目的タンパク質を含有する卵。
- 請求項12又は13に記載のトランスジェニック鳥類、又は、請求項14又は15に記載の後代トランスジェニック鳥類による外来目的タンパク質の生産方法。
- 外来目的タンパク質が、抗体、サイトカイン、インスリン、ホルモン、生理活性タンパク質又はこれらからなる融合タンパク質である請求項17記載の外来目的タンパク質の生産方法。
- トランスジェニック鳥類がトランスジェニックニワトリである請求項17又は18記載の外来目的タンパク質の生産方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007061038A JP5173218B2 (ja) | 2007-03-09 | 2007-03-09 | オボアルブミンプロモーターによる卵白特異的物質生産 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007061038A JP5173218B2 (ja) | 2007-03-09 | 2007-03-09 | オボアルブミンプロモーターによる卵白特異的物質生産 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008220224A true JP2008220224A (ja) | 2008-09-25 |
JP5173218B2 JP5173218B2 (ja) | 2013-04-03 |
Family
ID=39839558
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007061038A Expired - Fee Related JP5173218B2 (ja) | 2007-03-09 | 2007-03-09 | オボアルブミンプロモーターによる卵白特異的物質生産 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5173218B2 (ja) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000512149A (ja) * | 1996-06-12 | 2000-09-19 | ボード オブ トラスティーズ オペレイティング ミシガン ステイト ユニバーシティ | トランスジェニック雌鳥の卵におけるタンパク質の組織特異的合成のためのベクターおよび方法 |
JP2001520009A (ja) * | 1997-10-16 | 2001-10-30 | ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド | 鳥の導入遺伝子についてのマグナム特異的プロモーターを含むベクター |
JP2004236626A (ja) * | 2003-02-07 | 2004-08-26 | Univ Nagoya | 遺伝子導入鳥類及びそれを用いたタンパク質の生産方法 |
WO2007072611A1 (ja) * | 2005-12-21 | 2007-06-28 | Meiji University | 卵管特異的な遺伝子発現を誘導するdna |
-
2007
- 2007-03-09 JP JP2007061038A patent/JP5173218B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000512149A (ja) * | 1996-06-12 | 2000-09-19 | ボード オブ トラスティーズ オペレイティング ミシガン ステイト ユニバーシティ | トランスジェニック雌鳥の卵におけるタンパク質の組織特異的合成のためのベクターおよび方法 |
JP2001520009A (ja) * | 1997-10-16 | 2001-10-30 | ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド | 鳥の導入遺伝子についてのマグナム特異的プロモーターを含むベクター |
JP2004236626A (ja) * | 2003-02-07 | 2004-08-26 | Univ Nagoya | 遺伝子導入鳥類及びそれを用いたタンパク質の生産方法 |
WO2007072611A1 (ja) * | 2005-12-21 | 2007-06-28 | Meiji University | 卵管特異的な遺伝子発現を誘導するdna |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6012022757; EMBO J.,Vol.5,No.2(1986)p.277-285 * |
JPN6012022758; JMB,Vol.156(1982)p.1-19 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5173218B2 (ja) | 2013-04-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7378086B2 (en) | Retroviral vector having an ovalbumin promoter | |
JP6377095B2 (ja) | 鳥の導入遺伝子についてのマグナム特異的プロモーターを含むベクター | |
US20130276153A1 (en) | Production of Transgenic Avians Using Improved Retroviral Vectors | |
US20040234504A1 (en) | Methods of inhibiting gene expression by RNA interference | |
JP6004290B2 (ja) | 不活化された内因性遺伝子座を有するトランスジェニックニワトリ | |
US20140298504A1 (en) | Transgenic chickens with an inactivated endogenous gene locus | |
US9157097B2 (en) | Vectors for production of growth hormone | |
Min et al. | Generation of antiviral transgenic chicken using spermatogonial stem cell transfected in vivo | |
JP2003501083A (ja) | 鳥類ゲノムを操作するための方法 | |
NZ578390A (en) | Transgene expression in avians using oviduct specific promoters and SIN vectors | |
CN106978416B (zh) | 一种基因定位整合表达系统及其应用 | |
JP2006262875A (ja) | 鳥類の卵管内でタンパク質を発現させるための遺伝子構築物、およびこれを用いたタンパク質の生産方法 | |
JP5173218B2 (ja) | オボアルブミンプロモーターによる卵白特異的物質生産 | |
US20070190601A1 (en) | Modified integrase and methods of use | |
WO2005021769A1 (ja) | レンチウイルスベクターによる遺伝子導入鳥類作製法及びそれによって得られる遺伝子導入鳥類 | |
Chandrashekran et al. | Generating transgenic mice by lentiviral transduction of spermatozoa followed by in vitro fertilization and embryo transfer | |
AU769622B2 (en) | Tissue specific synthesis of protein in eggs of transgenic hens | |
JP2007275004A (ja) | レンチウイルスベクターの精巣への感染による遺伝子組換え鳥類作製法 | |
MXPA98010665A (en) | Vectors and methods for synthesis specific to protein tissue ingengos de gallinas transgeni | |
NZ503901A (en) | Transgenic avians containing replication-defective retroviral vectors and methods for tissue specific synthesis of protein in eggs laid by the avian or female progeny thereof. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100224 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20100224 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120508 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120705 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120918 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121109 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20121204 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20121227 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5173218 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160111 Year of fee payment: 3 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |