KR20040089096A - 렌티바이러스 벡터를 이용한 유전자 변형된 동물을제조하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
렌티바이러스 벡터를 이용한 유전자 변형된 동물을제조하기 위한 방법 및 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20040089096A KR20040089096A KR10-2004-7009817A KR20047009817A KR20040089096A KR 20040089096 A KR20040089096 A KR 20040089096A KR 20047009817 A KR20047009817 A KR 20047009817A KR 20040089096 A KR20040089096 A KR 20040089096A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- nucleotide sequence
- vector
- trans
- embryo
- lentiviral vector
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 207
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 152
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 54
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title abstract description 77
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 133
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 133
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 94
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims abstract description 57
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 55
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims abstract description 48
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims abstract description 48
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims abstract description 31
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 91
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 90
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 90
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 65
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 claims description 25
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 21
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 claims description 19
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 13
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 claims description 11
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 claims description 10
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 7
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 7
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims description 7
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 7
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 claims description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 6
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 6
- 210000001325 yolk sac Anatomy 0.000 claims description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 106
- 102100034347 Integrase Human genes 0.000 description 105
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 78
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 71
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 69
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 65
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 52
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 52
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 51
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 51
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 43
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 39
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 35
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 31
- 238000013461 design Methods 0.000 description 27
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 24
- 101710149136 Protein Vpr Proteins 0.000 description 21
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 18
- 238000011161 development Methods 0.000 description 15
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 15
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 15
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 15
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 14
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 14
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 13
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 12
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 12
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 11
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 10
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 9
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 9
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 9
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 9
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 9
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 7
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 7
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 7
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 6
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 6
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- 241000713704 Bovine immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 5
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 5
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 5
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 5
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 4
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 description 4
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- 241000713810 Rat sarcoma virus Species 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 101150040614 vpx gene Proteins 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 241000713821 Mason-Pfizer monkey virus Species 0.000 description 3
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 3
- 241001428754 Rat leukemia virus Species 0.000 description 3
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 108700010758 gag-pro Proteins 0.000 description 3
- 101150081889 gag-pro gene Proteins 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 3
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 2
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 2
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 2
- 241000713756 Caprine arthritis encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 101710118026 Gag-Pro-Pol polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 241001663880 Gammaretrovirus Species 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 2
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 2
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 2
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 208000010094 Visna Diseases 0.000 description 2
- 241001492404 Woodchuck hepatitis virus Species 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005422 blasting Methods 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 2
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 2
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 108010089520 pol Gene Products Proteins 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029077 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase Human genes 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000714475 Fujinami sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 102100034523 Histone H4 Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000988577 Homo sapiens 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase Proteins 0.000 description 1
- 101000582320 Homo sapiens Neurogenic differentiation factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000714259 Human T-lymphotropic virus 2 Species 0.000 description 1
- 241000282620 Hylobates sp. Species 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000713326 Jaagsiekte sheep retrovirus Species 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 102100032241 Lactotransferrin Human genes 0.000 description 1
- 241001428884 Langur virus Species 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 101800000021 N-terminal protease Proteins 0.000 description 1
- 102100030589 Neurogenic differentiation factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101710102818 Pro-Pol polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101000947125 Rattus norvegicus Beta-casein Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241001068263 Replication competent viruses Species 0.000 description 1
- 241001068295 Replication defective viruses Species 0.000 description 1
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000713896 Spleen necrosis virus Species 0.000 description 1
- 241000713820 Squirrel monkey retrovirus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241001365914 Taira Species 0.000 description 1
- 208000031320 Teratogenesis Diseases 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010048992 Transcription Factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102100023489 Transcription factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 241001069823 UR2 sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000271897 Viperidae Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000713325 Visna/maedi virus Species 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000714205 Woolly monkey sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- -1 and alternatively Proteins 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 210000004952 blastocoel Anatomy 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 150000001767 cationic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 210000001136 chorion Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 108700010759 gag-pro-pol Proteins 0.000 description 1
- 101150061559 gag-pro-pol gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 108700004028 nef Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150023385 nef gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000004508 polar body Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 230000010464 virion assembly Effects 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021241 α-lactalbumin Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/867—Retroviral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 목적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 게놈에 통합시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명의 방법은 바이러스 벡터가 도입되어 목적 뉴클레오티드 서열을 게놈에 통합시킬 수 있는 조건하에서 렌티바이러스 벡터와 난모세포, 초기 단계 배 또는 포배의 원형질막을 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 추가로 착상전 배를 형성시킬 수 있는 조건하에서 렌티바이러스 벡터와 접촉된 난모세포 또는 배를 배양시키는 것을 추가로 포함한다. 이후, 상기 착상전 배는 수용체 척추동물에 운반될 수 있으며, 이 경우, 이 배는 하나 이상의 유전자 변형된 동물로 발생될 수 있다. 따라서 본 발명의 방법 및 조성물은 유전자 변형된 동물, 구체적으로 척추동물 및 더욱 구체적으로 포유 동물을 생산할 수 있다.
Description
유전자를 기능에 의하여 특성 규명하고 유전자들을 연합시키는 복잡한 네트워크를 해부하기 위하여 동물의 유전자 구성을 조작하는 능력은 모델 유기체에서 널리 사용된다. 유전자 변형된 모델 유기체는 유전자 기능을 통찰할 수 있는 전망있는 경로인 것으로 판명되었다. 예를 들어, 가축의 유전자 변형은 질병에 내한 저항성, 성장 속도, 사육 효율, 골조성을 개선시키고, 육류 제품의 영양가 및 건강을 강화시시키는 방법을 설명할 수 있다. 그러나, 이러한 유전자 변형된 동물을 제조하는 현재의 방법들은 비용이 많이 소모되며 비효율적이다.
한때, 트랜스게닉 동물을 제조하는데 있어서 전핵 미세주입법이 바람직한 방법이었다. 이러한 연구에서, 전핵은 미세주입되어 그 결과 수백개의 트랜스 유전자 복사체가 전달된다. 수용체 동물에 이전된, 미세주입된 배 중에서, 10∼30%가 일정 기간 동안 생존하였는데, 이들중 1∼10%만이 트랜스게닉이다. 뿐만 아니라, 트랜스유전자는 유전자 변형된 세포주의 약 절반에서만 발현된다.
대안적으로, 핵 이전법 또는 클로닝은 유전자 변형된 동물의 제조에 사용되는 다른 방법이다. 이 방법에서, 트랜스유전자는 체세포로 도입되고, 이 세포들은 배양되어 새로운 유전자가 도입된 세포들을 선별한다. 이 유전자들의 핵은 이후 제핵 미수정란의 세포질로 이전된다. 핵 이전으로 인하여 탄생된 모든 트랜스게닉 동물의 태아의 생존율은 매우 낮지만, 그 기술 자체는 기술적으로 진보된 것이다.
대안적으로, 유전 정보가 RNA 분자로서 이전되는 레트로바이러스 감염법이 유전자를 배로 이전시키는데 사용되는 통상적인 방법이다. 레트로바이러스 RNA를 세포에 도입시켜 DNA로 역전사시킨후, DNA 프로바이러스를 숙주 세포 게놈으로 통합시키는 것은, 레트로바이러스 게놈의 말단부의 레트로바이러스 인테그라제 및 특이적 뉴클레오티드 서열에 의하여 매개된다[Goff 등 (1992) Annu.Rev.Genet.26:527-544 및 Brown 등(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.86:2525-2529]. 대부분의 레트로바이러스는 분열중인 세포에만 통합될 수 있다[Kulkosly et al. (1994)Parmacol. Ther. 61 : 185-203; Roe et al. (1993)EMBO J 12 : 2099-2108, Miller et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10 : 12: 4239-4242]. HIV 및 기타 렌티바이러스를 제외한, 레트로바이러스의 통합에 있어서 중요한 조건은 유사분열중 핵 외피를 분해하는 것이다. 이 방법을 사용하여 수년에 걸친 반복적 시도를 수행한 결과, 유전자 양과 타이밍의 제어능이 상실되면, 태어난 동물들의 거의 대부분은 상이한 조직에서는 상이한 위치에서 통합되는 것을 특징으로 하는 유전자 모자이크임을 파악하였다[Jaenisch et al. (1980) Cell 19 : 181-188]. 여기에는 유전자 발현 분석에 적당한 동형 접합체 및 이종 접합체 세포주를 확보하기 위한 이계 교배가 필요하다.
이에 유전자 변형된 동물을 제조하기 위하여 보다 효율적인 수단에 대한 신규이 방법 및 조성물이 필요하다.
본 발명은 목적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 동물의 게놈에 통합시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
도 1은 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 비제한적인 예를 개략적으로 나타내는 것이다. 구체적으로 도 1은 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 트랜스-바이러스 입자를 생성시키는데 사용되는 4개의 상이한 DNA 구조물을 포함하는 "트랜스-렌티바이러스" 벡터 디자인을 예시한다[불활성 역전사효소 및 인테그라제는 박스 밖에 나타내었다].
도 2는 트랜스-레트로바이러스 벡터 디자인의 비제한적 예를 제공한다.
도 3은 본 발명의 방법 및 조성물이 각 대리모 동물로부터 복수개의 트랜스게닉 세포주를 생산할 수 있는 능력을 보유한다는 증거를 제공한다. A는 제1 eGFP 대리모중 한마리로부터 생산된 자손 개체의 꼬리로부터 얻은 게놈 DNA를 나타내는 것이다. 도 B는 GFP에 대한 서던 블롯 프로빙을 나타내는 것이다. 도 3은 공초점이미지를 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 목적 뉴클레오티드 서열을 동물, 특히 척추동물, 특히 포유 동물의 게놈에 통합하는 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법은 원형질막을 보유하는 분리된 난모세포, 초기 단계의 배 또는 포배를 제공하는 단계, 및 이 원형질막과, 목적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 최소 제1 렌티바이러스 벡터 또는 이의 기능적 동등체를 유효 농도로 포함하는 조성물을 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 또 다른 방법은 착상전의 배를 형성할 수 있는 조건하에서 난모 세포, 초기 단계의 배 또는 포배를 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 방법은 착상전의 배를 수용체 척추동물에 이전하는 단계 및 상기 착상전의 배를 하나 이상의 유전자 변형된 척추동물로 발생시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 특정 방법에 있어서, 초기 단계의 배는 수정 난모 세포, 2-세포기 배, 4-세포기 배, 8-세포기 배 또는 상실배를 포함한다.
본 발명의 추가의 방법은 분리된 난모 세포, 초기 단계의 배 또는 포배의 원형질막과, 목적으로 하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 렌티바이러스 벡터 또는 이의 기능적 동등체, 그리고 목적으로 하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 방법에 있어서, 난모 세포 또는 발생 초기 단계의 배는 추가로 투명대를 포함하는데, 여기서 상기 투명대 및 상기 원형질막은 난황주위공간을 한정한다. 이 구체예에서, 목적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 최소 제1 렌티바이러스 또는 이의 기능성 동등체를 유효농도로 포함하는 조성물은 상기 난황주위공간에 도입된다. 특정 구체예에서, 도입 방법은 미세주입법을 포함한다.
본 발명의 추가의 방법은 분리된 난모 세포 또는 초기 단계의 배에 있는 난황주위공간에 목적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 렌티바이러스 벡터 및 목적으로 하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 도입시키는 것을 포함한다.
본 발명의 추가의 방법은, 인간 면역결핍증 바이러스 및 유인원 면역결핍증 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래된 렌티바이러스 벡터 또는 이의 기능적 동등체를 사용하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 렌티바이러스 벡터는 트랜스-바이러스 벡터(trans-viral vector)이다. 또 다른 구체예에서, 상기 트랜스-바이러스 벡터는 트랜스-렌티바이러스 벡터 또는 트랜스-레트로바이러스 벡터이다.
본 발명의 조성물은 분리된 난모 세포, 초기 단계의 배, 또는 포배와, 목적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 최소한의 제1 렌티바이러스 벡터 또는 이의 기능적 동등체를 유효 농도로 포함한다. 추가의 조성물은, 투명대 및 원형질막이 난황주위공간을 한정할 경우, 투명대를 추가로 포함하는 난모 세포 또는 초기단계의 배를 포함하며; 이 경우 렌티 바이러스 벡터는 난황주위공간에 있다.
본 발명의 추가의 조성물은 분리된 난모 세포, 초기 단계의 배, 또는 포배, 및 목적으로 하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 렌티바이러스 벡터 또는 이의 기능적 동등체, 그리고 목적으로 하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 렌티바이러스 벡터 및 이의 기능적 동등체를 유효농도로 포함한다. 추가의 조성물은 난황주위공간에 목적으로 하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 렌티바이러스 벡터 또는 이의 기능적 동등체, 그리고 목적으로 하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 렌티바이러스 벡터 또는 이의 기능적 동등체를 유효 농도로 보유하는 난모 세포 또는 초기 발생 단계의 배를 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물의 렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스 및 유인원 면역결핍 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 상기 렌티바이러스 벡터는 트랜스-바이러스 벡터이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 트랜스-바이러스 벡터는 트랜스-렌티 바이러스 벡터 또는 트랜스-레트로바이러스 벡터이다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 목적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 동물의 게놈에 통합시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명의 방법은, 바이러스 벡터를 도입시킨후, 목적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 게놈에 통합시킬 수 있는 조건하에서, 목적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터와 난모 세포, 초기 단계의 배 또는 포배를 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 착상전배를 형성시킬 수 있는 조건하에서 렌티바이러스 벡터 또는 이의 기능적 동등체와 접촉시킨 미수정 난모 세포, 초기 단계의 배 또는 포배를 배양하는 것을 추가로 포함한다. 이후, 상기 착상전 배는 이 배가 하나 이상의 유전자 변형된 동물로 발생될 수 있을 경우, 수용체 동물에 이전될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 방법 및 조성물은 유전자 변형된 동물 구체적으로, 척추동물 및 더욱 구체적으로 포유 동물을 생산할 수 있다. 다른 레트로바이러스와는 달리, 렌티 바이러스 벡터는 프로바이러스 게놈을 표적 세포의 염색체로 통합시키기 위해 세포 분열을 시킬 필요가 없다[Naldini et al. (1996) Science 272 : 263: 7, 본원에 참고문헌으로 인용됨]. 상기 렌티바이러스의 프로바이러스 게놈은 제1 세포 분열 이전에 난모 세포 또는 수정된 난모 세포의 게놈으로 통합될 수 있기 때문에, 본 발명의 방법의 특정 구체예는 목적 뉴클레오티드 서열이 모자이크식으로 존재하는 유전자 변형된 동물의 출현 빈도수를 감소시킬 수 있다.
더욱이, 본원에 기술한 바와 같이, 본 발명의 방법에서 렌티바이러스 벡터를 사용하면 유전자 변형된 동물이 생산됨에 따라서 상기 빈도수가 실질적으로 증가된다. 본 발명의 방법은 복수회의 독립적 통합 현상을 일으킬 수 있기 때문에, 복수개의 통합 현상을 포함하는 단일의 F0동물은 독립적인 위치에 통합 부위를 보유하는 복수개의 대리모 세포주를 생산하기 위하여 이계 교배될 수 있다. 그러므로, 형질전환 효율은 100% 이상이 될 수 있는 것이다. 구체적으로, 본 발명의 방법에 따른 형질 전환 효율은 약 5∼약 10%, 약 10∼약 20%, 약 20∼약 60%, 약 60∼약 80%, 약 80∼약 100%, 약 100∼약 125%, 약 125∼약 175%, 약 175∼약 200%, 약200∼약 300% 이상이다. 본원에 사용된 "형질전환 효율"이란, 독립적으로 유전 가능한 유전자 변형 동물의 수를 렌티바이러스 벡터와 접촉시킨 난모 세포 또는 배의 총 수로 나눈 값으로서 정의된다.
본 발명은 또한 복수개의 목적 뉴클레오티드 서열을 미수정 난모 세포, 초기 단계의 배 또는 포배의 게놈에 도입시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 의하여 모자이크 동물을 생산함으로써 DNA 통합 효율이 증가하고, 모자이크 동물이 생산되는 빈도수가 감소하면, 목적으로 하는 통합된 복수개의 뉴클레오티드 서열을 보유하는 비-모자이크 동물이 생산되는 효율이 개선된다.
Ⅰ. 배 발생의 다양한 단계에 있어서 난모 세포 및 배로의 렌티바이러스 벡터의 도입
본 발명은 유전자 변형된 동물의 생산을 위한 신규의 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명의 신규한 방법은 미수정 난모 세포, 초기 단계의 배, 또는 포배기 배와, 목적으로 하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 렌티바이러스 벡터를 유효 농도 함유하는 조성물을 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 목적 뉴클레오티드 서열을 미수정 난모 세포, 초기 단계의 배 또는 포배에 통합시켜 유전자 변형된 동물을 생산하는 효과적인 방법을 제공하는 효율적 수단을 제공한다.
본 발명의 방법을 임의의 동물, 구체적으로 척추동물 및 더욱 구체적으로 포유 동물에서 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 척추동물은 인간이다. 다른 구체예에서, 척추동물은 인간을 제외한 척추동물이다. 본원에 사용된 본 발명의 "인간을 제외한 척추동물"은 "유전자 변형된 인간을 제외한 척추동물"을 생산할 수 있는 모든 인간을 제외한 척추동물을 포함한다. 이러한 인간을 제외한 척추동물로서는 설치류, 인간을 제외한 영장류, 양, 소, 반추류, 토끼류, 돼지, 염소, 말, 쥐, 개, 고양이, 조류 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 인간을 제외한 척추동물로서는 마우스, 래트, 양, 송아지, 돼지, 조류 및 토끼를 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 의하여 포함되는 동물은 또한 발생의 모든 단계 예를 들어, 배 및 태아 단계에 있는 동물 개체를 추가로 포함하는 것으로 인식된다.
"유전자 변형된 동물" 또는 "유전자 변형된 척추동물"이란, 목적 핵산 서열의 통합에 의하여 게놈이 변형된 하나 이상의 세포를 함유하는 임의의 동물을 의미한다. 목적 뉴클레오티드 서열은 유전자 변형된 동물의 체세포 및/또는 생식 세포주중 어느 하나의 게놈에 통합될 수 있다.
본원에서 "난모세포"란, 암컷 배우자 세포를 의미하는 것으로서, 제1 난모세포, 제2 난모세포 및 성숙하였으면서도 미수정된 난자를 포함한다. 난모세포는 난세포질에 의하여 둘러싸인 거대한 핵(즉, 난핵)을 갖는 거대한 세포이다. 상기 난세포질은 mRNA, 리보좀, 미토콘드리아, 난황 단백질 등을 포함하는 비-핵성 세포질 함유물을 함유한다. 본원에서는 난모세포의 막을 "원형질막"이라 칭한다. 포유 동물의 난모세포는 투명대라 칭하여지는 세포외 외피에 의하여 추가로 둘러싸여져 있으며, 정자는 상기 난모세포의 원형질막과 접촉할 수 있을 때까지 이 투명대에 결합하여 이를 관통하여야 한다. "난황주위공간"이란 용어는, 포유 동물 난모세포와수정된 난모세포의 투명대와 원형질막 사이에 위치하는 공간을 의미하는 것으로서, 배발생의 초기 단계 동안 유지되는 것이다(즉, 투명대는 착상전 할구로부터 흘러 나온다).
본원에 사용된 "초기 단계 배"란, 난모 세포의 수정(즉, 수정 난모 세포)으로부터 시작되어 2-세포기, 4-세포기, 8-세포기 및 상실배(16∼32 세포기 배)로 이어지는, 모든 배 발생 단계를 포함한다. 본원에 정의된 바와 같이, 초기 단계 배는 발생 단계중 포배를 포함하지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, "포배"는 포배강이라 불리우는 공동을 둘러싸고 있는, 세포의 속이 빈 구의 발생을 특징으로 하는 배의 발생 단계를 의미한다. 당업자는 포배의 전반적인 구성은 유기체에 따라 상이함을 인식할 것이다. 예를 들어, "포배"란, 외부 영양막과 내부 세포 기질로 이루어진 속이 빈 세포구를 특징으로 하는 분할 단계의 포유 동물 배를 의미한다.
"수정 난모 세포"란, 발생의 "1 세포기"에 있는 배를 의미하는 것이다. 이 발생 단계는 수정에 의하여 유발되며, 제2 감수분열; 제2 극체의 돌출; 부모 전핵의 형성; 및 DNA 복제를 특징으로 한다. 본원에 있어서, "수정 난모세포"라는 용어에 포함되는 발생 단계는 수정과 함께 시작되어 수정된 난모세포가 2 세포 배로 분할되는 것으로 끝난다.
본원에 정의된 바와 같은 "분리된" 난모 세포, "분리된" 초기 단계 배(즉, 수정된 난모 세포, 2-세포기, 4-세포기, 8-세포기 또는 상실배) 또는 "분리된" 포배는 공여체 암컷의 천연 생체내 환경으로부터 분리되었다.
A. 난모세포 및 다양한 발생 단계의 배에 렌티바이러스 벡터를 접촉시키는방법
본 발명은, 미수정 난모 세포, 초기 단계의 배(즉, 수정된 난모세포, 2-세포, 4-세포 또는 8-세포 배, 또는 상실배), 또는 포배를 제공하는 단계, 및 이들을 목적 뉴클레오티드 서열을 보유하는 최소 제1 렌티바이러스 벡터 또는 이의 기능적 동등체를 유효 농도로 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 목적 뉴클레오티드 서열을 척추동물의 게놈에 통합시키는 방법을 제공한다. "접촉"이란, 렌티바이러스 벡터와 난모세포, 초기 단계 배 또는 포배를 직접 접촉시키는 것을 의미한다.
보다 특이적인 구체예에서, 본 발명의 방법은 난모세포, 초기 단계 배(즉, 수정된 난모세포, 2-세포, 4-세포 또는 8-세포 배, 또는 상실배) 또는 포배를, 목적 뉴클레오티드 서열을 보유하는 최소 제1 렌티바이러스 벡터 또는 이의 기능적 동등체를 유효 농도로 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. "원형질막과 접촉시킨다"란, 렌티바이러스 벡터와 난모세포, 초기 단계 배 또는 포배의 원형질막을 렌티바이러스 벡터와 직접 접촉시키는 것을 의미한다. 당업자는 바이러스 벡터 및 원형질막을 직접 접촉시킬 수 있는 다수의 방법이 사용될 수 있다는 사실을 이해할 것이다.
예를 들어, 난모 세포 또는 초기 단계의 배가 투명대를 보유할때, "접촉"이란 렌티바이러스 벡터를 난황주위공간에 도입시키는 것을 포함할 수 있다. 이 구체예에서, 목적 뉴클레오티드 서열은, 원형질막과 투명대가 난황주위공간을 한정하는 경우, 투명대와 원형질막을 보유하는 난모세포 또는 초기 단계 배를 제공하고; 바이러스 벡터를 세포에 도입시킬 수 있는 조건하에서, 이 난황주위공간에, 목적 뉴클레오티드 제1 서열을 포함하는 최소의 제1 렌티바이러스 벡터를 유효 농도로 포함하는 조성물을 도입함으로써 척추동물의 게놈에 통합된다.
"도입된"이란, 당업계에 공지된 임의의 수단을 사용하여 투명대를 관통함으로써 렌티바이러스 벡터를 난황주위공간에 도입시키는 것을 의미한다. 상기 렌티바이러스 벡터를 도입시키는 방법은 예를 들어, 바이러스를 난황주위공간에 미세주입하는 것[Chang et al. (2001) Science 291 : 309-312, Chan et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95 : 14028-33 및 미국특허 제6,080,912호, 본원에 참고문헌으로 인용됨]; 및 바이러스 벡터를 투명대에 도입시킬 수 있는 조건하에서 원형질막과 투명대를 포함하는, 미수정된 난모세포 또는 초기 단계의 배(즉, 수정된 난모세포, 2-세포, 4-세포, 8-세포 또는 상실배)를 항온처리하는 것을 포함한다.
미세주입 기법이 사용될때, 당업자는 대부분의 척추동물 난모세포는 주입된 액체의 약 1∼300 피코리터 이상을 수용할 수 있음을 이해할 것이다. 그러므로, 바이러스 역가가 높은 렌티바이러스 벡터가 본 발명의 방법에 바람직하게 사용된다. 고역가 스톡을 사용하면 유효 농도의 바이러스 입자를 난황주위공간에 도입시킬 수 있다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터는 1㎖당 약 1x106, 약 1x107, 약 1x108, 약 1x109, 약 1x1010, 약 1x101l이상의 역가의 형질도입 단위를 보유하는 것이 바람직할 것이다. 대안적으로, 본 발명의 렌티바이러스 벡터는 1㎖당 약 5x106∼약 5x107,약 5x107∼약 5x108, 약 5x108∼약 5x109, 약 5x109∼약 5x1010이상의 역가의 바이러스 입자를 보유할 수 있다. 특정 구체예에서, 바이러스 역가는 1㎖당 약 2.9x109이상의 형질 도입 단위이다. 당업자는 필요 농도의 바이러스 스톡을 제조하는 방법을 숙지하고 있을 것이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 투명대는 난모세포 또는 초기 단계 배(즉, 수정된 난모세포)로부터 제거될 수 있다. 이 구체예에서, "접촉"은 렌티바이러스 벡터를 유효농도로 포함하는 조성물을 난모세포 또는 초기 단계 배(즉, 수정된 난모세포, 2-세포, 4-세포, 8-세포 또는 상실배)와 함께 항온처리하는 것을 포함할 수 있다. 투명대를 제거하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[ Hogen et al. (1994) Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press]을 참조하시오. 본 구체예에서 상기 난모세포와 초기 단계 배를 접촉시키는 대표적인 조건은 4% 소 혈청 알부민(BSA, 인자 Ⅴ, 테스트된 배, Sigma order no. A-3311)로 보강된 Quinns Advantage Hepes 완충 배지(Sage Biofarm, order no. 1020) 및 4% BSA로 보강된 Quinns Advantage Cleavage Medium (Sage Biofarm order no. 1026)을 포함하는 완충액중에서 예를 들어, 난모세포 또는 초기단계 배 및 렌티바이러스 벡터를 항온처리하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 유효농도는 1㎕당 약 1x103, 약 1x104, 약 1x105, 약 1x106, 약 1x107또는 약 1x108의 형질도입 단위 바이러스 입자인 바이러스 농도를 포함한다. 대안적으로, 바이러스 입자 농도는 1㎕당 약 5x103∼약 5x104, 약 5x104∼약 5x105, 약 5x105∼약 5x106, 약 5x106∼약 5x107, 또는 약 5x107∼약 1x108의 형질도입 단위 바이러스 입자의 범위일 수 있다.
다른 구체예에서, 렌티바이러스와 접촉한 배가 발생 단계중 포배기에 있을때, 접촉 방법은 바이러스 입자를 포배강 공동에 주입하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어 문헌[Wolfgang et al.(2001) PNAS 98:10728-10732, 본원에 참고문헌으로 인용됨]을 참조하시오.
"유효량" 또는 "유효 농도"란, 하나 이상의 바이러스 벡터 입자와 난모세포, 초기 단계 배 또는 포배를 접촉시키는데 충분한 바이러스 벡터 입자의 농도를 의미한다. 대안적으로, 유효량은 난모세포, 초기 단계 배 또는 포배와 약 1∼10개, 약 10∼약 50개, 약 50∼약 100개, 약 100∼약 1000개, 약 1000∼약 2000개, 약 2000∼약 5000개, 약 5000∼약 1x104개, 약 1x104∼약 1x105개, 약 1x105∼약 1x106개 이상의 바이러스 입자를 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 렌티바이러스 스톡은 난황주위공간에 미세주입되기 이전에 적정 및 희석되어, 생성된 유전자 변형 동물에 통합된 프로바이러스 게놈의 수가 조절된다. 당업자는 목적으로 하는 통합 현상의 수에 대하여 필요한 바이러스 입자의 적절한 농도를 측정할 수 있을 것이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 원형질막은 2 이상의 개별 목적 뉴클레오티드 서열을 보유하는 2 이상의 렌티바이러스 벡터를 유효 농도로 포함하는 조성물과 접촉된다. 본 발명의 방법은 모자이크 동물의 생산을 최소화하므로, 이 구체예는 2 이상의 목적 뉴클레오티드 서열에 통합된 유전자 변형된 동물을 생산하는 효율을 개선시킬 수 있다.
당업계에서 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 바이러스 벡터의 저장, 관리 및/또는 생물 활성을 촉진시키는데 통상적으로 사용되는 담체를 의미한다. 적당한 담체는 안정해야 하는데 즉, 제제내 다른 성분과 반응할 수 없어야 한다. 사용된 농도의 수용체에 악영향을 거의 미치지 않아야 한다. 이러한 담체들은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 대표적인 약학적으로 허용 가능한 담체로서는 무발열원 멸균수 및 무발열원 멸균 생리 염용액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 당업자는 또한 약학적으로 허용 가능한 담체는 예를 들어, 바이러스 입자가 세포에 도입되는 능력을 개선시키는 추가의 화합물을 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 이러한 화합물은 다양한 양이온 화합물 예컨대, 이가 화합물인 폴리브렌 및 DEAE를 포함한다.
난모세포, 초기 단계 배 및 포배를 얻는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 수정된 난모세포는 배란기 및 수정이 고나도트로핀을 투여함에 의해서보다는 환경 조건에 의하여 제어되는 천연 교접에 의하여 얻을 수 있으며, 대안적으로, 고나도트로핀은 배란되는 난자의 수가 증가하기 이전에 교접되어 암컷에 투여될 수 있다. 당업자는 목적으로 하는 종, 암컷 공여체의 연령 및 무게, 고나도트로핀의 투여량, 고나도트로핀 투여 시기 및 번식용 수컷의 생식능력이 수정된 난모세포를 얻는데 사용되는 특정 방법에 영향을 미친다는 사실을 이해할 것이다. 대안적으로, 상기 난모세포는 시험관내에서 수정될 수 있다. 이러한 난모세포의 분리, 성숙 및 수정 방법은 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[미국 특허 제 5,741,957호; 미국 특허 제 6,080,912; Lonergan et al.(1994) Acta Vet Scand35 : 307-20; Nagai et al. (2001) Theriogenology 55 : 1291-301 (for bovine); Moor et al. (1990) J.Reprod. FertilSuppl 40 : 197-210, Nagai et al.(2001) Theriogeszology 55 :1291-301 ; Kikuchi et al. (1999) Biol Reprod 60 : 336-4;Funahashi et al. (1997)J ; Reprod Fertil suppl 52 : 271-83 (돼지); Wang et al. (2001) Reproduction 122 : 809-816 and Hogen et al. (1994) Manipulating the MouseEmbryo : A Laboratory Manual 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (마우스); and, Teotia et al. (2001)Small Rmnifa Res 40 : 165-177 (염소). 상기 모든 문헌은 본원에 참고 문한으로 인용되어 있다. 뿐만 아니라, 문헌[Jackson et al. (2000) Mouse Genetics and Transgenics : A Practical Approach, Oxford University Press and Pinkert et al. (1994) Transgenic Animal Technology : A Laboratory Handbook Academic Press, San Diego, 상기 양 문헌은 본원에 참고용으로 인용됨; Chan et al. (1998) PNAS 95 : 14028-14033; Parrish et al.(1986)Theriogenology 25: 591-600; and Leibfried etal.(1979) J. Animal Science 48: 76-86]을 참조 하시오.
B. 착상전 배의 제조 및 배 운반 방법
미수정 난모세포, 초기 단계 배(즉, 수정된 난모세포, 2-세포배, 4-세포배, 8-세포배 또는 상실배) 또는 포배와 렌티바이러스 벡터를 접촉시킨후, 배를 "착상전 배"가 형성될 수 있는 조건하에서 시험관내 배양시킨다. 이와 같은 착상전 배는 약 16∼150개 이상의 세포, 특히 약 16∼64개의 세포를 함유하는 것이 바람직하다.
당업자는 착상전 배를 배양하는데 필요한 방법이 렌티바이러스 벡터와 접촉한 난모세포 또는 배의 발생 단계에 따라서 다양할 수 있다는 사실을 알게 될 것이다. 예를 들어, 초기 단계 배 또는 포배가 접촉할때, 수정된 난모세포를 배양하는 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 이에는 문헌[Gordon etal. (1984) Methods in Enzymology101 : 414; Hogan etal. (1986) Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (마우스 배); Hammer et al. (1985) Nature 315 : 680 (토끼 및 돼지 배); Gandolfi et al. (1987) J. Reprod. Fert. 81 : 23-28; Rexroad et al. (1988)J Aniin. Sci. 66 : 947-953 (양의 배); 및 Eyestone et al.(1989)J.Reprod.Fert.85:715-720; Camous et al.(1984)J.Reprod.Fert.72:779-785; 및 Heyman et al.(1987) Theriogenology 27:5986(소의 배)]을 참조하시오.
미수정 난모세포가 바이러스 벡터와 접촉되는 구체예에서, 착상전 배의 형성은 성숙 난모세포와 정자를 배양하는 것을 포함한다. 이와같은 시험관내 수정 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 제6,080,912호; Chan et al.(2001)Science 291:309-312; 및 Chan et al.(1998) PNAS 95:14028-14033, 이들 문헌은 모두 본원에 참고 문헌으로 인용됨]을 참조하시오.
이와 같은 착상전 배는 그후 유전자 변형된 동물이 발생하여 태어나게 되는 표준적인 방법에 의하여 적당한 가임신 암컷에 운반된다. 종간교배에서, 유전자 변형된 동물인 대리모는 이후 이형접합체 및 동형접합체 동물을 생산할 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Hogen et al. (1994) Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조하시오.
"자손"이란, 동물이 뉴클레오티드 서열에 대한 이형접합체이거나 또는 동형접합체이든지에 상관없이, 특정의 유전자 변형된 동물 즉, 하나 이상의 목적 뉴클레오티드 서열을 게놈내에 보유하고 있는 동물로부터 유래되거나 또는 이로부터 전래된 임의의 및 모든 세대를 의미한다. 목적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 임의의 연속 세대의 자손은 본원에 포함되는데, 예를 들어 목적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 자손 즉, F1, F2, F3 세대 등등이 상기 정의에 포함된다.
C. 통합된 목적 뉴클레오티드 서열의 검출
유전자 변형된 동물인 잠재적 F0대리모[즉, 렌티바이러스 벡터와 접촉된 난모세포 또는 배로부터 유래된 포유 동물]는 처음에 당업계에 공지된 기법 예를 들어, PCR 분석법 및/또는 제한효소 분해 및/또는 서던 블럿 분석법에 의하여 동정될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 문헌[Hogen et al. (1994) Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, 본원에 참고문헌으로 인용됨]을 참조하시오. 당업자는 유전자 변형된 동물인 대리모는 가임신 암컷으로의 배 운반 단계 이전, 자궁내, 분만후 또는 출생후를 포함하는, 다양한 발생 단계에서 확인될 수 있다는 사실을 인식할 것이다.
게놈내 목적 뉴클레오티드 서열의 통합에 대한 분석법은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 목적 뉴클레오티드 서열의 통합화 또는 관련 선별성 마커는 착상전 배에 대하여 분석될 수 있다. 이러한 발생 단계에서의 검출을 통하여 유전자 변형이 일어난 배를 동정하여 그후 가임신 암컷에 유전자 변형된 배를 착상시킬 수 있을 것이다. 이 방법에서, 하나 이상의 세포는 착상전 배로부터 분리된다. 본질적으로, 필요한 모든 것은 목적 뉴클레오티드 서열의 통합에 대하여 분석되지 않은 배 즉, 전과정 자궁내에서 발생한 충분한 수의 세포중 하나이다. 착상전 배로부터 샘플 세포를 분리한후, 목적 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위해 게놈 DNA를 분석할 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제5,741,957호를 참조하시오.
당업자는 착상전 배에서 일어난 유전자 변형을 검출하는 단계는, 가임신 암컷에 착상시켜, 동일한 유전자형을 갖는 유전자 변형된 동물의 클론 군집을 생산할 수 있는 유전자 변형된 배의 클론 군집을 생산하는 배 클로닝 단계와 병행할 수 있다는 사실을 인식할 것이다. 여기서 "유전자형"이란, 배 개체 및/또는 유전자 변형된 동물 군집 사이에 게놈 DNA가 실질적으로 동일한 경우를 의미한다. 유사분열 동안에 하나 이상의 세포 및/또는 동물의 유전자형에 변이가 일어날 수 있는 다양한 체세포 돌연변이가 발생할 수 있다. 그러므로, 동일한 유전자형을 보유하는 군집은 각각의 개체 또는 하위 군집 변이를 증명할 수 있다.
대안적으로, 목적 뉴클레오티드 서열의 통합은 배 발생의 후기 단계에서 분석될 수 있다. 예를 들어, 조직의 자궁내에서, 그리고 분만후에 분석이 수행될 수있다. 자궁내 분석은 예를 들어, 반향에 의한 비유사분열 공동의 경질 구멍을 포함하는, 몇몇 기법에 의하여 수행된다. 예를 들어, 문헌[Bowgso et al. (1975) Bet. Res. 96 : 124-127 and Rumsey et al. (1974) J.Anim. Sci. 39 : 386-391, 상기 문헌은 모두 본원에 참고문헌으로 인용됨]을 참조하시오. 이러한 방법에 의하여 얻어진 세포는 게놈 변형을 위하여 PCR 분석되는 게놈 DNA를 포함한다. 대안적으로, 태아 세포는 융모막을 천공하여 회수될 수 있다. 이 방법은 또한 경질적으로 그리고 반향에 따라서 수행될 수 있다. 얻어진 융모막 세포를 PCR 분석하여 유전자 변형이 일어났는지 여부를 측정한다.
유전자 변형은 또한 출생후 검출될 수도 있다. 예를 들어, 조직 생검편 예컨대, 추정 유전자 변형 동물의 귀 또는 꼬리로부터의 생검편을 얻어 유전자 변형이 발생하였는지 여부에 대하여 분석할 수 있다. 더욱이, 유전자 변형은 또한 mRNA 서열의 발현, 목적 뉴클레오티드 서열에 의하여 조직내에서 암호화되는 폴리펩티드, 분비물(즉, 침) 또는 기타 체액, 또는 목적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 구조물에 포함된 선별성 마커에 의하여 나타나는 표현형을 분석함으로써 검출될 수 있다.
Ⅱ. 렌티바이러스 및 렌티바이러스 벡터
본 발명은 목적 뉴클레오티드 서열을 보유하는 렌티바이러스 벡터와 수정 난모세포의 원형질막을 접촉시킴으로써 목적 뉴클레오티드 서열을 포유 동물 게놈에 통합시키는 방법을 제공한다.
본원에 있어서 "렌티바이러스 벡터"란, 목적 뉴클레오티드 서열을 포함하는변형된 프로바이러스 RNA 게놈을 보유하는 재조합 변형 렌티바이러스를 의미한다. 본원에 정의된 본 발명의 렌티바이러스 벡터는 최소한 부분적으로나마, 군 일원이 비-분열성 세포를 감염시키는 능력을 갖는 것을 특징으로 하는, 레트로바이러스 하위군 렌티바이러스로부터 유래된다. 당업자는 본 발명의 방법에 사용된 렌티바이러스 벡터의 구성원은, 생성된 렌티바이러스 벡터가 비-분열성 세포내에 통합되는 능력을 보유하는 한, 임의의 바이러스 공급원, 구체적으로 레트로바이러스, 더욱 구체적으로 렌티바이러스 공급원으로부터 유래될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
렌티바이러스 벡터는 레트로비리대(Retroviridae) 및 하위군 렌티비리대(Lentiviridae) 바이러스로부터 유래된다. 상기 렌티바이러스는 서서히 진행되는 질병을 앓고있는 면역계와 관련되어 있으며[본원에 참고문헌으로 인용된, Coffin et al.(1997) Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press], 비-분열 세포의 게놈에 통합될 수 있음을 특징으로 한다. 렌티바이러스는 다양한 영장류(예를 들어, 인간 면역결핍증 바이러스[HIV-1 및 2], 및 유인원 면역결핍증 바이러스[SIV]), 그리고 비-영장류 바이러스(예를 들어, 마애디-비스나(maedi-visna) 바이러스[MVV], 고양이 면역결핍증 바이러스[FIV], 말 감염성 빈혈 바이러스[EIAV], 염소 관절염 뇌염 바이러스[CAEV] 및 소 면역결핍증 바이러스[BIV]를 포함한다. 예를 들어 문헌[Romano et al. (2000) Stem Cells 18 : 19-39]을 참고하시오.
본 발명의 방법에 유용한 다수의 렌티바이러스 벡터가 당업계에 공지되어 있으며, 이에는 HIV-1계 벡터 예컨대 문헌[Parolin etal. (1994) J Virol. 68:3888-3895 ; Naldini et al. Science. (1996) 272: 263-267; Zufferey et al. (1997) Nat Biotechnol. 15: 871-875;Uchida et al.(1998)ProcNatlAcadSciUSA. 95: 11939-11944;Kim etal. (1998) J. Virol. 72: 811-816 ; Poeschla et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Science 93: 11395-11399; Mochizuki etal. (1998) J Virol. 72:8873-8883 ; Gasmi et al. (1994) J Virol. 73: 1828- 1834; Buchschacher et al. (1992) J Virol. 66: 2731-2739; 및 Dropulic et al. (1996)Proc Natl Acad Sci USA. 93: 11103-11108;이들 모두는 본원에 참고문헌으로 인용됨]에 기술되어 있는 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱이, 자기-불활성화(Self-Inactivating;SIN) 렌티바이러스 벡터가 개발되어 본 발명에 사용된다. 예를 들어 문헌[Zufferey et al. (1998) J Virol. 72: 9873-9880 and Miyoshi et al. (1998) J Virol. 72: 8150-8157, 상기 문헌은 모두 본원에 참고문헌으로 인용됨]을 참조하시오. HIV-2 바이러스 벡터도 또한 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Poeschla et al.(1996)Proc NatlAcad Sci USA. 93: 11395-11399]을 참조하시오. 또한, FIV 바이러스 벡터도 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Johnston et al. (1999)J. Virology 73: 4991-5000; Johnston et al.(1999) J. Virology 73: 2491-2498; and Poeschla et al. (1998) Nat Med4 : 354-357]을 참조하시오.
대안적으로, 본 발명의 방법에 유용한 렌티바이러스 벡터는 또한 RNA 슈도형의 렌비타이러스 벡터를 포함할 수도 있다. 이형 프로바이러스 게놈 RNA를 패키징하는 레트로바이러스 입자를 RNA 슈도형(RNA pseudotype)이라 칭한다. RNA 슈도형 벡터는 패키징과 운반 벡터 사이의 상동성 재조합에 대한 잠재적인 이점을 보유하거나, 또는 위험성이 감소된다. 예를 들어 문헌[Rizvi et al. (1993) J Virol. 67: 2681-2688 and Embretson et al. (1987) J Virol. 61: 2675-2683; 상기 문헌은 모두 본원에 참고문헌으로 인용됨]을 참조하시오. 예를 들어, HIV-1/HIV-2계 벡터는 코보 및 동료에 의하여 디자인되었다[Corbeau et al.(1998)Gene Ther.5:99-104]. 뿐만 아니라, HIV-1/SIV-유래 벡터는 현재 문헌[White et al. (1999) J Virol. 73: 2832-2840]에 기술되어 있다. 상기 각 참고문헌은 본원에 참고용으로 인용되어 있다.
개발된 다른 렌티바이러스 벡터는 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV)(Mselli-Lakhal et al. (1998) Arch Virol. 143:681-695);말 감염성 빈혈 바이러스(Mitchell et al. (1998) Lancet. 351:346); 및 소 면역결핍증 바이러스를 기초로 한 복제-결함 벡터를 포함한다. 상기 각각의 문헌은 본원에 참고용으로 인용되어 있다.
더욱이, 당업자는 본 발명의 방법에 사용된 렌티바이러스 벡터가 "복제 결함성"일 수 있다는 것을 인식할 것이다. "복제 결함성"이란, 바이러스 벡터의 바이러스 입자가 표적 세포에서 완전한 바이러스 입자를 재구성할 수 없어서, 다른 세포로 증식되고 이 다른 세포를 감염시킬 수 없는 경우를 의미한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 렌티바이러스 벡터는 "감염성"이다. "감염성"이란, 바이러스 입자가 표적 세포에 도입될 수 있는 경우를 의미한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 렌티바이러스 벡터는 표적 세포에 "형질도입"될 수 있다. "형질도입"이란, 바이러스 벡터가 표적 세포내로 도입되어 유전자 운반 벡터를 표적 세포 게놈에 통합시키는 것을 의미한다.
목적 뉴클레오티드 서열을 게놈에 통합시키기 위하여 디자인된 재조합 렌티바이러스 벡터를 제조하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 간단히 말해서, 렌티바이러스 벡터는 예를 들어, 3개 이상의 유전 요소 즉, 유전자 운반 구조, 패키징 구조 및 Env 발현 구조를 포함하는 일시적 발현계를 생산할 수 있다[Naldini et al. (1996) Science. 272,263-267 ; Burns et al. (1993)Proc Natl Acad Sci USA. 90:8033-8037 ; and, White et al. (1999) J Virol. 73: 2832-2840]. 유전자 운반 구조는 레트로바이러스 cis-작용성 요소 및 목적 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 운반 구조는 표적 세포의 게놈에 삽입된 변형 프로바이러스 게놈에 포함된다. 패키징 구조는 외피를 제외한 바이러스 구조 단백질을 발현시킨다. 패키징 구조(주로 Gag/Pol)에 의하여 발현된 단백질은 캡시드 및 중합효소 성분을 형성하며, 레트로바이러스 RNA 게놈 및 이의 역전사된 DNA 생성물내 특이적 시스-작용성(cis-acting) 서열을 인식한다[Miller et al. (1997) Hum Gene Ther. 8:803-815]. 이러한 인식은 역전사 및 통합을 주도한다. 외피 구조는 통상적으로 이종성 외피(예를 들어, 소포성 체세포 바이러스 당단백질 G[VSV-G])를 포함한다. 이러한 3개의 발현 구조는 박테리아 플라스미드의 형태로 유지되며, 포유 동물 세포로 형질감염되어 복제-결함 바이러스 스톡을 생산한다[White et al. (1999) J Virol. 73:2832-2840 and Naldini et al. (1996) Science. 272: 263-267, 상기 문헌은 모두 본원에 참고문헌으로 인용됨].
당업자는 렌티바이러스 벡터가 다양한 방식으로, 본 발명의 방법에 유용한 "기능적으로 동등한" 바이러스 입자를 생산하도록 디자인될 수 있다. 트랜스-벡터계와 특히 관련된 "기능적 동등체"에 관한 보다 상세한 설명은 이하에 제시하였다. 당업자는 이 설명으로부터 상기 개념은 기타 공지된 렌티바이러스 벡터계에 동등하게 적용될 것이라는 사실을 인식할 것이다.
A. 트랜스-바이러스 벡터
본 발명의 하나의 구체예에서, 사용된 렌티바이러스 벡터는 "트랜스-바이러스" 벡터를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "트랜스-바이러스 벡터" 디자인을 보유하는 렌티바이러스 벡터는 Gag 및 Pol 폴리단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 최소한 부분적으로나마 분리되어 있는 것을 특징으로 한다. "폴리단백질"이란, 각 단백질로 가공되는 단일 전구체 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, HIV Pol 폴리단백질은 역전사효소 및 인테그라제를 포함한다. 상기 HIV Gag 폴리단백질은 예를 들어, MA, CA, NC 및 p6를 포함한다.
트랜스-바이러스 벡터 디자인에 있어서, Gag-Pro-Pol 폴리단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 2 이상의 각각의 부분으로 분리된다. 제1 DNA 분절은 Gag 또는 Gag/Pro를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 동등체, 역전사효소 및/또는 인테그라제를 암호화하는 최소한 제2 DNA 분절 또는 이의 기능적 동등체를 포함한다. 다시 말해서, 트랜스-바이러스계는, 역전사효소 및 인테그라제를 암호화하는 폴리펩티드가 기능적 Gag 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분절보다는 하나 이상의 기타 DNA 분절로부터 트랜스 방식으로 공급된다는 점에서 다른 바이러스 벡터계와 구별될 수 있다. 결과적으로, 트랜스바이러스 벡터계는 부분적으로 유전자 재조합을 통해 복제 수용성 레트로바이러스의 발생 가능성을 감소시킴으로써 바이러스 벡터를 보다 안전하게 만들 수 있다.
하나의 구체예에서, 트랜스 벡터 디자인은 "트랜스-렌티 바이러스 벡터"를 포함한다. 상기 "트랜스-렌티" 바이러스 벡터 디자인은 2 이상의 부분[Gag 또는 Gag-Pro를 발현하는 제1 DNA 분절과, 역전사효소 및/또는 인테그라제를 발현하는 최소의 제2 DNA 분절]내에 존재하는 Gag-Pro-Pol 폴리단백질을 발현하는 것을 특징으로 한다. "트랜스-렌티" 바이러스 벡터 디자인은, 바이러스 입자에 대하여 역전사 효소 및 인테그라제를 표적화하는, Vpr 및/또는 Vpx 폴리펩티드 또는 이의 기능적 동등체를 사용하는 것을 추가의 특징으로 한다. 이 디자인에서, 상기 Vpr 및/또는 Vpx 폴리펩티드는 기능적 역전사효소 및 인테그라제를 바이러스 입자에 운반하는 비이클로서 사용된다. 트랜스-렌티 바이러스 벡터 디자인에 사용된 Vpr/Vpx 융합 단백질의 디자인에 관한 보다 상세한 설명은 이하에 개력적으로 설명하였다.
또 다른 구체예에서, 트랜스-벡터 디자인은 "트랜스-레트로바이러스 벡터" 디자인을 포함한다. 이하에 더욱 상세히 설명되어 있지만, "트랜스-레트로바이러스" 벡터는 2 이상의 부분[Gag 또는 Gag-Pro를 발현하는 제1 DNA 분절, 및 역전사효소 및/또는 인테그라제를 발현하는 최소 제2 DNA 분절]내에서 Gag-Pro-Pol 폴리단백질을 발현시키는 것을 특징으로 한다. 역전사효소 및 인테그라제를 바이러스 입자에 대하여 표적화시키기 위한 상기 "트랜스-레트로바이러스" 벡터 디자인은, 바이러스 입자에 대하여 표적화될 수 있는 Gag 폴리펩티드의 최소 분절 또는 이의 기능성 동등체를 사용하는 것을 추가의 특징으로 한다. 이 디자인에서, 상기 Gag폴리펩티드 분절은 기능적 역전사 효소 및 인테그라제를 바이러스 입자에 운반하는 비이클로서 사용된다. 트랜스-레트로 바이러스 벡터 디자인에 관한 추가의 설명은 이하에 개략적으로 제시하였다.
당업자는 상기 트랜스-레트로바이러스 벡터 디자인이 임의의 레트로바이러스 공급원으로부터 유래된 바이러스 벡터에 사용될 수 있다는 사실을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명의 특정 구체예에서, 트랜스-레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스를 제외한 레트로바이러스로부터 유래된다. 이러한 레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스 예를 들어, 몰로니 백혈병 바이러스(MLV), 아벨슨 쥐 백혈병 바이러스, AKR(내생) 쥐 백혈병 바이러스, 조류 암종, 밀 힐(Mill Hill) 바이러스 2, 조류 백혈병 바이러스-RSA, 조류 골수아세포종 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스 29, 소 합포체(syncytial) 바이러스, 염소 관절염 뇌염 바이러스, 병아리 합포체 바이러스, 말 감염성 빈혈 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 합포체 바이러스, 핀켈-비스키스-진킨스(Finkel-Biskis-Jinkins) 쥐 육종 바이러스, 프렌드(Friend) 쥐 백혈병 바이러스, 후지나미(Fujinami) 육종 바이러스, 가드너-아른스타인(Gardner-Arnstein) 고양이 육종 바이러스, 기번(Gibbon) 원숭이 백혈병 바이러스, 기니아 피그 C형 온코바이러스, 하디-쥬커맨(Hardy-Zuckerman) 고양이 육종 바이러스, 하비(Harvey) 쥐 육종 바이러스, 휴만 수포 바이러스, 휴만 거품 바이러스, 휴만 T-림프친화성 바이러스 1, 휴만 T-림프친화성 바이러스 2, 잭시엑트(Jaagsiekte) 바이러스, 커스텐(Kirsten) 쥐 육종 바이러스, 랭구어(Langur) 바이러스, 메이슨-피저(Mason-Pfizer) 원숭이 바이러스, 몰로니 쥐 육종 바이러스,마우스 유방암 바이러스, 양 허파 선암종 바이러스, 돼지 C형 온코바이러스, 세망조직증 바이러스, 루(Rous) 육종 바이러스, 유인원 수포 바이러스, 유인원 육종 바이러스, 유인원 T-림프친화성 바이러스, 유인원 D형 바이러스 1, 스나이더-테일렌(Snyder-Theilen) 고양이 육종 바이러스, 다람쥐 원숭이 레트로바이러스, 트래거 덕(Trager duck) 비장 괴사 바이러스, UR2 육종 바이러스, 바이퍼(Viper) 레트로바이러스, 비스나/마에디(Visna/maedi) 바이러스, 울리(Woolly) 원숭이 육종 바이러스, 및 Y73 육종 바이러스 인간-, 유인원-, 고양이-, 및 소 면역결핍증 바이러스(HIV, SIV, FIV, BIV)로부터 유래될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 미국 특허출원 제09/578,548호를 참조하시오.
바이러스 입자를 생산하는데 사용되는 "트랜스" 바이러스 벡터 디자인, "트랜스-렌티" 바이러스 벡터 디자인 및 "트랜스-레트로바이러스" 벡터 디자인 및 바이러스 벡터계에 관한 설명은 미국 특허출원 제09/089,900호; 제09/709,751호; 제09/460,548호; 미국 특허 제6,001,985호; PCT 특허출원 제PCT/US00/18597호[Wu et al.(1997) EMBO16:5113-5122; 상기 문헌들은 모두 본원에 참고문헌으로 인용됨].
본 발명의 방법에 사용된 트랜스 바이러스 벡터계의 비제한적 예는 도 1∼2에 제시되어 있다. 이 예시에서, 트랜스-벡터계는 다음의 성분들을 포함한다: env 구조, 패키징 구조, 트랜스-효소 구조 및 레트로바이러스 유전자 운반 벡터. 상기 트랜스-바이러스 계의 "패키징 구조"는 Gag/Pro를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(도 1∼2에 박스 구조로 나타냄)을 포함하는 반면에, 역전사효소(RT) 및인테그라제(IN)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 구조로부터 완전히 결실되었거나 또는 기능적 폴리펩티드의 발현을 방지하는 몇몇 방식으로 파괴되었다. 역전사효소 및 인테그라제 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 "트랜스-효소 구조"로 칭하여지는 DNA 연장부상 패키징 구조의 반대편에 존재한다. 따라서 바이러스 발현계는 역전사효소 및 인테그라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로부터 Gag-Pro를 절단함으로써 Gag-Pro-Pol 구조를 펼친다.
트랜스-바이러스계에 의하여 생산된 트랜스-바이러스 벡터는 Gag/Pol이 폴리단백질로서 발현되는 3-벡터계를 사용하는 바이러스 벡터와 물리적으로 구별된다. 예를 들어, 문헌[Wu et al. (1997)EMBO J.16:5113-5122 and Wu et al. (2000) Mol. Therapy 1 : 47-55]에는, 3 벡터 렌티바이러스 벡터와 비교할 때 트랜스-렌티바이러스 입자내 절단되지 않은 Vpr/Vpx 융합 단백질을 확인하는 분석법, 및 트랜스-바이러스 벡터내 유전자 재조합의 감소된 수준을 측정하는 분석법을 제공한다.
본원에 사용된 "핵산 서열"은 종종 DNA 및 RNA 단편을 포함하는 일반적인 용어로서 사용될 것이다. 본 발명의 물질은 변형된 레트로바이러스 게놈 및 이의 프로바이러스 대응물을 포함하므로, 언급된 특정 기능을 갖는 서열은 RNA 형 및 DNA 형 둘다 존재할 것이다. 해당 위치는 DNA 및 RNA 모두에 존재하는 위치에 대하여 호환적으로 명명할 수 있다. 예를 들어, ψ패키징 시그널은 레트로바이러스 RNA 게놈내에서 패키징 시그널로서 작용하지만; 그러나, 해당 서열은 프로바이러스 DNA에 존재하지 않는다. 유사하게, 프로모터, 인핸서 및 종결자 서열은 약간은 다른 형태이지만, 게놈 RNA 및 프로바이러스 DNA형 모두로 존재한다. 바이러스 라이프사이클의 다양한 단계에 있어서 이러한 기능의 호환성은 당업자들에 의하여 이해되며, 이에 따라서 DNA 또는 RNA 상태에 대한 보다 광범위한 용어는 종종 이들을 칭하는데 사용된다. 특히, 염기의 진행에 의하여 특정되는 서열은 DNA 형 및 RNA 형 둘다인 특정 서열 및 이들의 상보 서열을 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
예를 들어, 트랜스-바이러스 벡터계의 유전자 운반 벡터, 패키징 구조, 외피 구조 및 트랜스-효소 구조에 사용되는 성분들을 포함하는 트랜스 바이러스 벡터계의 다양한 성분들에 관한 설명은 이하에 제시되었으며, 여기서 당업자는 "기능적으로 동등한" 구조를 용이하게 얻을 수 있다. "기능적으로 동등한" 구조는 각 DNA 구조(즉, 패키징 구조, 유전자 운반 벡터, 외피 구조 및 트랜스-효소 구조)를 포함하며, 본원에 예시된 특정 벡터 구조와 실질적으로 동일한 기능을 보유한다. 또한 트랜스-바이러스 벡터계의 다양한 벡터중 유전 요소는 임의의 바이러스 공급원, 구체적으로 레트로바이러스 및 더욱 구체적으로 렌티바이러스 공급원으로부터 유래될 수 있다.
트랜스-벡터계의 다양한 성분의 기능상 동등물에 대한 예 및 분석법은 이하에 더욱 자세히 기술되어 있다. 표 1은 HIV-1 게놈의 다양한 유전 요소에 대한 참고문헌을 제공하는 것으로서, NCBI Genebank 기탁 번호 AF033819를 기초로 하였으며, 다른 레트로바이러스 및/또는 렌티바이러스로부터 유래된 서열들은 당 업계에 공지되어 있으며, 소정의 숙주 동물종에 대하여 유도된 기능상 동등 벡터 및 벡터계를 구성하는데 사용될 수 있다. 성분에 대한 보다 상세한 설명은 표 1에 개략적으로 나타내었으며, 이의 기능은 본원에 참고 문헌으로 인용된, Coffin etal.(1997) Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York에서 살펴볼 수 있다. 뿐만 아니라, 당업자들은 다양한 유전 요소내에 존재하는 대립유전자 변이는 바이러스의 상이한 분리체들 사이에 존재하며, 이 변이체들은 본 발명의 구조물에 사용될 수 있다는 사실을 이해할 것이다. 예를 들어, 이러한 바이러스 분리물에 관하여는 문헌[Li et al. (1992)J.Virol 66 : 6587; Ghosh et al. (1993) Virology 194 :858 ; 및 미국 특허 제5,869,313호; 이들 문헌은 모두 본원에 참고용으로 인용됨]에 기술되어 있다.
| 인간 HIV-1 분리물의 유전 요소 및 위치 | |
| 유전 요소 | 위치 |
| R:U5:PBS:gag:pro:pol:vif:vpr:tat:rev:vpu:env:nef.PPT:U3:R: | (1-96)(97-181)(182-199)(336-1836)(1637-2099)(2102-4640)(4587-5163)(5105-5339)(5377-5591, 7925-7968)(5516-5591, 7925-8197)(5608-5854)(5771-8339)(8343-8710)(8615-8630)(8631-9085)(9086-9181) |
본 발명의 기능적 동등 서열은 또한 각각의 천연 서열과 실질적으로 동일한 기능을 보유하는 레트로바이러스 게놈의 다양한 단편들을 포함한다. 이러한 단편들은 약 10개 및 15개 이상의 연속 뉴클레오티드, 약 20개 이상의 연속 뉴클레오티드, 약 24, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300,340, 360, 380개 이상 또는 최대 목적 특정 유전 요소의 전체 연속 뉴클레오티드를 포함할 것이다. 그러한 단편들은 천연 바이러스 게놈을 분해하는 제한 효소를 사용하거나; 바이러스 게놈의 천연 뉴클레오티드 서열로부터 뉴클레오티드 서열을 합성함으로써 얻을 수 있거나; 또는 PCR 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 구체적으로 문헌[Mullis et al. (1987) Methods Enzymol. 155 : 335-350, 및 Erlich, ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, New York)]을 참조하시오. 또한, 다양한 벡터 성분들 예컨대, 부위-특이적 돌연변이유발법으로 얻어진 성분들은 본 발명의 방법에 의하여 포함된다. 이하에 더욱 상세히 기술한 바와 같이, 기능적 동등물을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
"변이체"란 실질적으로 유사한 서열을 말한다. 따라서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 경우 변이체는 렌티바이러스 벡터 시스템의 다양한 성분들과 기능적으로 동등한 서열들을 포함한다. 변이 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 위치 유도 돌연변이 유발에 의해 생성되었지만 천연 서열의 기능을 여전히 보유하는 합성에 의해 유도된 뉴클레오티드 서열들도 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 뉴클레오티드 서열 변이체 또는 아미노산 서열 변이체는 그 개개의 천연 뉴클레오티드 서열에 대해 70% 이상, 일반적으로 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다.
뉴클레오티드 서열의 변이체는 유전 암호의 축퇴성으로 인하여 보존적으로 상이한 아미노산 서열을 암호화한다. 이러한 자연 발생 대립유전자 변이체는 잘 알려진 분자생물학 기법, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 하이브리드화 기법을이용하여 확인할 수 있다. 변이 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 위치 유도 돌연변이 유발에 의해 생성되었지만, 여전히 기능적으로 동등한 상태로 존재하는, 합성에 의해 유도된 뉴클레오티드 서열들도 포함한다.
본 발명에 사용되는 렌티바이러스 벡터 시스템에 사용되는 다양한 전장 또는 성숙 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열과 관련하여, 변이체는 천연 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에 대한 하나 이상의 아미노산을 결실(소위 절두화) 또는 부가; 천연 폴리펩티드 내의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 부가; 또는 천연 폴리펩티드의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 천연 폴리펩티드로부터 유도된 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 변이체는, 예를 들어 유전적 다형 또는 인간의 조작에 의해 발생할 수 있다. 이러한 조작 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
예를 들어, 폴리펩티드의 아미노산 변이체는 소정의 특정 벡터 구성요소를 암호화하는 클로닝된 DNA 서열에서의 돌연변이에 의해 제조할 수 있다. 돌연변이 유발 및 뉴클레오티드 서열의 변경 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Walker 및 Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel 등. (1987) Methods Enzymol 154:367-382; Sambrook 등 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York]; 미국 특허 제4,873,192호 및 본원에 인용된 참고문헌을 참조할 수 있으며; 이 문헌들은 본원에서 참고로 인용한다. 다양한 벡터 폴리펩티드의 생물학적 활성에 영향을 주지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 지침은 Dayhoff 등의 모델(1978) [Atlas of Polypeptide Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.]에서 찾아볼 수 있으며, 이는 본원에서 참고로 인용한다. 한 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것과 같은 보존적 치환이 바람직할 수 있다. 보존적 치환의 예로는 Gly⇔Ala, Val⇔Ile⇔Leu, Asp⇔Glu, Lys⇔Arg, Asn⇔Gln 및 Phe⇔Trp⇔Tyr이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
천연 뉴클레오티드 서열 또는 천연 폴리펩티드의 변이체는 천연 서열 또는 천연 폴리펩티드와 상당한 동일성을 갖는다. 변이체는 1∼10개의 아미노산 잔기, 예컨대 6∼10개, 5개 정도로 적게, 4개, 3개, 2개 또는 1개 정도로 적은 수의 아미노산 잔기가 다를 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 변이체는 1∼30개 뉴클레오티드 정도로 적게, 예컨대 6∼20개, 5개 정도로 적게, 4개, 3개, 2개 또는 1개만큼 적은 수의 뉴클레오티드 잔기가 다를 수 있다.
"서열 동일성"이란 변이체의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 특정한 연속 분절을 기준 서열의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열에 대하여 정렬하고 비교하였을 때 변이체 서열과 기준 서열 내에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 관찰되는 것을 말한다. 서열 정렬 방법 및 서열들간의 동일성 측정 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 두 뉴클레오티드 서열의 최적 정렬에 대하여는, 변이체 뉴클레오티드 서열의 연속 분절은 기준 뉴클레오티드 서열에 대하여 부가적인 뉴클레오티드 또는 결실된 뉴클레오티드를 보유할 수 있다. 마찬가지로, 두 아미노산 서열의 최적 정렬을 위해서는, 변이체 아미노산 서열의 연속 분절은 기준 아미노산 서열에 대하여 부가적인 아미노산 잔기 또는 결실된 아미노산 잔기를 보유할 수 있다. 기준 뉴클레오티드 서열 또는 기준 아미노산 서열에 대한 비교에 사용되는 연속 분절은 20개 이상의 연속 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 포함하며, 30, 40, 50, 100 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기일 수 있다. 변이체 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열에 있어서의 갭의 포함과 관련된 증가된 서열 동일성에 대한 보정은 갭 패널티를 할당함으로써 수행할 수 있다. 서열 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
두 서열간의 퍼센트 동일성의 측정은 수학적 알고리즘을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열의 퍼센트 동일성은 스미스-워터만 상동성 검색 알고리즘을 이용하고, 갭 오픈 패널티가 12이고 갭 연장 페널티가 2인 유사변환 6갭 검색, BLOSUM 행렬 62를 이용하여 측정할 수 있다. 대안으로, 뉴클레오티드 서열의 퍼센트 동일성은 갭 오픈 패널티 25 및 갭 연장 패널티 5를 이용하는 스미스-워터만 상동성 검색 알고리즘을 이용하여 측정한다. 이러한 서열 동일성 측정은, 예를 들어 DeCypher Hardware Accelerator from TimeLogic Version G를 이용하여 수행할 수 있다. 스미스-워터만 상동성 검색 알고리즘은 본원에서 참고로 인용하는 문헌 [Smith 및 Waterman(1981) Adv. Appl. Math 2:482-489]에 교시되어 있다. 대안으로, 디폴트 매개변수를 이용하는 정렬 프로그램 GCG 갭(Wisconsin Genetic Computing Group, Suite Version 10.1)을 이용할 수 있다. GCG 갭 프로그램은 니들만(Needleman) 및 분쉬(Wunch) 알고리즘에 적용되며, 뉴클레오티드 서열 정렬을 위해서는 오픈 갭 페널티 3, 연장 갭 페널티 1을 이용할 수 있다. 두 서열의 비교에 이용되는 수학적 알고리즘의 비제한적인 또다른 바람직한 예는 Karlin 및 Altschul의 알고리즘(1990) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, Karlin 및 Altschul의 변형법(1993) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]이 있다. 이러한 알고리즘은 Altschul 등(1990)[J. Mol. Biol. 215: 403]의 NBALST 및 XBLAST에 통합된다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12를 이용하여 수행하여 충분한 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 얻을 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3을 이용하여 수행하여 충분한 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 얻기 위해서는, Altschul 등의 문헌(1997) [Nucleic Acids Res. 25:3389]에 기재된 바와 같이 갭이 있는 BLAST를 이용할 수 있다. 대안으로, 분자간의 원거리 관계를 검출하는 반복되는 검색을 수행하기 위해 PSI-Blast를 이용할 수 있다. Altschul 등의 상기 문헌(1997)을 참고할 수 있다. BLAST, 갭이 있는 BALST, PSI-Blast 프로그램을 이용할 경우, 개개의 프로그램(예, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개변수를 이용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참고. 서열 비교에 이용되는 수학적 알고리즘의 또다른 바람직한 비제한적인 예는 Myers 및 Miller(1988)의 알고리즘 [CABIOS 4:11-17]이다. 이러한 알고리즘은 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)에 포함되며, 이 프로그램은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부이다. 아미노산 서열을 비교하기 위하여 ALIGN 프로그램을 이용할 경우, PAM120 가중 잔기 표, 갭 길이 패널티 = 12 및 갭 패널티 = 4를 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예 내에서 후술하는 DNA 구조물은 벡터 또는 플라스미드에 포함된다. 이 플라스미드는 박테리아 복제 기점, 하나 이상의 선별 마커, 플라스미드 구조물이 단일 가닥으로 존재할 수 있게 하는 시그널(즉, M13 복제 기점), 다중 클로닝 부위 및 "포유동물" 복제 기점(즉, SV40 또는 아데노바이러스 복제 기점)을 포함할 수 있다. 이러한 벡터는 당업계에 공지되어 있다.
1. 유전자 전달 벡터
전술한 바와 같이, 트랜스-바이러스 벡터 시스템은 패키징 구조물, env 구조물, 및 트랜스-효소 구조물과 함께 복제 적격 바이러스의 형성을 막는 트랜스-바이러스 패키징 세포주의 작제를 가능하는 유전자 전달 벡터를 제공한다.
본원에서 사용되는 "유전자 전달 벡터"란 유전자 전달 벡터의 전사를 가능하게 하는 필수적 "시스 작용성" 성분; 바이러스 입자로의 유전자 전달 벡터 mRNA(즉, 변형된 프로바이러스 게놈)의 캡슐화; 유전자 전달 벡터 mRNA의 역전사; 및 표적 세포의 게놈으로의 유전자 전달 벡터의 통합을 말한다.
전술한 기능을 수행하는 시스 작용성 핵산 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 유전자 전달 벡터는 다음 성분들을 포함한다: 5' LTR; 패키징 시그널; Rev 반응성 구성요소(PRE); 및 3' LTR 또는 임의의 기능성 변이체 또는 상기 각 구성요소의 유도체. 유전자 전달 벡터는 원하는 표적 세포 내에서 유효한 프로모터에 기능적으로 결합된 소정의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다. 이들 성분들 각각에 대해서는 아래에서 보다 상세히 설명한다.
5' 및 3' LTR 서열은 유전자 전달 벡터의 다른 구성요소의 측면에 위치한다.LTR 서열은, 예를 들어 프로모터/인핸서 구성요소 및 표적 세포의 게놈으로의 프로바이러스 게놈의 통합에 있어서 중요한 다른 시스 작용성 서열 구성요소를 비롯하여 다수의 구성요소를 포함한다. LTR의 다양한 시스 작용성 구성요소는, 예를 들어 레트로바이러스 유전자 전달 벡터의 단일 전구체 mRNA로의 발현을 유도하는 바이러스 프로모터 및 인핸서 서열을 포함하는 U5 영역(진뱅크 등록 번호 AF033819의 nt 97-181) 및 U3 영역(진뱅크 등록 번호 AF033819의 nt 8631-9085)을 포함한다. 다른 LTR 성분은 RNA 전사 개시에 요구되는 서열(즉, 상호작용성 영역(TAR)), 폴리아데닐화 시그널(진뱅크 등록 번호 AF033819의 nt 1-96)을 포함하는 R 영역을 포함한다. LTR 서열 및 HIV-1 바이러스에 대한 기능적 변이체에 대한 보다 상세한 설명은 문헌 [Pereira 등 (2000) Nucleic Acid Research 28:663-668]에서 찾아볼 수 있으며, 이는 본원에서 참고로 인용한다. 당업자라면 유전자 전달 벡터의 다양한 성븐들을 이들이 5' 및 3' LTR 구성요소의 내부에 존재하는 한 어떠한 순서로도 정렬할 수 있음을 알 것이다. 전달 벡터는, 역전사 개시에 관여하는 tRNA 프라이머 결합 부위 서열(진뱅크 등록 번호 AF033819의 nt 182-199)을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 변형은 당업자에게 공지되어 있다. LTR에 대한 변형, 예컨대 자체 불활성화(SIN) 벡터의 변형 역시 공지되어 있다. 이러한 변경은 당업자에게 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 "패키징 시그널" 또는 "ψ시그널"은 바이러스 RNA를 바이러스 입자로 캡슐화하기 위해 시스 작용으로 요구되는 핵산 서열을 말한다. 본 발명의 방법에 사용되는 패키징 시그널은 유전자 전달 벡터를 바이러스 입자로 캡슐화하는 데 요구되는 최소 패키징 시그널일 수 있다. 본 발명의 바람직한 레트로바이러스 유전자 전달을 위한 이러한 최소 패키징 서열은 변형된 프로바이러스 게놈(즉, 유전자 전달 벡터)의 바이러스 입자로의 혼입을 유도하기에 충분하다.
공지된 패키징 시그널의 변이체 또는 단편은 변이체가 바이러스 입자로의 레트로바이러스 유전자 전달 벡터의 캡슐화를 유도하는 한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 최소 패키징 서열을 둘러싸는 연장된 패키징 시그널은 유전자 전달 벡터의 바이러스 입자로의 캡슐화 효율을 증가시킬 수 있다. HIV 패키징 시그널에 대해서는 본원에서 참고로 인용하는 문헌 [Mcbirde 등 (1997) J. Virol. 71 : 4544-4554]에서 추가로 특성이 분석되어 있다.
유전자 전달 벡터는 또한 Rev 반응성 구성요소(REV)를 포함할 수 있다. 이러한 구성요소의 존재는 Rev가 PRE-함유 mRNA의 핵으로의 수송을 유도할 수 있게 한다. PRE 및 이의 기능적 변이체의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 [Berchtold 등 (1995) Virology 211:285-289; Dillon 등 (1990) J. Virol. 64:4428-4437; Le 등 (1990) Nucleic Acid Research 18:1613-1623]을 참고할 수 있으며, 이들 문헌은 본원에서 참고로 인용한다. 또한, Rev/PRE는, 예를 들어 Rev-독립적 HIV-1 복제를 가능하게 하는 것으로 확인된 Mason-Pfizer monkey virus(매이슨-화이저 원숭이 바이러스; MPMV) 유래의 시스 작용성 219-뉴클레오티드 구성적 수송 구성요소(CTE)를 비롯하여 다른 구성요소로 치환될 수 있음이 알려져 있다. 이에 대해서는 예를 들어 문헌 [Bray 등 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1256-1260]을 참고할 수 있다.
유전자 전달 벡터는 소정의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 구조물을 추가로 포함한다. 따라서 유전자 전달 벡터에 포함된 소정의 뉴클레오티드 서열은 바이러스 입자를 통해 표적 세포로 도입될 경우 발현될 수 있다. 소정의 뉴클레오티드 서열 및 이 서열을 포함하는 DNA 구조물에 대해서는 아래에서 보다 충분히 설명한다. 또한, 유전자 전달 벡터는 소정의 하나 이상의 추가 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
유전자 전달 벡터는 프로모터에 기능적으로 결합된 선별 마커를 포함하는 하나 이상의 DNA 구조물을 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커의 사용에 대한 세부사항은 아래에서 보다 상세히 기술한다. 당업자라면 다수의 가능성이 존재함을 알 것이다. 또한, 선별 마커의 발현을 위해 선택된 프로모터는, 마커가 패키징 세포주 또는 표적 세포의 게놈으로의 유전자 전달 벡터의 혼입을 모니터링하는 데 사용될 수 있는지에 따라 달라진다는 것이 알려져 있다.
도 1 및 2는 트랜스 바이러스 시스템 유래의 유전자 전달 벡터의 비제한적인 예를 도시한다. 도시된 구조물은 하기 성분들에 측접한 HIV-1로부터의 LTR 서열을 포함한다: 패키징 시그널; PRE; 중앙 폴리퓨린 트랙트(PPT) 및 CMV 프로모터에 기능적으로 결합된 소정의 뉴클레오티드 서열.
2. 트랜스-효소 구조물
트랜스-효소 구조물은 천연 배열로부터 이격된 역전사 효소 및 인테그라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구체적으로, 트랜스-효소 구조물은 기능적 역전사 효소 및/또는 인테그라제 폴리펩티드에 기능적으로 결합된, 바이러스입자로 표적화될 수 있는 능력을 특징으로 하는 제1 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화한다. 예를 들어, HIV 비리온 관련 부속 단백질(Vpr 또는 Vpx) 또는 이의 변이체 또는 단편은 트랜스-바이러스 벡터 입자로 인테그라제 활성 및 역전사 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 전달하기 위한 비이클로서 사용될 수 있다. "트랜스-렌티" 바이러스 벡터 디자인은 도 1에 도시되어 있다. 상세히 설명하면, 트랜스-효소 구조물은 인테그라제 및/또는 역전사 효소 또는 이의 기능적 변이체 및 단편을 포함하는 하나 이상의 이종성 폴리펩티드에 프레임 내에 융합된, Vpr 또는 Vpx 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 트랜스-효소 구조물은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Liu 등 (1997) J. Virol. 71:7704-7710, Wu 등 (1997) EMBO J. 16:5113-5122; 미국 특허 제6,001,985호; 1998년 6월 3일자 미국 특허 출원 제 09/089,900호 및 1999년 12월 14일자 미국 출원 제09/460,548호]를 참조할 수 있으며, 이들은 본원에서 참고로 인용한다.
본원에서 사용되는 "융합 단백질"이란 프레임 내 발현을 위해 결합된 두 개 이상의 이종 폴리펩티드 서열을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 즉, 이종성 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 단일 번역 생성물로 번역된다. 한 구체예에서, 트랜스-효소 구조물에 의해 암호화되는 융합 단백질은 Vpr 또는 Vpx 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 포함하는 한편, 제2 폴리펩티드는 인테그라제 또는 역전사 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 다른 구체에에서 트랜스-효소 구조물에 의해 암호화되는 융합 단백질은 세 개의 모든 폴리펩티드(즉, Vpr/Vpx, 역전사 효소 및 인테그라제)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
Vpr 및 Vpx 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 제5,861,161호를 참조할 수 있다. Vpr 또는 Vpx 폴리펩티드의 단편 및 변이체가 사용될 수 있으며, 비리온 입자로 혼입되는 능력을 보유할 것이다. 이러한 활성을 보유하는 Vpr/Vpx 폴리펩티드의 단편 및 변이체의 예는 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Paxton 등 (1993) J. Virol. 67:7229-7237] 및 미국 특허 제6,043,081호를 참조할 수 있으며, 이들은 둘 다 본원에서 참고로 인용한다. 또한, Vpr 또는 Vpx 폴리펩티드가 비리온으로 혼입되는지를 확인하기 위한 분석은 당분야에서 통상적인 것이다. 요약하면, 마커 폴리펩티드에 융합된 Vpr/Vpx 폴리펩티드의 단편 또는 변이체는 바이러스 입자를 생산할 수 있는 패키징 세포주에서 발현시킨다. 이 세포주를 배양하고 바이러스 입자를 생산산한다. 이 바이러스 입자를 분리하고, 마커 단백질의 존재에 대해 분석한다. 예를 들어, 문헌 [Paxton 등 (1993) J. Virol. 67:7229-7237]을 참조할 수 있다.
트랜스-벡터 디자인의 또다른 예가 도 2에 도시되어 있다. 이 특정한 비제한적 예에서의 디자인은 본원에서, 트랜스-바이러스 벡터 입자로 인테그라제 활성 및 역전사 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 전달하기 위하여 바이러스 입자로 표적화할 수 있는 능력을 보유하는 Gag 폴리펩티드의 단편을 이용하는 트랜스-레트로바이러스 벡터 디자인으로서 칭해진다.
상세히 말하면, 이러한 구체예에서, 트랜스-효소 구조물은 인테그라제 및/또는 역전사 효소 또는 이의 기능적 변이체 및 단편을 포함하는 하나 이상의 이종성 폴리펩티드에 프레임 내에 융합된, 바이러스 입자로 표적화할 수 있는 능력을 보유하는 Gag 폴리펩티드의 단편을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 트랜스-효소 구조물은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 1999년 12월 14일자 미국 특허 출원 제09/578,548호를 참조할 수 있다.
한 구체예에서, 트랜스-효소 구조물에 의해 암호화된 단백질은 바이러스 입자로 표적화될 수 있는 능력을 보유하는 Gag의 단편을 포함하는 한편, 제2 폴리펩티는 인테그라제 또는 역전사 효소 활성을 보유하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 트랜스-효소 구조물에 의해 암호화되는 융합 단백질은 세 개의 모든 폴리펩티드(즉, Gag:역전사 효소:인테그라제)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다,
Gag 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 당업계에 공지되어 있다. Gag 폴리펩티드의 단편 및 변이체는 비리온 입자로 혼입될 수 있는 능력을 보유한다. 이러한 활성을 보유하는 Gag 폴리펩티드의 단편 및 변이체의 예는 공지되어 있다.
인테그라제 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 역시 공지되어 있다(표 1 참조). 인테그라제는 바이러스 생활 주기의 여러 양태에 관여한다. 예를 들어, 인테그라제는 비리온 어셈블리 및 성숙 과정의 다양한 단계에 관여하고, 숙주 세포에서의 바이러스 게놈의 역전사 및 통합에 관여하는 것으로 확인되었다(Lie 등 (1999) J. Virol. 73:8831-8836 및 Craigie 등 (2001) J. Bio. Chem. Manuscript R100027200). 본 발명 방법에 사용되는 인테그라제 폴리펩티드는 임의의 바이러스 원으로부터, 특히 레트로바이러스, 특히 렌티 바이러스원으로부터 유래될 수 있다.
인테그라제 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편은 인테그라제 활성을 보유한다. 인테그라제 활성이란 폴리펩티드가 바이러스 입자의 생성을 지지하기에(즉, 바이러스 어셈블리, 성숙 및/또는 통합을 지지하기에) 충분한 활성을 보유하는 것을 의미한다. 바이러스 어셈블리, 성숙 및 통합에 영향을 주는 인테그라제 폴리펩티드의 영역은 당업계에 공지되어 있으며, 이러한 기능을 측정하기 위한 분석 역시 공지되어 있다. 예를 들어, 인테그라제의 촉매 중심의 성숙은 바이러스 입자의 감염성을 감소시킨다. 예를 들어, 문헌 [Liu 등 (1997) J. Virol. 71:7704-7710; Wu 등 (2000) Mol. Therapy 2:47-55; 및 Craigie 등 (2001) J. Bio. Chem. Manuscript R100027200 및 Liu 등 (1999) J. Virol. 23:8831-8836]을 참조할 수 있으며, 이들 문헌은 모두 본원에서 참고로 인용한다.
역전사 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있다(표 1 참조). 역전사 효소는 프라이머로서 세포 tRNA를 사용하여 1본쇄 RNA 주형으로부터 2본쇄의 선형 DNA를 합성하는 데 관여한다. 본 발명에 사용되는 역전사 효소는 비제한적인 예로 HIV-1, HIV-2 및 SIV를 비롯하여 임의의 레트로바이러스원, 특히 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다. 역전사 효소 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편은 역전사 효소 활성을 보유한다.
"역전사 효소 활성"이란 폴리펩티드가 바이러스 입자 생산을 지지하기에 충분한 활성(즉, 유전자 전달 벡터의 복제를 촉매하는 활성)을 보유하는 것을 말한다. 역전사 효소의 활성을 측정하기 위한 분석은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 역전사 효소 활성의 측정은 인공 주형/프라이머 구조물 및 삼중수소화 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 뉴클레오티드 기질로서 사용하여 시험관내에서 수행할 수 있다. 이 분석 시스템은 트리클로로아세트산(TCA)으로 침전시킬 수 있는 RNA/DNA 하이브리드 내의 방사능 활성의 혼입을 검출하는 것에 기초한다. 역전사 효소 활성을 측정하기 위한 다른 방법은, 예를 들어 본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 제6,132,995호에서 찾아볼 수 있다.
단일 번역 생성물(즉, 프레임 내로 융합된)로 번역되는 이종성 폴리펩티드를 암호화하는 두 개 이상의 뉴클레오티드 서열을 보유하는 발현 벡터를 생성하는 방법 역시 당업계에 잘 알려져 있다. 뿐만 아니라, 당업자라면 링커 서열이 펩티드의 암호화 영역이 프레님 내에 유지되도록만 한다면, 트랜스-효소 구조물의 이종성 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 사이에 링커가 위치할 수 있음을 알 것이다. 이러한 링커 서열은, 예를 들어 패키징 구조물 상에 암호화된 프로테아제에 의해 인식되는 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 이러한 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 HIV-1 게놈의 역전사 효소 암호화 서열의 5' 위치의 33 뉴클레오티드 또는 대안으로, 진뱅크 등록 번호 LO2317의 인테그라제 암호화 서열의 5'에 위치하는 18개 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어 문헌[Wu 등 (1997) EMBO J. 16:5113-5122]을 참조할 수 있다. 당업자라면 Vpr 또는 Vpx 폴리펩티드 유래의 역전사 효소 또는 인테그라제의 효율적인 절단을 유도하기 위해 이러한 서열을 어떻게 이용해야 하는지를 알 것이다.
복제 결함이 있는 트랜스-바이러스 입자를 생성하기 위해서는 인테그라제 및 역전사 효소 둘 다를 패키징 세포주 내에서 Gag 또는 Gag/Pro 폴리펩티드를 암호화하는 패키징 구조물에 대하여 트랜스로 발현시킨다. 본 발명의 한 구체예에서, 역전사 효소 및 인테그라제를 포함하는 융합 단백질은 두 개의 독립적인 트랜스-효소 구조물 상의 패키징 세포주에서 발현시킨다. 이러한 구체예에서, 패키징 세포주는 두 개 이상의 트랜스-효소 구조물을 포함한다. 한 예로서 트랜스-렌티바이러스 벡터 디자인을 사용할 경우, Vpx 또는 Vpr 및 역전사 효소를 포함하는 제1 융합 단백질 및 Vpx 또는 Vpr 및 인테그라제를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 제2 트랜스-효소 구조물이 있다. 이러한 구조물에서 폴리펩티드의 순서는 다양할 수 있음은 알려져 있다. 게다가 트랜스-레트로바이러스 벡터 디자인이 유사한 방식으로 사용될 수 있음이 알려져 있다.
트랜스-효소 구조물의 또다른 구체예에서, 역전사 효소 및 인테그라제 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 폴리펩티드는 단일 번역 생성물로서 발현된다. 이러한 구체예에서, 트랜스-효소 구조물은 프레임 내에 융합된 하기의 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 갖는 융합 단백질을 암호화한다: Vpr 또는 Vpx, 역전사 효소 및 인테그라제. 예를 들어 미국 특허 출원 제09/089,900호 및 문헌 [Wu 등 (1997) EMBO J. 16:5113-5122]을 참조할 수 있다.
트랜스-효소 구조물의 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 패키징 세포주에서 유효한 프로모터에 기능적으로 결합된다. 트랜스-효소 구조물을 함유하는 DNA 구조물은, 패키징 세포주에서 역시 기능성인 전사 및 번역 종결 영역을추가로 포함할 수 있다. 소정의 프로모터는, 예를 들어 닭 베타 액틴 프로모터 CMV, HIV-2 LTR, SHVTK 프로모터, RSV 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 및 SV 40 프로모터를 포함한다.
도 1은 트랜스-렌티바이러스 벡터 시스템의 트랜스-효소 구조물의 비제한적인 예를 도시한다. 이 구조물은 하기의 기능적으로 결합된 성분들을 포함한다: CMV 프로모터; Vpr 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 역전사 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 인테그라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; HIV-2 유래의 PRE 및 SV40 폴리아데닐화 시그널. 도 1에 도시된 트랜스-효소 구조물은 역전사 효소의 N-말단 프로테아제 절단 부위 및 역전사 효소와 인테그라제 폴리펩티드 사이의 프로테아제 절단 부위를 보존한다.
3. 패키징 구조물
전술한 바와 같이, 본 발명 방법에 사용되는 트랜스-바이러스 입자는 패키징 구조물을 추가로 제공하며, 이것은 유전자 전달 벡터, env 구조물 및 트랜스-효소 구조물과 함께 복제 적격 바이러스의 형성을 막는 패키징 세포주의 작제를 가능하게 한다.
패키징 구조물은 기능적 인테그라제 또는 역전사 효소 폴리펩티드를 암호화하지 않는 절두된 Gag/Pol 서열(즉, Gag/Pol)을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산인 것이 특징이다. Gag/Pro 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 코어 매트릭스 및 뉴클레오캡시드 폴리펩티드를 구성하는 다양한 구조 단백질을 포함한다. 이 서열은 또한 기능적 프로테아제를 암호화한다.Gag/Pro 서열은 전술한 바와 같이 임의의 레트로바이러스로부터 유래될 수 있다. 이러한 Gag/Pro 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 진뱅크 등록 번호 AF033819의 뉴클레오티드 336-2099를 포함한다.
