JP2002176880A

JP2002176880A - 効率的な遺伝子導入鳥類の作製法及びそれによって得られる遺伝子導入鳥類

Info

Publication number: JP2002176880A
Application number: JP2000377549A
Authority: JP
Inventors: Shinji Iijima; 信司飯島; Masamichi Kamihira; 正道上平; Kenichi Nishijima; 謙一西島; Shinji Mizuarai; 慎司水洗; Kenichiro Ono; 健一郎小野
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2000-12-12
Filing date: 2000-12-12
Publication date: 2002-06-25
Also published as: US20050022260A1; AU2001277699A1; WO2002047475A1

Abstract

(57)【要約】【課題】目的とする遺伝子又は遺伝子配列を極めて高
い効率で生殖細胞に有し、子孫へ伝播するＧ_０トランス
ジェニックキメラ鳥類及びそれらの作製法、並びに、目
的とする遺伝子又は遺伝子配列を体細胞及び生殖細胞に
有するトランスジェニック鳥類及びそれらの作製法を提
供する。【解決手段】複製能欠失型レトロウイルスベクターに
よって遺伝子導入されたＧ_０トランスジェニックキメラ
鳥類であって、導入遺伝子のＧ_１への伝播効率が１０％
以上であるＧ_０トランスジェニックキメラ鳥類。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、目的とする遺伝子
又は遺伝子配列を極めて高い効率で子孫へ伝播するＧ_０
トランスジェニックキメラ鳥類及びそれらの作製法に関
する。本発明は、目的とする遺伝子又は遺伝子配列を極
めて高い効率で生殖細胞に有するＧ_０トランスジェニッ
クキメラ鳥類及びそれらの作製法に関する。また、本発
明は目的とする遺伝子又は遺伝子配列を体細胞及び生殖
細胞に有するトランスジェニック鳥類とその子孫及びそ
れらの作製法に関する。更に、本発明は目的とする遺伝
子又は遺伝子配列を体細胞及び生殖細胞に従来よりも多
くのコピー数で有するトランスジェニック鳥類とその子
孫及びそれらの作製法を提供する。更に本発明は安全性
の高いＧ_０トランスジェニックキメラ鳥類、トランスジ
ェニック鳥類及びその子孫とそれらの作製法を提供す
る。更に、本発明は親鳥類とは異なる遺伝的形質を付与
されたトランスジェニック鳥類及びそれらの作製法を提
供する。更に、本発明は機能が未知の遺伝子を鳥類に導
入し、その遺伝子の機能又は遺伝子にコードされている
タンパク質の機能を解明するためのトランスジェニック
鳥類及びそれらの作製法を提供する。

【０００２】

【従来の技術】トランスジェニック動物は、導入した遺
伝子の機能や発生段階での役割を研究する上で重要であ
る。また、新しい形質を動物に付与し、例えば各種動物
の品種改良又はタンパク質性医薬品の生産など産業的に
も重要である。特にトランスジェニック動物の組織や器
官において有用物質を生産する「動物工場」というアイ
デアは、大量のタンパク質性有用物質を生産することが
できる画期的方法として期待されている。

【０００３】今までに、山羊、ヒツジ、ブタ又は牛など
のトランスジェニック動物の乳汁中に有用物質を分泌生
産させる研究が行われ、実際に乳腺特異的プロモーター
を用いα１−アンチトリプシン、血液凝固因子又は抗体
などの有用物質の乳汁での生産が報告されている。しか
し、大型哺乳類は成長速度が遅いこと、飼育コストが高
いこと、比較的大きな飼育スペースが必要なこと、ま
た、ある種の動物では有用物質の工業的生産に必要な個
体数を確保するために非常に長い期間がかかることなど
の問題点がある。このような問題点を克服するために、
新しい生産システムとしてのトランスジェニック鳥類の
開発が望まれている。

【０００４】家畜として飼育されている鳥類はニワトリ
をはじめ、アヒル、七面鳥、カモ、ダチョウやウズラな
ど多種あるが、特にニワトリは食肉用又は採卵用家畜と
して重要である。

【０００５】トランスジェニック鳥類の作製技術は、例
えばニワトリを例にすると、品種の改良（例えば成長促
進、給餌効率、卵の品質、肉質や肉収量、多産卵、耐病
性、羽毛の質など）及び有用物質（例えば抗原、抗体、
生理活性ペプチド、治療用タンパク質性医薬品）の卵
白、卵黄又はその他の器官での生産への適用が挙げられ
る。

【０００６】鳥類の卵での有用物質の生産は産業上特に
重要な課題である。ニワトリなどの長年にわたり改良さ
れてきた家禽は成長が速く、短期間に個体の増殖が可能
であり、また、毎日１個の卵を産むために連続的な有用
物質の大量生産が可能である。

【０００７】鶏卵の卵黄は約２０％、卵白は約１０％の
タンパク質を含む。卵白中の主要タンパク質であるオボ
アルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、リ
ゾチームはそれぞれ卵白タンパク質の約５４％、１２
％、１２％、３．４％を占めており、こうしたものに代
替する形で有用物質を生産できれば、極めて高い有用物
質の生産性を得ることができる。

【０００８】しかしながら、現在まで鳥類の卵で有用物
質を生産したという報告はない。また、遺伝子的に修飾
された鳥類の改良品種に関する報告例もない。その大き
な理由は、導入した遺伝子を効率的に生殖細胞に保有す
るＧ_０トランスジェニックキメラ鳥類の作製法が確立さ
れていないことである。

【０００９】トランスジェニック鳥類を作製する幾つか
の方法が試みられている。Ｌｏｖｅら（Ｌｏｖｅ，Ｊ．
ら（１９９４）ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ１２，
６０）はニワトリの輸卵管から取り出した卵殻を持たな
い８８個の受精卵の細胞質に、マーカー遺伝子を有する
直鎖状のＤＮＡをマイクロインジェクションし、人工的
環境下で発生、分化させた。８８個の受精卵から７羽が
孵化し、このうちの１羽の雄鳥が導入した遺伝子を生殖
細胞にモザイク状に有し、その個体と交配した雌鳥が産
んだ４１２羽のうち１４羽に導入遺伝子が伝播したと報
告している。しかし、この方法は１つの受精卵を得るの
に１羽の雌鳥を必要とし、得られた遺伝子導入キメラ・
ニワトリの次世代への導入遺伝子の伝播効率は３．４％
と低いものであった。

【００１０】レトロウイルスベクターを用いたトランス
ジェニック鳥類の作製も行われた。レトロウイルスベク
ターを用いた初期のトランスジェニック鳥類の作出は複
製可能なレトロウイルスベクターを用いて試験的に行わ
れた（Ｓａｌｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら（１９８７）Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ１５７，２３５）。複製可能なレトロウイ
ルスベクターによる受精卵又は胚への遺伝子導入によれ
ば、導入されたベクターが細胞から細胞へと感染するた
めに、調製したレトロウイルスベクターのタイターに影
響されずに遺伝子を導入することが可能であるが、複製
可能なレトロウイルスベクター自体の個体への病原性が
否定できないこと、導入した複製可能なレトロウイルス
ベクターから新たな病原性ウイルスが生産される危険性
があること、複製可能なレトロウイルスベクターが導入
された個体から他の個体に感染する可能性があることな
どの重要な欠点があり、産業上利用することは困難であ
る。

【００１１】従って、トランスジェニック鳥類は複製能
欠失型レトロウイルスベクターを用いて作製された。放
卵された直後の鳥類の受精卵は、既に卵割が十数回行わ
れ、胚は約６０，０００の分化した細胞から構成されて
いる。このような胚に複製能欠失型レトロウイルスベク
ターをマイクロインジェクションした場合、一部の細胞
に遺伝子が導入される。この時期の胚（杯盤葉期の胚）
には将来生殖細胞に分化する始原生殖細胞となる細胞が
存在するが、マイクロインジェクションにより生殖細胞
の前駆細胞に遺伝子が導入された胚から孵化した雛は、
その生殖細胞の一部に（モザイク状に）導入遺伝子を保
有することになる。そのような鳥を、本明細書ではＧ_０
トランスジェニックキメラ鳥類又は単にＧ_０と呼ぶ。ま
た、Ｇ_０トランスジェニックキメラ鳥類から非トランス
ジェニック鳥類との自然交配又は人工授精（以下交配と
いう）によって得た子孫をＧ_１鳥類又は単にＧ_１と呼
ぶ。Ｇ_１鳥類のうち、導入遺伝子を持つ個体をＧ_１トラ
ンスジェニック鳥類と呼ぶ。Ｇ_１トランスジェニック鳥
類から非トランスジェニック鳥類との交配によって得た
子孫をＧ_２鳥類又は単にＧ_２と呼ぶ。Ｇ_２鳥類のうち、
導入遺伝子を持つ個体をＧ_２トランスジェニック鳥類と
呼ぶ。また、Ｇ_１トランスジェニック鳥類、Ｇ_２トラン
スジェニック鳥類、それらから交配により得た子孫のう
ち導入遺伝子を持つ個体を総じてトランスジェニック鳥
類と呼ぶ。雌雄のトランスジェニック鳥類やトランスジ
ェニックキメラ鳥類の交配によって得た子孫のうち、導
入遺伝子を持つ個体もトランスジェニック鳥類に含まれ
る。トランスジェニック鳥類の交配によって得られる子
孫は、生殖細胞（精子及び卵子）の生産過程において染
色体の分配又は遺伝子の組み換えがなされ、様々な遺伝
子型を持つ子孫が生まれる。本明細書中、「トランスジ
ェニック鳥類」の子孫とは、そのような様々な遺伝子型
を持つトランスジェニック鳥類を示す。

【００１２】Ｂｏｓｓｅｌｍａｎら（Ｂｏｓｓｅｌｍａ
ｎ，Ｒ．Ａ．ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３，
５３３）は、ネオマイシン耐性遺伝子とヘルペス・シン
プレックス・ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子とを有
する複製能欠失型レティキュロエンドセリオシス・ウイ
ルス（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓｖ
ｉｒｕｓ）を、ニワトリの放卵直後の受精卵（計２，５
５８個）の胚にマイクロインジェクションし、孵化した
雛のうち７６０羽に対し導入遺伝子の有無を検討した結
果、１７３羽が陽性であり、そのうちの雄鳥３３羽の精
子に導入したベクターに由来する遺伝子配列を見いだし
た。このように選択したＧ_０トランスジェニックキメラ
雄鳥４羽と、遺伝子操作をしていない雌鳥とを交配させ
て得たＧ _１ニワトリへの導入遺伝子の伝播効率を調べた
結果、その効率は約２％から８％であったことが報告さ
れている。また、Ｂｏｓｓｅｌｍａｎらは、彼らが作製
した１４羽のＧ_０トランスジェニックキメラ・ニワトリ
の２羽からは、感染性のあるレティキュロエンドセリオ
シス・ウイルスの生成を認めており、彼らの使用したベ
クター・システムが複製能欠失型レトロウイルスベクタ
ー・システムであるにせよ、感染性ウイルスを生成する
危険性があることを示している。

【００１３】Ｖｉｃｋら（Ｖｉｃｋ，Ｌら（１９９３）
Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．ＢＢｉｏｌ．Ｓｃ
ｉ．２５１，１７９）は、放卵後の胚から始原生殖細胞
を分離し、複製能欠失型レトロウイルスベクターで形質
転換し、別の胚に移植する方法によりＧ_０トランスジェ
ニックキメラ・ニワトリを得た。彼らの作製したＧ_０か
らＧ_１への導入遺伝子の伝播効率は、得られたＧ_０個体
によって異なるが、２％又は４％と報告している。

【００１４】Ｓｈｕｍａｎ，Ｒ．Ｍ．の総説（Ｓｈｕｍ
ａｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９１）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉａ
４７，８９７）によると、Ｌｅｅらは複製能欠失型レ
トロウイルスを用いて１羽のＧ_０トランスジェニックキ
メラ・ウズラから１，５９５羽のＧ_１ウズラを得たが、
導入遺伝子が伝播したＧ_１トランスジェニック・ウズラ
はわずか１羽であったと報告している。

【００１５】Ｔｈｏｒａｖａｌら（Ｔｈｏｒａｖａｌ，
Ｐ．ら（１９９５）ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓ．
４，３６９）はネオマイシン耐性遺伝子と大腸菌のβ−
ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子とを持つ複製能欠
失型のエビアン・ロイコシス・ウイルス（Ａｖｉａｎ
ｌｅｕｋｏｓｉｓｖｉｒｕｓ）を用いてニワトリ胚を
形質転換し、１羽のＧ_０トランスジェニックキメラ・ニ
ワトリを得たが、そのニワトリからのＧ_１への導入遺伝
子の伝播効率は２．７％であったと報告している。

【００１６】以上のように、トランスジェニック鳥類は
幾つかのグループによって作出されているが、彼らの方
法によって作製されたＧ_０トランスジェニックキメラ鳥
類から交配によって得られたＧ_１鳥類への導入遺伝子の
伝播効率は低く（１０％未満）、そのために多数のＧ_１
鳥類を誕生させ、それらについて導入遺伝子の有無の検
定を行う必要があり、トランスジェニック鳥類を作製す
る上で大きな障害となっていた。また、Ｇ_０トランスジ
ェニックキメラ鳥類からＧ_１への遺伝子伝播効率が低い
ことは、Ｇ_１トランスジェニック鳥類に伝播導入された
遺伝子のコピー数が少ないことを示しており、有用物質
のトランスジェニック鳥類での生産性を制限する要因と
なっていた。実際、複製能欠失型レトロウイルスベクタ
ーを用いて複数の導入遺伝子のコピーを有するＧ_１トラ
ンスジェニック鳥類の作製は報告されていない。また、
以上のような複製能欠失型レトロウイルスベクターを用
いた場合においても、感染性のあるレトロウイルスがト
ランスジェニック鳥類から生成する危険性を孕んでお
り、産業的に応用する上で大きな障害となっていた。

【００１７】また、鳥類に感染するレトロウイルスベク
ターを用いて作製されたトランスジェニック鳥類に、同
じ又は近縁のレトロウイルスが感染した場合、トランス
ジェニック鳥類に導入されたプロウイルスが感染性ウイ
ルス粒子としてレスキューされる危険性があり、鳥類に
効率良く感染するレトロウイルスに由来するレトロウイ
ルスベクターを用いて作製されたトランスジェニック鳥
類は、産業的に応用する上で大きな障害となっていた。

【００１８】

【発明が解決しようとする課題】トランスジェニック鳥
類を作製するには、鳥類の生殖細胞のゲノム中に目的と
する遺伝子又は遺伝子配列を挿入する必要がある。トラ
ンスジェニック哺乳類の作製技術として行われている受
精卵核へのＤＮＡマイクロインジェクションは、鳥類の
受精卵が極めて大きく、核の位置が不明瞭であり、また
受精卵の採取と取り扱いの困難さのために、トランスジ
ェニック鳥類の作製に一般的に適用されていない。実
際、トランスジェニック哺乳類の作製で通常用いられて
いる技術によるトランスジェニック鳥類の作製は報告さ
れていない。

【００１９】鳥類の生殖細胞のゲノム中に目的遺伝子を
導入するためには、前述のように放卵直後の胚盤葉期の
胚へ複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロイ
ンジェクションすることが行われている。マイクロイン
ジェクションされた胚を孵化させＧ_０トランスジェニッ
クキメラ鳥類を得、更に成長させ、交配によりＧ_１を得
る。Ｇ_０からＧ_１鳥類への導入遺伝子の伝播効率は、Ｇ
_０の有する全生殖細胞中のベクター由来の遺伝子配列を
有する生殖細胞の割合に依存すると考えられる。今まで
に報告されたＧ_０からＧ_１へのベクター由来の遺伝子の
伝播効率は１０％未満であり、多数のＧ_１鳥類の導入遺
伝子の有無を検定する必要があり、トランスジェニック
鳥類を作製する上で大きな障害となっていた。また、今
までに得られたＧ_０からＧ_１への導入遺伝子の伝播効率
が１０％未満と低いことは、Ｇ_１トランスジェニック鳥
類に伝播導入された遺伝子のコピー数が少ないことを示
しており、有用物質のトランスジェニック鳥類での生産
性を制限する要因となっていた。実際、複製能欠失型レ
トロウイルスベクターを用いて、複数の導入遺伝子を有
するＧ_１が得られた例は報告されていない。本発明は、
従来よりも高い導入遺伝子の伝播効率を有するＧ_０トラ
ンスジェニックキメラ鳥類及び複数の導入遺伝子のコピ
ーを有するＧ_１トランスジェニック鳥類を得る方法を開
示する。

【００２０】また、Ｂｏｓｓｅｌｍａｎら（Ｂｏｓｓｅ
ｌｍａｎ，Ｒ．Ａ．ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２
４３，５３３）が報告しているように、レティキュロエ
ンドセリオシス・ウイルスに由来する複製能欠失型レト
ロウイルスベクター・システムを用いた場合において
は、感染性のある自己複製可能なレトロウイルスがＧ_０
から検出されたことが報告されている。本発明は、自己
複製可能なレトロウイルスが生成しないより安全なＧ_０
トランスジェニックキメラ鳥類、トランスジェニック鳥
類及びその子孫を作製する方法を開示する。

【００２１】トランスジェニック鳥類の作製技術は、鳥
類の品種改良法として非常に重要である。本発明は、複
製能欠失型レトロウイルスベクターを用いた鳥類の品種
改良法を開示する。

【００２２】鳥類に感染するレトロウイルスベクターを
用いて作製されたトランスジェニック鳥類に、同じレト
ロウイルス又は近縁のレトロウイルスが感染した場合、
導入されたプロウイルスが感染性ウイルス粒子としてレ
スキューされる危険性がある。本発明は人の遺伝子治療
にも使用されている極めて安全なウイルスであるモロニ
ー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス（ＭｏＭＬＶ）
に由来するレトロウイルスベクターを鳥類に導入する方
法を開示する。

【００２３】

【課題を解決するための手段】レトロウイルスはＲＮＡ
ウイルスで、感染という過程を通しその宿主細胞に入り
込み、逆転写酵素により２本鎖ＤＮＡに変換された後、
ウイルスのｐｏｌに由来するインテグラーゼにより宿主
細胞のゲノム中にインテグレート（挿入）される。イン
テグレートしたレトロウイルスはプロウイルスと呼ばれ
る。プロウイルスは細胞分裂に伴い娘細胞へと伝えられ
る。プロウイルスからはレトロウイルスゲノムＲＮＡが
転写され、そのレトロウイルスゲノムＲＮＡはパッケー
ジングシグナル配列Ψを有し、プロウイルスが持つ２つ
の遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌから生産されるタンパク質群か
ら構成されるウイルス粒子に取り込まれる。レトロウイ
ルスゲノムＲＮＡを含むウイルス粒子は、同じくプロウ
イルスが持つｅｎｖ遺伝子から転写、翻訳された膜タン
パク質を含む宿主細胞膜に包み込まれ、細胞から放出さ
れ感染性のあるレトロウイルスが再生産される。

【００２４】このようなレトロウイルスの生活環を利用
したレトロウイルスベクターが１９８０年代から開発さ
れてきた。レトロウイルスベクターは複製可能なレトロ
ウイルスベクターと複製能欠失型レトロウイルスベクタ
ーに大別される。

【００２５】複製可能なレトロウイルスベクターには、
ウイルス粒子の複製に必要な３種の機能的な遺伝子ｇａ
ｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖが含まれている。複製可能なレトロ
ウイルスベクターは、それが導入された動物個体から感
染性のウイルス粒子を生産し、他の生物に感染させる危
険性があるために、産業上有用なトランスジェニック動
物を作製するには適切でない。

【００２６】複製能欠失型レトロウイルスベクターは、
ウイルス粒子の複製に必要な３種の機能的な遺伝子（ｇ
ａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）のうち、何れか又は全てを持た
ないか又は機能しない。従って、一度標的細胞に感染し
た後は、標的細胞は新たな感染性ウイルス粒子を生成し
ない。近年の複製能欠失型レトロウイルスベクターは、
ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの全ての遺伝子を欠失してい
る。そのような複製能欠失型レトロウイルスベクターを
調製するためには、様々な方法が知られているが、基本
的にはベクターコンストラクトと感染性ウイルス粒子の
生産に必要なｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子産物を供給
するシステム（ヘルパーウイルス又はパッケージング細
胞など）が必要である。

【００２７】ベクターコンストラクトとは、プロウイル
スの構造からｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなどの機能的な遺
伝子を除き、その代わりに所望の遺伝子又は遺伝子配列
を挿入した構造を有するＤＮＡである。また、ベクター
コンストラクトはパッケージングシグナル配列Ψを有し
ている。パッケージング細胞はベクターコンストラクト
を導入したときに感染可能なウイルス粒子を生産する細
胞で、機能的なｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子を発現し
ている。

【００２８】複製能欠失型レトロウイルスベクターは、
ベクターコンストラクトをパッケージング細胞に導入す
ればその培養液から回収される。レトロウイルスベクタ
ーは、標的細胞に感染及びゲノムへのインテグレーショ
ンという過程を通して効率よく外来性遺伝子を導入する
ことができる。この感染の過程は、レトロウイルスベク
ターの外被タンパク質（エンベロプ・プロテイン）と標
的細胞の膜に存在する外被タンパク質のレセプターに依
存する。従ってレトロウイルスベクターの外被タンパク
質のレセプターが存在しないか又は少ない標的細胞に
は、レトロウイルスベクターによる遺伝子の導入ができ
ないか又は導入できたとしても効率が悪い。

【００２９】例えば、レトロウイルスを代表するＭｏＭ
ＬＶは、外被タンパク質の違いによってエコトロピック
・ウイルス及びアンフォトロピック・ウイルスに分けら
れる。前者はマウス及びラットの細胞のみに感染する
が、ハムスター由来の細胞であるＢＨＫ細胞には感染し
ない。後者はマウス、ラットの他にハムスター、ヒト、
サル等の細胞に感染する。

【００３０】ＭｏＭＬＶに由来するレトロウイルスベク
ターは１９８０年代から研究され、哺乳類の細胞に安定
に遺伝子を導入することを可能にした。ＭｏＭＬＶに由
来するレトロウイルスベクターは人の遺伝子治療に用い
られている極めて安全性の高いベクターである。しか
し、ＭｏＭＬＶに由来するレトロウイルスベクターに代
表されるレトロウイルスベクターの特徴として、標的細
胞への感染効率（遺伝子の導入効率）が標的細胞の種類
によって大きく異なり、非常に感染、導入しにくい標的
細胞があることが挙げられる。

【００３１】この種のレトロウイルスベクターのもう一
つの特徴として、ウイルスのエンベロプが脆弱であり、
超遠心などの濃縮操作によってウイルスのタイターが上
がらないことがある。逆に、超遠心などの濃縮操作によ
りウイルスタイターが低下する場合がある。

【００３２】Ｇ_０トランスジェニックキメラ鳥類を得る
には、鳥類の胚にレトロウイルスベクターをマイクロイ
ンジェクションする過程が含まれるが、胚へのマイクロ
インジェクション可能な液量は使用する鳥類の胚の大き
さに依存する。実際、胚盤葉期の胚の場合、ウズラでは
数マイクロリットル、ニワトリでは十数マイクロリット
ルが限界である。

【００３３】以上のように、レトロウイルスベクターに
よって導入遺伝子の高い伝播効率を有するＧ_０トランス
ジェニックキメラ鳥類を生産するためには、鳥類の胚に
含まれる始原生殖細胞やその前駆細胞の使用するレトロ
ウイルスベクターへの感染感受性の有無、使用するレト
ロウイルスベクター・ストックのタイター及び胚へマイ
クロインジェクションする液量が関連すると考えられ
た。

【００３４】レトロウイルスベクターの感染宿主域を変
える有力な手段は、そのレトロウイルスベクターの宿主
域を決定している外被タンパク質を、他のウイルスに由
来する外被タンパク質と置換したレトロウイルスベクタ
ー（このようなレトロウイルスベクターをシュードタイ
プのレトロウイルスベクターという）を用いることであ
る。Ｅｍｉら（Ｅｍｉ，Ｎ．ら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ，６５，１２０２）は、ＭｏＭＬＶの外被タンパ
ク質の代わりに水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌ
ａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の
外被タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質を持つシュ
ードタイプのレトロウイルスベクターを作製し、それが
本来ＭｏＭＬＶに対し感染性の低いＢＨＫ細胞に感染、
導入されることを示した。その後、Ｂｕｒｎｓら（Ｂｕ
ｒｎｓ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，８０３３）により改
良され、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を持つシュードタイプの
レトロウイルスベクターが超遠心操作により濃縮される
ことが示された。同様に、センダイ・ウイルス（Ｓｅｎ
ｄａｉｖｉｒｕｓ）のヘマグルチニン−ノイラミニダ
ーゼや融合タンパク質（ＳＶ−Ｆ）を外被タンパク質と
して持つシュードタイプのＭｏＭＬＶの感染宿主域が、
それぞれ広くなったり、逆に狭くなることが報告されて
いる（Ｓｐｉｅｇｅｌ，Ｍ．ら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．，７２，５２９６）。

【００３５】ＶＳＶは、殆どの哺乳類及び鳥類の培養細
胞に感染することが知られている。また、爬虫類、魚
類、蚊やショウジョウバエなどの昆虫などの培養細胞で
感染、増殖することが知られている。

【００３６】本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇ外被タンパク質
を有するシュードタイプのレトロウイルスベクター（複
製能欠失型ウイルス）を鳥類の胚にマイクロインジェク
ションした場合、生殖細胞の前駆細胞に感染、導入され
るか否かの検討を行った。その結果、得られたＧ_０トラ
ンスジェニックキメラ鳥類が、導入した遺伝子をこれま
でになく極めて高い効率でＧ_１へ伝播することを発見
し、本発明に至った。

【００３７】更に、本発明者らは、本発明による極めて
高いＧ_１への導入遺伝子の伝播効率を有しているＧ
_０が、Ｇ_１トランスジェニック鳥類に多数の導入遺伝子
のコピーを伝播する能力を有することを発見した。この
発見は、有用物質のトランスジェニック鳥類での生産性
を高める上で重要な知見である。

【００３８】本発明によりＧ_１への極めて高い遺伝子伝
播効率を有しているＧ_０トランスジェニックキメラ鳥類
が得られることは、機能が未知の遺伝子を鳥類に高効率
に導入し、その遺伝子の機能又はその遺伝子にコードさ
れているタンパク質の機能を解明するためのトランスジ
ェニック鳥類を作製する上で、極めて優れた方法を提供
するものである。

【００３９】また、本発明においてＶＳＶ−Ｇ外被タン
パク質を有するシュードタイプのレトロウイルスベクタ
ーを用いて作製したＧ_０トランスジェニックキメラ鳥類
は、感染性の粒子を全く放出しないために、Ｇ_１や他の
鳥類が感染性ウイルス粒子に汚染されることがなく、安
全なトランスジェニック鳥類の作製法といえる。

【００４０】更に、本発明で初めて示したＭｏＭＬＶを
基本骨格として有するレトロウイルスベクターにより作
製されたトランスジェニック鳥類は、（鳥類のレトロウ
イルスを基本骨格として持つベクターと異なり、）鳥類
に感染可能なレトロウイルスが導入した遺伝子を感染性
ウイルス粒子としてレスキューし、その感染性ウイルス
粒子による他の鳥類への感染、伝播をする危険性が極め
て少なく、より安全なトランスジェニック鳥類の作製法
である。

【００４１】本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇ外被タンパク質
を有するシュードタイプのレトロウイルスベクターを用
いて作製したＧ_０トランスジェニックキメラ鳥類が、生
殖細胞系列のゲノムに多数の導入遺伝子のコピーを有す
ることを発見した。導入遺伝子の挿入部位は一見ランダ
ムな挿入部位である。導入遺伝子の挿入部位が鳥類の機
能的な遺伝子配列中である場合、Ｇ_０トランスジェニッ
クキメラ鳥類からは、遺伝子の機能が修飾されたＧ_１ト
ランスジェニック鳥類が効率的に誕生する可能性が考え
られた。例えば、羽毛の色調が変化したＧ_１トランスジ
ェニック鳥類が効率的に誕生すると考えられた。本発明
者は、遺伝子の機能が修飾された鳥類やノックアウト遺
伝子を有する鳥類を効率的に生産、育種することが可能
であることを、ＶＳＶ−Ｇ外被タンパク質を有するシュ
ードタイプのレトロウイルスベクターを用いて作製した
Ｇ_０トランスジェニックキメラ鳥類から、交配によりア
ルビノ形質を示すＧ_１トランスジェニック鳥類を得るこ
とに成功し、本発明に至った。

【００４２】本発明は、複製能欠失型レトロウイルスベ
クターによって遺伝子導入されたＧ_０トランスジェニッ
クキメラ鳥類であって、導入遺伝子のＧ_１への伝播効率
が１０％以上であるＧ_０トランスジェニックキメラ鳥類
である。以下に本発明を詳述する。

【発明の実施の形態】

【００４３】本発明で用いられる複製能欠失型レトロウ
イルスベクターとしては、複製能が欠失しているもので
あれば特に限定されず、例えば、ウイルス粒子の複製に
必要な３種の機能的な遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎ
ｖ）のうち、何れか又は全てを持たないか又は機能しな
いものを挙げることができる。このようなｇａｇ、ｐｏ
ｌ、ｅｎｖのうち、何れか又は全てを持たないか又は機
能しないレトロウイルスベクターは、一度標的細胞に感
染した後は、新たな感染性ウイルス粒子を生成すること
ができない。

【００４４】なお、ｇａｇは、ウイルス粒子の構造タン
パク質であるマトリックス、キャプシド、ヌクレオキャ
プシドを、ｐｏｌは酵素である逆転写酵素、インテグラ
ーゼ、プロテアーゼを、そしてｅｎｖは外被タンパク質
をコードしている。

【００４５】本発明で用いられる複製能欠失型レトロウ
イルスベクターとしては、例えば、モロニー・ミューリ
ン・ロイケミア・ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス・ザ
ルコーマ・ウイルス（ＲＳＶ）、マウス・ママリー・チ
ューモア・ウイルス（ＭＭＴＶ）等に由来するものを挙
げることができるが、なかでも、ＭｏＭＬＶに由来する
ものが好ましい。

【００４６】上記ＭｏＭＬＶは、多くのレトロウイルス
ベクター開発の基礎となったウイルスであり、約８キロ
ベースの１本鎖ＲＮＡをゲノムとして有している。その
構造は真核生物のｍＲＮＡの構造と類似しており、５’
末端にキャップ構造、３’末端にはポリ（Ａ）テイルを
持っている。５’端にはＲ−Ｕ５、３’端にはＵ３−Ｒ
という複製、転写に必要な領域が存在する。これらの両
端の間にはｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの翻訳領域がある。
Ｕ５とｇａｇの間にはウイルスＲＮＡゲノムがウイルス
粒子に取り込まれるために必要なパッケージングシグナ
ル配列Ψがある。ＭｏＭＬＶは、その感染により細胞に
侵入する。侵入したウイルスゲノムは逆転写酵素により
２本鎖ＤＮＡに変換され、宿主細胞のゲノムに挿入され
る。この挿入されたウイルス由来のＤＮＡをプロウイル
スというが、プロウイルスからは宿主細胞のＲＮＡポリ
メラーゼにより再びウイルスゲノムＲＮＡが合成され
る。また、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖから感染性のあるＭ
ｏＭＬＶ粒子の生産に必要な全てのタンパク質が生産さ
れ、細胞からＭｏＭＬＶが発芽により放出される。

【００４７】一般に、複製能欠失型レトロウイルスベク
ターを調製するためには、様々な方法（Ｒｅｔｒｏｖｉ
ｒｕｓｅｓ，Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｕｇｈｅｓ，
Ｓ．Ｈ．ａｎｄＶｅｒｍｕｓ，Ｈ．Ｅ．ｅｄｓ．
（１９９７）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）が知られている
が、基本的にはベクターコンストラクトと感染性ウイル
ス粒子の生産に必要なｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子産
物とを供給するシステム（ヘルパーウイルス又はパッケ
ージング細胞など）が必要である。

【００４８】上記のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子産物
を供給するシステム（ヘルパーウイルス又はパッケージ
ング細胞など）としては、通常、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ
ｅｓ，Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｕｇｈｅｓ，Ｓ．
Ｈ．ａｎｄＶｅｒｍｕｓ，Ｈ．Ｅ．ｅｄｓ．（（１９
９７）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）に記載されているシステ
ム等が用いられ、なかでも、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺
伝子産物を構成的に生産する細胞（パッケージング細
胞）が多用される。ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの遺伝子配
列がレトロウイルスと同様な構造でパッケージング細胞
中に存在すると、パッケージング細胞に導入したベクタ
ーコンストラクトとの間で組み換えを起こし、複製能の
ある感染性ウイルス粒子（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃ
ｏｍｐｅｔｅｎｔｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）が生成する
可能性がある。従って、近年のパッケージング細胞とし
ては、ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖの２種類の発現ベクタ
ーによって形質転換し、ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖが構
成的又は一過性に発現する細胞が用いられる。

【００４９】上記ベクターコンストラクトをパッケージ
ング細胞に導入する方法としては特に限定されず、例え
ば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、電気導
入法などを挙げることができる。

【００５０】本発明で用いられる複製能欠失型レトロウ
イルスベクターとしては、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を含む
膜を有する複製能欠失型レトロウイルスベクターが好適
に用いられる。複製能欠失型レトロウイルスベクターの
外被タンパク質を、ＶＳＶ−Ｇタンパク質と置換するこ
とにより、鳥類に感染能がないウイルスに由来するもの
であっても、鳥類を宿主とすることができる。

【００５１】上記ＶＳＶ−Ｇタンパク質を含む膜を有す
る複製能欠失型レトロウイルスベクターを調製する方法
としては特に限定されず、例えば、上述のｅｎｖを発現
するパッケージング細胞の代わりにＶＳＶ−Ｇタンパク
質を発現するパッケージング細胞を用い、このようなパ
ッケージング細胞にベクターコンストラクトを導入し、
パッケージング細胞を培養することにより、培養液中か
ら回収することができる。

【００５２】上記ＶＳＶ−Ｇタンパク質を発現するパッ
ケージング細胞としては、ｇａｇ−ｐｏｌを構成的に発
現するパッケージング細胞を、ＶＳＶ−Ｇタンパク質の
発現ベクターによりトランスフェクションしたものが好
適に用いられる。ｇａｇ−ｐｏｌを構成的に発現するパ
ッケージング細胞を、ＶＳＶ−Ｇタンパク質の発現ベク
ターによりトランスフェクションする際に、併せて、ベ
クターコンストラクトによりコトランスフェクションし
てもよい（Ｙｅｅ，Ｊ．Ｋ．ら（１９９４）Ｍｅｔｈｏ
ｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．，４３，ＰｔＡ，９
９）。また、ｇａｇ−ｐｏｌを構成的に発現し、ある条
件下でＶＳＶ−Ｇタンパク質を大量に誘導発現すること
が可能なパッケージング細胞が用いられてもよい（Ａｒ
ａｉ，Ｔ．ら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，１
１１５；米国特許５，７３９，０１８）。

【００５３】上記ＶＳＶ−Ｇタンパク質を含む膜を有す
る複製能欠失型レトロウイルスベクターは、また、複製
能欠失型プロウイルスを有し、且つｇａｇ−ｐｏｌを構
成的に発現するパッケージング細胞をＶＳＶ−Ｇタンパ
ク質の発現ベクターによりトランスフェクションするこ
とにより調製されてもよく、無細胞系により調製されて
もよい（Ａｂｅ，Ａ．ら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｏｌ．，
７２，６３５６）。

【００５４】ＶＳＶ−Ｇタンパク質は細胞に毒性を示す
ために、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を安定且つ大量に構成的
発現する細胞は得られない。従って、ｇａｇ−ｐｏｌ遺
伝子を構成的に発現するパッケージング細胞に、ＶＳＶ
−Ｇ遺伝子を含むベクターコンストラクトを導入するこ
とにより、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を外被タンパク質とし
て持つレトロウイルスが回収される（Ｅｍｉ，Ｎ．ら
（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６５，１２０２；Ｂｕ
ｒｎｓ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，８０３３）。しか
し、そのようにして作製したシュードタイプのレトロウ
イルスベクターは不要なＶＳＶ−Ｇ遺伝子を含むため
に、トランスジェニック鳥類を作製する上では適切でな
い。

【００５５】本発明において鳥類に導入される導入遺伝
子としては特に限定されないが、レトロウイルスに由来
しない遺伝子であるのが好ましい。上記レトロウイルス
に由来しない遺伝子としては特に限定されず、例えば、
ネオマイシン耐性遺伝子又はグリーン・フルオレッセン
ト・プロテイン（ＧＦＰ）遺伝子などを挙げることがで
きるが、有用タンパク質をコードする遺伝子などが用い
られてもよい。

