CN1820072A - 转基因禽类中的蛋白质生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种使用慢病毒载体系统输送外源遗传物质以来生产转基因禽类的方法。本发明还涉及通过这些转基因禽类、优选在卵清中，生产蛋白质的方法，以及检测在禽卵中表达这些蛋白质的可能性的方法。

Description

转基因禽类中的蛋白质生产
本发明涉及转基因禽类的传代及重组蛋白质的生产。更特别地，本发明涉及增强的外源遗传物质对禽类细胞的转导，以便将所述遗传物质掺入禽类基因组中，从而这种修饰被整合到种系中并引起所编码的蛋白质在禽卵中的表达。
生产大量药物级蛋白质的能力在生物技术和制药领域正变得越来越重要。近来这种产品尤其是单克隆抗体在市场上的成功给已经紧张的全球制造资源增加了巨大的负担。对于制造量增高的需求、相应的因制造量而产生的高额费用以及对生产空间的长期等待，加上在细胞系中生产蛋白质的成本和相关问题已经促使各个公司寻找传统生产模式之外的模式(Andersson&Myhanan，2001)。生产重组蛋白质的传统方法包括在细菌或哺乳动物细胞中进行生产。另一种生产策略是使用转基因动物和植物来生产蛋白质。
最初的经过遗传修饰的(转基因)动物是经遗传工程通过将感兴趣的蛋白质的基因转移至靶动物中产生的。目前的转基因技术可以追溯到1968和1981年之间进行的一系列关键实验，包括：通过胚干细胞的胚泡注射使嵌合小鼠传代(Gardner，1968)、通过精子将外源DNA输送至兔卵母细胞(Brackett et al，1971)、通过将病毒DNA注射进植入前的胚泡中来生产转基因小鼠(Jaenisch & Mintz，1974)，及通过原核注射(pronuclear injection)使小鼠中转基因在种系中传递(Gordon&Ruddle，1981)。对于早期的转基因历史，注意力集中在改良动物的遗传组成并因此提高毛、肉或蛋的产量(Curtis&Barnes，1989；Etches&Gibbins，1993)。然而，近年来感兴趣的是利用用于医学应用如器官移植、人类疾病模型或者被指定用于人类的蛋白质的生产的转基因系统。
许多基于生物制药的蛋白质已经在转基因小鼠、兔、猪、绵羊、山羊和牛的乳汁中以适当水平被生产，但这种系统传代时间往往很长，一些较大的哺乳动物从转基因建立者发育到可产乳汁的阶段需要许多年。关于乳汁的生化复杂性及人和哺乳动物之间的进化保守的额外困难，可在产生该药物的哺乳动物中产生对药物的不良反应(Harvey et al，2002)。
目前对于将鸡卵用作药物学上的重要蛋白质尤其是重组人抗体的潜在生产载体越来越感兴趣。每年医学界需要大量的治疗性抗体，数量可以是几千克/年或几吨/年，因此解决这种缺乏的生产方法学将具有巨大优势。一旦将其最优化选定，基于鸡卵的生产方法与哺乳动物细胞培养或使用转基因哺乳动物系统相比具有一些优势。
首先，鸡具有较短的传代时间(24周)，这将使得转基因禽群得以迅速建立。下表表示的是不同类型的转基因系统之间的比较。其次，转基因动物生产设备的投资费用远比细胞培养中的费用低。与细胞培养所需设备相比，额外的处理设备最少(BioPharm，2001)。由于这些较低的投资费用，每个治疗单位的生产成本将低于细胞培养的生产成本。另外，转基因系统在纯化批次大小和频率方面提供了显著更大的灵活性，这种灵活性可以通过对批次大小进行最优化，而使得纯化中的投资和操作成本被进一步降低。第三方面的优势是当这种技术已发展可进行商业实施的程度时，显然增加了市场导入速度。转基因哺乳动物每升乳汁中可产生几克的蛋白质产物，使得可以进行大规模的商业生产(Weck，1999)。
哺乳动物在按比例扩大生产所花费的时间方面不具有显著优势，因为牛和山羊的妊娠周期分别是9个月和5个月(Dove，2000)，并且会花费长达5年的时间来产生商业上可用的群体。然而，一旦该群体建立，来自乳汁的产物的产量将很高。
各种转基因动物生产系统之间的对比(Dove，2000)。
动物 妊娠期   成熟/传代时间   产生的子代   产生群体的时间   蛋白质/升/卵/天   建立者动物发育费用
  牛   9个月   2年   1个/年   5+年   15g   $5-10M
山羊 5个月 8个月   2-4个/年   3-5年 8g $3M
绵羊 5个月 8个月 2个/年   3-5生 8g $2M
  猪   4个月   8个月   10个   ？   4.1g   ？
  兔   1个月   5个月   8个   ？   0.05g   ？
鸡 21天 6个月 21个/月   18个月 0.3g $0.25M
禽类的短传代时间也使得可以快速扩大群体。鸡的孵育时间仅为21天，并且其在孵出6个月内达到成熟。事实上，一旦已经建立了群体的建立者动物，则可以在18个月内建立一个群体(Dove，2000)。扩大生产能力的过程与绵羊、山羊或牛的群体相比应更简便和更快速。
另一个优势是依赖于卵是天然的无菌容器的这个事实。细胞培养生产方法的一个固有问题是有被微生物污染的危险，因为使用的富有营养的培养基往往促进了微生物的生长。转基因生产提供了一种低危险性的替代方法，因为蛋白质的生产发生在动物自身内部，其自身机体将会抗击大多数感染。鸡卵提供了一种危险性更低的替代方法：卵被密封在卵壳和膜内并由此在很大程度上与环境隔离开。人和禽类之间的进化距离意味着这两者之间共有的疾病很少。
另一个潜在的优势是在鸡的蛋白质发生翻译后修饰。现在已经认识到一项生产方法在所生产的蛋白质上重现天然糖分布的能力如何是一项生产工艺是否成功的关键因素(Parekh et al，1989；Routier et al，1997；Morrow，2001；Raju et al，2000，2001)。细胞培养过程中所使用的主要细胞类型是仓鼠或小鼠衍生型，因此在蛋白质上不产生与人细胞相同的糖模式(Scrip，2001年6月8日)。哺乳动物及特别是植物转基因系统在表达的蛋白质上产生不同类型的翻译后修饰。糖分布对人免疫系统对蛋白质起反应的方式极为重要。Raju et al，(2000)发现糖基化的鸡蛋白质的糖分布与糖基化的人蛋白质间的相似性比其与非人哺乳动物蛋白质间的相似性更高，这在开发治疗产品中应是一个显著优势。
因此可以看出禽卵，特别是鸡卵，作为基于哺乳动物或植物的生产手段及其它转基因生产系统提供了超过细胞培养的一些主要优势。将转基因哺乳动物生产中使用的方法直接应用于禽类的遗传操纵还不可能，因为产卵母鸡的生殖系统具有特殊的特征。在天然或人工授精后，母鸡将产能育卵大约10天。它们每天排卵一次，并且几乎立即授精，此时卵子在输卵管的上部。该卵在输卵管中度过接下来的20-24小时，在此蛋白落下位于卵黄周围，plumping液被加入蛋白中，最后卵壳膜和卵壳自身落下。在此期间，细胞迅速分裂，由此到产到产卵时，胚胎包含一个胚盘，一盘大约60,000个相对未分化的细胞位于卵黄上。
卵形成的复杂性使得鸡胚发育的最早阶段相对难以接近。用于接近较早期胚的方法通常包括处死供体母鸡以获得胚胎或者直接注射进输卵管中。生产转基因哺乳动物的方法几乎只集中于对受精卵的显微注射，从而将前核在体外用DNA进行显微注射，并将被操纵的卵转移至代母充分发育，这个方法在母鸡中不可行。已经开发了产生转基因禽类的4种通用方法。开发了一种使用DNA显微注射入胚盘的细胞质中来生产转基因鸡的方法。将鸡受精卵在第一次卯裂分裂之前从产卵母鸡的输卵管中取出，移至替代卵壳中，操纵并培养直至孵化(Perry，1988；Roslin US 5,011,780和EP0295964)。Love et al，(1994)分析了在培养中存活至少12天的胚胎，并显示出大约一半的胚胎含有质粒DNA，其中6％处于与1个拷贝/细胞的水平。有7只鸡，占注射的卵总数的5.5％，存活直至性成熟。其中一只经鉴别是潜在的嵌合型转基因禽类的小公鸡，将转基因传递至其3.4％的子代。对这些禽类进行繁殖，表现出了转基因的稳定传递。如在通过原核注射产生的转基因小鼠中，质粒DNA的整合显然是一个随机事件。然而，直接将DNA显微注射入卵中导致转基因整合效率低下(Sang&Perry，1989)。估计仅1％的经显微注射的卵生成转基因胚胎，其中10％存活至孵化。这个方法的效率可以通过提高所培养的胚胎的存活率及被注入的DNA的染色体整合频率而改良。
第二种方法包括在体外转染原始生殖细胞并移植入被合适地制备好的受体中。原始生殖细胞的成功转移已被获得，致使从被转移的生殖细胞中产生能育的配子。作为转移之前向原始生殖细胞进行基因转移的结果，转基因子代至今还未被描述。
第三种方法包括使用衍生自致癌逆转录病毒的基因转移载体。早期载体是能复制的(Salter，1993)，但已经揭示了复制缺陷型载体(见例如US 5,162,215和WO 97/47739)。这些系统使用A型网状内皮组织增殖病毒(REV-A)或禽类自血病病毒(ALV)。这些载体在转基因禽类建立者的生产中效率较低，并且来自这些建立者的载体的遗传效率也很低下(Harvey et al，2002)。这些载体也可能由于它们所携带的转基因的表达沉默而受影响，如同报道所指出的那样蛋白质表达水平低(Harvey et al，2002)。
第四种方法包括在体外培养鸡胚胎细胞，随后通过将这些培养细胞导入受体胚胎中产生嵌合禽类(Pain et al，1996)。胚胎细胞可以在嵌合体产生之前在体外进行遗传修饰，由此生成嵌合转基因禽类。没有关于从经遗传修饰的细胞进行种系传递的报道。
尽管对衍生自如前述的ALV和REV这样的病毒的逆转录病毒载体已经进行了许多研究，但这种载体的局限性阻碍了其更广泛的应用。许多病毒载体的研究和进展都是基于它们在基因治疗应用中的用途，并由此表明基于慢病毒的载体能感染未分裂的细胞，这在临床基因治疗应用中具有明显的优势。慢病毒是逆转录病毒的一个亚组，包括多种灵长类动物病毒例如人免疫缺陷病毒HIV-1和HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，及非灵长类动物病毒(例如羊进行性间质肺炎病毒(MW)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)及牛免疫缺陷病毒(BIV))。这些病毒在基因治疗进展中特别引入注目，因为慢病毒不仅具有不可逆整合进宿主细胞DNA中的一般逆转录病毒特性，而且如前述也具有感染未增殖细胞的能力。其它类型逆转录病毒对细胞增殖状态的依赖性略微限制了其用作基因转移载体。慢病毒感染的生物学可参见Coffin et al，(1997)和Sanjay et al，(1996)所述。
在病毒载体的设计中要考虑的一个重要事项是其稳定地整合进细胞基因组中的能力。先前的研究已经表明用作基因转移载体的致癌逆转录病毒载体由于在发育期间的基因沉默作用所致而对整合的成功略有限制。Jahner et al，(1982)指出了基于莫洛尼鼠类白血病毒(MoMLV)的载体不适于例如生产转基因动物，这是由于在发育阶段期间病毒的沉默导致转基因的极低表达。因此，必需的是用于生产转基因禽类的任何病毒载体都不呈现基因沉默。Pfeifer et al，(2002)和Lois et al，(2002)对小鼠进行的研究显示基于HIV-1的慢病毒载体在发育期间不被沉默。
对慢病毒载体的大量试验性研究集中在HIV-1系统，主要是由于HIV因其在人体中的病原性而是被最充分表征的慢病毒这一事实。这种载体往往被设计成无复制能力，通过除去调节和附属基因而使其不能复制。最先进的这些载体已经被最小化至这样的程度，即几乎所有的调节基因和几乎所有的附属基因均被除去。
慢病毒属具有许多相似的特征，如相似的基因组组构、相似的复制周期和感染成熟巨噬细胞的能力(Clements&Payne，1994)。一个这样的慢病毒是马传染性贫血病毒(EIAV)。与慢病毒属其它病毒相比，EIAV具有相对简单的基因组：除了逆转录病毒gag、pol和env基因之外，基因组仅由三个调节/附属基因组成(tat、rev和S2)。安全而有效的慢病毒载体系统的开发将依赖于载体自身的设计。重要的是使载体的病毒成分最小化，而仍保留其转导载体功能。一个衍生自EIAV的载体系统已经显示出以相似效率将分化和未分化的细胞转导至基于HIV的载体(Mitrophanous et al，1999)。可以对致癌逆转录病毒和慢病毒载体系统加以修饰以扩大可转导的细胞类型和物种。这是通过用其它的病毒包膜蛋白取代该病毒的包膜糖蛋白而达到的。这些包括应用兼嗜性MLV包膜糖蛋白(Page et al，1990)、杆状病毒GP64包膜糖蛋白(Kumar et al，2003)、腺病毒AD5纤维蛋白(Von Seggem et al，2000)、狂犬病G-包膜糖蛋白(Mazarakis et al，2001)或者水泡性口炎病毒G-蛋白(VSV-G)(Yee et al，1994)。VSV-G假模标本的应用也导致病毒颗粒的更高的稳定性并使得病毒在较高效价产生。
本发明的一个目的是提供一种用以将转基因构建体转移至禽类胚胎细胞的有效方法，以产生在其组织尤其但非只在输卵管内的细胞内表达该基因的转基因禽类，以使得被翻译的蛋白质掺入产生的卵中。
本发明的另一个目的是提供一种载体和一种方法，用于将基因转移至禽类胚胎细胞中以产生转基因禽类，该转基因禽类已经将转基因稳定地掺入其部分或全部生殖细胞中，导致转基因传递至转基因禽类的部分子代中。这种种系传递导致建立者禽类的部分子代显示被改变了的基因型。
本发明的再一个目的是提供一种对禽类进行遗传修饰的有效方法，使得能以高频率并生产可靠表达转基因的种系转基因禽类。
本发明提供了一种生产转基因禽类的方法，该方法包括使用慢病毒载体系统将外源遗传物质输送至禽类胚胎细胞或睾丸细胞的步骤。
慢病毒载体系统包括一个慢病毒转基因构建体，其呈能被输送至禽类胚胎细胞或睾丸细胞的基因组并与之整合的形式。
优选地，在发育早期阶段，如当仅有少数细胞分裂时的早期分裂阶段输送并整合慢病毒载体系统。
在一个实施方案中，慢病毒转基因构建体被注射入开口的卵的内容物的胚盘下腔中，然后使其发育。
可以使用替代卵壳的Perry培养系统。
或者可以使用Bosselmann等或Speksnijder和Ivarie所用的卵开窗术。在这些方法中，新产的卵中的胚胎可以通过在卵壳中切开一个窗口而接近，并将慢病毒载体系统注射入胚胎的胚盘下腔中。然后将该卵密封并孵育。
在另一个实施方案中，将该构建体直接注射入卵的胚盘下腔中。典型地，所述遗传物质编码一种蛋白质。
所述遗传物质可以编码具有各种用途的大量蛋白质中的任何一种，所述用途包括人体和/或兽医目的的治疗性和诊断性应用，还可包括编码抗体、抗体片段、抗体衍生物、单链抗体片段、融合蛋白、肽、细胞因子、趋化因子、激素、生长因子或任何重组蛋白的序列。
本发明因此提供了一种转基因禽类。
优选地，通过本发明的方法产生的转基因禽类具有被掺入到至少一部分生殖细胞中的遗传物质，由此遗传物质将被传递至转基因禽类的至少一部分子代中。
本发明还提供了慢病毒载体系统在转基因禽类的生产中的应用。
已经令人惊奇地观察到应用本发明所述的慢病毒转基因构建体可以以出人意料的高效转导禽类胚胎的生殖细胞。所得禽类随后将整合的载体传递至大部分子代中，且载体所携带的转基因可以在相对高的水平被表达。
本发明因此进一步提供了转基因禽类。
根据本发明还提供了一种在禽类中生产异源蛋白质的方法，该方法包括将慢病毒载体构建体内编码蛋白质的遗传物质输送至禽类胚胎细胞的步骤，以产生在其组织内表达该遗传物质的转基因禽类。
优选地，所述转基因禽类在输卵管内表达该基因，以使得所翻译的蛋白质掺入卵中。
然后该蛋白质可以通过已知方法从卵中分离。
本发明提供了慢病毒构建体在转基因禽类生产中的应用。
本发明还提供了慢病毒载体构建体在转基因禽类中生产蛋白质的应用。
优选地，该慢病毒载体构建体被用于在特定的组织中，优选在卵清或卵黄中表达异源蛋白质。
这个应用中使用的慢病毒可以是任何慢病毒载体，但优选选自由以下所组成的组：EIAV、HIV、SIV、BIV和FIV。
特别优选的载体是EIAV。
任何可商购的慢病毒载体均可适于用作输送外源遗传物质的构建体的基础。
优选地，所述构建体包括用于后续的蛋白质生产的合适的增强子启动子元件。
一种特异性启动子可以与一种慢病毒载体构建体一起使用，导致DNA编码序列的组织特异性表达。这样的启动子可以包括如CMV、pCAGGS或者基于通常在禽卵中表达的蛋白质的任何启动子，所述蛋白质如卵清蛋白、溶菌酶、卵清蛋白样基因、卵类粘蛋白、卵抑制素(ovostatin)、核黄素结合蛋白或抗生物素蛋白。
优选地，使用可商购的包装系统包装载体构建体颗粒，以产生具有包膜、典型地具有VSV-G包膜的载体。
典型地，所述载体可基于得自ATCC登记号为VR-778的EIAV或者其它可商购的载体。
用于本发明的方法中的基于慢病毒的商用载体能感染广泛的物种而不产生任何活病毒也不引起细胞或组织毒性。
本发明的方法可用于产生任何转基因禽类，包括但不限于鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、鹅、鸵鸟、野鸡、孔雀、珍珠鸡、鸽子、天鹅、矮脚鸡和企鹅。
这些基于慢病毒的载体也具有巨大的转基因能力，可以携带较大的蛋白质编码构建体，如抗体编码构建体。
一种优选的慢病毒载体系统是Oxford BioMedica的LentiVector系统。
本发明还进一步提供了一种测定蛋白质在体内表达的可能性的方法，该方法包括在体外测定所述蛋白质在禽类输卵管细胞中表达的步骤。
因此，本发明提供了禽类细胞在体外确定体内表达的可能性的用途。
本发明通过参考以下非限制性实施例及附图举例说明。
图1是本研究中所使用的EIAV载体的示意图。
图2图解的是来自各个禽类的基因组DNA的Southern转移分析以鉴别前病毒插入。
图3图解的是在pONY8.0cZ和pONY8.0G G1转基因禽类中报道基因的表达。
图4图解的是在pONY8.4GCZ G1转基因禽类中报道基因的表达。
图5图解的是在G2转基因禽类中报道基因的表达。
图6图解的是pONY8.4GCZ G1禽类的Western分析。
图7图解的是在pONY8.0cZ G2禽类中报道基因的表达。
图8图解的是在转基因禽类的输卵管中lacZ的表达。
实施例1
获得新产的能孵育的母鸡卵，其含有处于发育阶段X-XIII的发育中的鸡胚胎(Eyal-Giladi&Kochav，1976)。将卵打开，将内容物移至一个盘中，并将2-3μL的慢病毒载体病毒颗粒的悬浮液注射入胚盘下腔，注射处为在发育中胚的下方但在黄色卵黄的上方。所使用的载体衍生自马感染性贫血病毒(EIAV)并携带有一个处于CMV(巨细胞病毒)增强子/启动子控制下的报道基因β-半乳糖苷酶(lacZ)。用于产生载体病毒颗粒的包装系统导致产生具有VSV-G包膜的载体。估计病毒转导颗粒的浓度在5×107-1×109/ml之间。通过使用第二和第三相的Perry培养系统(Perry，1988)培养使胚胎发育。取出12个胚胎并分析孵育2天后及3天后的12个胚胎中lacZ的表达情况。将胚胎及其周围的膜与卵黄切离，固定并染色以检测lacZ报道基因的表达。所有胚胎均显示出lacZ在胚及其周围的膜的一些细胞中表达。表达在接近胚胎的发育中的胚外膜中最高，并被限于分析的胚胎中的少数细胞。这些结果表明所有胚胎均已经通过注射的慢病毒载体而被成功地转导。
实施例2
在另一个实验中，将40个所产卵的每一个均用2-3μL的EIAV载体的悬浮液以5×108/ml的效价注射入胚盘下腔中。孵化出13只鸡(33％)，对其进行筛选以鉴别携带慢病毒载体序列的转基因子代。在孵化后从各个鸡中回收残存的胚外膜的样品，提取基因组DNA并使用特异于慢病毒载体序列的引物通过PCR分析该DNA。这一筛选鉴别到11只转基因鸡(85％)。载体序列在胚外膜中被检测，拷贝数为0.4％-31％之间，这表明所述鸡整合了载体的嵌合体。这个结果是在胚胎由至少60,000个细胞组成的阶段用载体注射胚胎进行预测的。不太可能的是胚胎中的所有细胞都将被病毒载体转导，由此产生对于载体整合为嵌合型的鸡。这11只鸡被饲喂至性成熟，发现有7只是雄性的。当公鸡达到16-20周龄时从中获得精液样品。将取自这些样品的DNA通过PCR进行筛选，发现7只公鸡在其精液中具有慢病毒载体序列，估计水平为0.1％-80％之间。大多数样品含有水平高于10％的载体序列。这提示这些公鸡的至少10％的子代将是转基因的。从一只公鸡中收集精液，编号为LEN5-20，估计其在来自血液样品的DNA中病毒载体的拷贝数为6％。来自精液样品估计拷贝数为80％。精液用于对原种母鸡授精，收集受精卵并对其进行孵育。孵育3天后获得9个胚胎，通过PCR进行筛选以鉴别转基因胚胎并加以染色以分析lacZ报道基因的表达。9个胚胎中有3个是转基因的，所有这3个胚胎均表达lacZ，但是是在少数细胞中以极低的水平表达。孵育10天后获得12个胚胎并如上述进行筛选。其中6个胚胎经鉴别是转基因的，并且在其中4个胚胎中检测到lacZ表达。在1个胚胎中的一些组织中高水平表达，而在其它3个胚胎中表达水平较低。这些结果表明公鸡LEN5-20的43％的子代是转基因的。慢病毒载体携带的报道基因构建体的表达在各个转基因鸡间不同。很可能各个鸡具有在不同的染色体位点整合的载体基因组拷贝，这可以影响转基因的表达。一些鸡也可能携带一个以上拷贝的转基因。
在此概述的结果表明一种特异的EIAV衍生的慢病毒载体，具有VSV包膜蛋白的假模标本，可以非常高效地转导鸡胚胎的生殖细胞。然后，所得禽类将整合的载体传递至其大部分子代。载体携带的转基因可以被表达以提供相对高水平的功能性蛋白质。载体携带的转基因可以被设计为在特定组织中高水平表达外源蛋白质。
利用经修改的上述实施例中的所述方法，慢病毒载体可以被导入不同发育阶段的鸡中。
可以在新产卵内的胚盘胚上方注射病毒悬浮液。通过利用Perry(1988)的培养方法培养或者从输卵管中获得卵然后将其通过卵子转移方法转移至一个受体母鸡中，病毒悬浮液可以被注射进新授精的卵内或者在早期分裂阶段直至X阶段被注射(Eyal-Giladi&Kochav，1976)。
病毒悬浮液可以通过在卵壳上切开一个窗口在新产卵内胚盘胚的上方或下方注射。所述窗口可以被再密封并将该卵孵育至孵化(Bosselman et al，1989)。
病毒悬浮液可以注射进公鸡的睾丸中，筛选精液以检测精原细胞的转导及随后的转基因精子的发育。
实施例3
材料和方法
EIAV载体及病毒原种的制备
载体pONY8.0cZ和pONY8.0G先前已有描述(Pfeifer et al，2002)。载体pONY8.4GCZ具有许多修饰，包括gag衍生区域中所有ATG序列均改变为ATTG，使得eGFP在5′LTR的下游表达。3′U3区域已经被修饰为包括莫洛尼白血病毒U3区域。载体原液通过用2μg载体质粒、2μg的gag/pol质粒(pONY3.1)和1μg的VSV-G质粒(pRV67)经FuGENE6(Roche，Lewes，U.K.)转染铺板于10cm平皿上的HEK293T细胞而产生(Lois et al，2002)。转染36-48小时后，过滤(0.22μm)上清并在-70℃贮存。浓缩的载体制品通过最初在4℃以6,000×g低速离心16小时，随后在4℃以50,500×g超速离心90分钟而制成。将病毒重悬于配制缓冲液(Lois et al，2002)中2-4小时，分成等份并在-80℃贮存。
转基因禽类的产生和分析
将大约1-2μl的病毒悬浮液显微注射入新产卵的胚盘胚之下的胚盘下腔中。使用来自体内(ex vivo)培养系统的替代卵壳(Challita&Kohn，1994)的II和III相将胚孵育至孵化。使用Puregene基因组DNA纯化试剂盒(Flowgen，Asby de 1a Zouche，U.K.)，从发育12天或在之后的培养中死亡的胚胎的CAM中提取DNA。基因组DNA样品得自孵化鸡的CAM，血液样品得自较大年龄的禽类，精液得自成熟公鸡。对50ng的DNA样品进行PCR分析以确定前病毒序列的存在。为估计拷贝数，如前所述对50ng鸡基因组DNA等分进行平行对照PCR反应，以相当于单拷贝基因(1×)、10倍稀释(0.1×)和100倍稀释(0.01×)的量加入载体质粒DNA(Perry，1988)。所用的引物是：
5′CGAGATCCTACAGTTGGCGCCCGAACAG3′
5′ACCAGTAGTTAATTTCTGAGACCCTTGTA-3′。
各个G1禽类中前病毒插入的数目通过Southern转移进行分析。用XbaI或BamHI消化从全血中提取的基因组DNA。消化的DNA在0.6％(w/v)琼脂糖凝胶上进行分离，然后转移至尼龙膜上(Hybond-N，Amersham Pharmacia Biotech，Amersham U.K.)。在65℃将膜与32P标记的报道基因lacZ或eGFP的探针杂交。通过放射自显影术检测杂交。所有实验、动物饲养及护养程序均在U.K.Home Office许可下进行。
表达分析
分离成熟组织并在溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的4％多聚甲醛、0.25％戊二醛中固定30分钟。将组织低温包埋并切成14μm切片。β-半乳糖苷酶活性通过在37℃在5mM高铁氰化钾、5mM亚铁氰化钾、2mM MgCl2、0.5mg/ml X-gal中保温90分钟(切片)或4小时(胚胎)进行检测。孵出的小鸡的GFP显影使用Fujifilm数码相机(Nikon 60mm透镜)捕获，通过GFsP-S透镜系统拍摄(BLS，Ltd，Czech Republic)。将选择的组织速冻并通过在含有蛋白酶抑制剂(complete mini，Roche，Lewes，U.K.)的PBS中均质化以提取总蛋白质。蛋白质浓度通过Bradford分析确定。将50μg(图4)或100μg(图3)的蛋白质提取物在12％的聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Paisley，U.K.)上分离并转移至PDVF膜。将膜与1∶5000稀释的小鼠抗β-半乳糖苷酶抗体(Promega，Southampton，U.K.)和1∶2000稀释的驴抗小鼠IgG-HRP抗体(SantaCruz Biotech)一起保温，并使用ECL western印迹检测系统(AmershamBiosciences，Amersham，U.K.)进行观测。使用β-gal Elisa试剂盒(Roche，Lewes，U.K.)进行ELISA。
结果
详细图解
图1：本研究中使用EIAV载体的示意图。
亮灰色框代表EIAV包装信号，pONY8.4GCZ中斜线框表示MLVU3区域。标示了用于Southen印迹分析的限制性位点(XbaI[X]、BstEII[B])。报道基因lacZ被用作探针(图2)。
图2：来自各个禽的基因组DNA的Southern转移分析，以鉴别前病毒插入。基因组DNA样品用XbaI(a、c、d)或BstEII(b)消化并与lacZ探针杂交。(a、b)：编号1-4的G0代禽的14个G1代后代的分析(表1)表明在G1代禽中有多个前病毒插入。(c)：编号2-2/19的G1代禽(泳道1)及其14个G2代后代(泳道2-15)和(d)：G1代禽2-2/6(泳道1)及其9个G2代后代(泳道2-10)的分析表明了种系传递后前病毒插入的稳定性。
图3：pONY8.0cZ和pONY8.0G G1代转基因禽类中报道基因表达。
a：对来自均含有单一的独立的pONY8.0cZ插入的5个成熟G1代禽中提取的肝、心脏、骨骼肌、脑、输卵管、皮肤、脾、肠、肾、胰腺和骨髓蛋白质进行Western印迹分析。每个泳道加样100μg蛋白质并如实验方案中所述检测β-半乳糖苷酶。b：将来自G12-2/19的皮肤、胰腺、和肠的切片染色以检测β-半乳糖苷酶活性，并与非转基因的对照组禽进行对比(箭头表示皮肤的表皮、肠绒毛)。标尺＝0.5mm。c：观测来自单拷贝转基因或野生型禽的胸肌、胰腺和皮肤切片的GFP荧光的情况(箭头表示皮肤表皮)。标尺＝0.5mm。
图4：报道基因在pONY8.4GCZ G1代转基因禽类中的表达。
a：将来自单拷贝的G1代禽的组织切片染色以分析β-半乳糖苷酶活性(箭头表示肠道平滑肌)。标尺＝0.5mm。A组：输卵管切片的较高放大倍率。箭头表示横切面切割的管状腺内的细胞。标尺＝0.05mm。b：对pONY8.0cZ和pONY8.4GCZ品系所确定的β-半乳糖苷酶水平。数据点是从三个独立的实验中产生的。
图5：报道基因在G2代转基因禽类中的表达。
a：对从G1代公鸡2-2/19和2-2/6及每个禽的两个G2代后代的肠、皮肤、肝和胰腺中提取的蛋白质进行Western分析。b：上面的一组：禽ID 4-1的5个G1代后代。左侧的4只禽是pONY8.0G转基因禽并表达GFP。右侧的一只禽是非转基因的。下面的一组：禽ID4-1/66的5个G2代后代。位于中间的禽是非转基因的。
图6：pONY8.4GCZ G1代禽的Western分析。
对从均含有单一的独立的pONY8.4GCZ插入的4个成熟G1代禽中提取的肝、心脏、骨骼肌、脑、输卵管、皮肤、脾、肠、肾、胰腺和骨髓蛋白质进行Western印迹分析。每个泳道加样100μg蛋白质，并如实验方案中所述的那样检测β-半乳糖苷酶蛋白质。
图7：报道基因在pONY8.0cZ G2代转基因禽中的表达。
将来自2-2/19的G2代后代的皮肤、胰腺和肠的切片(箭头表示上皮，箭头记号表示羽囊)进行染色以分析β-半乳糖苷酶活性，并与非转基因对照组禽的切片进行对比。标尺＝0.5mm。
G0代转基因禽的产生
使用三种不同的自身失活的EIAV载体(图1)，用疱疹性口腔炎病毒糖蛋白(VSV-G)制备假模标本。这些载体先前用于在一些体外和体内的一些动物模型系统中转导多种组织(Pfeifer et al，2002；Rholl etal，2002；Corcoran et al，2002；Azzouz et al，2002)。pONY8.4载体是从pONY8.0中通过取代5′LTR中的莫洛尼鼠类白血病毒(MoMLV)序列及缺失大部分病毒env基因进行修饰的。将载体制剂浓缩以提供大约107-1010转导单位/毫升(T.U./ml)的效价。将1-2ml的浓缩载体注射入新产卵的发育中的胚盘下方的胚盘下腔中，然后培养至孵化。从孵出的G0代鸡的尿囊绒膜(CAM)中提取基因组DNA，并通过PCR进行分析以检测EIAV包装位点序列。关于存在的基因组DNA的量估计了载体的大约拷贝数，范围从1个拷贝/个基因组至0.01个拷贝/个基因组(见实验方案)。所有的鸡均饲养至性成熟，并将雄性精液样品的基因组DNA通过PCR进行相似的筛选。
进行了4个实验。将病毒pONY8.0cZ在实验3.1中以5×107T.U./ml的效价及在实验3.2中以5×108T.U./ml效价进行注射。在实验3.3中，病毒pONY8.4GCZ以7.2×108T.U./ml的浓度进行注射，在实验3.4中pONY8.0G以9.9×109T.U./ml使用。在这4个实验中共注射了73个卵，从中孵出20只鸡(27％)。对每个实验孵出的雄性鸡和雌性鸡进行PCR筛选的结果示于表1。20个G0代禽中有14个含有载体序列，该序列的水平估计为0.5-0.01个拷贝/个基因组。当以相似浓度注射时，载体pONY8.0cZ转导鸡胚胎比载体pONY8.4GCZ更有效，可能是由于病毒cPPT序列的存在，该序列参与病毒DNA基因组的核输入(Lois et al，2002)。结果还表明转基因禽可以使用低至5×107T.U./ml的效价产生，但如果使用较高的效价则转导频率增加。
从G0代雄性中的种系传递
当这12个G0代雄性禽在16-20周龄达到性成熟时，从中收集精液样品。对从这些样品中提取的基因组DNA进行PCR筛选的结果如表1所示。这些结果表明载体序列存在于所有公鸡的种系中，甚至当在孵化中进行筛选时已被记录为是无转基因的那些公鸡。这个结果可以通过将这12只公鸡中的10只与原种母鸡杂交，并筛选其G1代后代来鉴别转基因禽而得到证实。所有10只公鸡均产生转基因后代，频率范围是4％-45％。种系传递的频率与从精液DNA的PCR分析中推测的结果非常接近，但在每种情况中，均高于从在孵化时所取的CAM样品中DNA的分析结果。从一些公鸡取血液样品，PCR分析结果与CAM DNA分析的结果严密地匹配(数据未显示)。结果提示种系转导频率比体组织的转导频率高大约10倍。
G1代转基因禽及传递至G2代的分析
当胚胎处于由估计60,000个细胞组成时的发育阶段，将建立者转基因禽进行转导，其中大约50个被认为产生了原始生殖细胞(Bienemann et al，2003；Ginsburg&Eyal-Giladi，1987)。我们推测G1代禽得自各个原始生殖细胞的单独转导活动，并且不同的禽具有独立的前病毒插入，代表单生殖细胞前体的转导。也可能的是各个细胞具有一个以上的前病毒插入。选择用pONY8.0cZ转导的4个G0公鸡(实验3.1和3.2)进一步分析其转基因后代(表2)。来自各个G1代禽的基因组DNA通过Southern印迹分析。将样品用XbaI和Bst EII单独消化，XbaI和Bst EII是在整合的EIAV前病毒内探针区域外进行切割的限制酶(图1)，并与探针杂交以鉴别代表在整合位点，前病毒插入与基因组DNA之间连接的限制性片段。这使得可以估计每个G1代禽中前病毒插入数及每个分析的G0代后代中存在的不同插入的数。这个分析的一个实例如图2a、b所示，结果概括于表2。大多数G1代禽携带单一的前病毒插入，但有一些含有多个拷贝，在一个禽中最多检测到4个拷贝。每个G0代禽的一些后代携带相同的前病毒插入，这表明它们衍生自相同的生殖细胞前体。
将禽2-2的3个雄性G1代后代(2-2/6、16和19)与原种母鸡杂交以分析至G2世代的传递频率。公鸡2-2/6和2-2/19具有单一的前病毒插入，转基因与非转基因后代比率为14/30(47％)和21/50(42％)，这与预期的孟德尔比率无显著差异。公鸡2-2/16具有两个前病毒插入，79％(27/34)的G2代后代是转基因的，反映出两个插入的独立传递。Southern转移分析被用于对禽2-2/6和2-2/19及其分别9和14个G2代后代中存在的前病毒插入(图2c、d)进行比较。在亲代和子代中观测到相同的限制性片段，表明前病毒一旦整合进基因组则是稳定的。
G1和G2代转基因禽中的转基因表达
载体pONY8.0cZ和pONY8.4GCZ携带有处于人巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子/启动子(CMVp)控制下的报道基因lacZ，pONY8.0G携带也处于CMVp控制下的报道基因eGFP。通过将组织切片染色以检测β-半乳糖苷酶活性和通过对分离自成熟禽的所选择的组织提取的蛋白质进行western分析以鉴别β-半乳糖苷酶蛋白而对lacZ的表达进行分析。eGFP的表达使用UV照明分析。
从均含有不同的单前病毒插入的7个pONY8.0cZ G1代禽的各种组织中提取蛋白质。在每个转基因禽中的一些组织中检测到期望的110kDa的蛋白质。在胰腺中表达始终较高，在其它组织包括肝、肠和骨骼肌中的存在的蛋白质水平较低。对这些禽中的5个进行分析，结果示于图3a。当较长时间曝光western印迹时，在决大多数组织中检测到β-半乳糖苷酶(数据未显示)。表达模式在各个禽之间一致，但蛋白质总量不同。将来自成熟pONY8.0cZ G1代禽的组织切片染色(图3b)。在整个胰腺外分泌部及在其它组织如皮肤表皮和小肠绒毛中都观测到强染色。对来自pONY8.0G禽的组织切片中GFP表达分析检测到其在胰腺、皮肤和胸肌中的表达(图3c)，在肠中弱表达(数据未显示)。这些结果表明用具有相同的EIAV载体但携带不同的报道基因的所产生的转基因禽有相似的表达模式。
对携带pONY8.4GCZ的不同单前病毒插入的6个G1代禽的组织进行Western分析，检测到lacZ在4个禽中表达，表达模式与在pONY8.0cZ转基因禽中所见模式相似(图6)。然而，组织切片染色揭示了一种比在pONY8.0cZ转基因禽中观测到的更广泛的表达模式。β-半乳糖苷酶活性在肠道平滑肌、表皮下血管及在输卵管的管状腺细胞中额外地被检测到(图4a)。使用ELISA分析量化携带pONY8.0和pONY8.4载体的转基因禽之间β-半乳糖苷酶的表达水平的差异(图4b)。在所有分析的组织中，β-半乳糖苷酶在pONY8.4GCZ禽中的水平均高于在pONY8.0cZ禽中的水平。胰提取物中的水平高出大约6倍，在编号3-5/337的禽中的表达水平为30pg/μg组织，或者总蛋白质的3％。
为确定转基因表达在种系传递后是否保留，检测了携带载体pONY8.0cZ和pONY8.0G的G2禽中的表达。对来自均具有单前病毒插入的两个G1代公鸡2-2/6和2-2/19及来自每个公鸡的两个G2代后代的组织提取物进行Western分析(图5a)。在亲代和两个子代中β-半乳糖苷酶蛋白水平非常相似，并且表达模式(主要在胰腺中)也非常相似。对来自一个代G2禽的组织切片进行染色表明表达模式与在亲代中观测到的相似(图7)。GFP荧光易于在活的携带pONY8.0G的G1代鸡中检测到，并且这些禽之一的G2代后代显示出相似的表达水平(图5b)。
图8表示携带具有报道基因lacZ的载体pONY8.4GCZ的转基因母鸡输卵管的一系列切片。切片中蓝色染色表示lacZ的表达。
讨论
我们已经论证了所测试的慢病毒载体系统是生产种系转基因禽的一种非常有效的方法。在本发明描述的实验中，在新产卵内囊胚层阶段胚胎的下方直接注射病毒载体颗粒的浓缩悬浮液后，产生了12只公鸡。我们从10只建立者公鸡开始进行繁育，均产生转基因子代，频率为4-45％。甚至在繁殖上所获得的最低频率的种系传递也用于实际中以从一个建立者公鸡中鉴别一些G1代转基因禽，以建立携带不同前病毒插入的独立品系。这个囊胚层下注射的方法与先前使用的将逆转录病毒导入鸡中的方法非常相似(Salter&Crittenden，1989；Bosselman et al，1989；Harvey etal，2002)。高成功率也许是由于许多因素所致，包括慢病毒载体转导非分化的细胞的能力、先前用于将逆转录病毒载体导入鹌鹑中的VSV-G假模标本的应用(Karagenc et al，1996)、以及使用了与先前的转基因研究相比更高的效价。孵化的卵中的鸡胚胎是由单层细胞组成的盘，位于卵黄的表面上，细胞开始经过胚胎移动以在胚盘下方形成下胚层(Mizuarai et al，2001)。原始生殖细胞也从胚盘经过胚盘下腔迁移至下方的下胚层上。可能在注射病毒之后紧接的发育阶段，原始生殖细胞经过病毒颗粒悬浮液进行迁移，因此与CAM或血液细胞相比具有更高的生殖细胞转导频率。
我们已经说明了大多数代G1转基因禽含有一单前病毒插入，但一些禽含有多个插入。这些结果表明易于使用这个载体系统来生产具有单载体-转基因插入的转基因禽，并且易于从相同的G0代禽中培育在不同的染色体基因组具有前病毒插入的一些品系。由特定的载体导入的但在鸡基因组内的不同位点被整合的转基因的表达水平很可能不同。从G1至G2的传递分析表明使用所述慢病毒载体对于建立携带稳定转基因插入的品系是简便的。
报道基因lacZ的表达在建立者(G0)、G1和代G2禽中被检测。LacZ的表达由人CMVp(第-726至+78位核苷酸)指导，CMVp通常被描述成是在许多细胞类型中无所不在地起作用的增强子/启动子。通常是这样的情况，即如果其在细胞培养转染实验中使用，但来自CMVp的转基因小鼠中的表达在组织之间有差异。特别地，已经报道了CMVp转基因显示出主要在转基因小鼠的胰腺外分泌部中表达(Eyal-Giladi&Kochav，1976)。我们已经表明了lacZ和GFP在胚胎和禽中的表达模式均在胰腺中是主要的，尽管其在大多数组织中表达水平不同。来自第三世代EIAV载体pONY8.4的表达显著高于来自pONY8.0载体的表达，可能是由于前者中由于env区域中不稳定的元件的去除提高了mRNA稳定性所致。转基因表达在少数pONY8.4GCZ转基因禽中未检测到，可能是由于载体中包含可诱导沉默的MoMLV序列所致(Zhan et al，2000)。在G1代禽中见到的表达模式在种系传递至G2后仍保留。这些结果表明来自用慢病毒载体导入的转基因的转基因特异性表达在种系传递后仍保留，这已经在小鼠和大鼠中被描述(Naldini et al，1996)。可以掺入慢病毒载体中的转基因的大小受限制，因此一些组织特异性调节序列对于在这些载体中使用而言则太大。所述限制还未阐明，但很可能是直至8kb，因为9kb的EIAV载体已经被成功地制备到(Lois et al，2002)。
lacZ在输卵管中的表达(图8)表明在携带编码一种蛋白质的整合型慢病毒载体系统的转基因禽中，合成卵清蛋白的细胞可以表达外源蛋白。
本发明所述研究是评价慢病毒载体应用于生产转基因禽的可能性。我们已经指出我们可以获得一种非常高频率的种系转基因禽，从一个世代稳定地传递至下一世代，并可以获得在种系传递后仍被保留的转基因表达模式。这些结果表明慢病毒载体的应用将克服迄今为止在开发有效的生产转基因禽的方法中所遇到的许多问题。这种方法在转基因生产中的应用将使得许多转基因构建体被测试以确定在合适的组织中以所需要的水平表达的那些构建体。近来，ALV载体已被用于生产转基因品系，其中证实了生物活性蛋白质在卵清中的低量表达和积聚(Rapp et al，2003)。尽管产生的蛋白质的量(每个卵产生几微克蛋白质)不是在便于商业生产的水平，但对从卵清中纯化的蛋白质分析支持了转基因母鸡可用作生物反应器的目的。慢病毒载体的应用可以克服与使用致癌逆转录病毒载体进行转基因掺入和表达相关的问题。该生产转基因禽的有效方法的开发是特别及时的，因为今年将完成鸡基因组序列，并且鸡作为分析脊椎动物基因功能的模型的价值正在增加(Mozdziak et al，2003)。
实验4
用Invitrogen ViraPowerTM系统进行实验。将鸡源化的R24微型抗体(minibody)编码序列被插入pLenti6/V5质粒中，位于组成型CMV启动子的紧邻下游。然后将ViraPowerTM 293FT细胞用pLenti6/V5/R24表达构建体和优化的ViraPowerTM包装混合物共转染。最后收集包装的含有病毒的组织培养上清。InvitrogenViraPowerTM系统的一种预期用途是作为高效转染试剂。epLenti6/V5质粒上杀稻瘟素抗性基因的存在赋予其优先选择被转导的群体的能力。这意味着相对低效价的病毒产量是足够的。然而，对于下述实验研究，需要更加被浓缩的病毒产量。评价了病毒浓缩的两种方法。首先，通过CentrikonPlus20自旋柱使用旋转浓缩。其次，使用标准超速离心方案。
被浓缩的包装的病毒载体的RNA基因组的结构通过Northern印迹和逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)双重分析。使用一些反向引物，寡dT，随机六聚体及一个特异于3′LTR的引物进行逆转录，以保证病毒基因组的代表性样品被转换为cDNA。使用优化为扩增特异性序列的单个PCR反应证实了cDNA样品中cR24编码序列的完整性。
被包装的pLenti6/V5/R24病毒载体也正被用于在体外转导293T细胞。在加入了聚季铵盐(Polybrene)的标准组织培养基中制备多重pLenti6/V5/R24病毒稀释液。然后将病毒/培养基/聚季铵盐混合物加入细胞中。3小时后，补充组织培养基直至再72小时后收获培养基。然后通过ELISA量化分泌的cR24微型抗体的水平。在收获培养基之前7-10天，也用杀稻瘟素选择被转导的细胞。在此，也通过ELISA量化被分泌的cR24微型抗体的水平。
另外，被包装的pLenti6/V5/R24病毒载体也正被用于在体内转导鸡胚胎，这是通过将该载体注射入处于发育中的胚胎下方但在黄色卵黄上方的胚盘下腔中进行。
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表1：对被孵化的小鸡和来自的建立者小公鸡的种系传递的PCR分析
  实验：构建体(病毒效价)   基因组等价物   种系传递
  禽编号   CAM   精子   转基因动物/总数
  1.pONY8.0cZ5×107T.U/ml   1-11-21-31-41-5   00.0100.010.01   0.05♀♀0.050.1   1/14(7％)--16/55(29％)nd
  2.pONY8.0cZ5×108T.U/ml   2-12-22-32-42-52-62-72-8   0.10.100.100.050.050.05   ♀1.00.010.5♀♀♀0.5   -4/20(20％)nd19/67(28％)---15/60(25％)
  3.p0NY8.4GCZ7.2×108T.U/ml   3-13-23-33-43-53-6   000.010.010.010.01   0.050.05♀0.050.1♀   1/25(4％)3/64(5％)-4/100(4％)9/82(11％)-
  4.pONY8.0G9.9×109T.U/ml   4-1   0.05   1.0   20/44(45％)
表2：G1禽的基因组中前病毒插入数的估计
禽编号   分析的总G1数   具有N个插入的禽的数目   独立插入的总数
  1   2   3   4
  1-42-22-42-8   1441414   1131110   3121   0012   0001   1041419

Claims (18)

1.一种生产转基因禽类的方法，所述方法包括使用慢病毒载体系统将外源遗传物质输送至禽类胚胎细胞或睾丸细胞的步骤。
2.权利要求1的方法，其中所述慢病毒载体系统包括一种慢病毒转基因构建体，该构建体呈能被输送至禽类胚胎细胞或睾丸细胞的基因组并与之整合的形式。
3.权利要求2的方法，其中慢病毒构建体被注射进开口的卵内容物的胚盘下腔中，然后使卵发育。
4.权利要求2的方法，其中所述构建体被直接注射进卵的胚盘下腔中。
5.前述任一项权利要求的方法，其中所述载体构建体高效转导生殖细胞。
6.前述任一项权利要求的方法，其中所述遗传物质编码一种蛋白质。
7.通过前述任一项权利要求的方法产生的转基因禽类。
8.一种转基因禽类及随后作为权利要求7的转基因禽类的后代而产生的转基因后代。
9.一种在禽类中生产异源蛋白质的方法，所述方法包括将位于慢病毒载体构建体内的编码蛋白质的遗传物质输送至禽类胚胎细胞中，以产生在其组织中表达该遗传物质的转基因禽类。
10.权利要求9的方法，其中转基因禽类在输卵管中表达所述基因，由此被翻译的蛋白质掺入到卵中。
11.权利要求10的方法，其进一步包括从卵中分离蛋白质的步骤。
12.慢病毒构建体在转基因禽类的生产中的用途。
13.慢病毒载体构建体在转基因禽类中蛋白质生产中的用途。
14.权利要求13的慢病毒载体构建体用于在特定的组织中，优选卵清或卵黄，表达异源蛋白质中的用途。
15.权利要求12-14中任一项的用途，其中所述慢病毒选自由以下所组成的组：EIAV、HIV、SIV、BIV和FIV。
16.权利要求12-15中任一项的用途，其中所述构建体包括适于后续蛋白质生产的合适的增强子启动子元件。
17.权利要求12-16中任一项的用途，其中所述载体构建体颗粒被包装以产生具有包膜的载体。
18.一种确定一种蛋白质在转基因禽类中表达的可能性的方法，所述方法包括检测所述蛋白质在体外输卵管细胞中的表达的步骤。
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