패키징 구조물은 복제 결함이 있는 바이러스 입자의 생성에 필요한 바이러스 게놈(특히 레트로바이러스 게놈) 유래의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 패키징 구조물에 포함될 수 있는 유전적 구성요소의 비제한적인 예는 Vif, Tat 및 Rev를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러나 패키징 구조물은 기능적 외피 폴리펩티드, 기능적 역전사 효소 폴리펩티드 및 기능적 인테그라제 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다. 이러한 서열들은 전체적으로 또는 부분적으로 결실되었거나 또는 기능적 폴리펩티드의 번역을 막기 위해 변경되었다. 또한, 패키징 구조물은 기능적 패키징 시그널(ψ시그널)이 없기 때문에, 이 구조물로부터 생성된 RNA가 바이러스 입자로 혼입되는 것을 막는다.
미국 특허 출원 제09/089,900호에 보다 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 역전사 효소 및 인테그라제가 패키징 구조물에서 돌연변이되는 방식은 바이러스 입자의 감염성에 영향을 줄 수 있다. 패키징 구조물 내의 역전사 효소 및/또는 인테그라제 서열에 대하여, 폴리펩티드의 기능을 파괴하며, 역전사 효소 및 인테그라제가 트랜스-효소 구조물 내에서 트랜스 방식으로 발현될 때 감염성이 있고 복제 결함이 있는 트랜스-바이러스 벡터를 생성할 수 있게 하는 임의의 변경이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 한 구체예에서 역전사 효소 및 인테그라제 서열은 프로테아제 서열의 3'에 종결 코돈을 포함하도록 변경된다. 또한, 다수의 돌연변이가 역전사 효소 및 인테그라제 서열에 도입될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 역전사 효소의 암호화 서열의 초반부에 번역 종결 코돈을 도입하는 것 외에도, 하나 이상의 부가적인 "치명적" 돌연변이를 역전사 효소 및/또는 인테그라제 암호화 서열 내에 위치시킬 수 있다. 이러한 부가적인 돌연변이는 패키징 구조물과 트랜스-효소 구조물 간의 유전적 재조합에 의하여 완전한 Gag-Pol 암호화 영역의 재확립 가능성을 추가로 감소시킨다.
패키징 구조물의 뉴클레오티드 서열은 패키징 세포주 내에서 유효한 프로모터를 추가로 포함하는 DNA 구조물 내에 포함된다. DNA 구조물은 역시 패키징 세포주 내에서 기능성인 전사 및 번역 종결 영역을 추가로 포함할 수 있다. 소정의 프로모터는, 예를 들어 CMV, HIV-2 LTR, HCMV-IE(Naldini 등 (1996) Science 272: 263-267), SHVTK 프로모터, RSV 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 및 SV40 프로모터를 포함한다. 패키징 구조물은 활성 프로모터에 기능적으로 결합된 선별 마커를 추가로 포함할 수 있다.
당업자라면, 패키징 구조물의 다양한 기능적 변이체를 고안할 수 있음을 알 것이다. 도 1 및 2는 본 발명 방법에 유용한 패키징 구조물의 비제한적인 예를 도시한다. 이 구조물은 Gag/Pro, Vif, Tat, Rev(진뱅크 등록 번호 L02317의 nt 258-8384)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 기능적으로 결합된 CMV 프로모터를 포함한다. 도 1의 패키징 구조물은 역전사 효소 및 인테그라제 암호화 서열의 첫 번째 아미노산 위치에서 번역 종결 코돈(TAA), ψ시그널의 결실, Vpr 암호화 서열로의 프레임 이동 돌연변이, nef 유전자의 완전한 결실, 불활성 Vpu 폴리펩티드를 생성하는 내부 결실 및 Env 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 패키징 구조물의 작제에 관한 보다 상세한 설명을 위해서는 미국 특허 출원 09/089,900호를 참조할 수 있다.
4. Env 구조물
본 발명은 또한 전술한 패키징 구조물, 유전자 전달 벡터 및 트랜스-효소 구조물과 함께 복제 완전 트랜스-바이러스 벡터 입자의 형성을 막는 env 구조물을 제공한다.
트랜스-바이러스 시스템의 env 구조물은 유효 프로모터에 기능적으로 결합된 외피 단백질 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다양한 외피 폴리펩티드가 당업계에 공지되어 있다. 본 발명 바이러스 입자가 감염시킬 수 있는 세포의 숙주 범위는 사용되는 외피 암호화 서열에 따라 변경될 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명 방법에 유용한 바이러스 외피 단백질은 HIV 외피 폴리펩티드(표 1 참조), MLV 외피 당단백질((Page 등 (1990) J. Virol. 64:5270-5276), 수포성 구내염 바이러스 G-단백질(VSV-G)(Yee 등 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:9564-9568 및 Burns 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037) 또는 에볼라(Ebola) 및 마콜라(Makola)의 외피 폴리펩티드(Kobinger 등(2001) Nature Biotechnology 19:225-230)를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 선택되는 env 암호화 서열은 바이러스 입자를 수정된 난모세포의 세포로 진입할 수 있게 한다. 본 발명의 방법에서는, 수포성 구내염 바이러스 G-단백질(VSV-G) 또는 이의 단편 또는 변이체가 env 구조물에 사용된다. 본발명 방법에 유용한 추가적인 외피 폴리펩티드를 확인하기 위한 유사 형별 분석은 당업계에 잘 알려져 있다. 또한, 트랜스-바이러스 벡터 입자는 Env 구조물 없이도 작제할 수 있는 것으로 이해된다.
외피 폴리펩티드의 단편 또는 변이체는 복제 결함 바이러스 입자의 생성을 지지하기에 충분한 활성(즉, 레트로바이러스 입자의 외피로 혼입될 수 있고, 표적 세포에 결합할 수 있고, 표적 세포로 바이러스 입자를 진입시킬 수 있는 활성)을 보유한다. Env 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체의 기능을 확인하기 위한 분석은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명 Env 폴리펩티드의 단편 또는 변이체의 발현은 그러한 패키징 세포주에서 생성된 벡터 입자가 선별 마커를 미성숙 민감성 세포에 전달할 수 있게 하여, 마커 약물 선별에 대한 내성이 생기도록 한다.
프로모터 서열은 패키징 세포주에서 활성이 있는 한 어떠한 것도 env 구조물에 사용될 수 있다. 이러한 프로모터 서열은 본원에 기술되어 있다. 적절한 폴리아데닐화 시그널의 대표적인 예는 SV40 후기 폴리아데닐화 시그널, 소 성장 호르몬 종결/폴리아데닐화 서열, 및 인슐린 폴리아데닐화 시그널을 포함한다.
env 구조물은 선별 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 선별 마커의 예로는 항생물질(예, 퓨로마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 가나마이신 등)에 대한 숙주 내성을 부여할 수 있는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 유사체에 대한 내성을 부여할 수 있는 뉴클레오티드 서열 등을 포함한다. 예를 들어 β-gal, GFP 및 루시퍼라제를 비롯한 다른 선별 마커도 당업계에공지되어 있다. 당업자라면 여러 가능성을 이해할 것이다.
본 발명의 전술한 바와 같은 비제한적인 env 구조물의 예는 도 1에 도시되어 있다. 이 구조물은 SV40 폴리아데닐화 시그널에 기능적으로 결합된 VSV-G 암호화 영역에 기능적으로 결합된 CMV 이른 초기 프로모터를 포함한다.
5. 패키징 세포주
본 발명 방법에 사용되는 트랜스-바이러스 입자는 당업계에 공지된 기법을 이용하여 생성한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,650,764호 및 미국 특허 출원 제09/089,900호를 참조할 수 있으며, 이 특허는 본원에서 참고문헌으로 포함한다. 이 방법은 패키징 세포주로 트랜스-효소 구조물, 유전자 전달 구조물, env 구조물 및 패키징 구조물을 혼입시키는 단계; 바이러스 입자의 형성이 가능한 적합한 조건 하에 패키징 세포주를 배양하는 단계 및 트랜스-바이러스 입자를 분리하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 인간, 고양이과 동물, 염소, 소, 양, 개 및 마우스와 같은 척추동물 또는 포유동물로부터 얻은 세포를 사용하여 본 발명의 패키징 세포를 제조할 수 있다. 적합한 패키징 세포주의 비제한적인 예로는 HeLa(ATCC No. CCL2); HT1080(ATCC No. CCL121); 293(ATCC No. 1573); 및 293T 세포주를 들 수 있다.
다양한 벡터 구조물을 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 패키징 세포 내로 도입할 수 있다. 이러한 방법의 비제한적인 예로는 전기천공법, 리포솜 사용 및 CaPO4침전을 들 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ausabel 등 (1994) Current Protocols in Molecular Biology; John Wileg and Sons, Inc.] 및 미국 특허 제5,739,081호를 들 수 있으며, 이들 문헌은 본원에서 참고문헌으로 포함한다. 또한, 트랜스-렌티바이러스 시스템의 다양한 구조물을 패키깅 세포주에서 일시적으로 발현시킬 수 있거나, 또는 구조물 중 일부 또는 전부를 패키징 세포의 게놈으로 안정하게 혼입시킬 수 있다.
트랜스-렌티바이러스 입자가 생성되는 조건 하에 패키징 세포주를 배양하는 방법 및 레트로바이러스 벡터 입자의 후속 분리 방법 역시 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 레트로바이러스 벡터 패키징 세포주는 다양한 단층 배양 시스템을 비롯하여 표준 배양 기법을 이용하여 배양할 수 있다. 이러한 패키징 세포주는 T-플라스크, 롤러병 또는 생물 반응기에서 배양할 수 있다. 임의의 적절한 배양 배지, 예컨대 5% 태아 소 혈청을 함유하는 AIM-V 배지(깁코 BRL, 그랜드 아일랜드, 뉴욕) 또는 10% 열불활성화 태아 소 혈청이 보강된 고글루코스(4.5 g/l) 함유 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)를 사용할 수 있다.
레트로바이러스 벡터 입자를 분리하는 방법은, 예를 들어 본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 제5,661,022호 및 미국 특허 제6,013,517호를 참조할 수 있다. 본원에서 사용되는 "정제된 트랜스-바이러스 벡터 입자"는 적어도 50 중량%, 60 중량%, 70 중량%, 80 중량%, 바람직하게는 적어도 85 중량%, 보다 바람직하게는 적어도 90 중량%, 93 중량%, 95 중량%, 98 중량%, 99 중량%의 레트로바이러스 벡터 입자를 함유하는 트랜스-바이러스 벡터 입자의 제조를 의미한다.
III. 소정의 뉴클레오티드 서열
본 발명의 방법 및 조성물에서, 렌티바이러스 벡터의 변형된 프로바이러스 게놈은 소정의 뉴클레오티드 서열을 하나 이상 포함한다. 소정의 핵산은 유전적으로 변형된 동물과 이종성일 수도 있고, 동종성일 수도 있다. 이종성이란 동물의 게놈에서 자연적으로 발견되지 않는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 동종성이란 자연 상태에서 동물에서 발견되며 자연 발생 서열의 위치와는 다른 위치에서 동물 게놈으로 통합되는 뉴클레오티드 서열을 말한다.
소정의 임의의 뉴클레오티드 서열을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 특히 유용한 서열은 발현이 검출가능한 표현형을 형성하는 뉴클레오티드 서열이다. 이러한 결과는 포유동물에서 이종성 생성물의 발현 또는 내생 생성물의 증가된 발현을 유도함으로써 얻을 수 있다. 대안으로, 상기 결과는, 하나 이상의 내생 생성물, 예를 들어 동물에서의 다양한 효소 또는 보조 인자의 발현을 감소시켜 얻을 수 있다. 당업자라면 이러한 소정의 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드, 리보자임 또는 안티센스 서열을 암호화할 수 있음을 이해할 것이다.
소정의 유전자는 상업적 시장을 반영하는 것이며, 유전적 변형 동물의 개발에 관련된 것의 이점을 반영한다. 소정의 뉴클레오티드 서열의 일반적 카테고리는, 예를 들어 암컷 포유동물의 젖내 재조합 폴리펩티드의 생산; 질병 연구를 위한 동물 모델의 생산; 질병(예, 유선염과 같은 유선의 질병)에 대한 내성이 큰 동물의 생산; 동물의 혈액, 뇨 또는 기타 적합한 체액 또는 조직내 재조합 폴리펩티드의 생산을 포함한다. 뿐만 아니라, 소정의 뉴클레오티드 서열은 연구 개발, 돌연변이유발, 기형발생, 동물 성장, 번식 및 예를 들어 고기/젖 생산을 개선시키기 위해 또는 특정 작물 특징을 부여하기 위해 고안된 유전자 변형의 유효성을 진보시키기 위한 수단으로서 선택할 수 있다.
소정의 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 예로는 젖 단백질을 암호화하는 서열(즉, 락토페린, 리소자임, 분비된 면역글로불린, 락트알부민, 담즙염 자극 리파제 등); 혈청 단백질(즉, 알부민, 면역글로불린, VIII 인자, IX 인자, C 단백질 등); 및 산업적 효소(즉, 프로테아제, 리파제, 키티나제, 및 원핵생물원 및 진핵생물원 유래의 리기나제)를 포함한다. 재조합 DNA 서열은 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 게놈 서열 및 cDNA 서열을 포함한다. 뿐만 아니라, 소정의 뉴클레오티드 서열은 다양한 생리학적 과정에서의 그 역할에 대해 선택할 수 있으며, 이로써 화합물 효능 및 독성을 평가하기 위해 약물 개발에 사용하기 위한 모델 동물 시스템을 생산하는 데 이용할 수 있다(Liggitt 등 (1992) Xenobiotica, 22 (9-10):1043-1054).
특정 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 리보자임을 포함한다. 리보자임은 폴리뉴클레오티드 가닥의 절단 및 결찰을 비롯하여 RNA와 관련된 다양한 반응을 수행하는 리보핵산(RNA)으로 이루어진 효소이다. 리보자임의 특이성은 리보자임의 표적화 도메인과 기질 RNA 사이의 염기쌍 형성(수소 결합)에 의해 결정된다. 표적화 도메인의 뉴클레오티드 서열을 변경시키면 이 특이성을 변화시킬 수 있다. 또한, 리보자임의 촉매 도메인을 변화시켜서 이 효소의 활성 또는 안정성을 증가시킬 수 있다. 리보자임 디자인 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,646,031호; 제5,646,020호; 및 제5,639,655호를 참조할 수 있으며, 이들 특허는 본원에서 참고문헌으로 포함한다.
대안으로, 뉴클레오티드 서열은 안티센스 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이 구체예에서 소정의 뉴클레오티드 서열은 유전적으로 변형된 동물의 표적화 서열에 대한 상보 서열을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 안티센스 서열에 의해 표적화된 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 표적화된 뉴클레오티드 서열은 그 발현이 소정의 표현형과 관련되어 있는 세포 유전자를 포함한다. 안티센스 상호작용이 일어날 표적화된 유전자 내의 위치(들)는 표적화 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 발현을 조절하는 것(전사 또는 번역 수준에서)이 될 것이며, 이로써 형성된 유전적 변형 동물의 표현형을 변경시킨다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로 표적화하기 위한 바람직한 부위는 표적화된 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 번역 개시 또는 종결 코돈을 포함하는 영역을 포함한다. 전사 개시 부위, 즉 "5' 캡 부위" 및 5' 캡 영역(이는 캡핑된 mRNA의 5' 최말단에 약 25∼약 50개의 연속 뉴클레오티드를 포함함) 역시 안티센스 뉴클레오티드 서열의 효과적인 표적이 될 수 있다.
또다른 구체예에서, 유전자 전달 벡터에 포함된 소정의 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이것이 발현될 때는 RNA 간섭을 매개할 수 있는 RNA 분자를 포함한다. "RNA 간섭"이란 표적 유전자와 동일하거나 또는 충분한 서열 동일성의 갖는 RNA의 존재가 표적 유전자로부터 전사된 전령 RNA의 분해를 초래하는 현상을 말한다(Sharp(2001) Genes and Dev. 15:485-490, 본원에서 참고문헌으로 포함함). 이 구체예에서, 바이러스 벡터는 표적 세포와 접촉하게 되고, 이 표적 세포(또는 유기체)는 간섭 RNA의 발현을 허용하여 표적 mRNA의 분해를 초래하는 조건 하에 유지된다.
RNA 간섭을 매개하는 RNA는 RNA 분자(들), RNA 분절(들) 또는 RNA 단편(들)을 포함한다. 이러한 용어는 2본쇄 RNA, 1본쇄 RNA, 분리된 RNA(부분적으로 정제된 RNA, 실질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 또는 재조합에 의해 제조된 RNA)뿐 아니라, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생 RNA와 상이한 변경된 RNA를 포함한다.
이러한 구체예에 사용되는 소정의 뉴클레오티드 서열로부터 발현된 간섭 RNA는 가닥당 2개 이상의 핵산 중합체의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 간섭 RNA를 포함하는 소정의 뉴클레오티드 서열은 2본쇄이고, 가닥당 약 50∼약 40개의 뉴클레오티드 염기, 가닥당 약 40∼약 30 뉴클레오티드 염기 또는 가닥당 약 15∼약 50 뉴클레오티드 염기를 포함한다. "siRNA"란 2본쇄 RNA인 것이 특징이며, 가닥당 30 뉴클레오티드 염기 미만이거나 또는 가닥당 약 10∼약 30 뉴클레오티드, 가닥당 약 15∼약 30 뉴클레오티드 또는 가닥당 약 21∼25 뉴클레오티드 염기인 짧은 간섭 RNA를 말한다. 간섭 RNA 서열 및 표적 서열의 완전한 일치가 존재하지만, 그 일치는 RNA가 표적 mRNA의 RNA 간섭 절단을 유도하기에 충분하여야 한다. RNA 간섭의 분석 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 노던 분석 또는 검출가능한 표현형의 분석을 포함한다. 예를 들어, 미국 출원 공개 공보 2002/0132788 및 미국 출원 공개 공보 2002/0162126을 포함하며, 이들은 본원에서 참고문헌으로 포함한다.