【００５６】上記導入遺伝子は、ベクターコンストラク
トのプロウイルスの５’端及び３’端の間に挿入され
る。これらの導入遺伝子を、トランスジェニック鳥類で
発現させるためには、必要に応じそれらの遺伝子は転写
をコントロールするプロモーター配列を用いてもよい。
上記プロモーター配列としては組織特異的な発現をコン
トロールするプロモーター配列、組織に於いて構成的な
発現をコントロールするプロモーター配列又は誘導可能
なプロモーター配列が利用できる。本発明のＧ_０トラン
スジェニックキメラ鳥類としては特に限定されず、例え
ば、ニワトリ、アヒル、七面鳥、カモ、ダチョウ、ウズ
ラなどの家畜として飼育されている有用鳥類を挙げるこ
とができる。なかでも、ニワトリやウズラが好ましい。
ニワトリやウズラは、入手が容易である。

【００５７】本発明のＧ_０トランスジェニックキメラ鳥
類を作製する方法としては特に限定されないが、例え
ば、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を含む膜を有する複製能欠失
型レトロウイルスベクターを鳥類の胚に導入し、その胚
を孵化させる方法により作製することができる。

【００５８】上記ＶＳＶ−Ｇタンパク質を含む膜を有す
る複製能欠失型レトロウイルスベクターを鳥類の胚に導
入する方法としては特に限定されず、例えば、放卵後の
胚に複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロイ
ンジェクションする方法などを挙げることができる。

【００５９】上記のマイクロインジェクション法として
は、従来行われている方法が適用できる。すなわち、Ｂ
ｏｓｓｅｌｍａｎら（Ｂｏｓｓｅｌｍａｎ，Ｒ．Ａ．ら
（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３，５３３）、Ｖｉ
ｃｋら（Ｖｉｃｋ，Ｌら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓ
ｏｃ．Ｌｏｎｄ．ＢＢｉｏｌ．Ｓｃｉ．２５１，１７
９）が彼らの文献で示した方法又は本発明者らが本発明
の実施例で示した方法などが適用できる。上記のＧ_０ト
ランスジェニックキメラ鳥類を作製する方法もまた、本
発明の１つである。

【００６０】上記複製能欠失型レトロウイルスベクター
をマイクロインジェクションをした胚を培養し、Ｇ_０ト
ランスジェニックキメラ鳥類を孵化させるには、本発明
者が開発した人工卵殻を用いた方法（Ｋａｍｉｈｉｒ
ａ，Ｍ．ら（１９９８）Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｔｈ
Ｄｉｆｆｅｒ．，４０，４４９）、Ｂｏｓｓｅｌｍａ
ｎら（Ｂｏｓｓｅｌｍａｎ，Ｒ．Ａ．ら（１９８９）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２４３，５３３）又はＶｉｃｋら（Ｖｉ
ｃｋ，Ｌら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎ
ｄ．ＢＢｉｏｌ．Ｓｃｉ．２５１，１７９）が彼らの
文献で示した方法が適用できる。

【００６１】本発明のＧ_０トランスジェニックキメラ鳥
類を成体まで成長させ、非トランスジェニック鳥類と交
配を行うことにより、Ｇ_０トランスジェニックキメラ鳥
類に導入した遺伝子をＧ_１鳥類へ伝播することができ
る。遺伝子伝播の成否は、得られたＧ_１の血液又は各組
織などからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法又はハイブリダイ
ゼーション法などにより導入遺伝子の有無を検定するこ
とによって調べられる。

【００６２】本発明のＧ_０トランスジェニックキメラ鳥
類は、導入遺伝子のＧ_１への伝播効率が１０％以上であ
ることを特徴とする。遺伝子伝播効率は、Ｇ_０トランス
ジェニックキメラ鳥類から交配により得られた全Ｇ_１鳥
類に対する導入遺伝子を有するＧ_１トランスジェニック
鳥類の割合（％）で示される。好ましくは、２０〜９０
％である。

【００６３】ＭｏＭＬＶに由来する複製能欠失型レトロ
ウイルスベクターを鳥類の胚に導入し、その胚を孵化さ
せ、導入遺伝子を有するＧ_０トランスジェニックキメラ
鳥類を得、更に成長させ、交配させることからなるトラ
ンスジェニック鳥類及びその作製法、並びに、ＶＳＶ−
Ｇタンパク質を含む膜を有する複製能欠失型レトロウイ
ルスベクターを鳥類の胚に導入し、その胚を孵化させ、
導入遺伝子を有するＧ_０トランスジェニックキメラ鳥類
を得、更に成長させ、交配させることからなるトランス
ジェニック鳥類及びその作製法もまた、本発明の１つで
ある。なお、本明細書において、トランスジェニック鳥
類とは、その子孫も含むものである。

【００６４】本発明のトランスジェニック鳥類は、全て
の生殖細胞及び体細胞に導入遺伝子を有しており、該ト
ランスジェニック鳥類が有する導入遺伝子は交配によっ
て得られる子孫へ伝播される。

【００６５】本発明のトランスジェニック鳥類は、導入
遺伝子を複数コピー有することが好ましい。本発明のト
ランスジェニック鳥類が有する導入遺伝子のコピー数
は、定量的なＰＣＲ法や該鳥類のＤＮＡを適切な制限酵
素で切断後、サザンブロットにより確認できる。本発明
のトランスジェニック鳥類が有する導入遺伝子のコピー
数は、好ましくは２以上である。

【００６６】本発明のトランスジェニック鳥類での導入
遺伝子の転写や発現は、トランスジェニック鳥類の各組
織からｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法で確認でき
る。また、抗原抗体反応などで確認される。

【００６７】Ｇ_０トランスジェニックキメラ鳥類から交
配により得られた子孫の遺伝形質を確認するには、目的
とする形質（例えば子孫の羽毛の色調、成長速度、給餌
効率、子孫の性の割合、肉質、産卵数又は寿命など）を
調べることにより確認することができる。

【００６８】本発明のトランスジェニック鳥類は、必要
に応じて親鳥類とは異なる遺伝的形質を有していてもよ
い。上記親鳥類とは異なる遺伝的形質としては特に限定
されず、例えば、アルビノを挙げることができる。アル
ビノはＺ染色体上のチロシナーゼ遺伝子が破壊された場
合に起こる形質であるので、アルビノの発生は導入遺伝
子伝播率が高いことを表す。

【００６９】本発明によれば、所望の形質を持つ鳥類を
育種することができるので、本発明は、遺伝子の機能が
修飾された鳥類やノックアウト遺伝子を有する鳥類を効
率的に生産、育種するために用いることができる。発明
はまた、有用物質を生産するために用いることもでき
る。

【００７０】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定される
ものではなく、実施例において用いられた鳥類の胚に含
まれる始原生殖細胞やその前駆細胞の複製能欠失型レト
ロウイルスベクターに対する感染感受性、ウイルス溶液
のタイター及び胚へマイクロインジェクションする液量
などにより何ら限定されるものではない。

【００７１】（実施例１）複製能欠失型レトロウイルス
ベクターの調製複製能欠失型レトロウイルスベクターのベクターコンス
トラクトｐＬＧＲＮは、以下のように作製した。すなわ
ち、プラスミドｐＧＲＥＥＮＬＡＮＴＥＲＮ（ギブコ
ＢＲＬ社製）からグリーン・フルオレッセント・プロテ
イン（ＧＦＰ）遺伝子を制限酵素ＮｏｔＩで切り出し、
ｐＺｅｏＳＶ２（＋）（インビトロジェン社製）のＮｏ
ｔＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＺｅｏ−ＧＦＰを作
製した。次ぎに、ｐＺｅｏ−ＧＦＰからＧＦＰ遺伝子を
制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＸｈｏＩによって更に切り出
し、ｐＬＸＲＮ（クロンテック社製）のＨｐａＩ、Ｘｈ
ｏＩサイトへ挿入し、ベクターコンストラクトｐＬＧＲ
Ｎを作製した。このように作製した複製能欠失型レトロ
ウイルスベクターのベクターコンストラクトｐＬＧＲＮ
の構造を図１に示した。

【００７２】（実施例２）コトランスフェクションによ
る複製能欠失型レトロウイルスベクターの生産トランスフェクションの前日に、ウイルスパッケージン
グ細胞であるＧＰ２９３細胞（クロンテック社製）を、
直径１００ｍｍのディッシュに５×１０^６細胞植え培養
した。２４時間後、ＧＰ２９３細胞がおよそ８０％コン
フルエントに増殖していることを確認し、新鮮なＤＭＥ
Ｍ（ダルベッコズ・モディファイド・イーグルズ・メデ
ィウム）培地に交換した。ＶＳＶ−Ｇ発現ベクターｐＶ
ＳＶ−Ｇ（クロンテック社製）８μｇとｐＬＧＲＮ８μ
ｇとをリポフェクション法によりＧＰ２９３細胞に導入
した。４８時間後、ウイルス粒子を含む培養上清を回収
し、０．４５μｍ酢酸セルロースフィルターを通して夾
雑物を除いた。得られたＶＳＶ−Ｇ外被タンパク質を有
するウイルス溶液にポリブレンを１０μｇ／ｍｌとなる
ように加えた。このようにして調製したウイルス溶液の
タイターは約１０^５ｃｆｕ（コロニー・フォーミング・
ユニット）であった。ウイルスタイターの測定は以下に
例示するように行った。アッセイする前日にＮＩＨ３Ｔ
３細胞（アメリカン・タイプカルチャー・コレクショ
ン）を直径３５ｍｍのディッシュに７×１０^４細胞植え
培養した（４ディッシュ）。１０^２から１０^６倍に希釈
したウイルス溶液を各ディッシュに１ｍｌ加え、２日後
に蛍光顕微鏡観察によりＧＦＰを発現している細胞の割
合を測定しタイターを決定した。例：細胞数（１０^５）×希釈率（１０^４）×発現率
（０．８）＝８×１０^８ｃｆｕ／ｍｌ

