JP2006512062A - トランスジェニック鳥類におけるタンパク質産生 - Google Patents

Abstract

本発明は、レンチウィルスベクター系を用いて外因性遺伝物質を移行するトランスジェニック鳥類の作製方法に関する。本発明はさらに、トランスジェニック鳥類による、好ましくは卵白内でのタンパク質の生産、および鳥類の卵における発現の見込みの試験方法に関する。

Description

本発明は、トランスジェニック鳥類の作製および組換えタンパク質の産生に関する。より詳細には、本発明は、外因性遺伝物質による鳥細胞の形質導入の改善に関する。これにより、遺伝物質を鳥ゲノムに組み込んでその修飾が生殖細胞系列（germline）に組み込まれるようにし、その結果、コードされたタンパク質が鳥の卵の中で発現される。

バイオテクノロジー分野および医薬分野において、医薬グレードタンパク質の大量生産能力が益々重要になってきている。最近、市場におけるこのような製品、とりわけモノクローナル抗体製品の成功により、生産設備は、既に世界規模に拡大しているにもかかわらず重圧に直面している。この製造能力に対する高い要求をはじめ、その結果生じるプレミアの問題、生産スペース取得のための待ち時間の長さ、さらに、細胞系を用いたタンパク質産生に要するコストやこれに伴う種々の問題によって、各社は、伝統的な生産形態とは異なる生産方法を模索するようになった（アンダーソン（Andersson）およびマイナハン（Myhanan）、２００１）。伝統的な組換えタンパク質製造方法は、例えば細菌細胞や哺乳動物細胞内で産生させるものであった。これに替わる一製造方法として出現したのがトランスジェニック動物やトランスジェニック植物を使用してタンパク質を産生させる方法である。

遺伝子修飾された（トランスジェニック）動物の最初の作製は、遺伝子操作によって得られた。すなわち、目的のタンパク質をコードする遺伝子を、ターゲット動物に組み込んだ。現在のトランスジェニック技術は、１９６８〜１９８１年に行われた一連の重要な実験、例えば、胚性幹細胞の胚盤胞注入によるキメラマウスの作製（ガードナー（Gardner）、１９６８）や、精子を用いたウサギ卵母細胞への外来ＤＮＡの移送（ブラケット（Brackett）ら、１９７１）、着床前胚盤胞へのウィルスＤＮＡ注入によるトランスジェニックマウスの作製（ジャニッシュ（Jaenisch）およびミンツ（Mintz）、１９７４）、マウスにおける前核注入によるトランスジーンの生殖細胞系列伝達（germlinetransmission）（ゴードン（Gordon）およびルドル（Ruddle）、１９８１）等を起源とするものである。トランスジェニック技法の歴史の初期においては、動物の遺伝的性質の改善ひいては木綿や肉、卵の収量の改善に焦点が当てられていた（カーティス（Curtis）およびバーンズ（Barnes）、１９８９；エッチズ（Etches）およびギビンズ（Gibbins）、１９９３）。しかしながら、近年においては、医療用途、例えば臓器移植やヒト疾患モデル、ヒト用途に特化したタンパク質の産生のためのトランスジェニック系の使用が注目されている。

種々のタンパク質系バイオ医薬が、トランスジェニックのマウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシのミルク中に適度なレベルで産生させることにより生産されてきたが、このような系は世代時間の長いものが多く、大型哺乳類の中には、初代トランスジェニックが生まれてからミルクを出すようになるまで数年かかるものもある。さらに、ミルクの生化学的複雑性やヒトと哺乳類の進化過程における保存性の相違に関する問題もある。進化過程における保存性の相違により、医薬を生産している哺乳類の体内で、その医薬に対する好ましくない反応が惹き起されることもある（ハーベイ（Harvey）ら、２００２）。

医薬として重要なタンパク質、とりわけ組換えヒト抗体の媒体として使用できる可能性のあるものとして、鶏卵の使用に対する注目が高まっている。医療界が一年に必要とする治療用途の抗体の量は膨大であり、年間キログラム乃至メートルトンにもなるため、この不足を解決できる製造手法があれば、非常に有利であろう。一旦最適化さえされれば、鶏卵に基づく製造方法は、哺乳類細胞培養やトランスジェニック哺乳類系の使用に優る利点が幾つかある。

第１の利点は、ニワトリの世代時間は短い（２４週）ことである。このため、トランスジェニック群はすぐに確立できるであろう。表１に、種々のトランスジェニック系の比較を示す。

第２の利点は、細胞培養に比べ、トランスジェニック動物作製設備への資本投資が非常に少ないことである。特別な処理装置は、細胞培養に必要な装置に比べ極力少なくできる（BioPharm、２００１）。これら資本投資が少なくて済む結果、医薬の単位あたりの製造コストは、細胞培養により製造した場合に比べ低くなるであろう。さらに、トランスジェニック系を用いた場合、精製バッチサイズと精製頻度に関しかなりの柔軟性を持たせることができ、バッチサイズの最適化により精製における資本コストおよび運転コストをさらに削減することができる。

第３の利点は、より早く市場に出せるという点であり、これは、技術が商業的に実行できる程度にまで発展したときに明らかとなるであろう。トランスジェニック哺乳類は、ミルク１Ｌあたり数グラムのタンパク質を産生できるため、商業的大規模生産が可能である（ウエック（Weck）、１９９９）。哺乳類は、生産規模を拡大するのに要する時間に関してはそれ程大きな利点はない。というのは、ウシ、ヤギの妊娠期間はそれぞれ９ヶ月、５ヶ月であり（ダブ（Dove）、２０００）、商業的に実行可能な群れを作るのに長くて５年もかかることがある。しかしながら、一旦群れを確率してしまえばミルクから高い収量で得られるようになるであろう。

鳥類は世代時間が短いので、迅速な規模拡大が可能である。ニワトリの孵化期間は２１日にすぎず、孵化後６ヶ月以内に成熟に達する。実際、群れの初代動物が確立されてしまえば、１８ヶ月以内に群れが確立できる（ダブ（Dove）、２０００）。生産能力の拡大は、ヒツジやヤギ、ウシの場合よりも簡単な方法で且つかなり迅速に達成できる筈である。

さらに別の利点は、卵が天然の殺菌容器であることである。細胞培養による生産方法に伴う本質的な一問題点は細菌汚染の危険である。これは、使用する媒体が栄養分に富んでいるため、細菌が増殖しやすいためである。これに比べ、トランスジェニックによる生産では、タンパク質が産生されるのは動物自身の体内であり、動物の体は殆どの感染に対し抵抗性を有しているため、感染の危険はより低い。鶏卵はさらに危険が低い。すなわち、卵は殻と膜の中に密封されているため、周囲とは充分に隔離されている。ヒトと鳥類の進化論的距離から見れば、両者に共通する疾患は殆どない。

さらに別の潜在的な利点は、ニワトリタンパク質の翻訳後修飾にある。現在、産生されるタンパク質に天然の糖プロファイルをどの程度上手く再生できるかという点が、生産技術の成功において鍵を握る要素として認識されている（パレック（Parekh）ら、１９８９；ルーティエル（Routier）ら、１９９７；モロウ（Morrow）、２００１；ラジュ（Raju）ら、２０００、２００１）。細胞培養手法に使用される主要な細胞のタイプは、ハムスター由来またはマウス由来であり、ヒト細胞と同一の糖パターンをタンパク質上に形成しない（スクリップ（Scrip）、２００１年６月８日）。哺乳類トランスジェニック系および、特に植物トランスジェニック系においては、種々の発現タンパク質について異なる翻訳後修飾を示す。糖プロファイルは、ヒト免疫系がタンパク質に対しどのように反応するかを定める極めて重要なものである。ラジュ（Raju）ら（２０００）は、ニワトリグリコシル化タンパク質が有する糖プロファイルは、非ヒト哺乳類タンパク質の糖プロファイルよりもヒトグリコシル化タンパク質の糖プロファイルに類似しており、医薬品を開発する上で、非常に有利であることを見出した。