RNA 간섭을 매개하는 RNA의 발현 및 디자인 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Paul 등 (2002) Nature Biotech. 20:505-508, 본원에서 참고문헌으로 포함함]을 참조할 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, siRNA는 세포내 프로세싱 후에 siRNA를 형성하는 폴드-백(fold-back) 스템 루프 구조로서 발현된다. 이러한 siRNA는 표적 세포내에서 siRNA 유사 분자로 세포내 프로세싱된다. 또다른 구체예에서, siRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 표적 세포내에서 개별적으로 전사된다. 이러한 구체예에서, 표적 유전자의 센스 가닥을 포함하는 제1 siRNA가 발현되고, 표적 유전자의 안티센스 가닥을 포함하는 제2 siRNA가 발현된다. 또한, 제1 및 제2 siRNA는 동일하거나 또는 별개의 유전자 전달 벡터 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어 미국 출원 공개 공보 2002/0132788; 미국 출원 공개 공보 2002/0162126 및 미국 출원 공개 공보 2002/0086356을 참조할 수 있으며, 이들 공보는 모두 본원에서 참고문헌으로 포함한다.
당업자라면 간섭 RNA를 발현시키는 데 다양한 프로모터를 사용할 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, Pol III 프로모터의 III형 클래스, 예컨대 U6 또는 H1 프로모터가 성공적인 것으로 입증되었다. 예를 들어, 문헌 [Tuschl (2002) Nature Biotech. 20:446-448; Miyagishi 및 Taira (2002) Nature Biotech. 19:497-500; Paule 및 White (2000) Nucleic Acid Res. 28:1283-1298]을 참조할 수 있으며, 이들 모두는 본원에서 참고문헌으로 포함한다. 다른 프로모터, 예컨대 Pol II 프로모터(예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터) 역시 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Xia 등 (2002) Nature Biotechnology 20:1006-1010]을 참조할 수 있으며, 이는 본원에서 참고문헌으로 포함한다. 또한 당업자라면, 폴리아데닐화 시그널 역시 간섭 RNA의 발현을 개선시키기 위해 추가할 수 있음을 알 것이다.
또한, 간섭 RNA는 표적 유전자의 발현을 (부분적으로 또는 완전히) 감소시키는 방법으로서 이용될 수 있는 것으로 이해된다. 유전자 발현을 감소시키는 이러한 방법은 치료 목적으로 이용될 수 있거나 또는 연구 목적으로(예를 들어, 질병 상태의 모델을 생성하기 위한 목적, 유전자의 기능을 조사하기 위한 목적, 제제가 유전자에 작용하는지를 평가하기 위한 목적, 약물 개발을 위한 표적을 확인하기 위한 목적 등) 사용될 수 있다. 유전자 기능을 제거하는 예에서는, 형성된 세포 또는 유기체를 "넉아웃" 또는 "넉다운"이라 칭할 수 있다. 또한, 다수의 질병은 특정 유전자 또는 유전자 그룹의 비정상적 발현으로부터 발생한다. RAN 간섭은 유전자의 발현을 억제하는 데 이용될 수 있으며, 이로써 질병의 증상을 경감시키거나 치유할 수 있다.
소정의 뉴클레오티드 서열은 DNA 구조물 내에 포함된다. 특정 구체예에서, DNA 구조물은 표적 세포 내에서의 소정의 뉴클레오티드 서열의 발현에 필요한 구성요소 전부를 포함한다. 따라서, 렌티바이러스 벡터의 변형된 프로바이러스 게놈 내에 포함된 소정의 뉴클레오티드 서열은, 바이러스 입자를 통해 표적 세포로 도입될 때 발현될 수 있다.
"기능적으로 결합된"이란, 소정의 뉴클레오티드 서열의 발현이 5' 및 3' 조절 서열의 조절 제어 하에 일어나도록 개개의 뉴클레오티드 서열이 결합되는 것을 말한다. 소정의 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드를 암호할 경우, "기능적으로 결합된"이란 암호화 서열의 발현이 적절한 리딩 프레임 내에서 일어나도록 하는 뉴클레오티드 서열의 결합을 포함한다. 유전자 전달 벡터는 프로모터에 기능적으로 결합된 소정의 하나 이상의 추가적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 소정의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 구조물은 전사의 5'-3' 방향, 전사 및 번역 개시 영역, 소정의 뉴클레오티드 서열 및 표적화된 숙주 세포(즉, 유전적으로 변형된 동물의 세포)에서의 전사 및 번역 종결 영역을 포함할 수 있다. 전사 개시 영역, 프로모터는 표적 세포 고유의 것이거나 외래의 것일 수 있다. 또한, 프로모터는 천연 서열일 수 있거나, 또는 합성 서열일 수 있다. "외래"란 전사 개시 영역이 렌티바이러스 벡터가 도입된 표적 세포 내에서는 발견되지 않음을 의미한다. 이종성 프로모터를 사용하여 서열을 발현시키는 것이 바람직할 수 있지만, 천연 프로모터 서열을 사용할 수도 있다. 종결 영역은 전사 개시 영역 고유의 것일 수도 있고 다른 공급원에서 유래된 것일 수도 있다.
프로모터가 표적 세포 내에서 유효하다면 어떠한 프로모터도 소정의 뉴클레오티드 서열에 기능적으로 결합시킬 수 있다. 이러한 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있다(즉, 베타 액틴 프로모터(Balling 등 (1989) Cell 58:337-347 및 Beddington 등 (1989) Development 105:733-737, 메탈로티오네인 프로모터(Palmiter 등 (1983) Science 222:809-814 및 Iwamoto 등(1991) EMBO J. 10:3167-3175, HMGCR 프로모터(Mehtali 등 (1990) Gene 91:179-184 및 Tam 등 (1992) Development 115:703-715, 및 히스톤 H4 프로모터(Choi 등 (1991) Mol. Cell. Biol. 11:3070-3074). 추가적인 프로모터 또는 인핸서 구성요소는, 예를 들어 진핵생물 프로모터 데이타 베이스 및 본원에서 참고문헌으로 포함하는 미국 특허 제6,271,436호에서 찾아볼 수 있다.
또는, 프로모터는 조건에 따라 유효할 수 있다. "조건적" 프로모터란 프로모터가 특이적으로 활성화될 때까지 휴지 상태라는 것(또는 감소된 발현을 나타냄)을 의미한다. 이 프로모터는 실험적 조작, 예컨대 약물 또는 기타 활성화제의 투여에 의해 활성화할 수 있거나, 또는 특정 발생 단계에서 또는 특정 조직 내에서 활성화할 수 있다.
발생 단계에서 조절되는 조건적 프로모터는, 예를 들어 포스포글리세레이트 키나제(Pgk) 프로모터 및 옥타머 결합 전사 인자 4(Oct-4)를 포함하는 미분화 세포에서 유효하다.
"조직 차등 프로모터"는 선택된 조직 또는 세포 유형에서만 실질적으로 발현되며, 다만 다른 조직 및/또는 세포 유형에서의 부수적 발현은, 유전적으로 변형된 동물에서 그러한 조직 또는 세포 유형에서의 발현이 동물에게 유해하지 않다면 허용된다. 조직 차등 프로모터는 젖에서의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하며, 비제한적 예로 유선 조직에서의 발현을 유도하는 유장 산 프로모터(유럽 특허 공보 제0 264 166호 및 PCT 공보 W088/00239), 알파 락트알부민 프로모터(PCT 공보 WO88/01648), 래트 베타 카세인 프로모터(유럽 특허 공보 제0 279 582호) 및 소 카세인 프로모터(PCT 공보 W088/10118)를 들 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,741,957호를 참조하라. 상기 각 문헌은 본원에서 참고문헌으로 포함한다.
또한, 소정의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 구조물은 소정의 뉴클레오티드 서열 및/또는 형성된 유전자 생성물의 발현, 안정화 및/또는 국소화를 촉진하는 다양한 서열들을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 서열은 인핸서, 인트론 및 전사 후 구성요소, 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 전사후 영역(WPRE) 또는 PPT-CTS 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Zufferey 등 (1999) J. Virol. 73:2886-2892] 및 2000년 11월 10일자 미국 특허 출원 제09/709,751호를 참조할 수 있으며, 이들은 모두 본원에서 참고문헌으로 포함한다. 또다른 구체예에서, 소정의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 구조물은 정제 또는 표지화를 위한 친화성 태그(예, 항체 사용)를 추가로 포함한다.
대안으로, 소정의 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열이 없는 DNA 구조물 내에 포함될 수 있다. 이 구체예에서, 소정의 뉴클레오티드 서열은 표적 세포의 내생 프로모터의 5'에 서열을 통합시킨 후 발현된다. 당업자라면 바람직한 방식으로 소정의 뉴클레오티드 서열을 발현하는(즉, 바람직한 발생 단계, 조직 또는 수준에서의 발현) 확인된 동물에 대하여 소정의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 기반(founder) 동물을 쉽게 스크리닝할 수 있다.
렌티바이러스 벡터의 프로바이러스 게놈은 프로모터에 기능적으로 결합된 선별 마커를 포함하는 하나 이상의 DNA 구조물을 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 비제한적으로 루시퍼라제(Lira 등 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:7215-7219 및 Lee 등 (1992) J. Biol. Chem. 267:15875-15885), β-gal(Goring 등 (1987) Science 235:456-458), GFP, 클로람페니콜 트랜스퍼라제(CAT)(Overbeek 등 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:7815-7819), 및 인간 성장 호르몬(hGH)(Pinkert 등 (1987) Genes Dev. 1:268-276)을 포함한다. 당업자라면 다수의 가능성이 존재함을 알 것이다.
당업자라면 적절한 선별 마커를 사용할 수 있음을 알 것이다. 예를 들어,lacZ는 전체 배가 염색될 수 있는 동물 내에서의 조직 또는 위치 특이적 유전자 발현의 연구에 특히 유용하다. CAT 및 루시퍼라제는 민감하고 정량적이지만, 이들 마커로는 발현의 공간적 패턴을 시각적으로 검출할 수 없다. 인간 성장 호르몬은 검출이 용이하며, 공간적 위치 파악 및 정량 둘 다에 유용하다.
DNA 구조물을 제조하는 데 있어서, 다양한 DNA 단편들을 조작하여 적절한 배향으로, 적당하게 적절한 리딩 프레임 내로 DNA 서열을 제공할 수 있다. 이를 위하여, 어댑터 또는 링커를 DNA 단편에 결합시킬 수 있다. 이를 위해, 시험관내 돌연변이유발, 프라이머 수복, 제한, 어닐링, 재치환, 예를 들어 트랜지션 및 트랜스버젼이 이용될 수 있다.
실시예 1: 렌티바이러스 벡터와 플라스마 막을 접촉시킴으로써 유전적 변형 마우스를 제조하는 방법
A. 트랜스-렌티 바이러스 벡터
플라스미드:
pPCW-eGFP 유전자 전달 벡터를 작제하기 위하여, EGFP cDNA(pEGFP-Cl 유래, 클론텍)를 포함하는 PCR 증폭 DNA 단편을 pHR-CMV-LacZ 플라스미드(Naldini 등 (1996) Science 272:263-7)의 BamHI/XhoI 부위에 결찰시켜서 pHR-CMV-eGFP를 생성하였다. 그 후, 중앙 폴리퓨린 트랙트(PPT) 및 중앙 말단 부위(CTS)를 포함하는 150 bp DNA 서열(배좌 4327-4483)를 HIV-1 pSG3 분자 클론(Ghosh 등 (1993) Virology 194:858-864)으로부터 PCR 증폭시키고, pHR-CMV-eGFP의 특유의 ClaI 부위로 결찰시켰다. eGFP 발현을 증가시키기 위해(Zufferey 등 (1999) J. Virol. 7: 2886), 우드척 간염 바이러스(WPRE) 유래의 전사후 조절자 구성요소를 eGFP의 하류에 삽입하여 pPCW-eGFP 유전자 전달 벡터를 형성하였다. 이 구조물은 하기 표 2에 제시된 세포 실험에 사용하였으며, 단, Fisher 334(a) 및 Fisher 344(b) 래트 경우에는 예외이다.
하기 표 2에 Fisher 334(a)로 명명되는 형질전환 동물은 pgk-eGFP 유전자 전달 벡터를 사용하여 생성하였다. 이 구조물은 전술한 pPCM-eGFP 유전자 전달 벡터와 동일하며, 단, CMV 프로모터 대신에 포스포글리세레이트 키나제 프로모터(pgk)를 사용하였다.
표 2에 Fisher 344(b)로 명명되는 형질전환 동물은 EFl알파-APP-eGFP 유전자 전달 벡터를 사용하여 생성하였다. 이 구조물은 IRES를 통해 GFP에 결합된 알츠하이머 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 돌연변이 형태를 나타낸다.
벡터 스톡의 제조:
트랜스-렌티 바이러스 벡터는 이전에 개시된 특유의 안전성 특징을 갖는 HIV계 벡터를 나타낸다(Wu 등 (2000) Mol. Therapy 2:47-55). 요약하면, 복제 적격 레트로바이러스(RCR)를 생성하는 위험을 감소시키기 위하여, RT 및 IN을 Gag-Pol로부터 분리하고, HIV-1 비리온 관련 단백질 Vpr과의 융합 파트너로서 트랜스 방식으로 이를 전달하는 TranzVectorTM(Tranzyme, Inc., Birmingham AL) 렌티바이러스 패키징 시스템을 사용하여 벡터 스톡을 제조하였다. 따라서, pCMV-gag-pro 패키징 플라스미드 3 ㎍, pCMV-vpr-RT-IN 트랜스-효소 플라스미드 1.0 ㎍, pMD.G(VSVG) 발현 플라스미드 1.5 ㎍, 및 유전자 전달(pPCW-eGFP) 플라스미드 3 ㎍으로 인산칼슘 DNA 침전법을 이용하여 293T 세포의 부분융합 단층 배양물을 형질감염시킴으로서 트랜스-렌티바이러스 벡터 스톡을 제조하였다. 60 시간 후 상청액을 회수하고, 저속 원심분리(1000 g, 10분)로 투명하게 만든 후, 소공 크기 0.45 ㎛의 필터를 통해 여과하였다. 원심분리에 의해 벡터 입자를 농축시켰다(Beckman SW28 로커, 23,000 rpm, 2 시간). 벡터 역가를 측정하기 위해, 0.2, 0.04, 0.008, 0.0016, 0.00032, 및 0.000064 ㎕의 상청액 스톡을 사용하여 HeLa 세포를 감염시키고, 2일 후 형광 현미경을 사용하여 GFP-양성(녹색) 세포 콜로니를 계측하였다. 각 GFP-양성 세포 콜로니를 단일 형질도입 단위(TU)로서 측정하였다. 사용된 정제된 바이러스의 역가는 2.9 x 109TU/ml였다. 바이러스 분액을 사용시까지 -80℃에 보관하였다.
B. 수정된 마우스 난모세포의 분리 및 메세주입 및 착상전 배의 전달
암컷 마우스에 마우스 1 마리당 50 IU로 PMS(FSH = 난포 자극 호르몬을 함유하는 임신 자성 혈청)를 복강 주사(i.p.)하여 과배란을 유도하였다. 46∼48 시간 후 HCG(인간 성선 자극 호르몬)을 마우스 1 마리당 3.75 IU으로 복강 주사하고, 교잡시켰다.
다음 날, 난관으로부터 수정된 난모세포를 회수하였다. 1% 히알루로니다제를 함유하는 hepes 완충 배 배지 중에서 세척하여 회수된 난모세포를 둘러싸는 적세포를 제거하였다. 적세포를 제거한 후 난모세포를 hepes 완충 배 배지에서 세척하여 잔류 히알루노니다제를 제거하였다. 수정된 난모세포를 파라핀 오일이 적층된 '난할 배양 배지'로 전달하였다. 37.0℃, 7% CO2공기의 함습 항온처리기에서 난모세포를 휴지시켰다. 0.5∼4 시간 후, 난모세포를 hepes 완충 배 배지에서 세척하고, 그 후 파라핀 오일이 적층된 유리 슬라이드 상에 소적 형태로 배치하였다. CMV-eGFP 트랜스유전자 함유 바이러스 입자(109/ml)를 유리 주사 바늘에 장입하고, 난모세포의 위난강(PVS)으로 미세주입하였다. 주입은 400배 확대하여 수행하였다. 난모세포 1개당 대략 100 pl 부피를 주입하였다. 전핵 주입(33% 이하의 난모세포 용해율을 유도함)과 비교하여, PVS 주입에 대한 난모세포 용해율은 약 5% 미만이었다.
성공적으로 주입된 난모세포는 파라핀 오일을 적층한 '난할 배지'에서 37.0℃, 7% CO2공기에서 밤새 배양하였다. 그 다음날, 난모세포는 2개의 세포 배로 발생하였다. 배를 가임신 암컷의 난관에 이식하였다. 19일 후 새끼가 태어났다. 관찰된 임신율은 전핵 주입이 75%인데 비하여 100%였다.
3주령때, 주입에 의해 발생된 새끼를 eGFP 및 CMV 진단 프로브를 사용하여 서든 블롯 분석에 의해 스크리닝하였다. 유전적으로 변형된 새끼의 수득 비율은 전핵 주입을 이용한 경우 1% 이상 20% 이하인데 비하여 65%였다. 표 2는 본 발명의 결과를 요약한 것이다.
도 3은 본 발명 방법 및 조성물이 각 기반 동물로부터 개개의 계통을 생성하는 능력을 보유함을 입증하는 증거를 제시한다. 도 3A는 야생형 마우스(BALB/cJ)에 교잡된 제1 eGFP 형질전환 기반 마우스 117_040 중 하나의 새끼(A 세대)의 꼬리끝으로부터 얻은 게놈 DNA를 보여준다. 이 게놈 DNA는 BamHI으로 제한 효소 분해하고, 0.8% 아가로스 겔 상에서 전개하고(상단 이미지), 표준 프로토콜을 이용하여 서던 블로팅을 수행하였다. 겔 상의 양성 대조군은 AsnI, StuI 및 Alw441로 제한 효소 분해하고, 이중 겔 정제를 실시한 PeGFP-C2(Clontech)이다.