【００７３】（実施例３）複製能欠失型レトロウイルス
ベクター生産用の安定形質転換株の樹立実施例２と同様に、ＧＰ２９３細胞を準備した。ＧＰ２
９３細胞が増殖したディッシュから培養液を除き、実施
例２で調製したＶＳＶ−Ｇ外被タンパク質を有するウイ
ルス溶液を１０ｍｌ加えた。更に２日間培養した後、ウ
イルス感染処理したＧＰ２９３細胞を６００μｇ／ｍｌ
のＧ４１８を含む培養液に植え継ぎ、Ｇ４１８耐性な安
定形質転換株を取得した。

【００７４】（実施例４）高タイターの複製能欠失型レ
トロウイルスベクターの調製直径１００ｍｍのディッシュに実施例３で得たＧ４１８
耐性な安定形質転換株を約８０％コンフルエントとなる
ように培養し、１６μｇのｐＶＳＶ−Ｇをリポフェクシ
ョン法により導入した。４８時間後、ウイルス粒子を含
む培養上清１２ｍｌを回収した。本培養上清に含まれる
ウイルスのタイターは約１０^７ｃｆｕ／ｍｌであった。

【００７５】（実施例５）複製能欠失型レトロウイルス
ベクターの濃縮実施例４で調製した複製能欠失型レトロウイルスベクタ
ーを含む培養上清を５０，０００×ｇ、４℃で１．５時
間遠心を行い沈殿させた。上清を除き、ウイルス粒子を
含む沈殿物に５０μｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．８）、１３０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤ
ＴＡ溶液を加えた。４℃で一晩放置後、よく懸濁してウ
イルス溶液を回収した。このようにして調製したウイル
スのタイターは約１０^９ｃｆｕ／ｍｌであった。

【００７６】（実施例６）ウズラ胚へのウイルス溶液の
マイクロインジェクションＷＥ系統のウズラ受精卵（日本生物化学研究所より入
手）を使用した。受精卵の卵殻を７０％エタノールで消
毒し、鋭端部を直径２ｃｍの円形にダイヤモンドカッタ
ー（ＭＩＮＯＭＯ７Ｃ７１０、ミニター社製）で切り取
り、胚を露出させた。胚盤葉を実体顕微鏡で観察しなが
ら、ガラス管（ＣＤ−１、オリンパス社製）をマイクロ
ピペット製作機（ＰＣ−１０、オリンパス社製）で加工
し、外径約２０μｍになるように先端を折って作製した
針を刺し、マイクロインジェクター（Ｔｒａｎｓｊｅｃ
ｔｏｒ５２４６、エッペンドルフ社製）を用いて胚盤下
腔の中央に、実施例５で調製したウイルス溶液約２μｌ
を微量注入した。

【００７７】（実施例７）ウズラ胚培養実施例６でウイルス粒子をマイクロインジェクションし
たウズラ受精卵を卵殻の切り口まで卵白で満たした後、
卵白を糊として、テフロン膜（ミリラップ、ミリポア社
製）とポリ塩化ビニリデンラップ（サランラップ、旭化
成社製）とで蓋をし、自動転卵装置が内蔵された孵卵器
（Ｐ−００８型、昭和フランキ研究所製）内で、約４８
時間、３７．９℃、湿度６５％で１５分毎に９０度転卵
しながら孵卵した。正常に発生が進行していることを確
認したのち、ニワトリのＳサイズの卵殻の鋭端部に直径
４ｃｍの穴をあけたものにウイルス導入胚を移した。胚
を上にして空気に触れるようにし、濃度５０ｍｇ／ｍｌ
で卵白に懸濁した乳酸カルシウム溶液を０．５ｍｌ添加
後、卵白を糊としてラップで密閉した。再度孵卵器に入
れ、３７．９℃、湿度６５％で１時間毎に３０度転卵し
ながら１３日間培養した。転卵を止め静置状態にし、胚
が肺呼吸に移行したら（ハシウチ）ラップに針で小さな
穴をあけ、呼吸を助けた。漿尿膜の血が引いたら培養器
から雛を出し、孵化させた。

【００７８】（実施例８）遺伝子導入ウズラ胚の孵化率ウイルス導入胚培養操作を３回（各回４０−４９胚）行
って、複製能欠失型レトロウイルスベクターによる遺伝
子導入処理した胚を実施例７で示した方法により孵化さ
せた。３回の実験では１３〜３９％の孵化率で遺伝子導
入ウズラ胚を孵化させることができた。表１に遺伝子導
入ウズラ胚の孵化率を示した。

【００７９】

【表１】

【００８０】（実施例９）孵化したウズラの導入遺伝
子の検定実施例８によって孵化したそれぞれのウズラの漿尿膜を
採取し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ｇｅｎｏｍｅ−
（東洋紡社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。遺伝
子導入に用いた複製能欠失型レトロウイルスベクターに
含まれるネオマイシン耐性遺伝子の一部３６８ｂｐをＰ
ＣＲ法により増幅し導入遺伝子の有無を検定した。検定
を行った１３羽のウズラ全ての漿尿膜に関してネオマイ
シン耐性遺伝子の増幅が確認できた（図２）。このこと
は、検定した１３羽のウズラが、全てＧ_０トランスジェ
ニックキメラウズラであることを示している。

【００８１】（実施例１０）Ｇ_０トランスジェニックキ
メラウズラの子孫への導入遺伝子の伝播効率実施例８によって孵化したＧ_０トランスジェニックキメ
ラウズラのうちの６羽と遺伝子操作をしていないウズラ
とをそれぞれ交配させ、複数のＧ_１ウズラを得た。実施
例９と同様にして、孵化したＧ_１ウズラの漿尿膜からゲ
ノムＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法によって遺伝子の伝播を
確認した。表２に示すように平均８２％の効率でＧ_１ト
ランスジェニックウズラを得た。また、Ｇ_０（＃６）で
は８８％のＧ_１への導入遺伝子の伝播効率を示した。

【００８２】

【表２】

【００８３】（実施例１１）Ｇ_１トランスジェニックウ
ズラ各組織での導入遺伝子の存在漿尿膜で導入遺伝子の存在が確認できたＧ_１トランスジ
ェニックウズラについて、各組織（肝臓、心臓、生殖
巣、脾臓、脳、表皮）から、ゲノムＤＮＡを抽出し、Ｐ
ＣＲ法により全身で導入遺伝子が存在するか調べた。導
入した複製能欠失型レトロウイルスベクター上にあるネ
オマイシン耐性遺伝子、ＧＦＰ遺伝子がともに各臓器の
ＤＮＡから増幅され、導入した複製能欠失型レトロウイ
ルスベクターが全身の細胞に存在することが確認できた
（図３）。

【００８４】（実施例１２）導入遺伝子のコピー数の測
定６羽のＧ_１トランスジェニックウズラの血液からゲノム
ＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡをそれぞれ制限酵素Ｘ
ｈｏＩ、ＫｐｎＩで切断し、０．８％アガロースゲルで
電気泳動を行った。泳動後、ＤＮＡをナイロンメンブレ
ン（ＨｙｄｏｎｄＮ＋、アマシャムファルマシア社製）
にアルカリトランスファーした。ランダムプライマー法
によって放射性同位体ラベルをしたＧＦＰ遺伝子のプロ
ーブ、ネオマイシン耐性遺伝子のプローブを用いてサザ
ンハイブリダイゼーションを行った。ＸｈｏＩ切断によ
り遺伝子のコピー数が分かり、ＫｐｎＩ切断により導入
遺伝子の欠失や組み換えが起こっていないことが確認さ
れた。６羽のＧ_１トランスジェニックウズラについての
解析結果を図４に示した。ゲノムあたり３コピーの導入
遺伝子を持つ固体が１羽、２コピーが３羽、１コピー持
つ固体が１羽であった。

【００８５】（実施例１３）Ｇ_１トランスジェニックウ
ズラ及びＧ_２トランスジェニックウズラでの導入遺伝子
の発現Ｇ_１トランスジェニックウズラを遺伝子操作をしていな
いウズラと交配させＧ_２トランスジェニックウズラを得
た。Ｇ_１トランスジェニックウズラ及びＧ_２トランスジ
ェニックウズラの各組織（心臓、脳、肝臓、筋肉、腎
臓、脾臓、生殖巣）からｍＲＮＡを、ｍＲＮＡｉｓｏ
ｌａｔｉｏｎＫｉｔ（ロッシュ社製）を用いて精製し
た。ＲＴ−ＰＣＲ法（ＲｅａｄｙｔｏＧｏＴＲ−
ＰＣＲｂｅａｄｓ、アマシャムファルマシア社製）に
より、ネオマイシン耐性遺伝子（増幅領域３６８ｂ
ｐ）、ＧＦＰ遺伝子（増幅領域３１１ｂｐ）の発現を調
べた。コントロールとしてＧＡＰＤＨ遺伝子（グリセル
アルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子；増幅
領域５８９ｂｐ）のＲＴ−ＰＣＲも行った。ネオマイシ
ン耐性遺伝子は心臓、筋肉において比較的強い発現が確
認された。また、肝臓、腎臓においても若干の発現が確
認された。ＧＦＰにおいては、ＲＴ−ＰＣＲでは発現が
検出されなかった。Ｇ_２トランスジェニックウズラにお
いてもネオマイシン耐性遺伝子は心臓と筋肉で強い発現
がみられ、発現パターンはＧ_１トランスジェニックウズ
ラからＧ_２トランスジェニックウズラに伝播された。結
果を図５に示した。ＧＦＰの発現が観察されなかったこ
とは、ＭｏＭＬＶのＬＴＲ（ロング・ターミナル・リピ
ート）のプロモーター活性が鳥類では機能しないことを
意味しており、本発明に使用した複製能欠失型レトロウ
イルスベクターが、トランスジェニック鳥類を作製する
上で、極めて安全であることを示唆している。

【００８６】（実施例１４）アルビノ形質を有するトラ
ンスジェニック鳥類の作製実施例１０で示したＧ_０トランスジェニックキメラウズ
ラ（＃４）由来の１６羽のＧ_１トランスジェニックウズ
ラのうち、２羽がアルビノであった。アルビノはＺ染色
体上のチロシナーゼ遺伝子が破壊された場合に起こる形
質であり、上記複製能欠失型レトロウイルスベクターに
より当該遺伝子の破壊又は機能の欠失が起こったことが
示唆された。

【００８７】（実施例１５）ニワトリに導入する複製能
欠失型レトロウイルスベクターの調製直径１００ｍｍのディッシュに実施例３で得たＧ４１８
耐性な安定形質転換株を約８０％コンフルエントとなる
ように培養し、１６μｇのｐＶＳＶ−Ｇをリポフェクシ
ョン法により導入した。４８時間後ウイルス粒子を含む
培養上清１２ｍｌを回収した。本培養上清を５０，００
０×ｇ、４℃で１．５時間遠心を行い沈殿させた。上清
を除き、ウイルス粒子を含む沈殿物に５０μｌの５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１３０ｍＭＮ
ａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ溶液を加えた。４℃で一晩放
置後、よく懸濁してウイルス溶液を回収した。このよう
にして調製したウイルス溶液のタイターは約１〜２×１
０^８ｃｆｕ／ｍｌであった。

【００８８】（実施例１６）ニワトリ胚へのウイルス溶
液のマイクロインジェクションニワトリ受精卵（日本生物化学研究所より入手）を使用
した。受精卵の卵殻を７０％エタノールで消毒し、鋭端
部を直径３．５ｃｍの円形にダイヤモンドカッター（Ｍ
ＩＮＯＭＯ７Ｃ７１０、ミニター社製）で切り取り、胚
を露出させた。胚盤葉を実体顕微鏡で観察しながら、ガ
ラス管（ＣＤ−１、オリンパス社製）をマイクロピペッ
ト製作機（ＰＣ−１０、オリンパス社製）で加工し、外
径約２０μｍになるように先端を折って作製した針を刺
し、マイクロインジェクター（Ｔｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ
５２４６、エッペンドルフ社製）を用いて胚盤下腔の中
央に、実施例１５で調製したウイルス溶液約２μｌを微
量注入した。

【００８９】（実施例１７）ニワトリ胚培養実施例１６でウイルス粒子をマイクロインジェクション
したニワトリ受精卵を卵殻の切り口まで卵白で満たした
後、卵白を糊として、テフロン（登録商標）膜（ミリラ
ップ、ミリポア社製）とポリ塩化ビニリデンラップ（サ
ランラップ、旭化成社製）とで蓋をし、自動転卵装置が
内蔵された孵卵器（Ｐ−００８型、昭和フランキ研究所
製）内で、約４８時間、３７．９℃、湿度６５％で１５
分毎に９０度転卵しながら孵卵した。正常に発生が進行
していることを確認したのち、有精卵よりも大きなニワ
トリ二黄卵の鋭端部に直径４．５ｃｍの穴をあけたもの
にウイルス導入胚を移した。胚を上にして空気に触れる
ようにし、濃度５０ｍｇ／ｍｌで卵白に懸濁した乳酸カ
ルシウム溶液を０．５ｍｌ添加後、卵白を糊としてラッ
プで密閉した。再度孵卵器に入れ、３７．９℃、湿度６
５％で１時間毎に３０度転卵しながら１５日間培養し
た。転卵を止め静置状態にし、胚が肺呼吸に移行したら
（ハシウチ）ラップに針で小さな穴をあけ、呼吸を助け
た。漿尿膜の血が引いたら培養器から雛を出し、孵化さ
せた。

【００９０】（実施例１８）遺伝子導入ニワトリ胚の孵
化率ウイルス導入胚培養操作を行って、複製能欠失型レトロ
ウイルスベクターによる遺伝子導入処理した胚を実施例
１７で示した方法により孵化させた。今回の実験では３
５の胚培養により６羽（１７％の孵化率）のニワトリの
雛を孵化させることができた。

【００９１】（実施例１９）孵化したニワトリの導入遺
伝子の検定実施例１８によって孵化した６羽のニワトリ雛の漿尿膜
を採取し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ｇｅｎｏｍｅ
−（東洋紡）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。遺伝子
導入に用いた複製能欠失型レトロウイルスベクターに含
まれるネオマイシン耐性遺伝子の一部３６８ｂｐを、Ｐ
ＣＲ法により増幅し導入遺伝子の有無を検定した。検定
を行った６羽のニワトリのうち４羽（６７％）にネオマ
イシン耐性遺伝子の増幅が確認でき、これらのニワトリ
がＧ_０トランスジェニックキメラニワトリであることが
分かった。

【００９２】（実施例２０）Ｇ_０トランスジェニックキ
メラニワトリの子孫への導入遺伝子の伝播効率実施例１９によって孵化した４羽のＧ_０トランスジェニ
ックキメラニワトリ（雄２羽、雌２羽）と遺伝子操作を
していないニワトリとをそれぞれ交配させ、２羽の雌の
Ｇ_０トランスジェニックキメラニワトリから、合計１９
羽のＧ_１ニワトリ（４羽及び１５羽）を得た。実施例１
９と同様にして、孵化した１９羽のＧ_１ニワトリの漿尿
膜からゲノムＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法により増幅し導
入遺伝子の有無を検定した。その結果、２羽のＧ_０トラ
ンスジェニックキメラニワトリからそれぞれ１羽（２５
％）、７羽（４７％）にネオマイシン耐性遺伝子の増幅
が確認でき、Ｇ_１トランスジェニックニワトリであるこ
とが確認された。

【００９３】

【発明の効果】本発明により、極めて高い効率で目的と
する遺伝子を導入し、該遺伝子を発現するトランスジェ
ニック鳥類を作製できる。特にニワトリ、アヒル、七面
鳥、カモ、ダチョウやウズラなどの家畜として飼育され
ている有用鳥類のトランスジェニック鳥類を極めて高い
効率で作製できる。また、本発明により感染性ウイルス
粒子を放出しない安全なトランスジェニック鳥類を作出
することができる。更に、本発明により所望の形質を持
つ鳥類の育種法が提供される。更に、本発明によれば、
遺伝子の機能が修飾された鳥類やノックアウト遺伝子を
有する鳥類を効率的に生産、育種することが可能とな
り、機能が未知の遺伝子を鳥類に導入し、その遺伝子の
機能又は遺伝子にコードされているタンパク質の機能を
解明するためのトランスジェニック鳥類の作製法が提供
される。また、本発明によれば、有用物質を効率的に生
産することも可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】複製能欠失型レトロウイルスベクターのベク
ターコンストラクトｐＬＧＲＮの構造を示す。Ｎｅｏ^ｒ
はネオマイシン耐性遺伝子を示す。Ｐ_ＲＳＶはラウス・
ザルコーマ・ウイルスのプロモーター配列を示す。ＧＦ
Ｐはグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子を
示す。Ψ＋はパッケージングシグナル配列の存在を示
す。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはそれぞれＭｏＭＬＶの
ロングターミナルリピート配列を示す。

【図２】Ｇ_０トランスジェニックキメラウズラにおけ
る導入遺伝子存在のＰＣＲ法による検定の結果を示す。
Ｃは陽性コントロールを示す。Ｎｅｏ^ｒはネオマイシン
耐性遺伝子を示す。

【図３】Ｇ_１トランスジェニックウズラの各組織にお
ける導入ベクターのＰＣＲ法による検定の結果を示す。
Ｍはマーカー、Ｃ１は陽性コントロール、Ｃ２は陰性コ
ントロールを示す。Ｌ、Ｈ、Ｔ、Ｐ、Ｂ及びＳは、それ
ぞれ肝臓、心臓、生殖巣、脾臓、脳、表皮を示す。Ｎｅ
ｏ^ｒはネオマイシン耐性遺伝子を示し、ＧＦＰはグリー
ン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子を示す。

【図４】サザンブロットによるＧ_１トランスジェニッ
クウズラにおける導入遺伝子の解析の結果を示す。レー
ン１−１５はＧＦＰプローブを用いてサザンブロットを
行った。レーン１６−２３はＮｅｏ^ｒプローブを用いて
サザンブロットを行った。レーン１−７はＸｈｏＩ切
断、レーン８−２３はＫｐｎＩ切断したＤＮＡを用い
た。レーン１−６、９−１４及び１７−２２は６羽のＧ
_１トランスジェニックウズラＤＮＡを、レーン７、１
５、２３は遺伝子操作を行っていないウズラＤＮＡを
（ネガティブコントロール）、レーン８、１６は複製能
欠失型レトロウイルスベクターのベクターコンストラク
トｐＬＧＲＮ（ポジティブコントロール）をそれぞれの
制限酵素で切断した後に電気泳動し、それぞれのプロー
ブを用いてサザンブロットした結果を示す。

【図５】ＲＴ−ＰＣＲ法によるＧ_１トランスジェニッ
クウズラ及びＧ_２トランスジェニックウズラにおける導
入遺伝子の各組織での発現の解析結果を示す。ｍはマー
カーを示す。Ｈ、Ｂ、Ｌ、Ｍ、Ｋ、Ｓ及びＧはそれぞれ
心臓、脳、肝臓、筋肉、腎臓、脾臓及び生殖巣を示す。

フロントページの続き (72)発明者水洗慎司愛知県名古屋市千種区幸川町２−43フォーブル若竹101 (72)発明者小野健一郎愛知県名古屋市千種区東山通３丁目22番地プライムコート東山４Ｂ号Ｆターム(参考） 4B024 AA10 BA80 CA04 DA02 EA02 FA10 FA11 GA12 HA01 4B065 AA90X AA90Y AC10 BA02 BA04 CA24 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】複製能欠失型レトロウイルスベクターに
よって遺伝子導入されたＧ_０トランスジェニックキメラ
鳥類であって、導入遺伝子のＧ_１への伝播効率が１０％
以上であることを特徴とするＧ_０トランスジェニックキ
メラ鳥類。
【請求項２】複製能欠失型レトロウイルスベクターが
モロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルスに由来す
るベクターである請求項１記載のＧ_０トランスジェニッ
クキメラ鳥類。
【請求項３】導入遺伝子がレトロウイルスに由来しな
い遺伝子配列を有する請求項１又は２記載のＧ_０トラン
スジェニックキメラ鳥類。
【請求項４】レトロウイルスに由来しない遺伝子配列
がネオマイシン耐性遺伝子配列又はグリーン・フルオレ
ッセント・プロテイン遺伝子配列である請求項３記載の
Ｇ_０トランスジェニックキメラ鳥類。
【請求項５】鳥類がニワトリ又はウズラである請求項
１〜４のいずれか１項記載のＧ_０トランスジェニックキ
メラ鳥類。
【請求項６】ＶＳＶ−Ｇタンパク質を含む膜を有する
複製能欠失型レトロウイルスベクターを鳥類の胚に導入
し、その胚を孵化させることからなる導入遺伝子のＧ_１
への伝播効率が１０％以上であるＧ_０トランスジェニッ
クキメラ鳥類の作製法。
【請求項７】複製能欠失型レトロウイルスベクターが
モロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルスに由来す
るベクターである請求項６記載のＧ_０トランスジェニッ
クキメラ鳥類の作製法。
【請求項８】導入遺伝子がレトロウイルスに由来しな
い遺伝子配列を有する導入遺伝子である請求項６又は７
記載のＧ_０トランスジェニックキメラ鳥類の作製法。
【請求項９】レトロウイルスに由来しない遺伝子配列
がネオマイシン耐性遺伝子配列又はグリーン・フルオレ
ッセント・プロテイン遺伝子配列である請求項８記載の
Ｇ_０トランスジェニックキメラ鳥類の作製法。
【請求項１０】鳥類がニワトリ又はウズラである請求
項６〜９のいずれか１項記載のＧ_０トランスジェニック
キメラ鳥類の作製法。
【請求項１１】モロニー・ミューリン・ロイケミア・
ウイルスに由来する複製能欠失型レトロウイルスベクタ
ーを鳥類の胚に導入し、その胚を孵化させ、導入遺伝子
を有するＧ_０トランスジェニックキメラ鳥類を得、更に
成長させ、交配させることからなるトランスジェニック
鳥類の作製法。
【請求項１２】Ｇ_０トランスジェニックキメラ鳥類の
導入遺伝子のＧ_１への伝播効率が、１０％以上である請
求項１１記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項１３】トランスジェニック鳥類が導入遺伝子
を複数コピー有するトランスジェニック鳥類である請求
項１１又は１２記載のトランスジェニック鳥類の作製
法。
【請求項１４】導入遺伝子がレトロウイルスに由来し
ない遺伝子配列を有する導入遺伝子である請求項１１〜
１３のいずれか１項記載のトランスジェニック鳥類の作
製法。
【請求項１５】レトロウイルスに由来しない遺伝子配
列がネオマイシン耐性遺伝子配列又はグリーン・フルオ
レッセント・プロテイン遺伝子配列である請求項１４記
載のトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項１６】親鳥類とは異なる遺伝的形質を有する
請求項１１〜１５のいずれか１項記載のトランスジェニ
ック鳥類の作製法。
【請求項１７】親鳥類とは異なる遺伝的形質がアルビ
ノである請求項１６記載のトランスジェニック鳥類の作
製法。
【請求項１８】鳥類がニワトリ又はウズラである請求
項１１〜１７のいずれか１項記載のトランスジェニック
鳥類の作製法。
【請求項１９】モロニー・ミューリン・ロイケミア・
ウイルスに由来する複製能欠失型レトロウイルスベクタ
ーを鳥類の胚に導入し、その胚を孵化させ、導入遺伝子
を有するＧ_０トランスジェニックキメラ鳥類を得、更に
成長させ、交配させることから得られるトランスジェニ
ック鳥類。
【請求項２０】Ｇ_０トランスジェニックキメラ鳥類の
導入遺伝子のＧ_１への伝播効率が、１０％以上である請
求項１９記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項２１】導入遺伝子を複数コピー有する請求項
１９又は２０記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項２２】導入遺伝子がレトロウイルスに由来し
ない遺伝子配列を有する導入遺伝子である請求項１９〜
２１のいずれか１項記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項２３】レトロウイルスに由来しない遺伝子配
列がネオマイシン耐性遺伝子配列又はグリーン・フルオ
レッセント・プロテイン遺伝子配列である請求項２２記
載のトランスジェニック鳥類。
【請求項２４】親鳥類とは異なる遺伝的形質を有する
請求項１９〜２３のいずれか１項記載のトランスジェニ
ック鳥類。
【請求項２５】親鳥類とは異なる遺伝的形質がアルビ
ノである請求項２４記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項２６】鳥類がニワトリ又はウズラである請求
項１９〜２５のいずれか１項記載のトランスジェニック
鳥類。
【請求項２７】ＶＳＶ−Ｇタンパク質を含む膜を有す
る複製能欠失型レトロウイルスベクターを鳥類の胚に導
入し、その胚を孵化させ、導入遺伝子を有するＧ _０トラ
ンスジェニックキメラ鳥類を得、更に成長させ、交配さ
せることからなるトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項２８】Ｇ_０トランスジェニックキメラ鳥類の
導入遺伝子のＧ_１への伝播効率が、１０％以上である請
求項２７記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項２９】トランスジェニック鳥類が導入遺伝子
を複数コピー有するトランスジェニック鳥類である請求
項２７又は２８記載のトランスジェニック鳥類の作製
法。
【請求項３０】複製能欠失型レトロウイルスベクター
がモロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルスに由来
するベクターである請求項２７〜２９のいずれか１項記
載のトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項３１】導入遺伝子がレトロウイルスに由来し
ない遺伝子配列を有する導入遺伝子である請求項２７〜
３０のいずれか１項記載のトランスジェニック鳥類の作
製法。
【請求項３２】レトロウイルスに由来しない遺伝子が
ネオマイシン耐性遺伝子配列又はグリーン・フルオレッ
セント・プロテイン遺伝子配列である請求項３１記載の
トランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項３３】親鳥類とは異なる遺伝的形質を有する
請求項２７〜３２のいずれか１項記載のトランスジェニ
ック鳥類の作製法。
【請求項３４】親鳥類とは異なる遺伝的形質がアルビ
ノである請求項３３記載のトランスジェニック鳥類の作
製法。
【請求項３５】鳥類がニワトリ又はウズラである請求
項２７〜３４のいずれか１項記載のトランスジェニック
鳥類の作製法。
【請求項３６】ＶＳＶ−Ｇタンパク質を含む膜を有す
る複製能欠失型レトロウイルスベクターを鳥類の胚に導
入し、その胚を孵化させ、導入遺伝子を有するＧ _０トラ
ンスジェニックキメラ鳥類を得、更に成長させ、交配さ
せることから得られるトランスジェニック鳥類。
【請求項３７】Ｇ_０トランスジェニックキメラ鳥類の
導入遺伝子のＧ_１への伝播効率が、１０％以上である請
求項３６記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項３８】トランスジェニック鳥類が導入遺伝子
を複数コピー有するトランスジェニック鳥類である請求
項３６又は３７記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項３９】複製能欠失型レトロウイルスベクター
がモロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルスに由来
するベクターである請求項３６〜３８のいずれか１項記
載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４０】導入遺伝子がレトロウイルスに由来し
ない遺伝子配列を有する導入遺伝子である請求項３６〜
３９のいずれか１項記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４１】レトロウイルスに由来しない遺伝子配
列がネオマイシン耐性遺伝子配列又はグリーン・フルオ
レッセント・プロテイン遺伝子配列である請求項４０記
載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４２】親鳥類とは異なる遺伝的形質を有する
請求項３６〜４１のいずれか１項記載のトランスジェニ
ック鳥類。
【請求項４３】親鳥類とは異なる遺伝的形質がアルビ
ノである請求項４２記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４４】鳥類がニワトリ又はウズラである請求
項３６〜４３のいずれか１項記載のトランスジェニック
鳥類。