したがって、鳥類の卵、とりわけ鶏卵には、生産手段としての細胞培養や哺乳類または植物に基づく他のトランスジェニック生産システムに優る幾つかの大きな利点があることが分かる。これまで、トランスジェニック哺乳類の作製に用いた方法を鳥類の遺伝子操作に直接適用しても、放卵中の雌鶏の繁殖系特有の問題のため成功しなかった。雌鶏は、自然受精または人工授精後約１０日間、受精卵を放卵する。放卵は１日１回であり、卵管の先端に卵子があるため、殆どすぐに受精が起こる。卵は、その後２０〜２４時間は卵管内に留まる。卵管内では、アルブメン（卵白）が卵黄を取り囲んでおり、プランピング液（plumping fluid）がアルブメンに添加されて、最終的に殻膜と卵殻自体とが形成される。この間の細胞分裂は活発であり、放卵までに、胚は、胞胚葉、すなわち比較的未分化の細胞約６万個からなる盤が卵黄上に形成された状態になる。

卵の形成過程は複雑であり、ニワトリ胚発生の最も初期のステージは他のステージに比べアクセスしにくい。初期ステージの胚にアクセスするのに使用される方法では、通常、ドナー雌鶏を犠牲にして胚を得るか、卵管への直接注入を用いる。これまでのトランスジェニック哺乳類作製方法は、殆ど受精卵のマイクロインジェクションのみに焦点を当てており、マイクロインジェクションによりＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで前核に注入し、操作後の卵を代理母に移行して満期まで生育する。この方法は雌鶏では実現できない。これまでに主に４種類のトランスジェニック鳥類創製方法が開発された。

第一は、芽盤の細胞質へのＤＮＡマイクロインジェクションによりトランスジェニックニワトリを作製する方法である。放卵中の雌鶏の卵管から、最初の卵割分裂の前のニワトリ接合体を採取し、代理卵殻（surrogate shells）に移行後、操作し培養して孵化させる（ペリー（Perry）、１９８８；ロスリン（Roslin）ＵＳ５０１１７８０およびＥＰ０２９５９６４）。ラブ（Love）ら（１９９４）は、少なくとも１２日の培養期間経過後に生残している胚を分析し、約半分の胚がプラスミドＤＮＡを含んでいること、そして６％は細胞あたりのコピー数が１のレベルであることを示した。注入した卵子の全数の５．５％にあたる７羽の雛は性成熟まで成育した。そのうちの１羽の雄鶏は潜在的モザイクトランスジェニックトリとして特定されたが、この一羽はその子孫の３．４％にトランスジーンを伝達していた。これらトリは、安定したトランスジーン伝達を示すまで生育された。前核注入により作製されたトランスジェニックマウスと同様、プラスミドＤＮＡの組込みは明らかにランダムイベントである。しかしながら、卵への直接ＤＮＡマイクロインジェクションは、トランスジーン組込み効率が低い（サン（Sang）およびペリー（Perry）、１９８９）。マイクロインジェクションを行った卵子の１％しかトランスジェニック胚を形成せず、孵化に至るのはこの内の１０％であると見積もられる。この方法の効率は、培養胚の生存率および注入ＤＮＡの染色体組込み頻度を高めることにより改善できる。

第２の方法は、始原生殖細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションと、適切に準備されたレシピエントへの移植とを行うものである。始原生殖細胞の移行は成功し、移行した生殖細胞から生育可能な配偶子が得られている。しかしながら、トランスジェニック子孫を移行前の始原生殖細胞への遺伝子導入により得ることについては、何ら文献報告がない。

第３の方法は、癌遺伝子レトロウィルス由来の遺伝子導入ベクターを使用するものである。初期のベクターは複製可能（replication competent）であった（サルター（Salter）、１９９３）が、複製欠陥を有するベクターも発生した（米国特許５１６２２１５、ＷＯ９７／４７７３９等参照）。これらの系は、Ａ型細網内皮症ウィルス（ＲＥＶ−Ａ）または鳥類白血病ウィルス（ＡＬＶ）を用いている。これらベクターの初代トランスジェニックトリ作製効率は低く、これら初代からのベクター遺伝も効率的でない（ハーベイ（Harvey）ら、２００２）。文献が示唆する低タンパク質発現レベル（ハーベイ（Harvey）ら、２００２）からわかるように、これらベクターはまた、保持しているトランスジーン発現のサイレンシングの影響を受けてしまうことがある。

第４の方法は、ニワトリ胚細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した後、これら培養細胞をレシピエントの胚に導入してキメラのトリを作製するものである（ペイン（Pain）ら、１９９６）。この胚細胞には、キメラ作製前にｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝修飾を行うことができ、この場合キメラのトランスジェニックトリが作製される。しかしながら、遺伝的修飾を施した細胞からの生殖細胞系列伝達（germline transmission）についての報告はされていない。

上記のように、ＡＬＶやＲＥＶ等のウィルス由来のレトロウィルスベクターについて多くの研究がなされてきたが、このようなベクターには制限があるため、さらに広範な用途での使用の障害となっている。このようなウィルスベクターの研究開発の多くは、遺伝子治療用途における使用に基づくものであり、成果として、レンチウィルスに基づくベクターは非分裂細胞を感染させることができることが示された。これは明らかに、臨床遺伝子治療用途に有利である。レンチウィルスは、ヒト免疫不全ウィルスＨＩＶ−１および２、類人猿免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）等の種々の霊長類ウィルスや非霊長類ウィルス（例えばマエディ・ビスナウィルス（ＭＶＶ）、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウィルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎・脳脊髄炎ウィルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウィルス（ＢＩＶ））を含むレトロウィルスのサブグループである。これらウィルスはとりわけ遺伝子治療処置の開発において注目されている。というのは、レンチウィルスは宿主細胞ＤＮＡへの不可逆組込みという一般的なレトロウィルス特性を有しているだけでなく、既に述べたように、非増殖細胞を感染させる能力を有するためである。レンチウィルス以外の種のレトロウィルスは細胞増殖状態に依存性があるため、遺伝子導入媒体としての使用に何らかの制限が生じてしまう。レンチウィルス感染の生物学的側面については、コフィン（Coffin）ら（１９９７）やサンジャイ（Sanjay）ら（１９９６）を参照することができる。

ウィルスベクターの設計において考慮すべき重要な点は、細胞のゲノムに安定して組み込まれる能力である。これまでの研究から、遺伝子導入媒体としての癌レトロウィルスベクターを使用しても、発生過程における遺伝子サイレンシング作用のため、幾分限定された成功しか得られないことが分かっている。ジャナー（Jahner）ら（１９８２）は、モロニーマウス白血病ウィルス（MoMLV）等に基づくベクターの使用は、発生フェーズにおけるウィルスのサイレンシングのため、トランスジェニック動物作製には適さず、トランスジーンの発現は非常に低いことを示した。したがって、トランスジェニックトリの作製に使用するためのウィルスベクターはいずれも遺伝子サイレンシングを示さないことが必須である。マウスに関するファイファー（Pfeifer）ら（２００２）やロイス（Lois）ら（２００２）の研究により、ＨＩＶ−１に基づくレンチウィルスベクターは発生の過程においてサイレンシングされないことが示されている。

レンチウィルスベクターに関する開発研究は全体として、ＨＩＶ−１系に焦点を当てている。これは主に、ＨＩＶは、ヒトにおける高い病原性のためレンチウィルスの特徴を最も良く現しているからである。このようなベクターは、調節遺伝子や付属遺伝子を除去して複製させないようにすることにより、複製不可能となるように遺伝子操作されることが多い。これらベクターのうち最も進んだものは、調節遺伝子の殆ど全てと付属遺伝子の全てを取り除いた程度まで極力小さくしたものである。

レンチウィルス属は、例えば、類似のゲノム構成、類似の複製サイクル、成熟マクロファージを感染させる能力等、多くの類似した特徴を有している。（クレメンツ（Clements）およびペイン（Payne）、１９９４）。このようなレンチウィルスの一例はウマ伝染性貧血ウィルス（ＥＩＡＶ）である。レンチウィルス属の他のウィルスと比較すると、ＥＩＡＶのゲノムは比較的単純である。すなわち、ゲノムを構成する遺伝子は、レトロウィルスｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子の他、３の調節／付属遺伝子（ｔａｔ、ｒｅｖおよびＳ２）だけである。安全で効率的なレンチウィルスベクター系の開発は、ベクター自体の設計に依存する。形質導入ベクター機能を保持したままベクターのウィルス成分を極力少なくすることが重要である。あるＥＩＡＶ由来のベクター系は、分裂細胞および非分裂細胞を形質導入し、ＨＩＶ系ベクターと同程度の効率を示した（ミトロファナス（Mitrophanous）ら、１９９９）。癌レトロウィルスベクター系およびレンチウィルスベクター系は、形質導入可能な細胞の種類および種の範囲を広げるように修飾することができる。これは、ウィルスのエンベロープ糖タンパク質を他のウィルスのエンベロープタンパク質に置換することにより達成できる。他のウィルスのエンベロープタンパク質としては、アンホトロピックＭＬＶエンベロープ糖タンパク質（ページ（Page）ら、１９９０）、バキュロウィルスＧＰ６４エンベロープ糖タンパク質（クマール（Kumar）ら、２００３）、アデノウィルスＡＤ５繊維タンパク質（ボン・セゲン（Von Seggern）ら、２０００）、狂犬病Ｇ−エンベロープ糖タンパク質（マザラキス（Mazarakis）ら、２００１）、水疱性口内炎ウィルスＧ−タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（イー（Yee）ら、１９９４）等が挙げられる。また、ＶＳＶ−Ｇのシュード・タイピング（pseudotyping）を使用すると、ウィルス粒子の安定性が増し、より高い力価でウィルスを産生できる。

本発明の目的は、トランスジーンコンストラクトを鳥類胚細胞に導入し、組織内、特に卵管を覆う細胞内で遺伝子を発現するトランスジェニックトリを創製し、翻訳されたタンパク質がその卵に取り込まれるようにする効率的な方法を提供することである。但し、遺伝子を発現させる組織はこれらに限定されるものではない。

本発明の別の目的は、鳥類胚細胞へ遺伝子を導入し、トランスジーンが生殖細胞の一部または全部に安定して取り込まれたトランスジェニックトリを創製するための媒体および方法を提供することである。その結果、トランスジーンはそのトランスジェニックトリの子孫の一部に伝達される。この生殖細胞系列伝達の結果、初代トリの子孫の一部は、変更された遺伝子型を示すようになる。

本発明のさらに別の目的は、生殖系列トランスジェニックトリを高効率で作製でき且つトランスジーンの信頼性の高い発現を可能とする、鳥類の効率的な遺伝子修飾方法を提供することである。

本発明によると、レンチウィルスベクター系を用いて外因性遺伝物質を鳥類の胚細胞または精巣細胞に移行する段階を含む、トランスジェニック鳥類の作製方法が提供される。

レンチウィルスベクター系は、鳥類の胚細胞または精巣細胞のゲノムに移行されうるあるいは該ゲノムに組み込まれうる形態のレンチウィルストランスジーンコンストラクトを含む。

好ましくは、レンチウィルスベクター系の移行または組込みは、細胞分裂が数回（a few）しか行われていない初期卵割等の発生初期ステージで行う。

一実施形態においては、レンチウィルストランスジーンコンストラクトを、開いた卵の内容物の胚下腔（subgerminal cavity）に注入し、その後この卵を発育させる。

代理卵殻のペリー培養系を用いることができる。

別の方法としては、卵に窓を開けるボッセルマン（Bosselmann）らの方法またはスペックスニジャー（Speksnijder）とイヴァリエ（Ivarie）の方法を使用できる。これらの方法では、放卵されたばかりの卵の胚へのアクセスは、卵の殻に窓を切り欠き、レンチウィルスベクター系を胚の胚下腔に注入することにより行う。その後、卵を密封してインキュベートする。

別の実施形態においては、コンストラクトは卵の胞胚下腔に直接注入される。

通常、前記遺伝物質はタンパク質をコードしている。

前記遺伝物質は、ヒトおよび／または脊椎動物のための治療および診断等の各種用途に使用される多種のタンパク質のいずれかをコードすることができる。また、この遺伝物質は、抗体、抗体断片、抗体誘導体、一本鎖抗体断片、融合タンパク質、ペプチド、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、成長因子、任意の組換えタンパク質をコードする配列を含むことができる。

このようにして、本発明はトランスジェニック鳥類を提供する。

好ましくは、本発明の方法により作製されたトランスジェニック鳥類の生殖細胞の少なくとも一部には、前述の遺伝物質が、トランスジェニック鳥類の子孫の少なくとも一部に伝達されるように組み込まれている。

また、本発明は、トランスジェニック鳥類の作製におけるレンチウィルスベクター系の使用を提供する。

驚くべきことに、本発明に記載されたレンチウィルストランスジーンコンストラクトの使用により、鳥類の胚の生殖細胞の形質導入が意外な程高効率で行えることがわかった。得られた鳥類はさらに、組み込まれたベクターを、子孫の大きな割合を占める部分に伝達し、ベクターに保持されたトランスジーンの発現レベルは比較的高い。

このようにして本発明は、さらに後代のトランスジェニック鳥類を提供する。

本発明はさらに、レンチウィルスベクターコンストラクト内に存在するタンパク質コード遺伝物質を鳥類胚細胞に移行し、組織内でこの遺伝物質を発現するトランスジェニック鳥類を創製する段階を含む、鳥類における異種タンパク質産生方法を提供する。

好ましくは、トランスジェニック鳥類は前記遺伝子を卵管において発現し、翻訳されたタンパク質が卵に取り込まれる。

次いでタンパク質は、公知の方法により卵から単離できる。

本発明は、トランスジェニック鳥類の作製のための、レンチウィルスコンストラクトの使用を提供する。

本発明は、トランスジェニック鳥類におけるタンパク質産生のための、レンチウィルスベクターコンストラクトの使用を提供する。

好ましくは、レンチウィルスベクターコンストラクトは、特定の組織、好ましくは卵白または卵黄において異種タンパク質を発現させるために使用される。

この用途に用いるレンチウィルスは任意のレンチウィルスベクターとすることができるが、好ましくは、ＥＩＡＶ、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＢＩＶおよびＦＩＶからなる群から選択される。

特に好ましいベクターはＥＩＡＶである。

市販のレンチウィルスベクターはいずれも、外因性遺伝物質を移行するためのコンストラクトの基礎として好適に使用できる。

好ましくは、コンストラクトは、後にタンパク質を産生するのに適したエンハンサープロモーター要素を含む。

レンチウィルスベクターコンストラクトと共に特定のプロモーターを用いることもでき、この場合ＤＮＡコード配列は組織特異的に発現する。このプロモーターとしては、ＣＭＶやｐＣＡＧＧＳ等のプロモーターや、鳥類の卵において通常発現するタンパク質に基づく任意のプロモーター、例えばオボアルブミン、リゾチーム、オボトランスフェリン、オボムコイド、オボスタチン、リボフラビン結合タンパク質、アビジン等が挙げられる。

好ましくは、ベクターコンストラクト粒子は市販のパッケージングシステムによりパッケージ化され、エンベロープ、通常はＶＳＶ−Ｇエンベロープを有するベクターが産生される。

通常、ベクターは、ＡＴＣＣから入手可能な受託番号ＶＲ−７７８のＥＩＡＶ、または他の市販のベクターに基づくものとすることができる。

市販のレンチウィルス系ベクターは、本発明の各方法において使用するためには、生きたウィルスを産生することなく多様な種を感染させることができ、且つ細胞毒性または組織毒性を惹き起こさないものでなければならない。

本発明の各方法によって任意のトランスジェニック鳥類を作製することができる。鳥類としては、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ウズラ、ガチョウ、ダチョウ、キジ、クジャク、ホロホロチョウ、ハト、ハクチョウ、チャボ、ペンギン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

これらレンチウィルスに基づくベクター系の遺伝子転換能（transgene capacity）は大きく、抗体コードコンストラクト等の大型のタンパク質コードコンストラクトを保持することができる。

好ましいレンチウィルスベクター系は、オックスフォードバイオメディカ（Oxford BioMedica）のＬｅｎｔｉＶｅｃｔｏｒ^（Ｒ）系である。

本発明はさらに、鳥類卵管細胞におけるタンパク質の発現をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する段階を含む、タンパク質発現の見込みをｉｎ ｖｉｖｏで測定する方法を提供する。

したがって、本発明は、タンパク質発現の見込みをｉｎ ｖｉｖｏで測定するための、鳥類細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用を提供する。

本発明によれば、トランスジーンコンストラクトを鳥類胚細胞に導入し、組織内、特に卵管を覆う細胞内で遺伝子を発現するトランスジェニックトリを創製し、翻訳されたタンパク質がその卵に取り込まれるようにする効率的な方法を提供することができる。

次に、各種実験および添付図面を参照しつつ本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実験に限定されるものではない。

（実験１）
発生ステージＸ−ＸＩＩＩ（イヤル−ギラディ（Eyal-Giladi）およびコチャブ（Kochav）、１９７６）のニワトリ発生胚を含む放卵されたばかりのニワトリ受精卵を得た。その内の１個の卵を開き、内容物を皿に移し、レンチウィルスベクターウィルス粒子の浮遊液（２〜３μＬ）を胚下腔（発生胚の下、卵黄の上）に注入した。使用したベクターは、ウマ伝染性貧血ウィルス（ＥＩＡＶ）由来であり、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）エンハンサー／プロモーターの制御下においてレポーター遺伝子（β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ））を保持していた。パッケージングシステムを用いてベクターウィルス粒子を発育させ、ＶＳＶ−Ｇエンベロープを有するベクターを作製した。形質導入ウィルス粒子の濃度はおよそ５×１０^７〜１×１０^９／ｍＬであった。ペリー培養系（Perry、１９８８）の第２相および第３相を用いて培養し胚を発生させた。２日間インキュベーションした胚１２個を取り出してｌａｃＺの発現について解析した。３日間インキュベーションした胚１２個も同様に解析した。胚とその周囲の膜を切開して卵黄から切り離し、固定後、染色してｌａｃＺレポーター遺伝子の発現を検出した。全ての胚が、胚とその周囲の膜の幾つかの細胞においてｌａｃＺの発現を示した。発現は、胚に近い発生胚外膜において最も高く、解析した胚の内の少数の細胞に限定されていた。これらの結果から、全ての胚が、注入したレンチウィルスベクターによりうまく形質導入できたことが分かる。

（実験２）
さらなる実験においては、産卵された４０個の卵の各々の胞胚下腔に、ＥＩＡＶベクター（２〜３μＬ、力価５×１０８／ｍＬ）の浮遊液を注入した。１３羽（３３％）の雛が孵化したが、これらをスクリーニングしてレンチウィルスベクター配列を有するトランスジェニック子孫を特定した。すなわち、孵化した個々の雛から残存した胚外膜試料を採取し、ゲノムＤＮＡを抽出し、レンチウィルスベクター配列に特異的なプライマーを用いたＰＣＲによりＤＮＡ解析を行った。このような篩い分けにより、１１羽（８５％）の雛をトランスジェニックとして特定した。ベクター配列は胚外膜にコピー数０．４％〜３１％で検出されたことから、これら雛はベクター組込みに関しモザイクであることがわかる。この結果は予想通りである。というのは、胚を構成する細胞数が少なくとも６万個以上のステージでベクターを注入したためである。胚の全細胞がウィルスベクターによって形質導入されベクター組込みに関しキメラな雛が得られるという可能性は低い。この１１羽の雛を性成熟まで育てたところ、７羽が雄性であることが分かった。これら雄鶏が１６〜２０週齢に達したとき、精液試料を採取した。これら試料のＤＮＡをＰＣＲにより測定したところ、７羽の雄鶏の精液にレンチウィルスベクター配列が含まれ、そのレベルは０．１％〜８０％と見積もられた。試料の大半は、ベクター配列の含有レベルが１０％を超えていた。このことから、これら雄鶏の子孫の少なくとも１０％はトランスジェニックになるであろうことが示唆される。１羽の雄鶏（コード番号：ＬＥＮ５−２０）から精液を採取した。この雄鶏の血液試料中のＤＮＡにおけるウィルスベクターのコピー数は予め６％と見積もられていた。精液試料から求めたコピー数は８０％であった。この精液を用いて家畜用の雌鶏を受精し、受精卵を回収してインキュベートした。３日間のインキュベーション後、９個の胚を採取しＰＣＲにより測定してトランスジェニック胚を特定し、染色してｌａｃＺレポーター遺伝子の発現を調べた。９個の胚の内、３個がトランスジェニックであり、この３個は全てｌａｃＺを発現していたが、発現レベルは非常に低く発現が見られたのは少数の細胞のみであった。インキュベーションを１０日間行った胚を１２個採取し、上と同様に測定した。６個の胚がトランスジェニックとして特定され、４個においてｌａｃＺの発現が認められた。この内の１個の胚においては数組織において高い発現が見られたが、これ以外の３個における発現レベルはこれより低かった。これらの結果から分かるように、雄鶏ＬＥＮ５−２０の子孫の４３％がトランスジェニックであった。レンチウィルスベクターが保持するレポーターコンストラクトの発現は、個々のトランスジェニック雛毎に異なっていた。ベクターゲノムのコピーが組み込まれる染色体部位は個々の雛によって異なり、そのためトランスジーンの発現が影響されるのであろう。また、雛によっては複数コピーのトランスジーンを有する場合もあろう。

ここに記載した結果から、特定のＥＩＡＶ由来レンチウィルスベクター（ＶＳＶエンベロープタンパク質でシュード・タイピングしたもの）は、非常に高効率でニワトリ胚の生殖細胞に形質導入を行うことができることが分かる。この結果得られたトリは、組み込まれたベクターを多数の子孫に伝達する。ベクターに担持されるトランスジーンが発現すると、機能的タンパク質が比較的高レベルで得られる。ベクターに担持するトランスジーンは、特定の組織において外来タンパク質を発現するように設計することができる。

レンチウィルスベクターの雛への導入は、上の例において記載した方法を変形して、種々の発生ステージにおいて行うことができる。

ウィルス浮遊液は、放卵されたばかりの卵の胞胚葉胚の上に注入することができる。ウィルス浮遊液は、受精したばかり、すなわち初期卵割ステージからステージＸ（イヤル−ギラディ（Eyal-Giladi）およびコチャブ（Kochav）、１９７６）の卵に注入することができ、この注入はペリー培養法（１９８８）を用いて、または卵管から採取した卵を卵細胞移入（ovum transfer）によりレシピエント雌鶏に戻すことにより行うことができる。

ウィルス浮遊液は、放卵されたばかりの卵の胞胚葉胚の上または下に注入することもできる。この場合、卵の殻を切り欠いて設けた窓からアクセスする。窓は再度シールして、卵をインキュベートし孵化させる（ボッセルマン（Bosselmann）ら、１９８９）。

ウィルス浮遊液は、雄鶏の精巣に注入することもできる。この場合、精液を検査し、精原細胞の形質導入およびその結果であるトランスジェニック精子の発育を検出する。

（実験３）
（材料および方法）
（各種ＥＩＡＶベクター、ウィルスストックの調製）
ベクターｐＯＮＹ８．０ｃＺおよびｐＯＮＹ８．０Ｇについては既に文献記載されている（ファイファー（Pfeifer）ら、２００２）。ベクターｐＯＮＹ８．４ＧＣＺは複数の修飾を有しており、これには、５’ＬＴＲの下流のｅＧＦＰを発現させるためｇａｇ由来領域の全てのＡＴＧ配列のＡＴＴＧへの変更が含まれる。３’Ｕ３領域は、モロニー白血病ウィルスＵ３領域を含むように修飾されていた。ベクターストックはＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＦｕＧＥＮＥ６（ロッシュ、英国ルイス）トランスフェクションにより作製した。細胞を２μｇのベクタープラスミド、２μｇのｇａｇ／ｐｏｌプラスミド（ｐＯＮＹ３．１）、および１μｇのＶＳＶ−Ｇプラスミド（ｐＲＶ６７）（Loisら、２００２）と共に１０ｃｍの皿に入れ、トランスフェクションの３６〜４８時間後、上清を濾過（０．２２μｍ）して−７０℃で保存した。ベクター濃縮調製物は、まず低速遠心分離（６０００×ｇ）を４℃で１６時間行った後、超遠心分離（５０５００×ｇ）を４℃で９０分行ない調整した。ウィルスは定式化バッファ（formulation buffer）（ロイス（Lois）ら、２００２）に２〜４時間再浮遊させておき、分液して−８０℃で保存した。

（トランスジェニックトリの作製と解析）
放卵したばかりの卵の胞胚葉胚の下の胚下腔に約１〜２μＬのウィルス浮遊液をマイクロインジェクションした。胚をインキュベートし、代理卵殻ｅｘ ｖｉｖｏ培養系（カリタ（Challita）およびコーン（Kohn）、１９９４）のフェーズＩＩおよびＩＩＩを用いて孵化させた。発生から１２日以上経過後、培養中に死んだ胚のＣＡＭからＰｕｒｅｇｅｎｅゲノムＤＮＡ精製キット（フローゲン（Flowgen）、英国アシュビー・デ・ラ・ズーシュ）を用いてＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡ試料は孵化したての雛のＣＡＭから得た。血液試料は、生育したトリから得た。精液は成熟した雄鶏から得た。ＰＣＲ解析を５０ｎｇのＤＮＡ試料を用いて行ない、プロウィルス配列の存在を調べた。コピー数を求めるため、ニワトリゲノムＤＮＡの５０ｎｇずつのアリコートに対して対照ＰＣＲ反応を同時並列的に行った。すなわち、Perry、１９８８に記載のように、ベクタープラスミドＤＮＡを、単一コピー遺伝子（１×）、１０倍希釈液（０．１×）および１００倍希釈液（０．０１×）と同量だけ添加した。プライマーは、５’ＣＧＡＧＡＴＣＣＴＡＣＡＧＴＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧ３’および５’ＡＣＣＡＧＴＡＧＴＴＡＡＴＴＴＣＴＧＡＧＡＣＣＣＴＴＧＴＡ−３’を用いた。個々のＧ_１トリにおけるプロウィルスの挿入の数はサザントランスファーにより測定した。全血から抽出したゲノムＤＮＡはＸｂａＩまたはＢａｍＨＩで切断した。切断したＤＮＡは、０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で分離した後、ナイロン膜に移した（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマーシャムファルマシアバイオテク、英国アマーシャム）。膜は、レポーター遺伝子ｌａｃＺ用またはｅＧＦＰ用の^３２Ｐ標識プローブと６５℃でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションはオートラジオグラフィーで検出した。実験、動物の飼育および管理の手続きは全て英国内務省（Home Office）のライセンスの下で行なった。

（発現の解析）
成体の組織を分離し、パラホルムアルデヒド４％とグルタルアルデヒド０．２５％とを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３０分間固定した。組織は凍結包埋（cryo-embedded）し１４μｍに切断した。５ｍＭフェリシアン化リン、５ｍＭフェロシアン化リン、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍｇ／ｍＬ Ｘ−ｇａｌ中３７℃で９０分（切断物）または４時間（胚）インキュベートしてβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。孵化したばかりの鶏のＧＦＰ画像は、富士フィルムデジタルカメラ（ニコン６０ｍｍレンズ）を用いてＧＦｓＰ−Ｓレンズ系（ＢＬＳ社、チェコ共和国）により撮影した。選択された組織を瞬間凍結し、プロテアーゼインヒビター（コンプリート・ミニ；ロッシュ社、英国ルイス）を含有するＰＢＳにホモジナイズして全タンパク質を抽出した。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイにより測定した。タンパク質抽出物５０μｇ（図４）（または１００μｇ（図３））１２％ポリアクリルアミドゲル（インビトロジェン、英国ペイズリー）上で分離しＰＤＶＦ膜に移した。膜をマウス抗β−ガラクトシダーゼ抗体（プロメガ、英国サザンプトン）１：５０００希釈物およびロバ抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（サンタクルズバイオテク（Santa Cruz Biotech））１：２０００希釈物と共にインキュベートし、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（アマーシャムバイオサイエンス、英国アマーシャム）を用いて視覚化した。ＥＬＩＳＡは、β−ｇａｌ ＥＬＩＳＡキット（ロッシュ、英国ルイス）を用いて行なった。

（結果）
（図中の記号等の詳細な説明）
（図１．この検討に用いた各種ＥＩＡＶベクターの概略の説明）
薄い灰色の四角はＥＩＡＶパッケージングシグナルを示し、ｐＯＮＹ８．４ＧＣＺにおいて斜線を付した四角はＭＬＶ Ｕ３領域を示す。サザンブロット解析に用いた制限部位（ＸｂａＩ［Ｘ］、ＢｓｔＥＩＩ［Ｂ］）が示されている。レポーター遺伝子ｌａｃＺをプローブとして用いた（図２）。

（図２．プロウィルスの挿入を調べるために行なった、個々のトリ個体からのゲノムＤＮＡのサザントランスファー解析）
ゲノムＤＮＡ試料をＸｂａＩ（ａ、ｃ、ｄ）またはＢｓｔＥＩＩ（ｂ）で切断し、ｌａｃＺ用のプローブとハイブリダイズした。（ａ、ｂ）Ｇ_０トリ番号１−４（表２）のＧ_１子孫の内の１４羽を解析したところ、Ｇ_１トリには複数のプロウィルス挿入物があることが分かった。（ｃ）Ｇ_１トリ番号２−２／１９（レーン１）およびそのＧ_２子孫１４羽（レーン２〜１５）と、（ｄ）Ｇ_１トリ２−２／６（レーン１）およびそのＧ_２子孫９羽（レーン２〜１０）とを解析したところ、生殖細胞系列伝達後もプロウィルス挿入物が安定していることが分かった。

（図３．ｐＯＮＹ８．０ｃＺ−Ｇ_１トランスジェニックトリおよびｐＯＮＹ８．０Ｇ−Ｇ_１トランスジェニックトリにおけるレポーター遺伝子の発現）
ａ：５羽のＧ_１成鳥から肝臓、心臓、骨格筋、脳、卵管、皮膚、脾臓、腸、腎臓、膵臓および骨髄のタンパク質抽出物を得て、ウェスタンブロット解析を行なった。各成鳥には、ｐＯＮＹ８．０ｃＺが単一コピー、独立挿入物として含まれている。各レーンに１００μｇのタンパク質を載せ、β−ガラクトシダーゼタンパク質を実験プロトコルに記載の方法で検出した。ｂ：Ｇ_１トリ２−２／１９から皮膚、膵臓、および腸の一部を切断しこれを染色してβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。対照用非トランスジェニックトリの比較用切断部についても同様に測定した（矢頭は皮膚の上皮、腸の絨毛を示す）。太線＝０．５ｍｍ。ｃ：単一コピーのトランスジェニックトリおよび野生のトリからの胸筋、膵臓および皮膚の一部をＧＦＰ蛍光により視覚化した（矢頭は皮膚の上皮を示す）。太線＝０．５ｍｍ。

（図４．ｐＯＮＹ８．４ＧＣＺ−Ｇ_１トランスジェニックトリにおけるレポーター遺伝子の発現）
ａ：単一コピーのＧ_１トリからの組織の一部を染色しβ−ガラクトシダーゼ活性を調べた（矢印は腸の平滑筋を示す）。太線＝０．５ｍｍ。パネルＡ：高倍率の卵管部。矢印は、断面で示す管状腺と並んでいる細胞を特定している。太線＝０．０５ｍｍ。ｂ：ｐＯＮＹ８．０ｃＺおよびｐＯＮＹ８．４ＧＣＺの各系統においてβ−ガラクトシダーゼタンパク質のレベルを測定した。データポイントは独立した３つの実験から得た。

（図５．Ｇ_２トランスジェニックトリにおけるレポーター遺伝子の発現）
ａ：Ｇ_１雄鶏２−２／１９および２−２／６ならびにそれらのＧ_２子孫２羽ずつの腸、皮膚、肝臓および膵臓から抽出されたタンパク質のウェスタン解析。ｂ：上のパネル：トリ（ＩＤ４−１）の５羽のＧ_１子孫。この内の左側の４羽のトリはｐＯＮＹ８．０Ｇについてトランスジェニックであり、ｅＧＦＰを発現する。右側のトリはトランスジェニックではない。下のパネル：トリ（ＩＤ４−１／６６）の５羽のＧ_２子孫。中央のトリはトランスジェニックではない。

（図６．ｐＯＮＹ８．４ＧＣＺ−Ｇ_１トリのウェスタン解析）
４羽のＧ_１成鳥から肝臓、心臓、骨格筋、脳、卵管、皮膚、脾臓、腸、腎臓、膵臓および骨髄のタンパク質抽出物を得てウェスタンブロット解析を行なった。各成鳥には、ｐＯＮＹ８．０ｃＺが単一コピー、独立挿入物として含まれている。各レーンに１００μｇのタンパク質を載せ、β−ガラクトシダーゼタンパク質を実験プロトコルに記載の方法で検出した。

（図７．ｐＯＮＹ８．０ｃＺ−Ｇ_２トランスジェニックトリにおけるレポーター遺伝子の発現）
２−２／１９のＧ_２子孫からの皮膚、膵臓および腸（矢頭は上皮を示し、矢印は羽嚢を示す）の一部を染色しβ−ガラクトシダーゼ活性を調べた。対照である非トランスジェニックトリの比較用の部分も同様に測定した。太線＝０．５ｍｍ。

（Ｇ_０トランスジェニックトリの作製）
３種の自己不活性ＥＩＡＶベクター（図１）を用いた。これらを水疱性口内炎ウィルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）でシュード・タイピングした。これらベクターはこれまでにも、数種の動物モデル系においてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで種々の組織の形質導入を行うのに使用されている（ファイファー（Pfeifer）ら、２００２；ロール（Rholl）ら、２００２；コルコラン（Corcoran）ら、２００２；アズーズ（Azzouz）ら、２００２）。ｐＯＮＹ８．４ベクターは、ｐＯＮＹ８．０を修飾して得た。すなわち、５’ＬＴＲのモロニーマウス白血病ウィルス（ＭｏＭＬＶ）配列を置換し、ウィルスｅｎｖ遺伝子の大半を欠失させた。ベクター調製物を濃縮して力価を約１０^７〜１０^１０形質導入ユニット／ｍＬ（Ｔ．Ｕ．／ｍＬ）とした。１〜２μＬの濃縮ベクターを放卵されたばかりの卵の発生胚盤の下方の胚下腔に注入し培養して孵化させた。孵化したＧ_０雛の漿尿膜（ＣＡＭ）からゲノムＤＮＡを抽出しＰＣＲにより解析し、ＥＩＡＶパッケージング部位配列を検出した。存在するゲノムＤＮＡの量に関するベクターの概略コピー数を求めたところ、ゲノムあたり１コピー〜０．０１コピー等量の範囲であった（実験プロトコル参照）。全ての雛を性成熟まで生育し、雄の精液試料から得たゲノムＤＮＡを同様にＰＣＲによりスクリーニングした。

４種の実験を行った。ウィルスｐＯＮＹ８．０ｃＺの注入は、実験３．１では力価５×１０^７Ｔ．Ｕ．／ｍＬで、実験３．２では５×１０^８Ｔ．Ｕ．／ｍＬで行った。実験３．３では、ウィルスｐＯＮＹ８．４ＧＣＺの注入は７．２×１０^８Ｔ．Ｕ．／ｍＬの濃度で行い、実験３．４ではｐＯＮＹ８．０Ｇは９．９×１０^９Ｔ．Ｕ．／ｍＬで使用した。４種の実験においては全部で７３個の卵に注入したが、その内２０個（２７％）の卵が孵化し雛となった。各実験において得た孵化した雄性および雌性の雛についてＰＣＲスクリーニングを行った結果を表２に示す。２０羽のＧ_０トリの内１４羽はベクター配列を含んでおり、そのレベルは０．５〜０．０１コピー／ゲノム等量であった。同様の濃度で注入した場合、ベクターｐＯＮＹ８．０ｃＺはベクターｐＯＮＹ８．４ＧＣＺよりも効率的にニワトリ胚に形質導入を行った。これは恐らく、ウィルスＤＮＡゲノムの核内移行（nuclear import）に関与するウィルスｃＰＰＴ配列が存在するためである（Loisら、２００２）。この結果からさらに、トランスジェニックトリは、力価が５×１０^７Ｔ．Ｕ．ｍＬと低くても作製できるが、使用する力価が高い程、形質導入頻度は増加することが分かる。

（Ｇ_０雄鶏からの生殖細胞系列伝達）
性成熟に達した１６〜２０週齢のＧ_０の雄１２羽から精液試料を採取した。これら試料から抽出したゲノムＤＮＡのＰＣＲスクリーニングの結果を表２に示す。この結果から、孵化時に行ったスクリーニングにおいてトランスジェニックでないと判断されたものを含め、全ての雄鶏の生殖細胞系列（germline）にベクター配列が存在することが分かった。これを確認するため、この１２羽の雄鶏の内の１０羽を家畜用雌鶏と交配させて成育し、得られたＧ_１子孫をスクリーニングしてトランスジェニックトリを特定した。１０羽の雄鶏は全てトランスジェニック子孫を作り、その頻度は４％〜４５％であった。この生殖細胞系列伝達頻度は、精液ＤＮＡのＰＣＲ解析からの予想に非常に近いものであったが、全てのケースにおいて、孵化時に採取したＣＡＭ試料のＤＮＡ解析から予想した値よりも高いものであった。数羽の雄鶏から血液試料を採取しＰＣＲ解析を行ったところ、その結果は、ＣＡＭのＤＮＡ解析の結果と非常に適合していた（データは示さず）。この結果から、生殖系列を用いた形質導入の頻度は、体細胞組織を用いた形質導入の頻度より約１０倍高いことが示唆される。

（Ｇ_１トランスジェニックトリの解析とＧ_２への伝達）
初代トランスジェニックトリに形質導入を行った発生ステージでは、胚を構成する細胞数はおよそ６万個であり、その内の約５０は始原生殖細胞になると考えられる（ビエネマン（Bienemann）ら、２００３；ギンスバーグ（Ginsburg)およびイヤル−ギラディ（Eyal-Giladi）、１９８７）。我々は、各Ｇ_１トリは、個々の始原生殖細胞の別個の形質導入イベントの結果得られること、および、トリが異なればプロウィルス挿入物も独立的に異なり、単一生殖細胞前駆体の形質導入を示すこと、を予想した。さらに、個別の細胞が複数のプロウィルス挿入物を有することも可能であろう。４羽のＧ_０雄鶏にはｐＯＮＹ８．０ｃＺを形質導入したが（実験３．１および３．２）、これらの鶏から選択したものをさらに、トランスジェニック子孫の解析に用いた（表３）。各Ｇ_１トリから得たゲノムＤＮＡをサザンブロットにより解析した。試料をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩまたはＢｓｔＥＩＩで切断した。これら制限酵素が切断を行う位置は、組み込まれたＥＩＡＶプロウィルス内であるがプローブ領域の外側である（図１）。これら制限酵素をプローブとハイブリダイズして、組込み部位におけるプロウィルス挿入物とゲノムＤＮＡの結合を示すであろう制限断片を特定した。これにより、各Ｇ_１トリ内のプロウィルス挿入物数および解析した各Ｇ_０の子孫に存在する、互いに異なる挿入物の種類数を求めることができた。この解析の例を図２ａ、ｂに、その結果の概要を表３に示す。Ｇ_１トリの大半は単一コピーのプロウィルス挿入物群（single proviral insertions）を保持していたが、数羽は複数コピーを含み、１羽のトリにおいては最大数の４コピーが検出された。各Ｇ_０トリの子孫には同一のプロウィルス挿入物を有するものがあった。これら子孫は、同一の生殖細胞前駆体由来であることがわかる。

トリ２−２のＧ_１子孫の３羽の雄（２−２／６、１６、１９）を家畜用雌鶏と交配させ、Ｇ_２世代への伝達頻度を解析した。雄鶏２−２／６と２−２／１９は単一コピーのプロウィルス挿入物を有しており、トランスジェニック子孫対非トランスジェニック子孫の比は１４／３０（４７％）および２１／５０（４２％）であり、予想されるメンデル比とは大きく違わなかった。雄鶏２−２／１６は２個のプロウィルス挿入物を有しており、Ｇ_２子孫の７９％（２７／３４）がトランスジェニックであった。これは、２個の挿入が独立した伝達であることを反映している。サザントランスファー解析により、トリ２−２／６およびトリ２−２／１９に存在するプロウィルス挿入物と、それらのＧ_２子孫それぞれ９羽および１４羽のプロウィルス挿入物とを比較した（図２ｃ、ｄ）。親および子において、同一の制限断片を観察したところ、一度ゲノムに組み込まれたプロウィルスは安定であることがわかった。

（Ｇ_１およびＧ_２トランスジェニックトリにおけるトランスジーンの発現）
ベクターｐＯＮＹ８．０ｃＺおよびｐＯＮＹ８．４ＧＣＺは、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）極初期エンハンサー／プロモーター（ＣＭＶｐ）の制御下にあるレポーター遺伝子ｌａｃＺを保持しており、ｐＯＮＹ８．０Ｇは、同じくＣＭＶｐに制御されるレポーターｅＧＦＰを保持している。ｌａｃＺの発現の解析は、組織の一部を染色してβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することにより、および成鳥から分離した選択した組織からのタンパク質抽出物をウェスタン解析してβ−ガラクトシダーゼタンパク質を特定することにより行った。ｅＧＦＰの発現はＵＶ照射により調べた。

異なる単一コピーのプロウィルス挿入物を含む７羽のｐＯＮＹ８．０ｃＺ−Ｇ_１トリの種々の組織からタンパク質抽出物を作製した。各トランスジェニックトリの幾つかの組織において、予想通りの１１０ｋＤａのタンパク質が検出された。膵臓においては安定して高発現を示したが、肝臓、腸、骨格筋等の組織に存在するタンパク質レベルはより低かった。これらのトリの内の５羽の解析結果を図３ａに示す。ウェスタンブロットの曝露時間をより長くしたところ、殆どの組織においてβ−ガラクトシダーゼが検出された（データは示さず）。どのトリにおいても一貫した発現パターンが見られたが、タンパク質の総量は異なっていた。ｐＯＮＹ８．０ｃＺ−Ｇ_１成鳥から得た組織の一部を染色した（図３ｂ）。膵臓外分泌部全体の他、皮膚上皮、小腸の絨毛等の組織に強い染色が観察された。ｐＯＮＹ８．０Ｇトリから得た組織の一部におけるＧＦＰ発現解析では、膵臓、皮膚および胸筋（図３ｃ）に発現が見られ、腸においても弱い発現が見られた（データは示さず）。これらの結果から、同一のＥＩＡＶベクターにより作製され異なるレポーター遺伝子を有するトランスジェニックトリであっても、類似した発現パターンを示すことが分かる。

ｐＯＮＹ８．４ＧＣＺの単一コピーのプロウィルス挿入物が異なる６羽のＧ_１トリから得た組織のウェスタン解析を行ったところ、４羽のトリにおいてｌａｃＺの発現を検出した。発現のパターンは、ｐＯＮＹ８．０ｃＺ トランスジェニックトリで観察されたものと同様であった（図６）。しかしながら、組織の一部を染色したところ、ｐＯＮＹ８．０ｃＺに関してトランスジェニックなトリにおいて観察された発現よりも広範な発現パターンを示した。すなわち、上に記載の組織に加え、腸の平滑筋、上皮の下の血管、卵管の管状腺細胞においてβ−ガラクトシダーゼ活性が検出された（図４ａ）。ＥＬＩＳＡアッセイにより、ｐＯＮＹ８．０ベクターを有するトランスジェニックトリとｐＯＮＹ８．４ベクターを有するトランスジェニックトリにおけるβ−ガラクトシダーゼ発現レベルの差を定量化した（図４ｂ）。β−ガラクトシダーゼレベルは、分析した全ての組織においてｐＯＮＹ８．４ＧＣＺトリの方がｐＯＮＹ８．０ｃＺトリよりも高かった。膵臓抽出物におけるレベルは約６倍高く、トリ番号３−５／３３７における発現は、組織μｇあたり３０ｐｇ、すなわち全タンパク質の３％であった。

生殖細胞系列伝達後もトランスジーン発現が維持されたかどうかを確認するため、ベクターｐＯＮＹ８．０ｃＺまたはｐＯＮＹ８．０Ｇを保持するＧ_２トリにおける発現を調べた。単一コピーのプロウィルス挿入物を有する２羽のＧ_１雄鶏２−２／６および２−２／１９と、それらのＧ_２子孫２羽ずつから組織抽出物を得てウェスタン解析を行った（図５ａ）。親と２羽の子におけるβ−ガラクトシダーゼタンパク質レベルは非常に近く、発現パターン、とりわけ膵臓における発現パターンも非常に似ていた。Ｇ_２トリから得た組織の一部を染色したところ、親の発現パターンと類似した発現パターンを示した（図７）。ｐＯＮＹ８．０Ｇを保持し生きている複数のＧ_１雛においてＧＦＰ蛍光が容易に検出され、その内の１羽のＧ_２子孫も同様の発現レベルを示した（図５ｂ）。

図８は、レポーター遺伝子ｌａｃＺを含有するベクターｐＯＮＹ８．４ＧＣＺが保持されたトランスジェニック雌鶏の卵管から得た各部分の範囲を示す。これら部分は明らかに青色に染色されており、ｌａｃＺの発現を示している。

（検討）
我々は、試験に用いたレンチウィルスベクター系は、生殖系列トランスジェニックトリを作製するのに非常に効率的な方法であることを示した。本明細書に記載した各実験において、放卵されたばかりの卵の胞胚葉ステージの胚のすぐ下にウィルスベクター粒子の濃縮浮遊液を注入して１２羽の雄鶏を作製した。１０羽の初代雄鶏を生育したところ、これら雄鶏の全てからトランスジェニック子孫が生まれ、その頻度は４〜４５％であった。異なるプロウィルス挿入物が保持された独立した系統を確立するためには、得られた中で最も生殖細胞系列伝達頻度の低いものであっても、１羽の初代雄鶏から数羽のＧ_１トランスジェニックトリを得る育種に関しては実地に有用である。この胞胚葉下注入を用いる方法は、レトロウィスルをニワトリに導入するのにこれまでに使用された各種方法（サルター（Salter）およびクリッテンデン（Crittenden）、１９８９；ボッセルマン（Bosselman）ら、１９８９；ハーベイ（Harvey）ら、２００２）に非常に類似している。本方法が高い成功率を達成できるのは、複数の要因、例えば、レンチウィルスベクターが非分割細胞に形質導入可能であること、レトロウィルスベクターをウズラに導入するのに使用されていたＶＳＶ−Ｇシュード・タイピングを用いたこと（カラジェンツ（Karagenc）ら、１９９６）、従来のトランスジェニック研究に比べ高い力価を用いたこと等によるものであろう。放卵された卵のニワトリ胚は、卵黄の表面に横たわった単層の細胞からなる盤であり、細胞は、胚盤の下方に内胚葉を形成するために胚内を移動し始めている（ミズアライ（Mizuarai）ら、２００１）。始原生殖細胞も、胚盤から胚下腔を通って下方の内胚葉に移動する。ウィルス注入直後の各発生ステージにおいて、始原生殖細胞はウィルス粒子浮遊液内を移動しうるため、ＣＡＭや血液の細胞に比べて高い生殖細胞形質導入頻度が達成される。

我々は、大半のＧ_１トランスジェニックトリは単一のプロウィルス挿入物（a single proviral insertion）を含むが、複数の挿入物（multiple insertions）を含んでいるトリもあることを示した。この結果から、このベクター系を用いると、容易に、単一コピーのベクター−トランスジーン挿入物（single vector-transgene insertions）を有するトランスジェニックトリを作製し、同一Ｇ_０トリから、異なる染色体遺伝子座にプロウィルスが挿入された数系統を生育することができることが分かる。トランスジーンは特定のベクターによりニワトリゲノム内に導入されるが、トランスジーンが組み込まれる部位によって、トランスジーンの発現は変わるであろう。Ｇ_１からＧ_２への伝達を分析した結果、上述の各種レンチウィルスベクターにより、トランスジーン挿入部が安定して保持された系統が簡単に確立できることが分かる。

レポーター遺伝子ｌａｃＺの発現は、初代（Ｇ_０）、Ｇ_１およびＧ_２の各トリにおいて検出された。ｌａｃＺの発現はヒトＣＭＶｐ（ヌクレオチド−７２６〜＋７８）により方向付けた。ヒトＣＭＶｐは、一般に各種細胞に普遍的に機能することが文献記載により知られているエンハンサー／プロモーターである。細胞培養トランスフェクション実験においてはＣＭＶｐを用いれば通常方向付けを行えるが、ＣＭＶｐからトランスジェニックマウスを発現させると、発現は組織により異なる結果となる。特に、ＣＭＶｐトランスジーンは、トランスジェニックマウスの脾臓外分泌部に主要な発現を示すことが報告されている（イヤル−ギラディ（Eyal-Giladi）およびコチャブ（Kochav）、１９７６）。我々は、胚およびトリにおけるｌａｃＺおよびＧＦＰの発現パターンは、殆どの組織において様々なレベルで見られるものの、膵臓で高い発現が見られることを示した。第３世代のＥＩＡＶベクターｐＯＮＹ８．４からの発現は、ｐＯＮＹ８．０ベクターからの発現よりも有意に高かった。これは恐らく、前者のｅｎｖ領域における不安定要素を除去したため前者のｍＲＮＡ安定性が向上したからであろう。少数のｐＯＮＹ８．４ＧＣＺトランスジェニックトリにおいてはトランスジーンの発現が検出されなかった。これは恐らく、ＭｏＭＬＶ配列がベクターに導入されたことでサイレンシングが惹き起こされたことによるものであろう（チャン（Zhan）ら、２０００）。Ｇ_１トリに見られる発現パターンはＧ_２への生殖細胞系列伝達後も維持されている。この結果は、レンチウィルスベクターを用いて導入したトランスジーンからのトランスジーン特異的発現は生殖細胞系列伝達後も維持されていることを示しており、このことはマウスおよびラットでも同様であることが記載されている（ナルディーニ（Naldini）ら、１９９６）。レンチウィルスベクターに導入可能なトランスジーンのサイズは限定されるため、組織特異的調節配列の中には大きすぎてこれらベクターに使用できないものもある。サイズ制限はまだ確定されていないが、９ｋｂのＥＩＡＶベクターが既に得られている（ロイス（Lois）ら、２００２）ので、８ｋｂまでのサイズが使用できるであろう。

卵管におけるｌａｃＺの発現（図８）から、卵白タンパク質を合成する細胞は、タンパク質をコードするレンチウィルスベクター系が組み込まれたトランスジェニックトリにおいて、外来タンパク質を発現させることができることが分かる。

本明細書に記載した研究は、トランスジェニックトリを作製するためにレンチウィルスベクターを使用できるかを評価したものである。我々は、生殖細胞系列トランスジェニックトリを非常に高い出現頻度で得ることができ、世代間の安定した伝達が達成され、生殖細胞系列伝達後も維持されるトランスジーン発現パターンが達成されたことを示した。この結果は、レンチウィルスベクターの使用により、確実なトランスジェニックトリ作製方法の開発においてこれまでに存在した多くの問題が克服されることを示している。このトランスジェニック作製方法を適用すれば、多種のトランスジーンコンストラクトを試験して適切な組織において必要なレベルで発現するものを選択することができる。最近、ＡＬＶベクターを用いて、卵白において少量の生物学的活性タンパク質の発現および蓄積を示すトランスジェニック系統が作製された（ラップ（Rapp）ら、２００３）。タンパク質産生量（卵あたりタンパク質μｇレベル）は商業生産には適さないが、卵白から精製したタンパク質の分析結果は、トランスジェニック雌鶏をバイオリアクターとして使用するという目的に役立つものである。レンチウィルスベクターの使用により、トランスジーン取込みや癌レトロウィルスベクターを用いた発現に関する問題が克服されるであろう。本年、ニワトリゲノム配列が完全解読されることになっており、脊椎動物遺伝子機能の解析用モデルとしてのニワトリの価値が高まりつつあるため、効率的なトランスジェニックトリ作製方法の開発はとりわけ時宜を得たものである（モジアック（Mozdziak）ら、２００３）。

（実験４）
インビトロジェンビラパワー（ViraPower^ＴＭ）システムを用いて種々の実験を行っている。チキナイズしたＲ２４ミニボディ（chickenised R24 minibody）コード配列をｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５プラスミドの構成ＣＭＶプロモーターのすぐ下流に挿入する。次にビラパワー２９３ＦＴ細胞を、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５／Ｒ２４発現コンストラクトおよび最適化ビラパワーパッケージングミックスで同時トランスフェクションする。最後に、パッケージ化ウィルス含有組織培養上清を回収する。インビトロジェンビラパワーシステムを使用する一目的は、高効率トランスフェクション試薬としての使用にある。ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５プラスミド上にブラストサイジン抵抗性遺伝子が存在するので、形質導入済みの集団を優先的に選択する能力がある。これは、比較的力価の低いウィルス調製物であっても十分であることを意味する。しかしながら、下に述べる実験作業には、さらに濃縮したウィルス調製物が必要である。ウィルス濃縮方法として２種の方法を評価している。第一は、セントリコンプラス２０（Centrikon Plus 20）スピンカラムによるスピン濃縮による濃縮方法、第二は、標準的な超遠心分離プロトコルによる濃縮方法である。

濃縮パッケージ化ウィルスベクターのＲＮＡゲノム構造をノーザンブロッティングと逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の両方で分析している。ウィルスゲノムの代表的試料をｃＤＮＡに確実に変換するため、逆転写は、数種のリバースプライマー、オリゴｄＴ、ランダムヘキサマー、３’ＬＴＲ特異的プライマーを用いて行う。ｃＲ２４コード配列のｃＤＮＡ試料への組込みは、特定の配列を増幅するのに適した個別のＰＣＲ反応により確認する。

パッケージ化ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５／Ｒ２４ウィルスベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの２９３Ｔ細胞の形質導入にも用いる。複数のｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５／Ｒ２４ウィルス希釈物を調製して標準組織培養培地に入れポリブレンを添加する。次にウィルス／培地／ポリブレン混合物を細胞に添加する。３時間後、組織培養培地を補充し、それから７２時間後、培地を回収する。次にｃＲ２４ミニボディの分泌レベルをＥＬＩＳＡにより定量する。培地回収の７〜１０日前の期間に、形質導入された細胞をブラストサイジンを用いて選択する。再度ｃＲ２４ミニボディの分泌レベルをＥＬＩＳＡにより定量する。

さらに、パッケージ化ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５／Ｒ２４ウィルスベクターを用いてｉｎ ｖｉｖｏでニワトリ胚の形質導入を行う。形質導入は、胚下腔（発生胚の下、卵黄の上）への注入により行う。

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この研究に用いた各種ＥＩＡＶベクターの概略説明図である。 プロウィルス挿入物を特定するために個別のトリから得たゲノムＤＮＡのサザントランスファー解析結果を示す図である。 ｐＯＮＹ８．０ｃＺ−Ｇ_１トランスジェニックトリおよびｐＯＮＹ８．０Ｇ−Ｇ_１トランスジェニックトリにおけるレポーター遺伝子発現を示す図である。 ｐＯＮＹ８．４ＧＣＺ−Ｇ_１トランスジェニックトリにおけるレポーター遺伝子発現を示す図である。 Ｇ_２トランスジェニックトリにおけるレポーター遺伝子発現を示す図である。 ｐＯＮＹ８．４ＧＣＺ−Ｇ_１トリのウェスタン解析結果を示す図である。 ｐＯＮＹ８．０ｃＺ−Ｇ_２トリにおけるレポーター遺伝子発現を示す図である。 トランスジェニックトリの卵管におけるｌａｃＺ発現を示す図である。

Claims (18)

1. レンチウィルスベクター系を用いて外因性遺伝物質を鳥類の胚細胞または精巣細胞に移行する段階を含む、トランスジェニック鳥類の作製方法。
2. レンチウィルスベクター系は、鳥類の胚細胞または精巣細胞のゲノムに移行されうるあるいは該ゲノムに組み込まれうる形態のレンチウィルストランスジーンコンストラクトを含む、請求項１に記載の方法。
3. レンチウィルスコンストラクトを、開いた卵の内容物の胚下腔に注入し、その後この卵を発生・発育させる、請求項２に記載の方法。
4. コンストラクトを卵の胞胚下腔に直接注入する、請求項２に記載の方法。
5. ベクターコンストラクトは、生殖細胞の形質導入を高効率で行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 遺伝物質はタンパク質をコードする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により作製されたトランスジェニック鳥類。
8. 請求項７に記載のトランスジェニック鳥類の子孫として作製されたトランスジェニック鳥類およびそのトランスジェニック子孫。
9. レンチウィルスベクターコンストラクト内に存在するタンパク質コード遺伝物質を鳥類胚細胞に移行し、この遺伝物質が組織内で発現されるトランスジェニック鳥類を創製する段階を含む、鳥類における異種タンパク質産生方法。
10. トランスジェニック鳥類は前記遺伝子を卵管において発現し、翻訳されたタンパク質が卵に取り込まれる、請求項９に記載の方法。
11. タンパク質を卵から単離する段階をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. トランスジェニック鳥類の作製のためにレンチウィルスコンストラクトを使用する、レンチウィルスコンストラクトの使用方法。
13. トランスジェニック鳥類においてタンパク質を産生させるためにレンチウィルスベクターコンストラクトを使用する、レンチウィルスベクターコンストラクトの使用方法。
14. 特定の組織、好ましくは卵白または卵黄において異種タンパク質を発現させるための、請求項１３に記載のレンチウィルスベクターコンストラクトの使用方法。
15. レンチウィルスは、ＥＩＡＶ、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＢＩＶおよびＦＩＶからなる群から選択される、請求項１２〜１４のいずれかに記載の使用方法。
16. コンストラクトは、後にタンパク質を産生するのに適したエンハンサープロモーター要素を含む、請求項１２〜１５のいずれかに記載の使用方法。
17. ベクターコンストラクト粒子はパッケージ化され、エンベロープを有するベクターが産生される、請求項１２〜１６のいずれかに記載の使用方法。
18. トランスジェニック鳥類におけるタンパク質の発現の見込みを予測する方法であって、卵管細胞におけるタンパク質の発現をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出する段階を含む方法。

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