도 3B는 Eco47III 및 EcoRI로 분해하고(∼750 bp) 이중 겔 정제한 PeGFP-C2(클론텍)으로부터 분리하고32P 표지한 eGFP로 프로빙한 후의 서든 블롯 결과를 제공한다. 서든 이미지에서 관찰되는 새끼의 상이한 분리 패턴의 수는 이 기법이 각 기반 동물로부터 개개의 계통을 생성시키는 능력을 보유함을 입증한다. 이 경우, 대략 12개의 상이한 독립적인 통합 패턴이 존재한다.
서든 블롯 방사성 사진(도 3B) 위의 화살표는 일반적인 밴딩 패턴을 보여주며, 따라서 꼬리 생검에서 eGFP를 발현하는 마우스의 이종 유전자 통합을 보여준다. 도 3B에 표시된 별표는 꼬리를 생검하여(고정 및 염색하지 않음) eGFP 형광에 대하여 공초점 현미경(BioRad Viewscan DVC 250 저 레이저 파워, 4x 대물렌즈 하의 488 nm 레이저 선)으로 분석한 마우스를 나타낸다. 도 3C에 제시된 이미지는 명확한 형광을 나타내는 공초점 이미지이다. 공초점 이미지에 대한 음성 대조군은 음성 한 배 새끼 유전형 A 세대 마우스였다.
| 마우스 및 래트 품종에서의 Tranz Vector 유전자 도입의 효율 | ||||||||
| 종 | 품종[1] | 주입[2] | 이식[2] | 새끼[4] | 새끼/트랜스[5] | 유전자형별[6] | tg 새끼[7] | tg/geno[8] |
| 마우스 | (FVB/nxBALB/cJ)F1 | 66 | 63 | 40 | 63.49% | 29 | 17 | 58.62% |
| BALB/cJ | 292 | 192 | 14 | 7.29% | 14 | 8 | 57.14% | |
| C57BL/6 | 315 | 265 | 47 | 17.74% | 46 | 22 | 47.83% | |
| FVB | 272 | 194 | 34 | 17.53% | 34 | 25 | 73.53% | |
| NOD/Lt | 266 | 218 | 40 | 18.35% | 37 | 21 | 56.76% | |
| C3H/HeJ | 195 | 187 | 45 | 24.06% | 44 | 24 | 54.55% | |
| [9] 총 마우스 | 1406 | 1119 | 220 | 19.66% | 204 | 117 | 57.35% | |
| 래트 | SD | 143 | 167 | 28 | 16.77% | 16 | 6 | 37.50% |
| Wistar | 290 | 250 | 76 | 30.40% | 71 | 53 | 74.65% | |
| Fisher 344(a) | 302 | 245 | 27 | 11.02% | 26 | 19 | 70.37% | |
| Fisher 344(b) | 82 | 81 | 15 | 18.50% | 15 | 4 | 70.37% | |
| [10] 총 래트 | 817 | 743 | 146 | 19.17% | 128 | 82 | 52.30% | |
| [11] 총 | 2223 | 1862 | 366 | 19.42% | 332 | 199 | 54.82% | |
| [1] 배 공여체로서 사용된 마우스 또는 래트 품종;[2] Tranz Vector 입자에 의해 위난강으로 주입된 수정된 난의 수;[3] 가임신 대리모 마우스 또는 래트에게 이식된 배의 수;[4] 대리모 동물로부터 잉태 말기에 태어난 새끼의 수;[5] 이식된 유전자 조작 배 1개당 태어난 새끼의 백분율;[6] 서든 블롯 분석을 이용하여 후에 유전자 형별을 실시한 출생 새끼의 수;[7] 확인된 형질전환 동물의 수;[8] 유전자 형별된 동물 1마리당 형질전환 동물의 백분율;[9] 마우스 실험에 대한 요약 데이터;[10] 래트 실험에 대한 요약 데이터;[11] 마우스와 래트를 합한 총 효율. |
본원에서 언급한 모든 공보 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 분야의 당업자의 기술 수준을 나타낸다. 모든 공보 및 특허 출원은 그 개개의 공보 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고문헌으로 포함되는 것과 동일한 정도로 본원에서 참고문헌으로 포함한다.
전술한 발명은 이해를 분명히 하기 위한 목적으로 예시 및 실시예를 통해 어느 정도 상세히 기술하였으나 첨부된 구체예의 범위 내에서 특정 변화 및 변형이 이루어질 수 있음은 명백하다.
Claims (43)
- a) 원형질막을 보유하는 분리된 초기 단계의 배를 제공하는 단계; 및b) 상기 원형질막과, 목적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 최소의 제1 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 목적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 척추동물의 게놈에 통합시키는 방법.
- 제1항에 있어서, a) 상기 분리된 초기 단계 배는 투명대를 추가로 포함하고, 상기 투명대와 상기 원형질막은 난황주위공간을 한정하며, b) 상기 원형질막을 접촉시키는 단계는 상기 조성물을 상기 난황주위공간에 도입시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 초기 단계 배는 수정된 난모세포인 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 초기 단계 배는 2-세포기 배, 4-세포기 배, 8-세포기 배 및 상실배로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 제1 렌티바이러스 벡터를 포함하는 상기 조성물은 미세주입법에 의하여 난황주위공간에 도입되는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 목적으로 하는 제1 뉴클레오티드 서열은 수정된 난모세포의 게놈에 통합되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 목적으로 하는 제1 뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍증 바이러스 및 유인원 면역결핍증 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스로부터 유래되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 렌티바이러스 벡터는 트랜스-바이러스 벡터(trans-viral vector)인 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 트랜스-바이러스 백터는 트랜스-렌티바이러스 벡터(trans-lentiviral vector) 또는 트랜스-레트로바이러스 벡터(trans-retinoviral vector)인 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 척추동물은 마우스, 토끼, 양, 소, 조류 및 래트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 목적으로 하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 렌티바이러스 벡터를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 제1 및 제2 렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍증 바이러스 및 유인원 면역결핍증 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래되는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 제1 및 제2 렌티바이러스 벡터는 트랜스-바이러스 벡터인 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 트랜스-바이러스 벡터는 트랜스-렌티바이러스 벡터 또는 트랜스-레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 착상전 배를 형성할 수 있는 조건하에서 초기 단계 배를 배양하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 방법은 상기 착상전 배를 수용체 척추동물에 운반하는 단계 및 상기 착상전 배를 하나 이상의 척추동물로 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, a) 상기 초기 단계 배는 투명대를 추가로 포함하고, 상기 투명대와 상기 원형질막은 난황주위공간을 한정하며, b) 상기 원형질막을 접촉시키는 단계는 목적으로 하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 최소의 제1 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 상기 난황주위공간에 도입시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 초기 단계 배는 수정된 난모세포인 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 초기 단계 배는 2-세포기 배, 4-세포기 배, 8-세포기 배 및 상실배인 것인 방법
- 제18항에 있어서, 상기 방법은 상기 착상전 배를 수용체 척추동물에 운반하는 단계 및 상기 착상전 배를 하나 이상의 유전자 변형된 척추동물로 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 제1 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 미세주입법에 의하여 난황주위공간에 도입시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 목적으로 하는 제1 뉴클레오티드 서열을 수정된 난모세포의 게놈에 통합시키는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 조성물은 목적으로 하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 렌티바이러스 벡터를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 방법은 상기 착상전 배를 수용체 척추동물에 운반하는 단계 및 상기 착상전 배를 하나 이상의 유전자 변형된 척추동물로 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 분리된 초기 단계 배와 목적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 렌티바이러스 벡터를 유효농도로 포함하는 조성물로서, 상기 초기 단계 배는 인간을 제외한 척추동물로부터 유래되는 것인 조성물.
- 제26항에 있어서, 상기 초기 단계 배는 수정된 난모세포인 것인 조성물.
- 제26항에 있어서, 상기 초기 단계 배는 2-세포기 배, 4-세포기 배, 8-세포기 배 또는 상실배인 것인 조성물.
- 제26항에 있어서,a) 상기 분리된 초기 단계의 배는 투명대를 추가로 포함하며, 상기 투명대및 상기 원형질막은 난황주위공간을 한정하고;b) 상기 렌티바이러스 벡터는 난황주위공간에 존재하는 것인 조성물.
- 제29항에 있어서, 상기 목적으로 하는 제1 뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 것인 조성물.
- 제26항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍증 바이러스 및 유인원 면역결핍증 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래되는 것인 조성물.
- 제26항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터는 트랜스-바이러스 벡터인 것인 조성물.
- 제32항에 있어서, 상기 트랜스-바이러스 벡터는 트랜스-렌티바이러스 벡터 또는 트랜스-레트로바이러스 벡터인 것인 조성물.
- 제26항에 있어서, 상기 인간을 제외한 척추동물은 마우스, 토끼, 양, 소, 조류 및 래트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제26항에 있어서, 상기 조성물은 목적으로 하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유효농도의 제2 렌티바이러스 벡터를 추가로 포함하는 것인 조성물.
- a) 원형질막을 보유하는 분리된 난모세포를 제공하는 단계; 및b) 상기 원형질막을 목적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 최소의 제1 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 목적 뉴클레오티드 서열을 척추동물의 게놈에 통합시키는 방법.
- 제36항에 있어서,a) 상기 분리된 난모세포는 투명대를 추가로 포함하며, 상기 투명대 및 상기 원형질막은 난황주위공간을 한정하고;b) 상기 원형질막을 접촉시키는 단계는 상기 난황주위공간에 상기 조성물을 도입시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 분리된 난모세포 및 목적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 최소의 제1 렌티바이러스 벡터를 유효농도로 포함하는 것인 조성물로서, 상기 난모세포는 척추동물로부터 유래되는 것인 조성물.
- 제38항에 있어서,a) 상기 분리된 난모세포는 투명대를 추가로 포함하며, 상기 투명대 및 상기원형질막은 난황주위공간을 한정하고;b) 상기 렌티바이러스 벡터는 난황주위공간에 존재하는 것인 조성물.
- a) 원형질막을 보유하는 분리된 포배를 제공하는 단계; 및b) 상기 원형질막과, 목적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 최소의 제1 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 목적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 척추동물의 게놈에 통합시키는 것인 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍증 바이러스 및 유인원 면역결핍증 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스로부터 유래되는 것인 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터는 트랜스-바이러스 벡터인 것인 방법.
- 분리된 포배 및 목적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 최소의 제1 렌티바이러스 벡터를 유효 농도로 포함하는 조성물로서, 상기 포배는 인간을 제외한 척추동물로부터 유래되는 것인 조성물.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US34484101P | 2001-12-21 | 2001-12-21 | |
| US60/344,841 | 2001-12-21 | ||
| US39847602P | 2002-07-25 | 2002-07-25 | |
| US60/398,476 | 2002-07-25 | ||
| PCT/US2002/041020 WO2003059923A2 (en) | 2001-12-21 | 2002-12-19 | Methods and compositions for generating a genetically modified animal using lentiviral vectors |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20040089096A true KR20040089096A (ko) | 2004-10-20 |
Family
ID=26994121
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR10-2004-7009817A KR20040089096A (ko) | 2001-12-21 | 2002-12-19 | 렌티바이러스 벡터를 이용한 유전자 변형된 동물을제조하기 위한 방법 및 조성물 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20030167500A1 (ko) |
| EP (1) | EP1465981A4 (ko) |
| JP (1) | JP2005538685A (ko) |
| KR (1) | KR20040089096A (ko) |
| CN (1) | CN1633495A (ko) |
| AU (1) | AU2002367024A1 (ko) |
| CA (1) | CA2470527A1 (ko) |
| WO (1) | WO2003059923A2 (ko) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1734811A4 (en) | 2003-11-21 | 2009-03-25 | Revivicor Inc | USE OF INTERFERENCE RNA IN TRANSGENIC ANIMAL PRODUCTION |
| US7732180B2 (en) | 2004-05-07 | 2010-06-08 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Porcine Forssman synthetase protein, cDNA, genomic organization, and regulatory region |
| EP2573185A3 (en) * | 2005-02-16 | 2013-06-05 | Lentigen Corporation | Lentiviral vectors and their use |
| WO2007035213A2 (en) | 2005-08-09 | 2007-03-29 | Revivicor, Inc. | Transgenic ungulates expressing ctla4-ig and uses thereof |
| GB0702694D0 (en) * | 2007-02-12 | 2007-03-21 | Ark Therapeutics Ltd | Vectors |
| JP5374389B2 (ja) * | 2008-01-29 | 2013-12-25 | 公益財団法人実験動物中央研究所 | 霊長類動物の初期胚への外来遺伝子導入法及び該導入法を含むトランスジェニック霊長類動物を作出する方法 |
| CN101717788B (zh) * | 2009-11-10 | 2012-06-20 | 中国农业大学 | 慢病毒感染胚胎的方法 |
| CA2827348C (en) | 2011-02-14 | 2021-02-23 | Revivicor, Inc. | Genetically modified pigs for xenotransplantation of vascularized xenografts and derivatives thereof |
| WO2017214937A1 (zh) * | 2016-06-16 | 2017-12-21 | 毛侃琅 | 一种促进 app 基因表达的慢病毒表达载体及其应用 |
| US10828330B2 (en) | 2017-02-22 | 2020-11-10 | IO Bioscience, Inc. | Nucleic acid constructs comprising gene editing multi-sites and uses thereof |
| EP4247151A1 (en) | 2020-11-20 | 2023-09-27 | Revivicor Inc. | Multi-transgenic pigs with growth hormone receptor knockout for xenotransplantation |
| KR20240099180A (ko) | 2021-09-20 | 2024-06-28 | 레비비코르 인코포레이션 | 이종이식을 위한 10개의 유전자 변형을 포함하는 다중전이유전자 돼지 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5633076A (en) * | 1989-12-01 | 1997-05-27 | Pharming Bv | Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo |
| WO1996032494A1 (en) * | 1995-04-14 | 1996-10-17 | University Of Alabama Research Foundation | Fusion protein delivery system and uses thereof |
| AU4984697A (en) * | 1996-10-11 | 1998-05-11 | The Texas A & M University System | Methods for the generation of primordial germ cells and transgenic animal species |
| US6080912A (en) * | 1997-03-20 | 2000-06-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods for creating transgenic animals |
| US6207455B1 (en) * | 1997-05-01 | 2001-03-27 | Lung-Ji Chang | Lentiviral vectors |
| EP1030929B1 (en) * | 1997-11-14 | 2009-03-18 | Cedars-Sinai Medical Center | Transfection and transfer of non-human male germ cells for generation of transgenic non-human mammals |
| US6555342B1 (en) * | 1998-06-03 | 2003-04-29 | Uab Research Foundation | Fusion protein delivery system and uses thereof |
| US6313373B1 (en) * | 1998-10-30 | 2001-11-06 | Case Western Reserve University | Tissue specific promoters and transgenic mouse for the screening of pharmaceuticals |
-
2002
- 2002-12-19 KR KR10-2004-7009817A patent/KR20040089096A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-12-19 CA CA002470527A patent/CA2470527A1/en not_active Abandoned
- 2002-12-19 EP EP02806493A patent/EP1465981A4/en not_active Withdrawn
- 2002-12-19 AU AU2002367024A patent/AU2002367024A1/en not_active Abandoned
- 2002-12-19 WO PCT/US2002/041020 patent/WO2003059923A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-12-19 CN CNA028282469A patent/CN1633495A/zh active Pending
- 2002-12-19 JP JP2003560026A patent/JP2005538685A/ja active Pending
- 2002-12-19 US US10/325,459 patent/US20030167500A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20030167500A1 (en) | 2003-09-04 |
| WO2003059923A3 (en) | 2003-10-30 |
| CN1633495A (zh) | 2005-06-29 |
| EP1465981A4 (en) | 2006-04-12 |
| AU2002367024A1 (en) | 2003-07-30 |
| WO2003059923A2 (en) | 2003-07-24 |
| EP1465981A2 (en) | 2004-10-13 |
| CA2470527A1 (en) | 2003-07-24 |
| JP2005538685A (ja) | 2005-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2002353231B2 (en) | Method for producing a transgenic organism using a lentiviral expression vector such as EIAV | |
| AU2002336517B2 (en) | Method for producing transgenic animals | |
| Park | Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis? | |
| Wongsrikeao et al. | Antiviral restriction factor transgenesis in the domestic cat | |
| US20040234504A1 (en) | Methods of inhibiting gene expression by RNA interference | |
| AU2002330022A1 (en) | Method for producing transgenic birds and fish | |
| AU2002336517A1 (en) | Method for producing transgenic animals | |
| KR20040089096A (ko) | 렌티바이러스 벡터를 이용한 유전자 변형된 동물을제조하기 위한 방법 및 조성물 | |
| JP2006512062A (ja) | トランスジェニック鳥類におけるタンパク質産生 | |
| Chandrashekran et al. | Efficient generation of transgenic mice by lentivirus‐mediated modification of spermatozoa | |
| JP5020083B2 (ja) | 栄養外胚葉細胞特異的遺伝子導入法 | |
| WO2002047475A1 (fr) | Procede de creation efficace d'oiseaux transgeniques et oiseaux transgeniques ainsi obtenus | |
| Nakagawa et al. | Generation of lentiviral transgenic rats expressing glutamate receptor interacting protein 1 (GRIP1) in brain, spinal cord and testis | |
| JP2014103900A (ja) | 神経変性疾患関連タンパク質を神経細胞内で可視化したモデル動物 | |
| US20060265773A1 (en) | Methods for producing transgenic animals with modified disease resistance | |
| Heo et al. | Germ-line transmission of pseudotyped retroviral vector in chicken | |
| JP2011254701A (ja) | 目的遺伝子を脳で小脳プルキンエ細胞、脳幹および嗅球特異的に過剰発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物 | |
| CA2419505A1 (en) | Use of a transgene encoding a vertebrate phytase to increase capacity to utilize phytic acid in livestock feed | |
| WO2005102039A1 (ja) | ヒトレトロウイルス感受性トランスジェニック非ヒト動物細胞およびヒトレトロウイルス感受性トランスジェニック非ヒト動物モデル | |
| KR20140091119A (ko) | 난모세포에 렌티바이러스 벡터를 주입하는 방법을 이용한 형질전환동물의 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |