WO2005065450A1 - 遺伝子導入鳥類及びその作製法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for producing transgenic birds that can be applied to the production of bioactive proteins, and to a transgenic bird obtained by the method.
- bioactive proteins such as erythropoietin, which require sugar chains, and antibody drugs are currently produced in cultured cell reactors.
- production methods using animal cells are more costly than microorganisms. Costs are high, increasing the burden on patients and the government.
- transgenic animals As a new protein production method that overcomes these drawbacks, the use of transgenic animals (transgenic animals) has attracted attention. Proteins produced by transgenic animals in milk, blood, and eggs are carbohydrate-added, and the production cost is 1Z
- Non-Patent Document 1 There is also a trial calculation of 10-1 / 100 (Non-Patent Document 1). Among them, transgenics using birds are expected to be put to practical use because they have the advantages of a short period of maturity and a small breeding area.
- Non-Patent Document 2 An external gene to avian fertilized eggs Although it was difficult to introduce E. coli (Non-Patent Document 2), the present inventors used a highly safe replication-defective virus vector and microinjected the gene into the early bird embryo to obtain the body. The transgenic chimera (called GO), which has a transgene in a part of it, was successfully produced (Patent Document 1).
- the gene thus introduced is inactivated by a host defense mechanism having host power S (a phenomenon called silencing), and does not express the protein, or even a small amount of the protein is expressed. Furthermore, in order to stably supply proteins as pharmaceuticals, it is necessary to establish a lineage of birds that have transgenes in whole somatic cells as descendants of GO transgenic chimeras. The descendants of these G0 transgenic chimeras are called G1-G2-G3- according to their generation number Patent Document 1: JP-A-2002-176880
- Patent Document 2 JP 2001-520009
- Non-patent literature l Nature Biotechnology 19, 184 2001
- Non-Patent Reference 2 Harvey AJ, et al. Consistent production of transgenic c hickens using replication— deficient retroviral vectors and high— thro ughput screening procedures. Poult. Sci. Feb. 2002, Vol. 81, No. 2, p. 202 -212
- the present invention provides a method for transgenic birds to be applied as a safe and efficient protein production system.
- the aim is to establish a transgenic bird production method with high expression efficiency.
- the transgenic bird of the present invention hatches avian fertilized eggs and removes the blastoderm stage immediately after oviposition to an early embryo thereafter.
- G1 transgenic birds can be obtained by crossing the GO transgenic chimeric birds with the GO transgenic chimeric birds or their progeny, or wild-type birds.
- G2 transgenic birds and their progeny that are born successively by crossing the G1 transgenic birds with GO transgenic chimeras, G1 transgenic birds, wild-type birds, and the like. I do.
- the present invention also provides a G2 transgenic bird obtained by crossing a G1 transgenic bird with a GO transgenic bird, the G1 transgenic bird or its progeny, or a wild-type bird. It is a transgenic bird characterized by its descendants.
- transgenic birds that effectively express By injecting into the early heart formed in the embryo, transgenic birds that effectively express can be obtained.
- Examples of the target protein gene to be introduced into transgenic birds include those requiring a sugar chain for the activity of the expressed protein, such as the gene constituting erythropoietin, and antibody genes.
- a target protein By using a bird or a pea as a bird into which a gene is introduced, a target protein can be stably obtained in the form of an egg in high yield.
- the present invention also relates to an early embryo after hatching a fertilized avian egg and excluding the blastoderm stage immediately after oviposition,
- a method for producing a G1 transgenic bird comprising crossing the GO transgenic chimeric bird with the GO transgenic chimeric bird or a progeny thereof, or a wild-type bird.
- the present invention also provides the G1 transgenic bird, wherein the G1 transgenic bird is a G1 transgenic bird.
- a method for producing transgenic birds which comprises producing G2 transgenic birds or their progeny by crossing with transgenic birds or their progeny or wild-type birds.
- the present invention is also a method for producing a protein, comprising extracting a target protein from somatic cells, blood or eggs of transgenic birds produced by the above method.
- the present invention also relates to a transgenic bird produced by the method described above.
- a germline chimera having a gene inserted into the germline is selected from the prepared GO transgenic chimeras.
- screening it is possible to identify GO parents that efficiently produce G1.
- This sorting method is also one of the present invention.
- the present invention also provides a microinjection of a replication-defective retrovirus vector encoding a protein of interest in an embryo after hatching a fertilized avian egg and excluding the blastoderm stage immediately after oviposition. This is a method for selecting GO transgenic chimeric birds by confirming expression of a target protein in the blood of GO transgenic birds obtained by hatching.
- the present invention discloses a method for producing transgenic birds that are advantageous for protein production. Also disclosed are transgenic birds produced by the method.
- Transgenic birds produced by this method can be used for the production of proteins that can be used for pharmaceuticals and the like.
- the G1 transgenic bird and / or its progeny of the present invention is a bird into which a foreign gene has been introduced by a replication-defective retrovirus vector, which contains the foreign gene evenly in its somatic cells, and Characterized in that the target protein derived from E. coli is stably expressed in blood, egg white or egg yolk.
- the birds used in the present invention are not particularly limited, and include, for example, poultry birds and pet birds domesticated for meat and egg collection purposes, such as birds, turkeys, ducks, locusts, and quail. Can. Above all, it is preferable that birds and birds are easily available, and that they are prolific in spawning species.
- retrovirus vector used in the present invention examples include a vector derived from Moro-I 'murine' Leukemia 'virus (MoMLV), Evian leukosis virus (ALV), and a lentivirus vector. . Among them, those derived from MoMLV are preferable, but the present invention is not limited to this.
- a virus used as a gene transfer vector usually lacks one or all of the three genes gag, pol, and env required for replication of virus particles, and thus has a self-replicating ability.
- a virus deficient in is used.
- a virus vector in which the outer coat protein is artificially VSV-G (derived from vesicular stomatitis virus) pseudotype is preferable, but the present invention is limited to this virus type. Not something.
- Pseudo-type viral vectors prepared by using knocking cells or helper virus, etc. can be used to prepare early embryos, by the usual microinjection method (Bosselman, RA et al. (1989) Science 243, 533). It is introduced into blood vessels and the heart. In addition to these, a gene transfer method such as a lipofection or elect-portation method can be considered.
- the gene introduced into birds according to the present invention is not particularly limited, but includes a marker gene, a structural gene for expressing a target protein, a promoter gene for controlling the expression of these genes, a secretion signal gene, and the like. Is done.
- Examples of the marker gene include a neomycin resistance gene,
- the structural gene for expressing the target protein is not particularly limited, and examples include a gene encoding an antibody, an enzyme, or the like useful in the gene industry such as a human monoclonal antibody.
- genes of other useful physiologically active substances can also be used.
- the genes of antibodies with constant regions of the human IgG class and antibodies with the constant regions of subclasses of human IgGl, Pezura IgG2, -Petri IgG2 and mouse IgG2 Structural genes of exogenous antibodies, such as genes are preferred.
- Preferred examples of the structural gene include a structural gene of a chimeric antibody.
- Chimeric antibodies are antibodies composed of two or more different genetic traits.
- a medical antibody produced by a mouse or an ibridoma is derived from a mouse, so that when administered to a human body, there is a problem that a rejection reaction by the immune system is caused.
- the risk of rejection can be greatly reduced by, for example, humanizing the Fc portion or the like of a mouse antibody by a recombinant technique.
- chimeric antibodies examples include anti-human CD2 antibody, anti-CD20 receptor antibody, anti-TNF antibody and the like, and some of them have already been described as pharmaceuticals.
- More preferable structural genes include structural genes of scFv-Fc antibodies.
- Another group of medical-use recombinant antibodies is called a low-molecular antibody.
- Immunoglobulin IgG has a domain composed of VH and VL heterodimers called the Fvment of variable region (Fv: Fragment of variable region) that directly binds to the antigen. This Fv domain is about one-fifth of IgG. Despite its molecular weight, it has sufficient antigen binding ability by itself.
- a single-chain antibody (scFv: single chain) in which VH and VL domains are artificially linked with a peptide linker
- Fv small molecule antibody
- the antibody content in blood is preferably 0.5 ⁇ gZml or more, more preferably 5 ⁇ gZml or more.
- the antibody content in egg white is preferably 0.1 ⁇ g Zml or more, more preferably 1 ⁇ g It is at least Zml and the antibody content in the yolk is preferably at least 0.1 ⁇ g Zml, more preferably at least gZml.
- the antibody content in the blood is preferably at least 20 ⁇ gZml, more preferably at least 2000 ⁇ gZml.
- the antibody content in the egg white is preferably 5 / z gZml or more, more preferably 500 gZml or more.
- the antibody content in egg yolk is preferably at least 1 ⁇ gZml, more preferably at least 100 gZml.
- the promoter gene includes a constitutive promoter. It is preferable that the antibody gene is controlled by a constitutive promoter, since the expression of the antibody gene may be stabilized.
- a more preferred constitutive promoter is -Avian j8-actin motor.
- the protein production method of the present invention is characterized in that a target protein is recovered from the transgenic bird. More specifically, the present invention relates to a method for producing a protein for recovering and purifying a target protein from somatic cells, blood, and Z or eggs of transgenic birds. Eggs produced by the transgenic birds of the present invention are also one of the present invention.
- the content of the target protein in the above egg is preferably lmgZlOOg or more, more preferably 20mgZlOOg. It is at least lOOg, particularly preferably at least lOOmgZlOOg.
- a fertilized avian egg is incubated, and a replication-defective retrovirus vector is transmitted to an early embryo except a blastoderm stage immediately after oviposition, and the embryo is transfected. Incubation method is mentioned.
- a method for incubating avian fertilized eggs, incubating the embryo with a replication-deficient retrovirus vector in an embryo that preferably has an incubating power of preferably 24 hours or more, more preferably 48 hours or more, and incubating the embryo is also described in the present invention. This is one of the production methods of the invention.
- the method for producing a GO transgenic chimeric bird according to the present invention comprises microinjecting a replication-defective retrovirus vector into a fertilized egg that has passed a specified time after oviposition.
- the embryo divides into an upper layer and a lower layer, forming a blastocoel. Oviposition occurs when the lower layer of the blastoderm is formed, the original streak is formed, and the blastoderm takes the upper, middle, and lower triple structures, and the three germ layers are formed. Then, after embryo formation and growth, they hatch on day 22 after ovulation.
- the blastoderm stage is also called stage X, and since germ cells are generated from some of the cells at this stage, fertilized eggs at this stage are conventionally used for gene transfer.
- fertilized eggs in the blastoderm stage immediately after oviposition are hatched under conditions suitable for hatching, for example, at a temperature of about 37.7 to 37.8 ° C and a humidity of about 50 to 70% for chickens.
- the microinjection was performed with the passage of time as 0 hour. From 36 hours after the start of hatching in the quail and 50 hours after the start of incubation in the chick, the formation of a vasculature was observed on the yolk, and the pulsation of the organs confined to the heart could be observed.
- the replication-defective retrovirus vector, the gene to be introduced, and the transgenic bird used in the production method of the present invention include those similar to the GO transgenic chimeric bird described above.
- a gene not derived from a retrovirus be contained in a replication-defective retrovirus vector!
- examples of the “gene that is not derived from a retrovirus” include the above-mentioned structural gene, promoter gene, secretion signal gene and the like.
- the above-mentioned gene not derived from retroinoles is preferably a gene controlled by the -petri j8-actin promoter. Further, the gene not derived from the retrovirus is preferably a gene encoding an antibody.
- replication ability having a titer of preferably 1 ⁇ 10 7 cfu / ml or more, more preferably 1 ⁇ 10 8 cfu / ml or more, and still more preferably 1 ⁇ 10 9 cfu / ml or more Microinjection of the deletion type retrovirus vector is preferable in that the gene can be efficiently introduced.
- birds in which a gene has been introduced into a fertilized egg grow as transgenic birds having the transgene in a mosaic form in their somatic cells.
- This first-generation transgenic bird is called a GO transgenic chimeric bird.
- the second and third generations born by crossing GO transgenic chimeric birds and non-transgenic chimeric birds or GO transgenic chimeric birds are germ cells that have the introduced gene on the chromosome. When it develops from, it grows as an individual containing the transgene in somatic cells throughout the body. The offspring that inherit this germline chimeric individual transgene are called G1-G2-G3-transgenic birds for generations.
- the transgene By crossing the GO transgenic chimeric bird according to the present invention with a non-transgenic bird of the same species or a mated GO transgenic chimeric bird, the transgene can be transmitted to offspring, Complete transgenic birds with the transgene in somatic cells throughout the body can be produced.
- a transgene that stably transmits a transgene Establishing the ethnic bird strain enables stable quality production as a protein production system. Furthermore, since transgenic birds that are completely transgenic have a higher percentage of somatic cells carrying the transgene, it is expected that the amount of recombinant protein derived from the transgene may increase compared to GO transgenic chimeric birds. it can.
- the method for producing G1 transgenic birds of the present invention comprises producing and crossing the aforementioned GO transgenic chimeric birds.
- Mating types include GO transgenic female and wild-type female, GO transgenic female and wild-type female, GO transgenic female and female, and backcrossing by offspring and their parents is also possible. It is. Among them, the mating type of GOos and wild-type females is preferable in terms of efficiency because one GOos can cross 3 to 10 wild-type females.
- Germ-line chimeras can be selected by collecting the GOs sperm and examining the presence or absence of a transgene in the sperm.
- the transgene assay may be a PCR method, a Western plot method, or the like, but the present invention is not limited thereto.
- Another aspect of the present invention is a method for selecting a germline chimera in which G1 transgenic birds, G2 transgenic birds and their offspring oss sperm are collected, and the genes in the sperm are similarly tested. .
- a germline chimera is an individual having both sperm having a transgene and having no sperm. Chick matured from an embryo fertilized with the sperm containing the transgene become G1 transgenic with the transgene in all its somatic cells. Selecting germline chimeric GOs can produce G1 transgenic chimeric birds more efficiently than crossing randomly.
- the G1 transgenic bird and its progeny of the present invention must efficiently express a foreign gene introduced by a highly safe replication-defective retrovirus vector without inactivating it. Can be.
- the G1 transgenic bird of the present invention has a transgene present in all somatic cells, has stable protein expression at the individual level, and can be a stable supply system as an established strain. Further, the method for producing transgenic birds of the present invention makes it possible to safely and efficiently produce G1 transgenic birds, and G2 and G3 transgenic birds as descendants thereof.
- the Gl, G2, G3-transgenic birds of the present invention express a protein derived from a foreign gene in somatic cells, and recover and purify serum, albumen, and egg yolk proteins. It is possible to supply an inexpensive production system for proteins and antibodies attached to sugar chains that have been difficult to produce.
- the scFv-Fc antibody expression vector construct was prepared as follows.
- pMSCVneo removed from (Clontech) by a series of murine 'phosphoglycerate' kinase (PGK) restriction fragment containing the promoter and Neo 1 gene enzymes Bglll and BamHI, and the remaining vector fragment Serufurai Plasmid pMSCV was prepared by the procedure.
- PGK murine 'phosphoglycerate' kinase
- a GFP gene fragment was excised from pGREEN LANTERN-1 (manufactured by Gibco BRL) using the restriction enzyme Notl, and inserted into the Notl site of pZeoSV2 (+) (manufactured by Invitrogen).
- a plasmid having a structure in which the GFP gene was inserted in the same direction as the T7 promoter was designated as pZeoZ GFP.
- a GFP gene fragment was excised from pZeoZGFP with restriction enzymes EcoRI and Xhol, and ligated to a vector fragment of pMSCV treated with restriction enzymes EcoRI and Xhol to prepare plasmid pMSCV / G.
- ⁇ Act promoter After amplifying the one fragment, the ⁇ Ac promoter fragment was cut out with the restriction enzyme Sail and inserted into the Sail site of pETBlue-2 (manufactured by Novagen) to prepare a plasmid pETBlue / ⁇ Act.
- a ⁇ Act promoter fragment was excised from pETBlueZA Act with the restriction enzyme Sail, and inserted into the Xhol site of pMSCVZG.
- a plasmid having a structure into which the ⁇ Act promoter was inserted in the same direction as the GFP gene was designated as pMSCVZG ⁇ A.
- a scFv gene fragment was excised from pBlueZscFv with restriction enzymes Notl and BamHI, and inserted into NotI and BamHI sites of pCEP4 (Invitrogen) to prepare plasmid pCEP4ZscFv.
- the two i-Dai ⁇ 1 synthetic gen- eratives 5 attaggatccgagcccaaatcttgtgacaaact c-3 '(SEQ ID NO: 9, underlined BamHI restriction enzyme site) and 5'-agc ⁇ Seiitcatttac ccggagacaggga-3' (SEQ ID NO: 10) ,
- the underlined part is Hindlll restriction enzyme site) as a primer.
- a scFv gene fragment was excised from pCEP4ZscFv with the restriction enzymes Hindlll and BamHI.
- An Fc gene fragment was excised from pBlueZFc with the restriction enzymes BamHI and Hindlll. The two fragments cut out above were inserted into the Hindlll site of pBluescriptIISK (+) to prepare a plasmid pBlue / scFv-Fc.
- a gene fragment of the structure (scFv-Fc) in which the human antibody H chain ⁇ 1'Fc is linked to the variable region of the -chain tree antibody from pBlueZscFv-Fc is excised with the restriction enzyme Hindlll, It was ligated to the treated vector fragment of pMSCVZG ⁇ A.
- a plasmid having a structure in which the scFv-Fc gene was ligated in the same direction as the ⁇ Act port motor was designated as pMSCVZGAAscFv-Fc.
- knocking cells GP293 (manufactured by Clontech) were inoculated into 5 ⁇ 10 6 cells in a culture dish having a diameter of 100 mm and cultured. .
- the medium was replaced with fresh DMEM (Dalbecco's modified Eagle's medium), and 8 ⁇ g of pVSV-G vector (Clontech) and 8 ⁇ g of ⁇ MSCV / G ⁇ AscFv-Fc were added to the GP293 cells by the lipofection method. Introduced.
- the culture supernatant containing the virus particles was collected, and impurities were removed through a 0.45 / zm cellulose acetate filter (manufactured by Advantech). Polypropylene is added to the resulting solution. (Manufactured by Sigma) was added to give 10 ⁇ g Zml to prepare a virus solution.
- the prepared virus solution was added to separately cultured GP293 cells, and after culturing for 48 hours, the cells were cloned by the limiting dilution method to obtain a stable transformed GP293 strain that strongly expresses GFP.
- the obtained stable transformants were cultured in a 100 mm diameter dish so as to be 80% confluent, and 16 / z g of pVSV-G was introduced by a lipofection method. After 48 hours, 12 ml of the culture supernatant containing virus particles was recovered.
- the culture supernatant was centrifuged at 50,000 X g at 4 ° C for 1.5 hours to precipitate a virus.
- the high titer virus vector obtained in this way was 10 8 -10 9 cfuZ ml.
- Virus titer number of cells X dilution ratio X expression ratio (cf uZml)
- Chicken fertilized eggs (Japan Biochemical Laboratory) were used. The time when this fertilized egg was placed in an environment of 37.9 ° C and 65% humidity in an incubator (Model P-008 manufactured by Showa Franchi) with an automatic egg-turning device was taken as the hatching start time (0 hour). After that, hatching was performed every 15 minutes while turning at 90 degrees.
- the eggshell of a fertilized egg was disinfected with 70% ethanol, and the sharp end was cut into a 3.5 cm diameter circle with a diamond cutter (MINOMO7C710, manufactured by Minitar) to expose the embryo.
- a diamond cutter (MINOMO7C710, manufactured by Minitar) to expose the embryo.
- blood vessels were observed on the surface of the yolk, and it could be observed with a stereomicroscope that a part of the blood pulsated and became the heart's primordium.
- a stereomicroscope While observing the initial heart with a stereomicroscope, make a glass pipette (CD-1, Olympus) by micropipette.
- Example 2 With a micro-injector (Transjector 5246, manufactured by Eppendorf) to cut the subblastolar space using a microinjector (Transjector 5246, manufactured by Eppendorf). About 21 of the virus solution prepared in Example 2 was microinjected into the center. After filling the egg shell with the egg white up to the cut end, cover the egg white with a Teflon membrane (Milliwrap, manufactured by Millipore) and poly-Shiidai Biylidene wrap (Saran Wrap, manufactured by Asahi Kasei) using the egg white as a paste, and rotate 90 degrees every 30 minutes. Incubation was carried out while eggs were being laid.
- a Teflon membrane manufactured by Millipore
- Saran Wrap poly-Shiidai Biylidene wrap
- the GO transgenic chimera-pet bird born in Example 3 was bred to grow chicks.
- blood was collected from the subwing vein of the grown male chicks (individual identification numbers # 1111, # 3108, # 4102) to obtain a blood sample.
- the obtained blood was centrifuged at 15, OOO rpm for 10 minutes, and the amount of serum power scFv-Fc antibody obtained as a supernatant was measured.
- An anti-human IgG antibody (manufactured by Cosmo Bio) diluted with PBS was added to an ELISA plate at 100 ⁇ g / well and allowed to stand at 4 ° C. After washing each well three times with 200 ⁇ l of a PBS—0.05% Tween20 solution, PBS / 0.05% Tween20 solution 2% skim milk was added at 150 / zlZwell.
