JP2020080747A - 遺伝子改変鳥類の作出方法および遺伝子改変鳥類 - Google Patents
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Abstract
Description
前記卵殻と接触させた状態で人工培養する工程は、前記胚を、前記受精卵中の産卵直後における卵黄の比重よりも大きい比重を有する卵白組成物とともに卵殻内で培養する工程とすることができる。
本発明に係る遺伝子改変鳥類の作出方法は、例えば、前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の産卵直後における卵白の比重が、前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の産卵直後における卵黄の比重と比較して同じか又はより小さいものである場合に適用される。
本発明に係る遺伝子改変鳥類の作出方法は、例えば、前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、第1の内因性卵白タンパク質遺伝子への第1の外因性構造遺伝子のヘテロ又はホモのノックインである場合に適用される。
また、本発明に係る遺伝子改変鳥類の作出方法は、例えば、前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、前記第1の内因性卵白タンパク質遺伝子への前記第1の外因性構造遺伝子のヘテロのノックインであり、前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚における遺伝子改変が、前記第1の内因性卵白タンパク質遺伝子への前記第1の外因性構造遺伝子のホモのノックインである場合に適用される。
本発明に係る遺伝子改変鳥類の作出方法は、例えば、前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、第2の内因性卵白タンパク質遺伝子のヘテロ又はホモのノックアウトである場合に適用される。
また、本発明に係る遺伝子改変鳥類の作出方法は、例えば、前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、前記第2の内因性卵白タンパク質遺伝子のヘテロのノックアウトであり、前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚における遺伝子改変が、前記第2の内因性卵白タンパク質遺伝子のホモのノックアウトである場合に適用される。
本発明の遺伝子改変鳥類の作出方法は、例えば、前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、第3の内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列に機能的に接続した第2の外因性構造遺伝子のゲノムへのヘテロ又はホモの非特異的挿入である場合に適用される。
また、本発明に係る遺伝子改変鳥類の作出方法は、例えば、前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、前記第3の内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列に機能的に接続した前記第2の外因性構造遺伝子のゲノムへのヘテロの非特異的挿入であり、前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚における遺伝子改変が、前記第3の内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列に機能的に接続した前記第2の外因性構造遺伝子のゲノムへのホモの非特異的挿入である場合に適用される。
前記第1〜3の内因性卵白タンパク質遺伝子は、例えば、それぞれ、オバルブミン遺伝子、オボムコイド遺伝子、オボムチン遺伝子、オボトランスフェリン遺伝子、オボインヒビター遺伝子又はリゾチーム遺伝子のいずれかであり、又は、前記第1〜3の内因性卵白タンパク質遺伝子は、例えば、オバルブミン遺伝子である。
また、前記遺伝子改変鳥類の作出方法は、例えば、前記遺伝子改変鳥類がニワトリ、ウズラ、アヒル又はシチメンチョウである場合、ニワトリ又はウズラである場合、又は、ニワトリである場合に適用される。
本発明において、「遺伝子改変鳥類」とは、遺伝子改変前の鳥類(たとえば、野生型鳥類)が有するゲノムの塩基配列に対して意図的に変異が導入された塩基配列を有するゲノムを持つ細胞から構成される鳥類を意味する。
本発明の第1の実施形態に係る遺伝子改変鳥類の作出方法(以下、単に「作出方法」という。)は、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚を、その発生初期において、胚を卵殻に接触させた状態で第1の代理卵殻内で培養する工程(以下「工程A」という。)、および、その発生後期において、第1の卵殻とは異なる第2の代理卵殻内で培養する工程(以下「工程B」という。)を行う。なお、「第1の代理卵殻」および「第2の代理卵殻」については後に説明する。
本実施形態の作出方法は、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵であって、当該受精卵中の産卵直後における卵白の比重が産卵直後の卵黄の比重と比べて同じか又はより小さい受精卵を出発材料とすることが好ましい。
本実施形態の作出方法の工程AおよびBにおいて、遺伝子改変鳥類のメスが産卵した受精卵中の胚を培養するための容器として、当該受精卵以外の受精卵または未受精卵の卵殻を材料として作製される第1の代理卵殻および第2の代理卵殻が用いられる。代理卵殻の材料として用いる受精卵の内容積は、本実施形態の作出方法に供される受精卵の内容積と同程度であるか又はそれよりも大きいことが好ましい。
本明細書において、卵白組成物とは、鳥類の卵白からなる組成物を意味する。卵白は、受精卵又は未受精卵の内水様性卵白、濃厚卵白および外水様性卵白の何れかであってもよく、これらを混合した組成物であってもよい。本実施形態の作出方法の工程Aに用いる卵白組成物は、その比重が遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の卵黄の比重よりも大きいものである。
本実施形態の作出方法における胚1を代理卵殻内で保温する工程(S4およびS6)においては胚を保温するために自動転卵装置付きの孵卵器を用いることができる。孵卵器としては、特に限定されるものではなく、たとえば、昭和フランキ社製のType P−008等のように一般に使用されているものを用いることができる。
まず、工程Aについて説明する。図2は、工程Aの人工培養法を模式的に示す図である。図1に示すように、工程Aでは、受精卵を割卵し受精卵の内容物を容器に移す工程(S1)と、受精卵の内容物中の胚と卵黄のみを第1の代理卵殻に移す工程(S2)と、第1の代理卵殻を卵白組成物で満たし密封する工程(S3)と、胚を第1の代理卵殻内で保温する工程(S4)を行う。
S1は、遺伝子改変鳥類のメスが産卵した産卵直後の受精卵を割卵し、卵の内容物を容器に移す工程である。容器としては、たとえば、直径50mm〜150mmのセラミックス製、ガラス製又は金属製の蒸発皿等の開口部が大きな容器を用いることが好ましい。
S2は、容器内に移された受精卵内容物から胚1および卵黄2のみを第1の代理卵殻4内に卵黄2に傷がつかないように移す工程である。S2において、第1の代理卵殻4に卵黄2とそれに付着する胚1のみを移すために、まず、上記容器内にある受精卵内容物から、吸引ピペット等を用いて卵白等の胚1および卵黄2以外の卵内容物を吸引する。ついで、容器から胚1および卵黄2のみを代理卵殻4内に移す。
S3では、胚1および卵黄2が入れられた第1の代理卵殻4の開口部から卵白組成物3を注入して第1の代理卵殻内を開口部の淵まで卵白組成物3で満たしたのち、第1の代理卵殻4の開口部を密封する。この際、代理卵殻4の内容物内に気泡が入らないように密封する。また、あらかじめ卵白組成物3の一部を第1の代理卵殻4に入れておき、胚1および卵黄2を第1の代理卵殻4に移してから、卵白組成物3で第1の代理卵殻4を満たしてもよい。
S4では、胚1が入れられた第1の代理卵殻4を、第1の代理卵殻4の長軸が水平になるように自動転卵機能が付いた孵卵器内に置き、たとえば、温度37℃〜40℃、湿度50%〜80%で保温する。保温は、第1の代理卵殻4内の胚1の発生段階がHHステージ9〜20又はそれに相当するステージに達するまで行う。第1の代理卵殻4は保温時に転卵されることが好ましい。転卵の角度は40°〜120°であることが好ましく、転卵の頻度は15分に1回〜1時間に1回であることが好ましい。
次に、工程Bについて説明する。図3は、工程Bの人工培養法を模式的に示す図である。図1に示すように、工程Bでは、第1の代理卵殻の内容物を第2の代理卵殻に移す工程(S5)と、胚を第2の代理卵殻内で保温する工程(S6)を行う。
S5では、まず、第1の代理卵殻4内の胚1、卵黄2および卵白8を、第2の代理卵殻9内に移す。第1の代理卵殻4内の内容物を第2の代理卵殻9に移した後、開口部を上側にして第2の代理卵殻9を直立させた場合、内容物の表面と第2の代理卵殻9の開口部が形成する平面との間に空気層10があることが好ましい。空気層の幅は、第2の代理卵殻を転卵した際に卵内容物が第2の代理卵殻の開口部の淵まで到達しない程度の幅とする。
S6では、胚1が入れられた第2の代理卵殻9を、開口部を上側にして第2の代理卵殻9の長軸が垂直になるように、自動転卵機能が付いた孵卵器内に置き、温度37℃〜40℃、湿度50%〜80%で保温する。保温は、第2の代理卵殻9内の胚1由来の産子が孵化するまで行う。第2の代理卵殻9は、胚1由来の産子の孵化予定日の5日前まで転卵されることが好ましい。
本発明の第2の実施形態に係る作出方法は、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚を、その発生初期において、胚を卵殻に接触させた状態で第1の代理卵殻内で培養する工程(以下「工程C」という。)、および、その発生後期において、プラスチックフィルム成形体内で培養する工程(以下「工程D」という。)を含む方法である。なお、プラスチックフィルム成形体およびそれを備える人工培養容器については、後に説明する。
〔S15〕
S15では、人工培養容器に備えられたプラスチックフィルム成形体11の凹状部に乳酸カルシウム粉末および蒸留水を入れる。遺伝子改変ニワトリのメスが産卵する受精卵内の胚1を培養する場合には、乳酸カルシウム粉末の質量を、0.25g〜0.3gとし、蒸留水の体積を、2.5ml〜3.0mlとすることができる。また、遺伝子改変ウズラのメスが産卵する受精卵内の胚1を培養する場合には、乳酸カルシウム粉末の質量を、0.025g〜0.1gとし、蒸留水の体積を、0.25ml〜1.0mlとすることができる。
S16では、胚1が入れられた人工培養容器を孵卵器内で、たとえば、温度37℃〜40℃、湿度50%〜80%で保温する。胚1が入れられた人工培養容器は保温中に転動されることが好ましい。人工培養容器の転動は、たとえば、人工培養容器の長軸を地表面に垂直な軸に対して8°程度傾けておき、人工培養容器の長軸を、地表面に垂直な軸の周りで120°づつ歳差運動させることによって行うことが好ましい。転動の間隔は、1日に1回〜2回である。孵卵条件をこのようにすることで産子のより高い孵化率が得られる。
本発明の第3の実施形態に係る作出方法は、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚を、その発生初期において、胚を卵殻に接触させた状態で第1の代理卵殻内で培養する工程(以下「工程E」という。)、および、その発生後期において、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜成形体内で培養する工程(以下「工程F」という。)を含む方法である。なお、PTFE膜成形体およびそれを備える人工培養容器については、後に説明する。
〔S25〕
S25では、HHステージ9〜20又はそれに相当ステージまで発生した胚1を第1の代理卵殻4内の卵黄2および卵白8とともに人工培養容器に備えられたPTFE膜成形体16の凹状部内に移す。
S26において、胚1が入れられた人工培養容器を孵卵器内で、鳥類胚で適した温度および湿度条件下、たとえば、温度37℃〜40℃、湿度50%〜80%で保温する。胚1が入れられた人工培養容器は保温中に転動されることが好ましい。転動は、人工培養容器を所定の角度傾けることによって行う。転動の角度は、30°が好ましく、転動の間隔は、1日に1回〜2回である。これによって、より高い産子の孵化率が得られる。
本発明の第4の実施形態に係る遺伝子改変鳥類は、上記第1〜3の実施形態に係る作出方法によって作出された遺伝子改変鳥類である。
(1−1)インターフェロンβ構造遺伝子ノックインのためのドナープラスミドの構築
配列番号1に示される塩基配列を有するドナーDNAを調製した。このドナーDNAの塩基配列は、ニワトリオバルブミン遺伝子におけるタンパク翻訳開始コドンの直上流から5‘側約2.8キロベースまでの塩基配列、ヒトインターフェロンβ構造遺伝子の塩基配列、ピュロマイシン耐性遺伝子ユニットの塩基配列、および、ニワトリオバルブミン遺伝子におけるタンパク質翻訳開始コドンの直上流から3’側約3.0キロベースまでの塩基配列から構成される。このドナーDNAをプラスミドpBlueScriptII (SK+)(Stratagene社(現Agilent Technologies社))に挿入してドナープラスミドpBS-IFNbetaを調製した。
横斑プリマスロック由来の株化されたニワトリPGCに、pBS-IFNbetaおよびpx330-Neor-OVATg1をトランスフェクトし、その後細胞をピュロマイシンで選択することにより、ドナーDNAがノックインされている遺伝子改変PGCを含むPGC集団を得た。px330-Neor-OVATg1は、内因性オバルブミン遺伝子内の翻訳開始コドン直上流にある塩基配列を標的配列とするガイドRNAおよびDNA分解酵素Cas9を発現するプラスミドである。こうして得られたPGC集団の一部を、レシピエント胚(白色レグホン)に移植して生殖細胞キメラニワトリ(以下「G0ニワトリ」という。)を作出した。
G1ニワトリのメスは、性成熟後に未受精卵を産卵した。産卵直後における未受精卵においては、卵黄の周囲の白濁した卵白、および、粘性の低い比較的少量の水様性卵白があることが確認された。白濁した卵白中のヒトインターフェロンβの量を、抗ヒトインターフェロンβ抗体を用いたELISA法(VeriKine Human Interferon Beta ELISA kit, PBL Assay Science社)で検査した。卵白には、1.8〜3.5mg/mlの濃度のヒトインターフェロンβが含まれていた。
(2−1)ヒト抗体構造遺伝子ノックインのためのドナープラスミドの構築
配列番号7に示される塩基配列を有するドナーDNAを調製した。このドナーDNAの塩基配列は、ニワトリオバルブミン遺伝子におけるタンパク翻訳開始コドンの直上流から5‘側約2.8キロベースまでの塩基配列、卵白リゾチーム由来のシグナルペプチドをコードするDNAの塩基配列、ヒト免疫グロブリン(IgG1)重鎖構造遺伝子の塩基配列、furinタンパク質切断標的配列をコードするDNAの塩基配列、2A自己プロセッシング性ペプチドをコードするDNAの塩基配列、卵白リゾチーム由来のシグナルペプチドをコードするDNAの塩基配列、ヒト免疫グロブリン(IgG1)軽鎖構造遺伝子の塩基配列、ピュロマイシン耐性遺伝子ユニットの塩基配列、および、ニワトリオバルブミン遺伝子におけるタンパク質翻訳開始コドンの直上流から3’側約3.0キロベースまでの塩基配列から構成されている。
横斑プリマスロック由来の株化されたニワトリPGCに、pBS-Ig(H+L)およびpx330-Neor-OVATg1をトランスフェクトし、その後細胞をピュロマイシンで選択することにより、ドナーDNAがノックインされている遺伝子改変PGCを含むPGC集団を得た。PGC集団に遺伝子改変PGCが含まれていることをPCR法により確認した。すなわち、PGCから調製したDNAを鋳型として、第1に、プライマーP1および配列番号8の塩基配列を有するプライマーP6を用いてPCRを行い、それにより得られた増幅産物を鋳型として、配列番号9の塩基配列を有するプライマーP7および配列番号10の塩基配列を有するプライマーP8を用いてPCRを行った。
G2ニワトリのメスは、性成熟後に未受精卵を産卵した。産卵直後における未受精卵の水様性卵白および濃厚卵白をともに超音波処理し、得られた標品の一部を、7%ポリアクリルアミドゲルを用いた非還元条件でのSDSゲル電気泳動法(レムリー法)により分析した。ポリアクリルアミドゲルには標準品として精製ヒトIgG1(アブカム社)もロードした。
インターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ(G2又はG3ニワトリ)のメスをインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ(G1又はG2ニワトリ)のオスの精液で人工受精した後に当該ノックインニワトリのメスが産卵した受精卵を採取した。ヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ(G1又はG2ニワトリ)のメスをヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ(G1又はG2ニワトリ)のオスの精液で人工受精した後に当該ノックインニワトリのメスが産卵した受精卵を採取した。野生型ニワトリ(白色レグホン)のメスを野生型ニワトリ(白色レグホン)のオスの精液で人工授精した後に当該野生型ニワトリのメスが産卵した受精卵を採取した。
ヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリおよびヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した受精卵中の胚を、第1の代理卵殻および第2の代理卵殻を用いた人工培養法により培養して産子の孵化率を調べた。
受精卵を割卵し卵内容物をガラス製蒸発皿に移した。注射筒(テルモシリンジ(登録商標)、テルモ社製)を用いて濃厚卵白、水様性卵白およびカラザを吸引除去して胚および卵黄のみを残した。ヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリおよびヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した受精卵については、さらに、スパーテルを用いて卵黄に付着する濃厚卵白を注意深く掻きとることにより卵黄から濃厚卵白を除去した。
実施例4で得られたヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した受精卵中の胚由来の産子の遺伝子型を、産子の羽軸から調製したDNAを鋳型としたPCRを行って調べた。すなわち、プライマーP1およびP2を用いてPCRを行い、それにより得られた増幅産物を鋳型として、P7および配列番号13の塩基配列を有するプライマーP11を用いてPCRを行った。また、プライマーP1およびプライマーP5を用いてPCRを行った。
ヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリおよびヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した卵の卵白が胚の発生に及ぼす影響を調べるため、これら遺伝子改変ニワトリのメスが産卵した受精卵の卵白を含む卵白組成物を用いて野生型ニワトリ由来の胚の人工培養を行った。
Claims (12)
- 遺伝子改変鳥類のメスが産卵した受精卵中の胚を、卵殻と接触させた状態で人工培養する工程を含む遺伝子改変鳥類の作出方法。
- 前記卵殻と接触させた状態で人工培養する工程は、前記胚を、前記受精卵中の産卵直後における卵黄の比重よりも大きい比重を有する卵白組成物とともに卵殻内で培養する工程である請求項1に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
- 前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の産卵直後における卵白の比重が、前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の産卵直後における卵黄の比重と比較して同じか又はより小さいものである請求項1又は2に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
- 前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、第1の内因性卵白タンパク質遺伝子への第1の外因性構造遺伝子のヘテロ又はホモのノックインである請求項1〜3のいずれか1項に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
- 前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、前記第1の内因性卵白タンパク質遺伝子への前記第1の外因性構造遺伝子のヘテロのノックインであり、前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚における遺伝子改変が、前記第1の内因性卵白タンパク質遺伝子への前記第1の外因性構造遺伝子のホモのノックインである請求項4に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
- 前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、第2の内因性卵白タンパク質遺伝子のヘテロ又はホモのノックアウトである請求項1〜3のいずれか1項に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
- 前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、前記第2の内因性卵白タンパク質遺伝子のヘテロのノックアウトであり、前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚における遺伝子改変が、前記第2の内因性卵白タンパク質遺伝子のホモのノックアウトである請求項6に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
- 前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、第3の内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列に機能的に接続した第2の外因性構造遺伝子のゲノムへのヘテロ又はホモの非特異的挿入である請求項1〜3のいずれか1項に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
- 前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、前記第3の内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列に機能的に接続した前記第2の外因性構造遺伝子のゲノムへのヘテロの非特異的挿入であり、前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚における遺伝子改変が、前記第3の内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列に機能的に接続した前記第2の外因性構造遺伝子のゲノムへのホモの非特異的挿入である請求項8に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
- 前記第1〜第3の内因性卵白タンパク質遺伝子は、それぞれ、オバルブミン遺伝子、オボムコイド遺伝子、オボムチン遺伝子、オボトランスフェリン遺伝子、オボインヒビター遺伝子およびリゾチーム遺伝子のいずれか1の遺伝子である、請求項4〜9のいずれか1項に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
- 前記遺伝子改変鳥類が、ニワトリ、ウズラ、アヒル又はシチメンチョウである請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
- 遺伝子改変鳥類の受精卵から請求項1〜11のいずれか1項に記載の作出方法により作出された遺伝子改変鳥類。
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