- a standard calibration curve was prepared using purified scFv-Fc.
- the vector construct pMSCVZscFv-Fc prepared in Example 1 was introduced into GP293 cells by the lipofection method, and the culture supernatant was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes at 4 ° C to remove solids. The supernatant was stirred while being cooled, and ammonium sulfate, which had been finely ground to 50% saturation, was gradually added (313 g of ammonium sulfate ZlOOOOml water) to precipitate the protein.
- Binding Buffer 10 ml (flow rate 2 ml Z minute).
- the protein solution dissolved in PBS was flowed for 1 mlZ, and scFv-Fc was adsorbed on the column. Unnecessary proteins are removed by flowing 20 ml of Binding Buffer at 1.7 mlZ, and Elution Buffer (7.507 g / l of glycine, adjusted to pH 2.5-3.0 with 2N HC1) at 1.5 ml / min to remove scFv-Fc Eluted.
- the eluted fraction was dialyzed three times against PBS (2L) to obtain purified scFv-Fc, and the protein concentration was determined from the absorbance at a wavelength of 280nm.
- Table 1 shows the blood antibody levels of the three male GO transgenic chimeric-bird chicks (individual identification numbers # 1111, # 3108, and # 4102) born in Example 3.
- Example 3 Three male GO tigers (individual identification numbers # 1111, # 3108, and # 4102) born in Example 3 Sussienique Chimera- ⁇ Chicken chick ⁇ ! Six months later, 0.2 mL of sperm was collected from the growing male transgenic chimera-Petri by abdominal massage.
- Example 5 a male GO transgenic chimera-petri (# 4102) in which a transgene was detected in sperm was crossed with three wild-type females (white leghorn) to obtain a fertilized egg.
- the fertilized egg was hatched in an incubator (Model P-008, manufactured by Showa Franchi) at 37.9 ° C and 65% humidity in an incubator equipped with an automatic egg turning device.
- an incubator Model P-008, manufactured by Showa Franchi
- chicks were born.
- the chicks were bred for one week, and 100 1 blood was collected from the inferior vein to separate serum, and the amount of antibody in the serum was quantified by the ELISA method of Example 4.
- the genome was extracted from the blood sediment obtained by centrifugation by the method of Example 5, and the transgene was confirmed by PCR.
- a primer set capable of amplifying 355 bp of a part of the GFP gene contained in the transgene: 5, CAACACTGGTCACTACCTTCACCTATG-3, (SEQ ID NO: 15) / 5, one ACGGATCCATCCTCAATGTTGTGTC-3, (SEQ ID NO: 16) was used.
- a primer set capable of amplifying a part of 317 bp of ovalbumin gene contained in -Avian genome: 5, -CGCTTTGATAAACTTCCAGGATTCGG-3, (SEQ ID NO: 17) / 5 '-CATCTAGCTGTCTTGCTTAAGCGTACA-3' (SEQ ID NO: 18) was used.
- the transgene As a result of testing the transgene from 110 chicks, the transgene was detected from 5 chicks. accidental The genome was extracted from each organ of this Gl individual who died suddenly, and the transgene was confirmed by PCR.
- the present method can express a scFv-Fc antibody based on a transgene and produce a complete G1 transgenic bird having the transgene in all somatic cells.
- the 77th chicken bird hatched according to Example 6 was found to be a G1 transgenic-bird (female) by the PCR method of Example 6.
- the individual number of G1 is # 77.
- the 103rd chick was G1 transgenic-Petri (os) by PCR (individual number # 103).
- Blood was collected from the subwings of the two G1 birds, lymphocytes were separated from 2 mL of blood by the Ficoll-pack method, and mitogen (Concanapalin A Cosmonoio), mercaptoethanol (Wako Pure Chemical Industries), Culture using RPMI1640 containing kanamycin sulfate (manufactured by Cosmonio) and 18% FBS (manufactured by Invitrogen) at 37 ° C in a 5% CO atmosphere.
- mitogen Concanapalin A Cosmonoio
- mercaptoethanol Wicoll-pack method
- RPMI1640 containing kanamycin sulfate manufactured by Cosmonio
- 18% FBS manufactured by Invitrogen
- the prepared chromosome specimen was dried for several days, stained with Hoechst 33258 (manufactured by Merck), subjected to UV treatment, dried, and analyzed by the FISH method.
- Probe DNA pMSCV / s cFv-Fc ⁇ BamHl
- piotin Cosmo Bio
- a goat anti-piotin antibody After reacting with ZFITC-anti-goat IgG, imaging with a fluorescence microscope (Leica DMRA system) and analysis with an image analyzer (Leica550CW-QFISH software) were performed.
- the probe DNA (pMSCV / scFv-Fc ⁇ BamHl) was excised from the pMSCV / scFv-Fc of Example 1 with a restriction enzyme treatment to cut out a BamHl-BamHl fragment (1.57kb) and labeled with biotin in a conventional manner. Produced.
- Example 8 G1 # 77 individuals (female) of Example 8 were bred with wild-type oss (white leghorn) and # 103 individuals (oss) were bred with wild-type female (white leghorn) to obtain sperm eggs and hatch.
- Genomes were extracted from the plasma of the chicks by the method of Example 5, and the presence or absence of the transgene was analyzed by PCR to determine whether the chicks were G2 transgenic.
- # 77 is G1 having two copies of the transgene on one chromosome, and it is probable that 3Z4 of chicks born in a cross with a wild type is transgenic. Of these, 1Z4 should have two copies of the transgene, like the G1 parent, and 2Z4 should be G2, which has only one of the transgenes with G1 affinity S.
- Gl # 77 had a blood antibody titer of 0.5-0.8 mgZmL, whereas G2, which was born as a result of mating with the wild type, had a similar blood antibody titer. there were. Also, as shown in Table 3, Gl # 103 had a blood antibody titer of 0.3-0.5 mg Showed similar blood antibody titers in G2. Further, as shown in Table 4, the # 77 G2 female with an average expression level of 0.3 mg ZmL of antibody in egg white expressed the same level of antibody in egg white.
- the transgenic bird of the method of the present invention can be applied as a low-cost protein production plant by using the offspring increased by crossing without generating gene silencing even with generations. It has been demonstrated that this is possible.
- the G1 transgenic bird and its progeny of the present invention must efficiently express a foreign gene introduced by a highly safe replication-defective retrovirus vector without inactivating it. Can be.
- the G1 transgenic bird of the present invention has a transgene in all somatic cells, has stable protein expression at the individual level, and can be a stable supply system as an established strain. .
- the method for producing transgenic birds of the present invention enables safe and efficient production of G1 transgenic birds, and further, G2 and G3 transgenic birds as progeny thereof.
- the Gl, G2, G3-transgenic birds of the present invention express proteins derived from foreign genes in somatic cells, and have been produced by collecting and purifying serum, egg white, and egg yolk caps. An inexpensive production system for proteins and antibodies provided by sugar chains, which was difficult, can be provided.
- FIG. 1 shows the structure of the scFv-Fc antibody expression vector construct pMSCVZG ⁇ AscFv-Fc.
- Amp 1 indicates an ampicillin resistance gene.
- ⁇ act indicates the j8-actin promoter gene.
- ⁇ + indicates a packaging signal sequence.
- GFP represents the green fluorescent protein gene.
- scFv-Fc indicates a scFv-Fc antibody gene.
- 5 'LTR and 3, LTR indicate the long terminal repeat sequence of MoMLV, respectively.
- FIG. 2 shows the results of PCR analysis of a transgene in the extracted genome of each organ of the G1 transgenic- ⁇ bird.
- M indicates a marker
- C1 indicates a positive control
- C2 indicates a negative control.
- L, K, H, MU and I indicate liver, kidney, heart, muscle and intestine, respectively.
- GFP Green indicates the 'fluorescent' protein gene and OVA indicates the ovalbumin gene.
- FIG. 3 shows the results of FISH analysis of G1 transgenic-Petries # 77 and # 103.
- the arrow indicates the transgene (pMSCVZscFv-Fc ⁇ BamHl).
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Abstract
鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に有用タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、孵化によりＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を得、該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を、該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類若しくはその子孫又は野生型鳥類と交配することにより得られるＧ１トランスジェニック鳥類及びその子孫を提供する。
鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に有用タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、孵化によりＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を得、該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を、該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類又はその子孫又は野生型鳥類と交配することにより得られるＧ１トランスジェニック鳥類及びその子孫である。
Description
明 細 書
遺伝子導入鳥類及びその作製法
技術分野
[0001] 本発明は、生理活性タンパクの生産に応用可能な遺伝子導入（トランスジヱニック）鳥 類の作製法、ならびに該作製法により得られる遺伝子導入 (トランスジヱニック)鳥類 に関する。
背景技術
[0002] 遺伝子組換え技術の発展により、数多くの生理活性タンパクが工業生産され、医薬 品などの用途に用いられるようになった。しかしこれら組換えタンパクの生産に最もよ く用いられる大腸菌等の微生物は、糖鎖を付与する能力がないため、生産されたタ ンパクは元来持っている糖鎖修飾を受けられず、本来の活性が低下したり安定性が 悪くなるとの欠点があった。
[0003] 更に、微生物は抗体のような複数のユニットからなる複雑なタンパクを生産することが できないため、医薬品として使用されるモノクローナル抗体の生産に利用できないこ とも大きな難点である。
[0004] このため、現在糖鎖を必要とするエリスロポエチンなどの生理活性タンパクや、抗体 医薬品などは、培養細胞リアクターによって生産されているが、このような動物細胞に よる生産法は微生物に比べコストが高くつくため、患者や行政の負担増加が問題とな つている。
[0005] これらの欠点を克服した新たなタンパク生産法として、遺伝子導入動物（トランスジェ ニック動物）の利用が注目を浴びている。トランスジエニック動物が乳汁や血液、卵中 に生産するタンパクは糖鎖が付与されるうえ、その生産コストは動物培養細胞の 1Z
10— 1/100との試算もある（非特許文献 1)。なかでも鳥類を使ったトランスジェ-ッ クは、成熟までの期間が短い事や、飼育面積が少なくて済むとの利点があるため実 用化が嘱望されている。
[0006] このように、多くの利点をもつトランスジエニック鳥類によるタンパク生産技術であるが
、その実用化にはいくつかの困難があった。そのひとつは鳥類受精卵へ外部遺伝子
を導入する事が難しい点であつたが (非特許文献 2)、本発明者らは安全性の高い複 製能欠失型ウィルスベクターを用い、鳥類初期胚に遺伝子をマイクロインジェクション することで体の一部に導入遺伝子を持つトランスジエニックキメラ (GOと呼ぶ）を効率 的に作製することに成功した (特許文献 1)。
[0007] しかしこのようにして導入された遺伝子は、宿主力 Sもつ生体防御機構により不活性ィ匕 され (サイレンシングと呼ばれる現象）、タンパクを発現しないか、発現しても微量であ る。更に医薬品としてタンパクを安定に供給するには、 GOトランスジエニックキメラの 子孫として体細胞全体に導入遺伝子をもつ鳥類の系統確立が必要である。これら G 0トランスジエニックキメラの子孫は、その世代数に準じて G1— G2— G3—と呼ばれる 特許文献 1：特開 2002-176880号公報
特許文献 2：特表 2001— 520009号公報
非特許文献 l :Nature Biotechnology 19, 184 2001
非特干文献 2： Harvey AJ, et al. Consistent production of transgenic c hickens using replication— deficient retroviral vectors and high— thro ughput screening procedures. Poult. Sci. Feb. 2002, Vol. 81, No. 2, p . 202-212
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、上記現状に鑑み、トランスジエニック鳥類を、安全で効率のよいタンパク生 産系として応用するために、体細胞全体に導入遺伝子が入り、導入遺伝子に由来す るタンパクを高発現する効率のょ 、トランスジエニック鳥類作製法を確立することを目 的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明のトランスジエニック鳥類は、鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除 くそれ以降の初期胚に、
a)目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジ 工クシヨンし、
b)孵化により GOトランスジエニックキメラ鳥類を得、
c)該 GOトランスジヱニックキメラ鳥類を、該 GOトランスジヱニックキメラ鳥類若しくはそ の子孫、又は、野生型鳥類と交配することにより、 G1トランスジエニック鳥類として得ら れる。
[0010] この G1トランスジエニック鳥類を、 GOトランスジエニックキメラ、 G1トランスジエニック鳥 類同士、野生型鳥類等と交配することにより、継代的に誕生する G2トランスジ ニック 鳥類及びその子孫を開示する。
つまり、本発明は、また、 G1トランスジエニック鳥類を、 GOトランスジエニック鳥類、該 G1トランスジエニック鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配することにより 得られる、 G2トランスジエニック鳥類又はその子孫であることを特徴とするトランスジェ ニック鳥類である。
[0011] インジェクションする初期胚は、鳥類の種類によって決まる特定の時間経過したのち
、胚に形成される初期の心臓内にインジヱクシヨンすることにより、効果的に発現する トランスジェニック鳥類が得られる。
[0012] トランスジエニック鳥類に導入する目的タンパク質遺伝子としては、エリスロポエチン の構成遺伝子のように、発現したタンパクの活性に糖鎖が必要なものや、抗体遺伝 子などが挙げられる。
[0013] 遺伝子を導入する鳥類として、 -ヮトリ又はゥズラを使用することにより、多産で安定 的に卵の形で目的タンパク質を得る事ができる。
[0014] 本発明は、また、鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期 胚に、
a)目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジ 工クシヨンし、
b)孵化により GOトランスジエニックキメラ鳥類を得、
c)該 GOトランスジヱニックキメラ鳥類を、該 GOトランスジヱニックキメラ鳥類若しくはそ の子孫、又は、野生型鳥類と交配することよりなる G1トランスジエニック鳥類の作製法 である。
[0015] 本発明は、また、上記 G1トランスジエニック鳥類を、 GOトランスジエニック鳥類、該 G1
トランスジヱニック鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配することにより、 G 2トランスジエニック鳥類又はその子孫を作製することを特徴とするトランスジエニック 鳥類の作製法である。
[0016] 本発明は、また、上記の方法で作製されたトランスジエニック鳥類の体細胞、血液又 は卵から目的タンパク質を抽出することよりなるタンパク質の生産法である。
本発明は、また、上述の方法で作製されたトランスジヱニック鳥類である。
[0017] マイクロインジェクションによって導入される遺伝子の、染色体上の位置を特定するこ とはできないが、作製された GOトランスジヱニックキメラの中から生殖系列に挿入遺 伝子をもつ生殖系列キメラを選別することにより、 G1を効率的に産生する GO親を特 定することは可能である。選別に際しては GOのォスカも腹部マッサージ法により精子 を採取し、この精子中の導入遺伝子を検定する方法が有効である。この選別法も本 発明のひとつである。
[0018] 本発明は、また、鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期 胚に、目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロイ ンジェクシヨンし、孵化することにより得られた GOトランスジエニック鳥類の血中におけ る、目的タンパク質の発現を確認することによる、 GOトランスジエニックキメラ鳥類の選 別法である。
[0019] 本発明は、このようにタンパク生産に有利なトランスジエニック鳥類の作製法を開示す る。また該作製法による遺伝子導入鳥類を開示する。
この方法により作製されたトランスジヱニック鳥類は、医薬品等に利用可能なタンパク 質の生産に利用できる。
[0020] 以下に本発明を詳述する。
本発明の G1トランスジエニック鳥類及び/又はその子孫は、複製能欠失型レトロウイ ルスベクターによって外来遺伝子が導入された鳥類であって、外来遺伝子をその体 細胞に均等に含有し、その導入遺伝子に由来する目的タンパク質を、血中、卵白中 あるいは卵黄中に安定に発現することを特徴とする。
[0021] 本発明で使用する鳥類としては特に限定されず、例えば-ヮトリ、七面鳥、カモ、ダチ ヨウ、ゥズラなど、食肉、採卵目的で家畜化されている家禽鳥類や愛玩用鳥類を挙げ
ることができる。なかでも-ヮトリやゥズラは入手が容易で、産卵種としても多産である 点が好ましい。
[0022] 本発明で使用されるレトロウイルスベクターとしては、モロ-一'ミューリン'ロイケミア' ウィルス（MoMLV)、ェビアン.ロイコシス.ウィルス（ALV)等に由来するベクターや 、レンチウィルスベクター等が挙げられる。なかでも MoMLVに由来するものが好まし いが、本発明はこれに限定されるものではない。
[0023] 安全性を考慮し、遺伝子導入ベクターとして用いられるウィルスは、通常ウィルス粒 子の複製に必要な 3種の遺伝子 gag、 pol、 envのうちいずれかまたは全てを欠くこと により、自己複製能を欠失したウィルスが用いられる。鳥類細胞にこのウィルスベクタ 一を効率的に感染させるため、外皮タンパクを人工的に VSV— G (水疱性口内炎ウイ ルス由来）シユードタイプとしたウィルスベクターが好ましいが、本発明はこのウィルス タイプに限定されるものではな 、。
[0024] ノ ッケージング細胞またはヘルパーウィルス等を利用することにより調製されたシュ ードタイプのウィルスベクターは、通常のマイクロインジェクション法（Bosselman, R . Aら（1989) Science 243、 533)により、初期胚、血管内、心臓内へ導入される。 遺伝子導入法としてはこの他にもリポフエクシヨンやエレクト口ポレーシヨン法等が考え られる。
[0025] 本発明により鳥類に導入される遺伝子は特に限定されな 、が、マーカー遺伝子や目 的タンパク質を発現するための構造遺伝子、これらの遺伝子発現をコントロールする プロモーター遺伝子、分泌シグナル遺伝子等により構成される。
[0026] 上記マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、 |8—ガラクトシダーゼ遺伝 子、蛍光タンパク質例えば GFP (グリーン'フルォレツセント ·プロテイン)等をコードし た遺伝子が挙げられる。
[0027] 上記目的タンパク質を発現するための構造遺伝子としては特に限定されず、ヒトモノ クローナル抗体などの遺伝子産業上有用な抗体、酵素等をコードした遺伝子などが 挙げられる。また、その他の有用生理活性物質の遺伝子を用いることもできる。特に 、卵中での蓄積がよいことから、ヒト IgGクラスの定常領域をもつ抗体の遺伝子や、ヒト IgGl、ゥズラ IgG2、 -ヮトリ IgG2やマウス IgG2のサブクラスの定常領域をもつ抗体
の遺伝子など外来性抗体の構造遺伝子が好ま 、。
[0028] また好ましい上記構造遺伝子としては、キメラ抗体の構造遺伝子が挙げられる。キメ ラ抗体とは、 2種以上の異なる遺伝形質から構成される抗体のことをいう。従来マウス ノ、イブリドーマによって作製された医療用抗体は、マウス由来であるためヒト体内に投 与されると免疫系による拒絶反応が引き起こされるという問題があった。この欠点を解 消するため、例えばマウス抗体を組換え手法によって Fc部等をヒト化することにより、 拒絶反応のリスクを大幅に軽減することができる。
[0029] 上記キメラ抗体としては、例えば抗ヒト CD2抗体、抗 CD20受容体抗体、抗 TNF抗 体などが挙げられ、すでに医薬品として上巿されているものもある。
[0030] さらに好ましい上記構造遺伝子としては、 scFv— Fc抗体の構造遺伝子が挙げられる 。医療用の組換え抗体には、この他に低分子抗体と称される一群がある。免疫グロブ リン IgGには直接抗原と結合する可変領域（Fv: Fragment of variable region) と呼ばれる VH、 VLのへテロ二量体からなるドメインがあり、この Fvドメインは IgGの 約 5分の 1の分子量でありながら、単独で充分な抗原結合能を持つ。 VH、 VLドメイ ン間を人工的にペプチドリンカ一で結合したものが 1本鎖抗体（scFv: single chain
Fv)と呼ばれる低分子抗体で、 VH、 VL単独よりも安定性が向上することが知られ ていた。
[0031] Powersら（Powers, D. Bら（2000)J Immunol Method. 251, 123)は、この sc Fvにヒ HgG 1に由来する Fc部を融合させることで、血中での安定性が増すことを見 出した。この scFv— Fc抗体は医療用として有用と考えられるが、安価な大量生産シス テムである大腸菌では生産されな!、。
[0032] 本発明の GOトランスジエニックキメラ鳥類において、鳥類に導入される遺伝子として、 これらヒトモノクローナル抗体遺伝子、キメラ抗体遺伝子、 scFv— Fc抗体遺伝子等を 使用することにより、従来生産が困難だった抗体医薬品を安価に大量生産することが できる
[0033] 例えば、キメラ抗体遺伝子を導入した GOトランスジエニックキメラ鳥類の場合、血液中 の抗体含有量は、好ましくは 0. 5 μ gZml以上、より好ましくは 5 μ gZml以上である 。また、卵白中の抗体含有量は、好ましくは 0. 1 μ gZml以上、より好ましくは 1 μ g
Zml以上であり、卵黄中の抗体含有量は、好ましくは 0. 1 μ gZml以上、より好まし くは: gZml以上である。
[0034] また、 scFv— Fc抗体遺伝子を導入した GOトランスジエニックキメラ鳥類の場合、血液 中の抗体含有量は、好ましくは 20 μ gZml以上、より好ましくは 2000 μ gZml以上 である。また、卵白中の抗体含有量は、好ましくは 5 /z gZml以上、より好ましくは 50 0 gZml以上である。卵黄中の抗体含有量は、好ましくは 1 μ gZml以上、より好ま しくは 100 gZml以上である。卵黄中では抗体が蓄積されたのち、酵素等により分 解されるが、これは分解を受けないものとした含有量を示す。卵黄中における抗体の 分解は、早い段階での酵素阻害剤の添加、分解を受ける構造の修飾等により防ぐこ とがでさる。
[0035] 上記プロモーター遺伝子としては、構成的なプロモーターが挙げられる。抗体遺伝 子が構成的なプロモーターにより制御されている場合、抗体遺伝子発現が安定して よいので好ましい。より好ましい構成的なプロモーターとして、 -ヮトリ j8—ァクチンプ 口モーターが挙げられる。 —ァクチンプロモーターで発現制御した場合、 目的タン パク質は血中に発現される特徴がある。
[0036] トランスジエニック動物によるタンパク生産では乳汁、あるいは卵中に目的タンパク質 を生産させる時、性成熟によって乳汁分泌、あるいは産卵等が開始されるまでその生 産量がどれくらいか検討がつかないとの欠点があった。生物種によっては性成熟に は数年かかる場合もあり、産業的に目的タンパク質を計画生産する時の大きな不安 定要素となっていた。この点、 j8—ァクチンプロモーターで発現制御したトランスジェ ニック鳥類においては、幼鳥の段階で血液中のタンパク発現量を調べる事で、性成 熟後の卵中タンパク発現量を予見的に把握することが可能であり、得られた結果に 従い選別を行うことで計画生産には大きなプラス要因となる。
[0037] 本発明のタンパク生産法は、上記トランスジヱニック鳥類から目的タンパク質を回収 することを特徴とする。より詳細には、作製されたトランスジエニック鳥類の体細胞、血 中及び Z又は卵中から目的タンパク質を回収、精製するタンパク質の生産法である。 また、本発明のトランスジエニック鳥類が生んだ卵もまた本発明の 1つである。上記卵 の目的タンパク質の含有量は、好ましくは lmgZlOOg以上、より好ましくは 20mgZ
lOOg以上、特に好ましくは lOOmgZlOOg以上である。
[0038] 次に本発明の G1トランスジエニック鳥類及びその子孫の親となる、 GOトランスジェ- ックキメラ鳥類の作製法にっ 、て説明する。
[0039] 当該作製法の 1つとして、鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以 降の初期胚へ複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させる 作製法が挙げられる。また、鳥類受精卵を孵卵し、孵卵開始力も好ましくは 24時間 以降、より好ましくは 48時間以降の初期胚へ複製能欠失型レトロウイルスベクターを 感染させ、その胚を孵化させる作製法も、本発明の作製法の 1つとして挙げられる。
[0040] より好ましくは、上記初期胚に形成される心臓内へ、複製能欠失型レトロウイルスべク ターをマイクロインジェクションする方法である。
[0041] つまり、本発明に関わる GOトランスジエニックキメラ鳥類の作製法は、放卵後特定の 時間経過した受精卵に複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジエタショ ンすることよりなる。放卵後の受精卵の初期発生について-ヮトリを例にとると、まず 輸卵管内で受精した卵は、受精後約 1. 5時間で卵割を開始する。細胞質がつなが つたまま盤割が始まった卵は、 1日かけて体外に放出される間に分裂し、約 6万個の 細胞カゝらなる胚盤葉と呼ばれる胚になる (胚盤葉期)。この胚盤葉は、卵黄中央部の 直径 3— 4mmの白いリングとして観察される。この胚は、上層と下層に分裂し、割腔 を形成する。放卵は胚盤葉下層が形成されるころに起こり、原条が形成され、胚盤葉 は上、中、下の三重構造を取り、三胚葉が形成される。その後、胚の形成、成長を経 て、排卵から 22日目に孵化する。胚盤葉期は、ステージ Xとも呼ばれ、この時期の細 胞の一部から生殖細胞が生じることから、従来は遺伝子導入の対象としてこの時期の 受精卵を使用している。
[0042] 本発明においては放卵直後、胚盤葉期の受精卵を孵化条件、例えばニヮトリならば 37. 7— 37. 8°C、湿度 50— 70%程度の孵化に適した環境条件においた時間を 0 時間とし、経時的にマイクロインジヱクシヨンを行った。ゥズラでは孵卵開始から 36時 間後、ニヮトリでは孵卵開始後 50時間頃から、卵黄上に血管系の形成が観察され、 心臓に分ィ匕する器官の脈動が観察できた。
[0043] 上述の遺伝子を導入した受精卵の孵化には、本発明者らが開発した人工卵殻による
方法 (Kamihira, M.ら（1998) Develop. Growth Differ. , 40, 449)等が応用 できる。
[0044] 本発明の作製法において使用する複製能欠失型レトロウイルスベクター、導入する 遺伝子、遺伝子導入鳥類としては、上述した GOトランスジエニックキメラ鳥類と同様の ものが挙げられる。
[0045] 本発明の作製法においては、レトロウイルスに由来しない遺伝子が複製能欠失型レト ロウィルスベクターに含有されて!、ることが好まし!/、。
なお本発明の作製法において、「レトロウイルスに由来しない遺伝子」としては、上述 した構造遺伝子、プロモーター遺伝子、分泌シグナル遺伝子等が挙げられる。
上記レトロゥイノレスに由来しない遺伝子は、 -ヮトリ j8—ァクチンプロモーターにより制 御されている遺伝子であることが好ましい。また、上記レトロウイルスに由来しない遺 伝子は、抗体をコードする遺伝子であることが好ま 、。
[0046] 本発明の作製法では、好ましくは 1 X 107cfu/ml以上、より好ましくは 1 X 108cfu/ ml以上、更に好ましくは 1 X 109cfu/ml以上のタイターを持つ複製能欠失型レトロ ウィルスベクターをマイクロインジェクションすることが、遺伝子を効率よく導入できる 点で好ましい。
[0047] 本発明の作製法で、受精卵に遺伝子を導入された鳥類は、その体細胞にモザイク状 に導入遺伝子をもったトランスジエニック鳥類として成長する。この一世代目の遺伝子 導入鳥類を、 GOトランスジエニックキメラ鳥類と呼ぶ。
[0048] GOトランスジエニックキメラ鳥類と非トランスジエニック鳥類、あるいは GOトランスジェ ニックキメラ鳥類同士を交配させて誕生する二世代目、三世代目は、これらが導入遺 伝子を染色体にもつ生殖細胞から発生した場合、全身の体細胞に導入遺伝子を含 有する個体として成長する。この生殖系列キメラ個体力 導入遺伝子を受け継ぐ子孫 を、代々 G1— G2— G3—トランスジエニック鳥類と称する。
[0049] 本発明による GOトランスジエニックキメラ鳥類を同種の非トランスジエニック鳥類ある いは配偶型 GOトランスジエニックキメラ鳥類と交配させることにより、導入遺伝子を子 孫に伝播させることができるとともに、全身の体細胞に導入遺伝子をもつ完全なトラン スジエニック鳥類を作製できる。このように安定的に導入遺伝子を伝播するトランスジ
エニック鳥類の系統を確立することで、タンパク産生システムとしての品質の安定ィ匕が 可能である。更に完全なトランスジエニック鳥類は、導入遺伝子をもつ体細胞の割合 が多いことから、 GOトランスジエニックキメラ鳥類に比べ、導入遺伝子に由来する組 換えタンパク質の産生量が増加する場合もあると予想できる。
[0050] 本発明の G1トランスジエニック鳥類の作製法は、前述の GOトランスジエニックキメラ鳥 類を作製し、交配させることよりなる。交配型は GOトランスジエニックォスと野生型メス 、 GOトランスジエニックメスと野生型ォス、 GOトランスジエニックのォスとメス等が考えら れ、更に子孫とその親による戻し交配も可能である。中でも GOォスと野生型メスの交 配型は、 1羽の GOォスに対し、野生型メス 3羽から 10羽を交配させることができるた め、効率の点力も好ましい。
[0051] 上記 GOォスの精子を採取し、精子中の導入遺伝子の有無を調べる事により、生殖 系列キメラを選別できる。導入遺伝子検定法には PCR法、ウェスタンプロット法等が 考えられるが、本発明はこれに限定されない。
また、 G1トランスジエニック鳥類、 G2トランスジエニック鳥類やその子孫のォスの精子 を採取し、同様にして精子中の遺伝子を検定する生殖系列キメラの選別法もまた本 発明の 1つである。
[0052] 生殖系列キメラはォスの場合、導入遺伝子をもつ精子ともたない精子を併せ持った 個体となる。導入遺伝子を含む精子が受精した胚から成熟した雛は、その体細胞全 体に導入遺伝子をもつ G1トランスジエニックとなる。生殖系列キメラ GOを選別するこ とで、ランダムに交配するよりも効率的に G1トランスジエニックキメラ鳥類を作製するこ とがでさる。
発明の効果
[0053] 本発明の G1トランスジエニック鳥類及びその子孫は、安全性の高い複製能欠失型レ トロウィルスベクターで導入された外来遺伝子を、不活性化することなく効率的に発 現することができる。
[0054] また本発明の G1トランスジエニック鳥類は、体細胞全体に導入遺伝子が存在し、個 体レベルでタンパクの発現が安定で、また確立された系統として安定な供給系となる ことができる。
[0055] 更に本発明のトランスジエニック鳥類作製法は、安全かつ効率的に G1トランスジェ- ック鳥類、更にその子孫としての G2、 G3トランスジエニック鳥類を作製することを可能 にする。
[0056] 本発明の Gl、 G2、 G3—トランスジヱニック鳥類は、体細胞で外来遺伝子に由来す るタンパクを発現し、血清、卵白、卵黄カゝら回収、精製することで、これまで生産困難 であった糖鎖が付与したタンパクや抗体類の安価な生産系を供給することができる。 発明を実施するための最良の形態
[0057] 以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定される ものではない。
(実施例 1) scFv— Fc抗体発現ベクターコンストラクトの作製
scFv— Fc抗体発現ベクターコンストラクトは、以下のように作製した。
[0058] 1. pMSCVneo (クロンテック社製）から一連のミューリン'ホスホグリセレート'キナー ゼ（PGK)プロモーター及び Neo1遺伝子を含む断片を制限酵素 Bglll及び BamHI によって除去し、残ったベクター断片のセルフライゲーシヨンによりプラスミド pMSCV を作製した。
[0059] 2. pGREEN LANTERN— 1 (ギブコ BRL社製）から GFP遺伝子断片を制限酵素 Notlによって切り出し、 pZeoSV2 ( + ) (インビトロジェン社製）の Notlサイトに挿入し た。 T7プロモーターと同方向に GFP遺伝子が挿入された構造のプラスミドを pZeoZ GFPとした。
[0060] 3. pZeoZGFPから GFP遺伝子断片を制限酵素 EcoRI及び Xholによって切り出し 、制限酵素 EcoRI及び Xholによって処理した pMSCVのベクター断片に連結し、プ ラスミド pMSCV/Gを作製した。
[0061] 4. 2つのィ 学合成オリゴヌクレオチド 5 ' -acecgtcgacgtgcatgcacgctcattg-3， (配 列番号 1、下線部は Sail制限酵素サイト）及び 5， -acgcgtcgacaacgcagcgactcccg 3' (配列番号 2、下線部は Sail制限酵素サイト）をプライマーとする PCR(94°CZl 5秒→50°CZ30秒→68°CZl分： 10サイクル； 94°CZ15秒→62°CZ30秒→68°C /1分： 30サイクル; KOD— Plus— DNAポリメラーゼ（東洋紡社製） )により pMiwZ (S uemori et al. , 1990, Cell Diff. Dev. 29 : 181— 185)から Δ Actプロモ
一ター断片を増幅後、制限酵素 Sailによって Δ Actプロモーター断片を切り出し、 p ETBlue-2 (ノバジェン社製）の Sailサイトへ挿入し、プラスミド pETBlue/ Δ Actを 作製した。
[0062] 5. pETBlueZ A Actから Δ Actプロモーター断片を制限酵素 Sailによって切り出し 、 pMSCVZGの Xholサイトへ挿入した。 GFP遺伝子と同方向に Δ Actプロモータ 一が挿入された構造のプラスミドを pMSCVZG Δ Aとした。
[0063] 6. 5，末端をリン酸化した 2つの化学合成オリゴヌクレオチド 5，一 ei^ccatgaggtctt tgctaatcttggtgctttgcttcctgcccctggctgctctgggg— 3 (目 ti歹 U番 3、下線部は Xb al末端、 は Haelll末 )及び 5 — ccccagagcagccaggggcaggaagcaaagcac caagattagcaaagacctcatggt-3 ' (配列番号 4、王魁部は Xbal末端、下線部は Hae III末端)をァニールさせ、リゾチーム分泌シグナルの遺伝子断片を調製した。 2つの ィ匕学合成オリゴヌクレオチド 5， -gcgtttaaagtgacgttggacgtccg-3，（配列番号 5、 下線部は Dral制限酵素サイト）及び 5， -attaggatccgcgcttaaggacggtcagg-3， ( 配列番号 6、下線部は BamHI制限酵素サイト）をプライマーとする PCR (94°CZl5 秒→58°CZ30秒→68°CZl分： 30サイクル）により HUC213細胞の-ヮトリ抗体可 変領域遺伝子から調製された一本鎖抗体 (scFv)の遺伝子を含んだプラスミド pPDS /scFv (Nakamura et al. , 2000, Cytotechnology 32 : 191— 198)力も scF v遺伝子断片を増幅後、制限酵素 Dral及び BamHIによって切り出した。 pBluescri ptIISK ( + ) (ストラタジーン社製)の Xbal、 BamHIサイトに上記調製した 2断片を挿 入し、プラスミド pBlueZscFvを作製した。
[0064] 7. pBlueZscFvから scFv遺伝子断片を制限酵素 Notl及び BamHIによって切り出 し、 pCEP4 (インビトロジェン社製）の NotI、 BamHIサイトへ挿入し、プラスミド pCEP 4ZscFvを作製した。
[0065] 8.ヒト IgGl産生ミエローマ細胞 IM— 9 (ジャパニーズ 'コレクション'ォブ'リサーチ'バ ィオリソーシズ 0024)力ら mRNA isolation Kit (ロッシュ社製）を用いて mRNA を取得し、得られた mRNAから ReverTra Ace (東洋紡社製）を用いて cDNAライ ブラリを調製した。 2つの化学合成オリゴヌクレオチド 5，-caagcttcaagggcccat-3， ( 配列番号 7)及び 5， -atttacccggagacaggga-3，（配列番号 8)をプライマーとする P
CR(95°CZ2分→52°CZ30秒→74°CZ3分： 30サイクル； Pfu DNAポリメラーゼ (プロメガ社製)）により上記 cDNAライブラリから Μ γ 1遺伝子断片を増幅した。さら に、 2つのィ匕^ 1合成才ジ メクレ才テ 5 — attaggatccgagcccaaatcttgtgacaaaact c-3' (配列番号 9、下線部は BamHI制限酵素サイト）及び 5'— agc^Seiitcatttac ccggagacaggga-3' (配列番号 10、下線部は Hindlll制限酵素サイト）をプライマー とする PCR (94°CZ15秒→58°CZ30秒→68°CZl分： 30サイクル; KOD— plus— DNAポリメラーゼ）により上記 PCR産物からヒト抗体 H鎖 γ 1の Fc領域 (Fc)の遺伝 子断片を増幅後、制限酵素 BamHI及び Hindlllによって切り出し、 pBluescriptllS K ( + )の BamHI、 Hindlllサイトへ挿入し、プラスミド pBlue/Fcを作製した。
[0066] 9. pCEP4ZscFvから scFv遺伝子断片を制限酵素 Hindlll及び BamHIによって切 り出した。 pBlueZFcから Fc遺伝子断片を制限酵素 BamHI及び Hindlllによって 切り出した。 pBluescriptIISK( + )の Hindlllサイトへ上記切り出した 2断片を挿入し 、プラスミド pBlue/scFv— Fcを作製した。
[0067] 10. pBlueZscFv— Fcから-ヮトリー本鎖抗体可変領域にヒト抗体 H鎖 γ 1 'Fcが連 結した構造 (scFv— Fc)の遺伝子断片を制限酵素 Hindlllによって切り出し、制限酵 素 Hindlllによって処理した pMSCVZG Δ Aのベクター断片に連結した。 Δ Actプ 口モーターと同方向に scFv— Fc遺伝子が連結された構造のプラスミドを pMSCVZ G AAscFv— Fcとした。
このように作製した複製能欠失型レトロウイルスベクターのベクターコンストラクト pMS CV/G Δ AscFv— Fcの構造を図 1に示した。
[0068] (実施例 2) scFv— Fc抗体発現レトロウイルスベクターの調製
実施例 1で作製したベクターコンストラクト pMSCV/G AAscFv— Fcよりレトロウィル スベクターを調製するため、ノ ッケージング細胞 GP293 (クロンテック社製)を直径 1 OOmmの培養ディッシュに 5 X 106細胞植え、培養した。培地を新鮮な DMEM (ダル べッコ変法イーグル培地）に交換し、 pVSV— Gベクター（クロンテック社製） 8 μ gと ρ MSCV/G Δ AscFv-Fc8 μ gをリポフエクシヨン法により前記 GP293細胞に導入し た。 48時間後、ウィルス粒子を含む培養上清を回収し、 0. 45 /z m酢酸セルロースフ ィルター（アドバンテック社製)を通して夾雑物を除去した。得られた溶液にポリプレン
(シグマ社製）を 10 μ gZmlとなるように加えウィルス液とした。
[0069] 調製したウィルス液を別に培養した GP293細胞に加え、 48時間培養後、細胞を限 界希釈法によりクローユングし、 GFPを強く発現する安定形質転換 GP293株を取得 した。
[0070] 得られた安定形質転^ ¾を 80%コンフルェントとなるよう直径 100mmディッシュに 培養し、 16 /z gの pVSV— Gをリポフエクシヨン法で導入した。 48時間後ウィルス粒子 を含む培養上清 12mlを回収した。
[0071] この培養上清を 50, 000 X g、 4°Cで 1. 5時間遠心を行い、ウィルスを沈殿させた。
上清を除き、ウィルス粒子を含む沈殿物に 50 1の 50mM Tris— HCl(pH7. 8)、 1 30mM NaCl、 ImM EDTA溶液を加え、 4°Cでー晚放置後、よく懸濁してウィル ス溶液を回収した。このようにして得られた高タイターウィルスベクターは、 108— 109 cfuZ mlで ¾> た。
[0072] ウィルスタイターの測定は、以下のように行った。測定の前日に NIH3T3細胞（ァメリ カン 'タイプ'カルチヤ一'コレクションより入手）を直径 35mmのディッシュに 7 X 104 細胞植え培養した。 102— 106倍に希釈したウィルス溶液を各ディッシュに lml加え、 48時間後に蛍光顕微鏡により GFPを発現している細胞の割合（100%を 1とする）を 測定し、以下の計算式によりタイターを決定した。
ウィルスタイター =細胞数 X希釈率 X発現割合 (cf uZml)
[0073] (実施例 3) -ヮトリ胚へのレトロウイルスベクターのインジェクション
ニヮトリ受精卵（日本生物化学研究所)を使用した。この受精卵を自動転卵装置が内 蔵された孵卵器（昭和フランキ社製 P— 008型）内で 37. 9°C、湿度 65%環境に置い た時刻を孵卵開始時刻（0時間）とし、以後 15分毎に 90度転卵しながら孵卵を行つ た。
[0074] 遺伝子注入のため、受精卵の卵殻を 70%エタノールで消毒し、鋭端部を直径 3. 5c mの円形にダイヤモンドカッター（MINOMO7C710、ミニター社製）で切り取り、胚 を露出させた。孵卵後約 50時間目力も卵黄表面に血管の発生が認められ、その一 部が脈動して心臓の原基となることが実体顕微鏡で観察できる。この初期心臓を実 体顕微鏡で観察しながら、ガラス管 (CD— 1、ォリンパス社製)をマイクロピペット製作
器 (PC— 10,ォリンパス社製)で加工し、外径約 20 mとなるよう先端を折って作製し た針を刺し、マイクロインジェクター（Transjector5246、エツペンドルフ社製）を用い て胚盤下腔の中央に、実施例 2で調製したウィルス溶液約 2 1を微量注入した。この 卵殻の切り口まで卵白を満たした後、卵白を糊としてテフロン膜 (ミリラップ、ミリポア社 製)とポリ塩ィ匕ビユリデンラップ (サランラップ、旭化成社製)とで蓋をし、 30分毎に 90 度転卵しながら孵卵を行った。
[0075] 孵卵開始から 18日目に転卵を停止し、 21日目に雛がハシ打ちを始めたら卵殻を破 つて孵化を助けた。この人工孵化による孵化率は 50— 60%だった。
[0076] (実施例 4) ELISA法による血清中 scFv— Fc抗体の定量
実施例 3により誕生した GOトランスジエニックキメラ-ヮトリを飼育して雛を成長させた 。一週間後、成長した雄性雛 (個体識別番号 # 1111、 # 3108、 # 4102)の翼下静 脈より採血を行い、血液サンプルを得た。得られた血液を 15, OOOrpmで 10分間遠 心し、上清として得られる血清力 scFv— Fc抗体量の測定を行った。
[0077] PBSで希釈した抗ヒト IgG抗体（コスモバイオ社製）を ELISAプレートに 100 μ g/w ell入れて 4°Cでー晚静置した。 PBS— 0. 05%Tween20溶液を 200 μ 1で各 wellを 3回洗浄した後、 PBS— 0. 05%Tween20溶液 2%スキムミルクを 150 /z lZwell入 れた。
[0078] 室温で 2時間静置後、 wellを 200 μ 1の PBS— 0. 05%Tween20溶液で 3回洗浄し、 採取した血液サンプルを 120 μ 1入れ、 4°Cでー晚静置した。この ELISAプレートを 室温に戻した後、 PBS— Tween20溶液で 3回各 wellを洗浄し、 PBS— 0. 05%Twe en20溶液で希釈した Peroxide (POD)標識抗ヒ HgG抗体 (コスモノィォ社製）を 10 0 μ lZwell入れて室温で 1時間静置した。
[0079] PBS— 0. 05%Tween20溶液で wellを 4回洗浄し、発色液（10mgの o フエ-レン ジァミン (片山化学工業製)を lmlのメタノールに溶解し、蒸留水で 100mlとしたもの に 10 μ 1の過酸化水素水（和光純薬工業製)をカ卩えて調製した） 100 μ 1を wellにカロ えた。 8M硫酸を 50 1添カ卩して反応を止め、 490nmの蛍光強度をプレートリーダー で測定して、標準検量線から濃度を計算した。ゥズラ、 -ヮトリ各々 3羽から得られた サンプルの抗体濃度を平均したものを結果とした。
標準検量線作製のための標準抗体 (コスモバイオ社製）は、 50%卵黄- PBS(WZV )で希釈した。
[0080] 標準検量線は精製した scFv— Fcを用いて作製した。実施例 1で作製したベクターコ ンストラタト pMSCVZscFv— Fcをリポフエクシヨン法により GP293細胞に導入し、そ の培養上清を 4°C、 10分間、 3000rpmで遠心して固形物を除去した。この上清を冷 却しながら攪拌し、 50%飽和となるよう細力べ砕いた硫酸アンモ-ゥムを徐々に加え（ 313g硫安 ZlOOOml水）、タンパク質を沈殿させた。これを 4°Cでー晚静置した後、 4 °Cで 10分間、 15, OOOrpmで遠心して沈殿を完全に沈降させ、少量の PBSで溶解 した。 2Lの PBSで 3回透析して硫安を除去した。
[0081] 精製用のプロテイン Gカラム（日本ガイシ社製）の初期洗浄を Binding Buffer (Na ΗΡΟ ·2Η O 1.56g/l、NaHPO -12H O 7.16g/l) lOmL, Wash Buffer
4 2 4 2
(酢酸 20%、蒸留水 80%) 10ml、 Binding BufferlOmlの順で行った（流速 2ml Z分)。 PBSに溶解したタンパク液を lmlZ分で流し、 scFv— Fcをカラムに吸着させ た。 Binding Buffer20mlを 1.7mlZ分で流して不要なタンパクを除去し、 Elutio n Buffer (グリシン 7.507g/l、 2N HC1にて pH2.5—3.0に調製）を 1.5ml/ 分で流して scFv— Fcを溶出した。
[0082] 溶出分画を PBS (2L)で 3回透析し、精製 scFv— Fcとし、波長 280nmの吸光度より タンパク濃度を定量した。実施例 3で誕生した 3羽（個体識別番号 #1111、 #3108 、 #4102)の雄性 GOトランスジエニックキメラ-ヮトリ雛の血中抗体値を表 1に示す。
[0083] [表 1] 個体識別番号 血中抗体値
# 1 11 1 1 , 6mg/mL
#3108 1, 6mg/mL
#4102 1. 5mg/mL
[0084] (実施例 5) PCR法による精子中導入遺伝子の確認
実施例 3で誕生した 3羽（個体識別番号 #1111、 #3108、 #4102)の雄性 GOトラ
ンスジエニックキメラ-ヮトリ雛^!司育成長させ、性成熟を待った。 6力月後、生育した 雄性トランスジエニックキメラ-ヮトリから、腹部マッサージ法により 0. 2mLの精子を採 取した。
[0085] 採取した精子力 キット（東洋紡社製 MagExtractor-genome-)を用いて抽出し たゲノム DNA50ngを使 、、 PCR法で導入遺伝子を確認した。
[0086] PCR法には、導入遺伝子に含まれる scFv遺伝子断片の一部 393bpを増幅可能な プライマーセット： 5， -GTCTTATTAGCGGTGCTGGTAGTAGCACAA-3， ( 配列番号 11) Z5 ' -GAGACTTCTGCTGGTACCAGCCATA-3 ' (配列番号 1 2)及び導入遺伝子に含まれる GFP遺伝子の一部 31 lbpを増幅可能なプライマーセ ット： 5， -AGCTCACCCTGAAATTCATCTGCACCACTG-3，（配列番号 13) /5 ' -GTTGTATTCCAGCTTGTGGCCGAGAATGTT-3 ' (配列番号 14)を 用いた。
[0087] (実施例 6)交配による G1トランスジエニック-ヮトリの作製
実施例 5により、精子中に導入遺伝子を検出した雄性 GOトランスジエニックキメラ-ヮ トリ（# 4102)を 3羽の野生型メス（白色レグホン)と交配し、有精卵を得た。
[0088] この有精卵を、自動転卵装置が内蔵された孵卵器 (昭和フランキ社製 P— 008型）内 で 37. 9°C、湿度 65%環境にて孵化処理し、 21日一 22日目に雛を誕生させた。こ の雛を一週間飼育して翼下静脈より 100 1採血して血清を分離し、血清中の抗体 量を実施例 4の ELISA法で定量した。また、遠心で得られた血沈から、実施例 5の方 法でゲノム抽出し、 PCR法で導入遺伝子を確認した。
[0089] PCR法には、導入遺伝子に含まれる GFP遺伝子の一部 355bpを増幅可能なプライ マーセット： 5，— CAACACTGGTCACTACCTTCACCTATG— 3，（配列番号 15 ) /5，一 ACGGATCCATCCTCAATGTTGTGTC— 3，（配列番号 16)を用いた。 内部標準として、 -ヮトリゲノムに含まれるオボアルブミン遺伝子の一部 317bpを増 幅可能なプライマーセット： 5， -CGCTTTGATAAACTTCCAGGATTCGG-3， (配列番号 17) /5 ' -CATCTAGCTGTCTTGCTTAAGCGTACA-3 ' (配列番 号 18)を用いた。
[0090] 110羽の雛から導入遺伝子を検定した結果、 5羽から導入遺伝子を検出した。偶発
的に死亡したこの Gl個体の各臓器よりゲノムを抽出し、 PCR法で導入遺伝子を確認 した。
[0091] (実施例 7) G1臓器中の導入遺伝子の確認
実施例 6により作製され、血液より抽出したゲノム中に導入遺伝子が確認された G1 個体のうち 1羽が偶発的に死亡したため、胃、肝臓、腎臓、腸、筋肉を摘出して実施 例 6の方法によりゲノムを抽出し、 PCR法により導入遺伝子を確認した（図 2)。
[0092] この結果より、この個体は体中の各臓器に導入遺伝子をもつ G1個体であるとの確証 が得られた。
[0093] 5羽の G1の血中 scFv— Fc抗体値を実施例 4の方法により定量したところ、うち 3羽が lmgZmLの抗体を発現して!/ヽた。
[0094] これにより、本方法により導入遺伝子に基づく scFv— Fc抗体を発現し、体細胞全体 に導入遺伝子をもつ完全な G1トランスジエニック-ヮトリが作製できることが明らかと なった。
[0095] (実施例 8) FISH法による G1染色体解析
実施例 6により孵化した 77番目の-ヮトリ雛は、実施例 6の PCR法による検定により、 G1トランスジエニック-ヮトリ（メス）であることがわかった。この G1の個体番号を # 77 とする。同様に 103番目の雛も PCR法により、 G1トランスジエニック-ヮトリ（ォス)だつ た (個体番号 # 103)。
[0096] この 2羽の G1の翼下静脈から採血を行い、血液 2mLからフイコールパック法でリンパ 球を分離し、マイトジェン (コンカナパリン A コスモノィォ社製）、メルカプトエタノー ル (和光純薬工業製）、硫酸カナマイシン (コスモノィォ社製）、および 18%FBS (ィ ンビトロジェン社製）をカ卩えた RPMI1640を用い、 37°C、 5%CO雰囲気で培養を行
2
つた。染色体標本作製の数時間前に BrdU (5—プロモデォキシゥリジン メルク社製） を培地に添加し、さらにコルセミド (メルク社製)を添加して 1時間後、細胞を回収して 低張処理を行い、メタノール:酢酸 (3 : 1)固定液で固定し、標本を作製した。
[0097] 作製した染色体標本は数日間乾燥させた後、へキスト 33258 (メルク社製)での染色 、 UV処理を施し乾燥後、 FISH法による解析を行った。プローブ DNA(pMSCV/s cFv-Fc Δ BamHl)はピオチン (コスモバイオ社製)で標識し、ャギ抗ピオチン抗体
ZFITC—抗ャギ IgGを反応させ、蛍光顕微鏡 (Leica DMRAシステム）による撮像 、画像解析装置（Leica550CW— QFISHソフトウェア）による解析を行った。
[0098] プローブ DNA(pMSCV/scFv— Fc Δ BamHl)は、実施例 1の pMSCV/scFv— Fcから制限酵素処理により BamHl— BamHl断片（1. 57kb)を切り出し、常法に従 つてピオチン標識して作製した。
このようにして解析した # 77と # 103の FISH解析結果を、図 3に示す。この FISH解 析結果から、 # 77個体はマイクロ染色体に 2個の導入遺伝子が挿入された G1であり 、 # 103は第 3染色体長腕部に導入遺伝子が 1コピー挿入された G1トランスジェ-ッ クニヮトリであることがわかった。
[0099] (実施例 9)交配による G2トランスジエニック-ヮトリの作製
実施例 8の G1 # 77個体 (メス）を野生型ォス (白色レグホン）、 # 103個体 (ォス）を野 生型メス（白色レグホン)とそれぞれ交配し、有精卵を取得'孵化させた。この雛の血 漿から実施例 5の方法によりゲノム抽出し、 PCR法で導入遺伝子の有無を解析して G2トランスジエニック-ヮトリであるかどうか検定した。
[0100] # 77は導入遺伝子を一方の染色体に 2コピーもつ G1であり、野生型との交配で生ま れる雛の 3Z4がトランスジエニックであることが確率的に期待される。このうち 1Z4が G1親と同じく 2コピーの導入遺伝子をもち、 2Z4は G1親力 Sもつ導入遺伝子の一方 のみをもつ G2となるはずである。
[0101] 実際に孵化した雛を調べたところ、 20羽中 14羽が G2トランスジヱニックであり、ほぼ 確率的に期待される頻度で、 G2が誕生したことがわ力つた。
同様に Gl # 103と野生型の交配によって生まれた雛を、 PCR法により検定した。 # 103は導入遺伝子を 1コピーもつ G1であるため、 G2は 1Z2の確率で出現すること が予測される。実際の検定結果は 43羽中 22羽が G2トランスジエニックであり、本発 明により作製されたトランスジエニック G1-ヮトリからは、確率的に期待できる通りの G 2が誕生することがわ力つた。
[0102] 作製した G2^司育し、メスが産卵する卵中抗体発現量ならびに血中発現量を、実施 例 4の方法で測定した。 G1 # 77及び # 103の子孫である G2 (6ヶ月齢)の血中抗体 発現量をそれぞれ表 2、表 3に、 # 77の 6ヶ月齢 G2メスが産んだ卵中抗体発現量を
表 4に示す,
[0103] [表 2]
# 77の G 2血中 s c F V -F c抗体値
個体識別番号 血中抗体値
# 77— 3 0. 6 3mg/mL
# 7 7— 5 0. 58 m g/mL
[0104] [表 3]
# 1 03の G 2血中 s c F v-F c抗体値
個体識別番号 血中抗体値
# 1 03— 3 0. 35m g/mL
# 1 03— 8 0. 42mg/mL
[0105] [表 4]
# 7 7の G 2卵中 s c F v-F c抗体値
個体識別番号 卵白中抗体値 卵黄中抗体値
# 7 7— 1 2 0. 5 7 m g /m L 0. 33 m g /m L
[0106] 表 2に示すように、 Gl#77は血中抗体価が 0.5-0.8mgZmLであるのに対し、野 生型との交配の結果、誕生した G2は同程度の血中抗体価であった。また表 3に示す ように、 Gl# 103は血中抗体価が 0.3-0.5mgZmLであるのに対して、野生型と
の交配による G2で同程度の血中抗体価を示した。更に表 4に示すように、平均的卵 白中抗体発現量が 0. 3mgZmLの # 77の G2メスは、同程度の抗体を、卵白中に発 現していた。
[0107] この結果力も本発明法のトランスジヱニック-ヮトリは、世代を重ねても遺伝子サイレ ンシングを起こさず、交配によって増やされた子孫を使う事によって、コストの安いタ ンパク生産工場として応用可能であることが実証された。
産業上の利用可能性
[0108] 本発明の G1トランスジエニック鳥類及びその子孫は、安全性の高い複製能欠失型レ トロウィルスベクターで導入された外来遺伝子を、不活性化することなく効率的に発 現することができる。
[0109] また本発明の G1トランスジエニック鳥類は、体細胞全体に導入遺伝子が存在し、個 体レベルでタンパクの発現が安定で、また確立された系統として安定な供給系となる ことができる。
[0110] 更に本発明のトランスジエニック鳥類作製法は、安全かつ効率的に G1トランスジェ- ック鳥類、更にその子孫としての G2、 G3トランスジエニック鳥類を作製することを可能 にする。
[0111] 本発明の Gl、 G2、 G3—トランスジエニック鳥類は、体細胞で外来遺伝子に由来す るタンパクを発現し、血清、卵白、卵黄カゝら回収、精製することで、これまで生産困難 であった糖鎖が付与したタンパクや抗体類の安価な生産系を供給することができる。 図面の簡単な説明
[0112] [図 l]scFv— Fc抗体発現ベクターコンストラクト pMSCVZG Δ AscFv— Fcの構造を 示す。 Amp1はアンピシリン耐性遺伝子を示す。 Ρ Δ actは j8—ァクチンプロモーター 遺伝子を示す。 Ψ +はパッケージングシグナル配列を示す。 GFPはグリーン ·フルォ レツセント'プロテイン遺伝子を示す。 scFv— Fcは scFv— Fc抗体遺伝子を示す。 5 'L TR及び 3， LTRはそれぞれ MoMLVのロングターミナルリピート配列を示す。
[図 2]G1トランスジエニック-ヮトリの各臓器力もの抽出ゲノム中の導入遺伝子の PCR 解析結果を示す。 Mはマーカー、 C1は陽性コントロール、 C2は陰性コントロールを 示す。 L、 K、 H、 MU及び Iはそれぞれ肝臓、腎臓、心臓、筋肉、腸を示す。 GFPは
グリーン 'フルォレツセント'プロテイン遺伝子を示し、 OVAはオボアルブミン遺伝子 を示す。
[図 3]G1トランスジエニック-ヮトリ # 77、 # 103の FISH解析結果を示す。矢印は導 入遺伝子（pMSCVZscFv— Fc Δ BamHl)を示す。
Claims
[1] 鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に、
a)目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジ 工クシヨンし、
b)孵化により GOトランスジエニックキメラ鳥類を得、
c)該 GOトランスジヱニックキメラ鳥類を、該 GOトランスジヱニックキメラ鳥類若しくはそ の子孫、又は、野生型鳥類と交配することにより得られる、
G1トランスジエニック鳥類又はその子孫であることを特徴とするトランスジエニック鳥類
[2] 初期胚が、孵卵開始から 24時間以降のものである請求項 1に記載のトランスジェ-ッ ク鳥類。
[3] 初期胚が、孵卵開始力も 48時間以降のものである請求項 2に記載のトランスジェ-ッ ク鳥類。
[4] 目的タンパク質力 抗体である請求項 1一 3のいずれか 1項記載のトランスジヱニック 鳥類。
[5] 鳥類が、 -ヮトリ又はゥズラである請求項 1一 4のいずれか 1項記載のトランスジェ-ッ ク鳥類。
[6] 請求項 1一 5のいずれ力 1項記載の G1トランスジエニック鳥類を、 GOトランスジェ-ッ ク鳥類、該 G1トランスジヱニック鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配す ることにより得られる、 G2トランスジエニック鳥類又はその子孫であることを特徴とする トランスジェニック鳥類。
[7] 鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に、
a)目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジ 工クシヨンし、
b)孵化により GOトランスジエニックキメラ鳥類を得、
c)該 GOトランスジヱニックキメラ鳥類を、該 GOトランスジヱニックキメラ鳥類若しくはそ の子孫、又は、野生型鳥類と交配することよりなる G1トランスジエニック鳥類の作製法
[8] 初期胚が、孵卵開始から 24時間以降のものである請求項 7に記載のトランスジェ-ッ ク鳥類の作製法。
[9] 初期胚が、孵卵開始力 48時間以降のものである請求項 8に記載のトランスジェ-ッ ク鳥類の作製法。
[10] 目的タンパク質力 抗体である請求項 7— 9のいずれか 1項記載のトランスジヱニック 鳥類の作製法。
[11] 鳥類が、 -ヮトリ又はゥズラである請求項 7— 10のいずれか 1項記載のトランスジェ- ック鳥類の作製法。
[12] 1 X 107cfuZmL以上のタイターをもつ複製能欠失型レトロウイルスベクターをインジ ェクシヨンすることを特徴とする請求項 7— 11のいずれか 1項記載のトランスジエニック 鳥類の作製法。
[13] 1 X 109cfuZmL以上のタイターをもつ複製能欠失型レトロウイルスベクターをインジ ェクシヨンすることを特徴とする請求項 12記載のトランスジエニック鳥類の作製法。
[14] 請求項 1一 5のいずれ力 1項記載の G1トランスジエニック鳥類を、 GOトランスジェ-ッ ク鳥類、該 G1トランスジヱニック鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配す ることにより、 G2トランスジエニック鳥類又はその子孫を作製することを特徴とするトラ ンスジエニック鳥類の作製法。
[15] 請求項 7— 14のいずれか 1項記載の方法で作製されたトランスジエニック鳥類の体細 胞、血液又は卵から目的タンパク質を抽出することよりなるタンパク質の生産法。
[16] 請求項 1一 6のいずれか 1項記載のトランスジエニック鳥類の精子を採取し、該精子 中の遺伝子を検定することよりなる生殖系列トランスジエニックキメラ鳥類の選別法。
[17] 複製能欠失型レトロウイルスベクターがモロ-一 ·ミューリン'ロイケミア ·ウィルス由来 ベクターであることを特徴とする請求項 7— 14のいずれか 1項記載のトランスジェ-ッ ク鳥類の作製法。
[18] 複製能欠失型レトロウイルスベクターが VSV— Gシユードタイプであることを特徴とす る請求項 7— 14のいずれ力 1項記載のトランスジエニック鳥類の作製法。
[19] レトロウイルスに由来しない遺伝子が複製能欠失型レトロウイルスベクターに含有され ている請求項 7— 14、 17及び 18のいずれ力 1項記載のトランスジエニック鳥類の作
製法。
[20] レトロウイルスに由来しない遺伝子は、 -ヮトリ j8—ァクチンプロモーターにより制御さ れている遺伝子である請求項 19記載のトランスジエニック鳥類の作製法。
[21] レトロウイルスに由来しない遺伝子は、抗体をコードする遺伝子である請求項 19又は
20記載のトランスジエニック鳥類の作製法。
[22] 抗体がキメラ抗体である請求項 21記載のトランスジエニック鳥類の作製法。
[23] キメラ抗体が scFv— Fc抗体である請求項 22記載のトランスジヱニック鳥類の作製法。
[24] 請求項 7— 14及び 17— 23のいずれか 1項記載の方法で作製されたトランスジェ-ッ ク鳥類。
[25] 目的タンパク質を lmgZlOOg以上含有することを特徴とする、請求項 24記載のトラ ンスジエニック鳥類が産んだ卵。
[26] 目的タンパク質を 20mgZl00g以上含有することを特徴とする、請求項 24記載のト ランスジェニック鳥類が産んだ卵。
[27] 目的タンパク質を lOOmgZlOOg以上含有することを特徴とする、請求項 24記載の トランスジェニック鳥類が産んだ卵。
[28] 鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に、 目的タンパ ク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、 孵化することにより得られた雄性 GOトランスジエニック鳥類の、精子中の目的タンパク 質をコードする遺伝子を確認することによる生殖系列トランスジエニックキメラ鳥類の 選別法。
[29] 請求項 1一 6のいずれか 1項記載のトランスジエニック鳥類の血中における、 目的タン ノ ク質の発現を確認することによる、トランスジエニック鳥類の選別法。
[30] 鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に、 目的タンパ ク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、 孵化することにより得られた GOトランスジエニック鳥類の血中における、 目的タンパク 質の発現を確認することによる、 GOトランスジエニックキメラ鳥類の選別法。
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