PT1023442E

PT1023442E - Vectores compreendendo um promotor específico do magno para transgénese aviária

Info

Publication number: PT1023442E
Application number: PT98954994T
Authority: PT
Inventors: Robert D Ivarie; Alex J Harvey; Julie A Morris; Guodong Liu; Jeffrey C Rapp
Original assignee: Synageva Biopharma Corp; Univ Georgia
Priority date: 1997-10-16
Filing date: 1998-10-15
Publication date: 2011-02-25
Also published as: US20060185024A1; EP1023442B1; US6730822B1; US8519214B2; US20060075513A1; US8507749B2; EP1023442A1; WO1999019472A9; JP2001520009A; IL135604A; US7521591B2; IL135604A0; JP6078451B2; US20060123488A1; ES2357495T3; AU752946B2; DK1023442T3; CA2307840C; US20140065690A1; JP2016119913A

Description

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DESCRIÇÃO VECTORES COMPREENDENDO UM PROMOTOR ESPECÍFICO DO MAGNO PARA TRANSGÉNESE AVIÁRIA"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO a) Campo da Invenção A presente invenção refere-se a métodos para a introdução de material genético exógeno em células de aves e a expressão do material genético exógeno nas células. A invenção refere-se também a espécies aviárias transgénicas, incluindo galinhas, produzindo ovos de aves que contêm proteína exógena. b) Descrição da Técnica Relacionada

Numerosas proteínas naturais e sintéticas são utilizadas em aplicações de diagnóstico e terapêuticas; muitas outras estão em desenvolvimento ou em ensaios clínicos. Os actuais métodos de produção de proteínas incluem isolamento a partir de fontes naturais e produção recombinante em células bacterianas e de mamífero. Devido à complexidade e ao elevado custo destes métodos de produção de proteínas, estão, no entanto, em curso esforços para desenvolver alternativas. Por exemplo, foram relatados métodos para produção de proteínas exógenas no leite de porcos, ovelhas, cabras e vacas. Estas abordagens sofrem de várias limitações, incluindo longos tempos de geração entre os bandos fundadores e os bandos transgénicos de produção, muita manutenção e custos veterinários, e níveis variáveis de expressão devido a efeitos de posição no local da inserção do transgene no genoma. Estão também a ser produzidas proteínas utilizando processos de moagem e maltagem a partir de cevada e centeio. No entanto, as 2 modificações pós-tradução vegetais diferem das modificações pós-traduçâo dos vertebrados, que têm frequentemente um efeito critico na função das proteínas exógenas.

Tal como um biorreactor de cultura de tecidos e de glândula mamária, o oviduto aviário pode também servir potencialmente como biorreactor. Métodos bem sucedidos de modificação de material genético de aves de modo a que elevados níveis de proteínas exógenas sejam segregados para e empacotados em ovos permitiriam a produção barata de grandes quantidades de proteína. Várias vantagens de uma tal abordagem seriam: a) curtos tempos de geração (24 semanas) e rápido estabelecimento de bandos transgénicos através de inseminação artificial; b) produção facilmente aumentada através de aumento do tamanho dos bandos para satisfazer as necessidades de produção; c) modificação pós-tradução das proteínas expressas; 4) alimentação e recolha de ovos automáticas; d) claras de ovo naturalmente estéreis; e e) reduzidos custos de processamento devido à elevada concentração de proteína na clara do ovo. 0 sistema reprodutor das aves, incluindo o da galinha, está bem descrito. 0 ovo da galinha consiste em várias camadas que são segregadas sobre o vitelo durante a sua passagem através do oviduto. A produção de um ovo começa com a formação do grande vitelo no ovário da galinha. 0 oócito não fertilizado é então posicionado no topo do saco vitelino. Após ovulação ou libertação do vitelo do ovário, o oócito passa para o infundíbulo do oviduto onde é fertilizado se estiverem presentes espermatozóides. Move-se então para o magno do oviduto que está revestido com células glandulares tubulares. Estas células segregam as proteínas da clara do ovo, incluindo ovalbumina, lisozima, 3 ovomucóide, conalbumina e ovomucina, para o lúmen do magno onde são depositados sobre o embrião e vitelo da ave. 0 gene da ovalbumina codifica uma proteina de 45 kDa que é especificamente expressa nas células glandulares tubulares do magno do oviduto (Beato, Cell 56: 335-344 (1989)). A ovalbumina é a proteina da clara do ovo mais abundante, constituindo mais de 50 porcento da proteina total produzida pelas células glandulares tubulares, ou cerca de 4 gramas de proteina por ovo grande de Classe A (Gilbert, "Egg albumen and its formation" em Physiology and Biochemistry of the Domestic Fowl, Bell and Freeman, eds., Academic Press, London, New York, págs. 1291-1329). O gene da ovalbumina e mais 20 kb de cada região flanqueadora foram clonados e analisados (Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75: 2205-2209 (1978); Gannon et al., Nature 278: 428-424 (1979); Roop et al., Cell 19: 63-68 (1980); e Royal et al., Nature 279: 125-132 (1975)).

Foi dada muita atenção à regulação do gene da ovalbumina. O gene responde a hormonas esteróides tais como estrogénio, glucocorticóides, e progesterona, que induzem a acumulação de cerca de 70.000 transcritos de ARNm de ovalbumina por célula glandular tubular em galinhas imaturas e 100.000 transcritos de ARNm de ovalbumina por célula glandular tubular na galinha poedeira madura (Palmiter; J. Biol. Chem. 248: 8260-8270 (1973); Palmiter, Cell 4: 189-197 (1975)). A análise de hipersensibilidade à ADNAse e ensaios de promotor-gene repórter em células glandulares tubulares transfectadas definiram uma região de 7,4 kb como contendo as sequências necessárias para a expressão do gene da ovalbumina. Esta região flanqueadora a 5' contém quatro locais de hipersensibilidade à ADNase 1 centrados a -0,25, -0,8, -3,2, e -6,0 kb do local de início da transcrição. Estes locais são designados HS-I, II, III e IV, 4 respectivamente. Estas regiões reflectem alterações na estrutura da cromatina e estão especificamente correlacionadas com a expressão do gene de ovalbumina em células do oviduto (Kaye et al., EMBO 3: 1137-1144 (1984)). A hipersensibilidade de HS-II e III é induzida por estrogénio, apoiando um papel para estas regiões na indução hormonal da expressão do gene de ovalbumina. HS-I e HS-II são ambos necessários para a indução por esteróides da transcrição do gene da ovalbumina, e uma porção de 1,4 kb da região a 5' que inclui estes elementos é suficiente para dirigir a expressão de ovalbumina dependente de esteróides em células glandulares tubulares explantadas (Sanders e McKnight, Biochemistry 27: 6550-6557 (1988)). HS-I é designado o elemento de resposta negativa ("NRE") porque contém vários elementos reguladores negativos que reprimem a expressão de ovalbumina na ausência de hormona (Haekers et al., Mol. Endo. 9: 1113-1126 (1995)). Factores proteicos unem estes elementos, incluindo alguns factores verificados apenas em núcleos do oviduto sugerindo um papel em expressão especifica do tecido. HS-II é designado o elemento de resposta dependente de esteróides ("SDRE") porque é necessário para promover a indução por esteróides da transcrição. Liga-se a uma proteína ou complexo proteico conhecido como Chirp-I. Chirp-I é induzido por estrogénio e renova-se rapidamente na presença de ciclo-hexamida (Dean et al., Mol. Cell. Biol. 16: 2015-2024 (1996)). Experiências utilizando um sistema de cultura de células glandulares tubulares explantadas definiram um conjunto adicional de factores que se ligam a SDRE de um modo dependente de esteróides, incluindo um factor semelhante a NFkB (Nordstrom et al., J. Biol. Chem. 268: 13193-13202 (1993); Schweers e Sanders, J. Biol. Chem. 266: 10490-10497 (1991)). 5

Conhece-se menos acerca da função de HS-III e IV. HS-III contém um elemento funcional de resposta a estrogénio, e confere indutibilidade por estrogénio ao promotor proximal da ovalbumina ou a um promotor heterólogo quando co-transfectado para células HeLa com um ADNc do receptor de estrogénio. Estes dados implicam que HS-III pode ter um papel funcional na regulação global do gene da ovalbumina. Pouco se sabe acerca da função de HS-IV, excepto que não contém um elemento de resposta a estrogénio funcional (Kato et al.r Cell 68: 731-742 (1992)).

Tem havido muito interesse na modificação de genomas eucarióticos através da introdução de material genético estranho e/ou através da ruptura de genes específicos. Certas células eucarióticas podem demonstrar ser hospedeiros superiores para a produção de proteínas eucarióticas exógenas. A introdução de genes codificando certas proteínas permite também a criação de novos fenótipos que podem ter maior valor económico. Adicionalmente, alguns estados de doença causados geneticamente podem ser curados através da introdução de um gene estranho que permita que as células geneticamente deficientes expressem a proteína que de outro modo não podem produzir. Finalmente, a modificação de genomas animais através da inserção ou remoção de material genético permite estudos básicos da função génica, e finalmente pode permitir a introdução de genes que podem ser utilizados para curar estados de doença, ou resultar em melhores fenótipos animais. A transgénese foi alcançada em mamíferos através de alguns métodos diferentes. Primeiro, em mamíferos incluindo o ratinho, o porco, a cabra, a ovelha e a vaca, um transgene 6 é microinjectado no prónucleo de um ovo fertilizado, que é então colocado no útero de uma mãe adoptiva onde dá origem a um animal fundador possuindo o transgene na sua linha germinativa. 0 transgene é concebido para possuir um promotor com sequências reguladoras especificas dirigindo a expressão da proteína estranha num determinado tipo celular. Uma vez que o transgene se insere aleatoriamente no genoma, os efeitos de posição no local da inserção do transgene no genoma podem causar variavelmente menores níveis de expressão do transgene. Esta abordagem requer também a caracterização do promotor de modo a que as sequências necessárias para dirigir a expressão do transgene no tipo celular desejado sejam definidas e incluídas no vector do transgene (Hogan et al. "Manipulating the Mouse Embryo", Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988)).

Um segundo método para efectuar transgénese animal é a destruição génica direccionada, em que um vector direccionador possuindo sequências do gene alvo a flanquear um gene marcador seleccionável é introduzido em células estaminais embrionárias ("ES") . Através de recombinação homóloga, o vector direccionador substitui as sequências génicas alvo no locus do cromossoma ou insere-se em sequências interiores impedindo a expressão do produto génico alvo. Clones de células ES possuindo o gene apropriadamente destruído são seleccionados e depois injectados em blastocistos de estado inicial gerando animais fundadores quiméricos, alguns dos quais possuem o transgene na linha germinativa. No caso em que o transgene suprime o locus alvo, substitui o locus alvo com ADN estranho proveniente do vector do transgene, que consiste em ADN codificando um marcador seleccionável útil para detecção de células ES transfectadas em cultura e pode 7 adicionalmente conter sequências de ADN codificando uma proteína estranha que é então inserida no lugar do gene suprimido para que o promotor do gene alvo dirija a expressão do gene estranho (Patente U.S. N03. 5,464,764 e 5,487,992 (M.P. Capecchi e K.R. Thomas)). Esta abordagem sofre da limitação de não estarem disponíveis células ES em muitos mamíferos, incluindo cabras, vacas, ovelhas e porcos. Para além disso, este método não é útil quando o gene suprimido é necessário para a sobrevivência ou o desenvolvimento correcto do organismo ou tipo celular.

Desenvolvimentos recentes em transgénese de aves permitiram a modificação de genomas de aves. Galinhas transgénicas na linha germinativa podem ser produzidas através de injecção de retrovírus deficientes na replicaçâo na cavidade subgerminal de blastodermes de galinha em ovos acabados de ser postos (Patente U.S. Número 5,162,215; Bosselman et al., Science 243: 533-534 (1989); Thoraval et ai., Transgenic Research 4: 369-36 (1995)). 0 ácido nucleico retroviral possuindo um gene estranho insere-se aleatoriamente num cromossoma das células embrionárias, gerando animais transgénicos, alguns dos quais possuem o transgene na sua linha germinativa. Infelizmente, os vectores retrovirais não podem ancorar grandes pedaços de ADN, limitando o tamanho e o número de gene estranhos e de sequências reguladoras estranhas que podem ser introduzidos utilizando este método. Adicionalmente, este método não permite a introdução ou destruição direccionadas de um gene através de recombinação homóloga. A utilização de elementos isoladores inseridos na região 5' ou 3' da construção génica fundida para superar efeitos de posição no local de inserção foi descrita (Chim et al., Cell 74: 504-514 (1993)) .

Noutra abordagem, um transgene foi microinjectado no disco germinativo de um ovo fertilizado para produzir uma ave fundadora transgénica estável que passa o gene à geração FI (Love et al. Bio/Technology 12: 60-63 (1994)). Este método tem, no entanto, várias desvantagens. As galinhas têm de ser sacrificadas para recolher o ovo fertilizado, a fracção de fundadores transgénicos é baixa, e os ovos injectados requerem cultura in vitro trabalhosa em cascas substitutas.

Noutra abordagem, células da blastoderme contendo presumíveis células germinais primordiais ("PGCs") são excisadas de ovos dadores, transfectadas com um transgene e introduzidas na cavidade subgerminal de embriões receptores. As células dadoras transfectadas são incorporadas nos embriões receptores gerando embriões transgénicos, alguns dos quais espera-se que possuam o transgene na linha germinativa. O transgene insere-se em locais cromossómicos aleatórios através de recombinação não homóloga. Esta abordagem requer a caracterização do promotor de modo a que as sequências necessárias para dirigir a expressão do transgene no tipo celular desejado sejam definidas e incluídas no vector do transgene. No entanto, ainda não foram geradas aves fundadoras transgénicas através deste método.

Liu et al. Poult Sei. 74 (Supl. 1), página 11 (1995), utilizaram um vector direccionador contendo sequências de ADN flanqueadoras do gene da vitelogenina para suprimir parte do gene residente em células da blastoderme de galinha em cultura. No entanto, foi demonstrado que estas células possam contribuir para a linha germinativa e assim produzir um embrião transgénico. Adicionalmente, este método não é útil quando o gene suprimido é necessário para 9 a sobrevivência ou o desenvolvimento correcto do organismo ou tipo celular.

Assim, pode observar-se que existe a necessidade de um método de introdução no genoma de ave de ADN estranho que esteja operativamente ligado a um promotor activo no magno. Existe também a necessidade de um método de introdução de ADN estranho em porções não essenciais de um gene alvo do genoma de ave para que as sequências reguladoras do gene alvo dirijam a expressão do ADN estranho, de preferência sem destruir a função do gene alvo. A capacidade para efectuar a expressão do transgene integrado selectivamente dentro do oviduto das aves é também desejável. Além disso, existe a necessidade de criar aves transgénicas modificadas na linha germinativa que expressem genes exógenos nos seus ovidutos e segreguem as proteínas exógenas expressas nos seus ovos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Este pedido descreve métodos para a introdução estável de sequências de codificação exógenas no genoma de uma ave e expressão das sequências de codificação exógenas para produzir proteínas desejadas ou para alterar o fenótipo da ave. São também aqui descritos vectores úteis nos métodos, tal como aves transgénicas que expressam a proteína exógena e ovos de aves contendo a proteína exógena.

Em certas formas de realização, o presente invento refere-se a métodos para produção de proteínas exógenas em tecidos de aves específicos, mais particularmente, num oviduto de aves. Os transgenes são introduzidos em células embrionárias da blastoderme, de preferência próximo do estádio X, para produzir uma ave transgénica, de modo a que a proteína de interesse seja expressa nas células 10 glandulares tubulares do magno do oviduto, segregada para o lúmen, e depositada sobre a gema do ovo. Uma ave transgénica assim produzida possui o transgene na sua linha germinativa. Os genes exógenos podem portanto ser transmitidos a aves através da introdução artificial do gene exógeno em células embrionárias da ave, e através da transmissão do gene exógeno para a descendência da ave estavelmente de um modo mendeliano.

Num primeiro aspecto, o presente invento proporciona um método de produção de uma proteina exógena num oviduto de uma ave. O método compreende um primeiro passo proporcionando um vector retroviral que contém uma sequência de codificação e um promotor constitutivo operativamente ligado à sequência de codificação, para que o promotor possa efectuar a expressão do ácido nucleico nas células glandulares tubulares do magno de um oviduto de uma ave. A seguir, o vector é introduzido em células embrionárias da blastoderme de uma ave, isoladas de fresco, em cultura ou num embrião, para que a sequência do vector seja inserida aleatoriamente no genoma da ave. Finalmente, uma ave transgénica madura que expressa a proteina exógena nas suas células glandulares tubulares é derivada das células transgénicas da blastoderme. Este método pode também ser utilizado para produzir um ovo de ave que contenha proteina exógena quando a proteina exógena que é expressa nas células glandulares tubulares for também segregada para o lúmen do oviduto e depositada sobre a gema de um ovo. A inserção cromossómica aleatória e a produção de uma ave transgénica podem ser alcançadas através da transdução de células embrionárias da blastoderme com partículas retrovirais deficientes na replicação ou competentes na 11 replicação possuindo ARN do transgene entre as LTRs 5' e 3' do vector retroviral.

Uma cópia do ARN do vector retroviral modificado, empacotado em partículas virais, pode ser utilizada para infectar blastodermes embrionárias que se desenvolvem em aves transgénicas. Alternativamente, células ajudantes que produzam as partículas retrovirais transdutoras são distribuídas à blastoderme embrionária.

Os vectores integrados no genoma da ave contêm promotores constitutivos que estão operativamente ligados à sequência de codificação exógena.

Se um promotor constitutivo for operativamente ligado a uma sequência de codificação exógena a expressar no oviduto, então os métodos da invenção podem também envolver opcionalmente o proporcionar de um segundo vector que contenha uma segunda sequência de codificação e um promotor específico do magno operativamente ligado à segunda sequência de codificação. Este segundo vector é também expresso nas células glandulares tubulares da ave transgénica madura. Nesta forma de realização, a expressão da primeira sequência de codificação no magno está directamente ou indirectamente dependente da presença celular da proteína expressa pelo segundo vector. Um tal método pode incluir opcionalmente a utilização de um sistema Cre-loxP. É também aqui descrito um ovo de ave que contém uma proteína exógena à espécie de ave. A utilização da invenção permite a expressão de proteínas exógenas em células do oviduto com secreção das proteínas para o lúmen do magno do oviduto e deposição sobre a gema do ovo da ave. As 12 proteínas assim empacotadas em ovos podem estar presentes em quantidades de até um grama ou mais por ovo.

Outras formas de realização da invenção proporcionam aves transgénicas, tais como galinhas ou perus, que possuem um vector retroviral no material genético do tecido da sua linha germinativa. 0 vector compreende um gene exógeno operativamente ligado a um promotor constitutivo, e o gene exógeno é expresso no oviduto aviário da ave transgénica para produzir uma proteína exógena em que a proteína exógena contém uma sequência sinal e é segregada para o lúmen do oviduto para que a proteína seja depositada na clara de um ovo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figs. 1 (a) e 1 (b) ilustram vectores de expressão do promotor da ovalbumina compreendendo segmentos do promotor da ovalbumina e uma sequência de codificação, o gene X que codifica uma proteína exógena X.

As Figs. 2 (a), 2 (b), 2(c) e 2 (d) ilustram vectores retrovirais compreendendo um promotor de ovalbumina e uma sequência de codificação, o gene X, codificando uma proteína exógena X. A Fig. 2 (e) ilustra um método de amplificação de um gene exógeno para inserção nos vectores de 2(a) e 2(b). A Fig. 2(f) ilustra um vector retroviral compreendendo um promotor de ovalbumina controlando a expressão de uma sequência de codificação, o gene X, e um elemento do local de entrada no ribossoma (IRES) que permite a expressão de uma segunda sequência de codificação, o gene Y. 13

As Figs. 3 (a) e 3 (b) mostram representações esquemáticas dos vectores derivados de ALV pNLB e pNLB-CMV-BL, respectivamente. Os vectores são ambos mostrados tal como apareceriam quando integrados no genoma de galinha. A Fig. 4 mostra um gráfico mostrando a quantidade de β-lactamase verificada na clara de ovos de galinhas transduzidas com NLB-CMV-BL, tal como determinado através do ensaio de actividade de β-lactamase. A Fig. 5. mostra um western blot indicando a presença de β-lactamase na clara de ovos de galinhas transduzidas com NLB-CMV-BL.

As Figs. 6(a) e 6(b) ilustram a expressão génica especifica do magno, activada por recombinação. Os transgenes cre e β-lactamase esquemáticos são mostrados integrados no genoma de uma galinha numa célula sem ser do magno na Fig. 6 (a). Na Fig. 6 (b), transgenes esquemáticos da recombinase cre e da β-lactamase são mostrados integrados no genoma de uma galinha numa célula do magno. A Fig. 7 ilustra um método alternativo de silenciamento da expressão da β-lactamase utilizando locais loxP no qual dois locais loxP flanqueando um codão de terminação (TAA) enquadrado com o primeiro codão (ATG) são inseridos na sequência de codificação do péptido sinal da β-lactamase de modo a que o péptido sinal não seja destruído.

As Figs. 8(a) e 8 (b) ilustram vectores direccionadores utilizados para inserção de um minigene sem promotor da invenção num gene alvo. 14 A Fig. 9 ilustra um vector direccionador utilizado para detecção da inserção homóloga correcta de um minigene sem promotor da invenção num gene alvo. 15 DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO a) Definições e Parâmetros Gerais

As seguintes definições são expostas para ilustrar e definir o significado e âmbito dos vários termos utilizados para descrever a invenção daqui.

Uma "sequência de ácido nucleico ou polinucleotídica" inclui, mas não se limita a ARNm eucariótico, ADNc, ADN genómico e sequências sintéticas de ADN e ARN, compreendendo as bases nucleosidicas naturais adenina, guanina, citosina, timidina e uracilo. 0 termo engloba também sequências possuindo uma ou mais bases modificadas.

Uma "sequência de codificação" ou "enquadramento de leitura aberto" refere-se a uma sequência polinucleotídica ou de ácido nucleico que pode ser transcrita e traduzida (no caso de ADN) ou traduzida (no caso de ARNm) num polipéptido in vitro ou in vivo quando colocada sob o controlo de sequências reguladoras apropriadas. Os limites da sequência de codificação são determinados por um codão de início da tradução no terminal 5' (amino) e um codão de terminação da tradução no terminal 3' (carboxilo). Uma sequência de terminação da transcrição estará habitualmente localizada a 3' da sequência de codificação. Uma sequência de codificação pode estar flanqueada na extremidade 5' e/ou 3' por regiões não traduzidas. "Exão" refere-se à parte de um gene que, quando transcrita num transcrito nuclear, é "expressa" no ARNm citoplasmático após remoção dos intrões ou sequências intervenientes através de processamento nuclear. 16 "Sequências de controlo" ou "sequências requladoras" de ácido nucleico referem-se a codões de inicio e terminação da tradução, sequências promotoras, locais de ligação ao ribossoma, sinais de poliadenilação, sequências de terminação da transcrição, domínios reguladores a montante, estimuladores e semelhantes, conforme necessário e suficiente para a transcrição e tradução de uma dada sequência de codificação numa célula hospedeira definida. Exemplos de sequências de controlo adequadas para células eucarióticas são promotores, sinais de poliadenilação e estimuladores. Todas estas sequências de controlo não necessitam de estar presentes num vector recombinante desde que aquelas necessárias e suficientes para a transcrição e tradução do gene desejado estejam presentes. "Operativamente ligado" refere-se à configuração das sequências de codificação e controlo de modo a efectuar a função desejada. Assim, sequências de controlo operativamente ligadas a uma sequência de codificação são capazes de efectuar a expressão da sequência de codificação. Uma sequência de codificação está operativamente ligada a, ou sob o controlo de, regiões reguladoras da transcrição numa célula quando a ADN-polimerase se liga à sequência promotora e transcreve a sequência de codificação em ARNm que pode ser traduzido na proteína codificada. As sequências de controlo não necessitam de ser contíguas com a sequência de codificação, desde que funcionem dirigindo a expressão desta. Assim, por exemplo, sequências não traduzidas mas transcritas intervenientes podem estar presentes entre uma sequência promotora e a sequência de codificação e a sequência promotora pode ainda ser considerada "operativamente ligada" à sequência de codificação. 17

Os termos "heteróloga" e "exógena" quando se referem a sequências de ácido nucleico tais como sequências de codificação e sequências de controlo, denotam sequências que não estão normalmente associadas a uma região de uma construção recombinante e/ou não estão normalmente associadas com uma determinada célula. Assim, uma região "heteróloga" de uma construção de ácido nucleico é um segmento identificável de ácido nucleico dentro ou ligado a outra molécula de ácido nucleico que não se encontra em associação com a outra molécula na natureza. Por exemplo, uma região heteróloga de uma construção pode incluir uma sequência de codificação flanqueada por sequências não encontradas em associação com a sequência de codificação na natureza. Outro exemplo de uma sequência de codificação heteróloga é uma construção onde a própria sequência de codificação não se encontra na natureza (p.ex., sequências sintéticas possuindo codões diferentes do gene nativo). Semelhantemente, uma célula hospedeira transformada com uma construção que não está normalmente presente na célula hospedeira seria considerada heteróloga para fins desta invenção. "Gene exógeno" ou "sequência de codificação exógena" refere-se a uma sequência de ácido nucleico naturalmente não presente num determinado tecido ou célula. "Proteína exógena" refere-se a uma proteína naturalmente não presente num determinado tecido ou célula. "Gene endógeno" refere-se a um gene de ocorrência natural ou fragmento deste normalmente associado a uma determinada célula.

Os produtos de expressão aqui descritos podem consistir em material proteináceo possuindo um estrutura química definida. No entanto, a estrutura exacta depende de vários 18 factores, particularmente modificações químicas comuns às proteínas. Por exemplo, uma vez que todas as proteínas contêm grupos amino e carboxilo ionizáveis, a proteína pode ser obtida na forma de sal ácido ou básico, ou na forma neutra. A sequência de aminoácidos primária pode ser derivada utilizando moléculas de açúcar (glicosilação) ou através de outras derivações químicas envolvendo ligação covalente ou iónica com, por exemplo, lípidos, fosfato, grupos acetilo e semelhantes, ocorrendo frequentemente através de associação com sacáridos. Estas modificações podem ocorrer in vitro, ou in vivo, sendo as últimas efectuadas por uma célula hospedeira através de sistemas de processamento pós-tradução. Tais modificações podem aumentar ou diminuir a actividade biológica da molécula, e pretende-se que tais moléculas quimicamente modificadas recaiam também dentro do âmbito da invenção. Métodos alternativos de clonagem, amplificação, expressão e purificação serão aparentes para o perito na técnica. Métodos representativos são divulgados em Sambrook, Fritsch, e Maniatis, "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989). "PMGI" refere-se à inserção de um minigene sem promotor, um método no qual um gene sem um promotor é inserido através de recombinação homóloga num gene alvo de modo a que as sequências reguladoras do gene alvo governem a expressão do gene inserido num tecido apropriado. Um minigene é uma versão modificada de um gene, frequentemente apenas um ADNc com um sinal de poliadenilação apropriado e por vezes um intrão. Um minigene habitualmente não tem todos os intrões do gene genómico. 19 "Vector" significa um polinucleótido constituído por uma cadeia simples, cadeia dupla, ADN circular ou super-enrolado ou ARN. Um vector típico pode ser constituído pelos seguintes elementos operativamente ligados a distâncias apropriadas para permitir uma expressão génica funcional: origem de replicação, promotor, estimulador, sequência líder a 5' do ARNm, local de ligação ao ribossoma, cassete de ácido nucleico, locais de terminação e poliadenilação e sequências marcadoras seleccionáveis. Um ou mais destes elementos podem ser omitidos em aplicações específicas. A cassete de ácido nucleico pode incluir um local de restrição para inserção da sequência de ácido nucleico a expressar. Num vector funcional a cassete de ácido nucleico contém a sequência de ácido nucleico a expressar incluindo locais de início e terminação da tradução. Um intrão pode opcionalmente ser incluído na construção, de preferência ^ 100 pb a 5' da sequência de codificação.

Nalgumas formas de realização o promotor será modificado através da adição ou deleção de sequências ou substituído por sequências alternativas, incluindo sequências naturais e sintéticas bem como sequências que podem ser uma combinação de sequências sintéticas e naturais. Muitos promotores eucarióticos contêm dois tipos de sequências de reconhecimento: a caixa TATA e os elementos promotores a montante. A primeira, localizada a montante do local de iniciação da transcrição, está envolvida na direcção da ARN-polimerase para iniciar a transcrição no local correcto, enquanto que as últimas parecem determinar a taxa de transcrição e estão a montante da caixa TATA. Os elementos estimuladores podem também estimular a transcrição a partir de promotores ligados, mas muitos funcionam exclusivamente num determinado tipo celular. 20

Muitos elementos estimuladores/promotores derivados de vírus, p.ex. os promotores de SV40, do vírus de sarcoma de Rous (RSV), e de CMV são activos num amplo espectro de tipos celulares, e são designados "constitutivos" ou "ubíquos". A sequência de ácido nucleico inserida no local de clonagem pode ter qualquer enquadramento de leitura aberto codificando um polipéptido de interesse, com a condição de quando a sequência de codificação codifica um polipéptido de interesse, não deve possuir locais de processamento crípticos que possam bloquear a produção de moléculas de ARNm apropriadas e/ou produzir moléculas de ARNm processadas aberrantemente ou anormais. A região de terminação que é primeiramente empregue será uma de conveniência, uma vez que as regiões de terminação parecem ser relativamente intercambiáveis. A região de terminação pode ser nativa em relação à sequência de ácido nucleico de interesse pretendida ou pode ser derivada de outra fonte.

Um vector é construído de modo a que a sequência de codificação particular fique localizada no vector com as sequências reguladoras apropriadas, sendo o posicionamento e a orientação da sequência de codificação em relação às sequências de controlo tais que a sequência de codificação é transcrita sob o "controlo" das sequências de controlo ou reguladoras. Modificação das sequências codificando a proteína particular de interesse pode ser desejável para alcançar este fim: por exemplo, nalguns casos pode ser necessário modificar a sequência para que esta possa ser ligada às sequências de controlo com a orientação apropriada; ou para manter o enquadramento de leitura. As sequências de controlo e outras sequências reguladoras podem ser ligadas à sequência de codificação antes da 21 inserção num vector. Alternativamente, a sequência de codificação pode ser clonada directamente num vector de expressão que contenha já as sequências de controlo e um local de restrição apropriado que esteja enquadrado em leitura e sob o controlo regulador das sequências de controlo.

Um "gene marcador" é um gene que codifica uma proteína que permite a identificação e o isolamento de células correctamente transfectadas. Sequências marcadoras adequadas incluem, mas não se limitam aos genes das proteínas fluorescentes verde, amarela e azul (GFP, YFP e BFP, respectivamente). Outros marcadores adequados incluem os genes da timidina-cinase (tk), dl-hldrofolato-redutase (DHFR), e aminoglicósido-fosfotransferase (APH) . 0 último confere resistência aos antibióticos aminoglicosídicos, tais como canamicina, neomicina e geneticina. Estes, e outros genes marcadores tais como os codificando a cloranfenicol-acetiltransferase (CAT), β-lactamase, β-galactosidase (β-gal), podem ser incorporados na cassete de ácido nucleico primária juntamente com o gene expressando a proteína desejada, ou os marcadores de selecção podem estar contidos em vectores separados e ser cotransfectados.

Um "gene repórter" é um gene marcador que "relata" a sua actividade numa célula através da presença da proteína que codifica.

Uma "partícula retroviral", "partícula transdutora", ou "partícula de transdução" refere-se a um vírus deficiente na replicação ou competente na replicação capaz de transduzir ADN ou ARN não virai numa célula. 22

Os termos "transformação", "transdução" e "transfecção" denotam todos a introdução de um polinucleótido numa célula da blastoderme de ave. 0 "magno" é a parte do oviduto entre o infundibulo e o istmo contendo células glandulares tubulares que sintetizam e segregam as proteínas da clara de ovo do ovo.

Um promotor "especifico do magno", tal como aqui se utiliza, é um promotor que é principalmente ou exclusivamente activo nas células glandulares tubulares do magno. b) Transgénese de Células da Blastoderme

Através dos métodos da presente invenção, podem ser introduzidos transgenes em células embrionárias da blastoderme, para produzir uma galinha transgénica, ou outras espécies aviárias, que possui o transgene no material genético do tecido da sua linha germinativa. As células da blastoderme são tipicamente células de estádio VII-XII, ou o equivalente destas, e estão de preferência próximas do estádio X. As células úteis na presente invenção incluem células germinais embrionárias (EG), células estaminais embrionárias (ES) & células germinais primordiais (PGCs) . As células embrionárias da blastoderme podem ser isoladas de fresco, mantidas em cultura, ou residirem dentro de um embrião.

Uma variedade de vectores úteis na realização dos métodos da presente invenção é aqui descrita. Estes vectores podem ser utilizados para produzir proteínas exógenas no oviduto de uma ave. Ainda noutras formas de realização, os vectores são utilizados em métodos para produzir ovos de aves que contêm proteína exógena. 23

Nalguns casos, a introdução de um vector da presente invenção nas células embrionárias da blastoderme é efectuada com células embrionárias da blastoderme que são isoladas de fresco ou em cultura. As células transgénicas são então tipicamente injectadas na cavidade subgerminal por baixo de uma blastoderme receptora num ovo. Nalguns caso, no entanto, o vector é distribuído directamente às células de um embrião blastodérmico.

Um vector aqui descrito contém uma sequência de codificação e um promotor específico do magno em relação operacional e posicionai para expressar a sequência de codificação na célula glandular tubular do magno do oviduto da ave. 0 promotor específico do magno pode ser opcionalmente um segmento da região promotora da ovalbumina que seja suficientemente grande para dirigir a expressão da sequência de codificação nas células glandulares tubulares.

As Figs. 1 (a) e 1 (b) ilustram exemplos de vectores de expressão do promotor da ovalbumina. 0 gene X é uma sequência de codificação que codifica uma proteína exógena. As setas dobradas indicam os locais de início da transcrição. Num exemplo, o vector contém 1,4 kb da região flanqueadora a 5' do gene da ovalbumina (Fig. l(a)). A sequência do "promotor de -1,4 kb" da Fig. l(a) corresponde à sequência que começa aproximadamente a 1,4 kb a montante (-1,4 kb) do local de início da transcrição da ovalbumina e se prolonga aproximadamente 9 resíduos para a região não traduzida a 5' do gene da ovalbumina. 0 segmento com aproximadamente 1,4 kb de comprimento ancora dois elementos reguladores críticos, o elemento regulador dependente de esteróides (SDRE) e o elemento regulador negativo (NRE). 0 NRE é assim nomeado porque contém vários elementos 24 reguladores negativos que bloqueiam a expressão do gene na ausência de hormona. Um segmento mais curto de 0,88 kb contém também ambos os elementos. Noutro exemplo, o vector contém aproximadamente 7,4 kb da região flanqueadora a 5' do gene da ovalbumina e ancora dois elementos adicionais (HS-III e HS-IV), um dos quais sabe-se que contém uma região funcional que permite a indução do gene por estrogénio (Fig. 1(b)). Um segmento mais curto de 6 kb contém também todos os quatro elementos e pode ser opcionalmente utilizado.

Cada vector utilizado para integração aleatória compreende de preferência pelo menos um elemento de 1,2 kb do locus da β-globina de galinha que isola o gene de dentro tanto da activação como da inactivação no local de inserção no genoma. Dois elementos isoladores podem ser adicionados a uma extremidade da construção do gene de ovalbumina. No locus da fi-globina, os elementos isoladores servem para impedir a região de controlo do locus (LCR) distai de activar genes a montante do domínio do gene da globina, e mostrou-se que superam efeitos de posição em moscas transgénicas, indicando que podem proteger contra efeitos positivos e negativos no local de inserção. 0(s) elemento (s) isoladores são apenas necessários numa das extremidades 5' ou 3' do gene porque os transgenes são integrados em múltiplas cópias em cadeia criando eficazmente uma série de genes flanqueados pelo isolador do transgene vizinho. Noutra forma de realização, o elemento isolador não está ligado ao vector mas é co-transfectado com o vector. Neste caso, o vector e o elemento são unidos em cadeia na célula através do processo de integração aleatória no genoma. 25

Cada vector pode opcionalmente compreender também um gene marcador para permitir a identificação e o enriquecimento de clones celulares que foram estavelmente integrados no vector de expressão. A expressão do gene marcador é dirigida por um promotor ubíquo que dirige elevados níveis de expressão numa variedade de tipos celulares. Numa forma de realização preferida o gene repórter da proteína fluorescente verde (GFP) (Zoiotukhin et al., J. virol. 70: 4646-4654 (1995)) é dirigido pelo promotor do factor de alongamento 1-α (ef-lot) de Xenopus (Johnson e Krieg, Gene 147: 223-26 (1994)). O promotor de ef-ΐα de Xenopus é um promotor forte expresso numa variedade de tipos celulares. A GFP contém mutações que aumentam a sua fluorescência e é humanizada ou modificada de modo a que os codões coincidam com o perfil de utilização de codões dos genes humanos. Uma vez que a utilização de codões de aves é virtualmente a mesma que a utilização de codões humana, a forma humanizada do gene é também altamente expressa em células da blastoderme de aves. Em formas de realização alternativas, o gene marcador é operativamente ligado a um dos promotores ubíquos de HSV tk, CMV, ou $-actina.

Embora a utilização de codões humana e de aves seja bastante coincidente, quando um gene não de vertebrado é utilizado como sequência de codificação no transgene, a sequência não de vertebrado pode ser modificada para alterar os codões apropriados de modo a que a utilização de codões seja semelhante à de humanos e aves. A transfecção das células da blastoderme pode ser mediada através de quaisquer métodos conhecidos dos vulgares peritos na técnica. Na presente invenção, a introdução do vector nas células embrionárias da blastoderme é mediada por retrovírus. 26

Num método de transfecção de células da blastoderme, um vector baseado em retrovírus empacotado é utilizado para distribuir o vector em células embrionárias da blastoderme para que o vector seja integrado no genoma da ave.

Como alternativa à distribuição de partículas de transdução retrovirais às células embrionárias da blastoderme num embrião, células ajudantes que produzam o retrovírus podem ser distribuídas à blastoderme.

Um retrovírus preferido para introdução aleatória de um transgene no genoma da ave é o retrovírus ALV deficiente na replicação.

Qualquer um dos vectores da presente invenção pode também incluir opcionalmente uma sequência de codificação codificando um péptido sinal que dirigirá a secreção da proteína expressa pela sequência de codificação do vector a partir das células glandulares tubulares do oviduto. Este aspecto da invenção alarga eficazmente o espectro de proteínas exógenas que podem ser depositadas em ovos de aves utilizando os métodos da invenção. Quando uma proteína exógena não seria de outro modo segregada, o vector possuindo a sequência de codificação é modificado para compreender uma sequência de ADN compreendendo cerca de 60 pb codificando um péptido sinal do gene da lisozima. A sequência de ADN codificando o péptido sinal é inserida no vector para que fique localizada no terminal N da proteína codificada pelo ADNc.

As Figs. 2(a)-2(d), e 2(f) ilustram exemplos de vectores retrovirais. O vector é inserido no genoma da ave com LTRs flanqueadoras a 5' e 3'. Neo é o gene da neomicina- 27 fosfotransferase. As setas dobradas indicam os locais de inicio da transcrição. As Figs. 2 (a) e 2 (b) ilustram a LTR e os transcritos do oviduto com um sequência codificando o péptido sinal da lisozima (LSP), enquanto as Figs. 2 (c) e 2 (d) ilustram transcritos sem uma tal sequência. Existem duas partes para a estratégia do vector retroviral. Qualquer proteína que contenha um péptido sinal eucariótico pode ser clonada nos vectores representados nas Figs. 2 (b) e 2(d) . Qualquer proteína que não seja vulgarmente segregada pode ser clonada nos vectores ilustrados nas Figs. 2 (a) e 2 (b) para permitir a sua secreção a partir das células glandulares tubulares. A Fig. 2 (e) ilustra a estratégia para clonagem de um gene exógeno num vector do péptido sinal da lisozima. A reacção em cadeia da polimerase é utilizada para amplificar uma cópia de uma sequência de codificação, o gene X, utilizando um par de iniciadores oligonucleotídicos contendo locais de enzimas de restrição que permitem a inserção do gene amplificado no plasmídeo após digestão com as duas enzimas. Os oligonucleótidos 5' e 3' contêm os locais de restrição Bsu361 e Xbal, respectivamente.

Outro aspecto da invenção envolve a utilização de elementos do local interno de entrada no ribossoma (IRES) em qualquer um dos vectores da presente invenção para permitir a tradução de duas ou mais proteínas a partir de um ARNm di-cistrónico ou policistrónico. As unidades IRES são fundidas a extremidades 5' de uma ou mais sequências de codificação adicionais que são então inseridas nos vectores na extremidade da sequência de codificação original, para que as sequências de codificação fiquem separadas umas das outras através de um IRES. De acordo com este aspecto da invenção, a modificação pós-tradução do produto é 28 facilitada porque uma sequência de codificação pode codificar uma enzima capaz de modificar o produto da outra sequência de codificação. Por exemplo, a primeira sequência de codificação pode codificar colagénio que seria hidrolisado e tornado activo pela enzima codificada pela segunda sequência de codificação.

Para ilustração, no exemplo de vector retroviral da Fig. 2(f), um elemento do local interno de entrada no ribossoma (IRES) está posicionado entre duas sequências de codificação exógenas (gene X e gene Y) . 0 IRES permite que tanto a proteína X como a proteína Y sejam traduzidas a partir do mesmo transcrito dirigido pelo promotor da ovalbumina. As setas dobradas indicam locais de início da transcrição. Espera-se que a expressão da proteína codificada pelo gene x seja mais elevada em células glandulares tubulares, onde é especificamente expressa mas não segregada. A proteína codificada pelo gene Y é também expressa especificamente em células glandulares tubulares mas como é eficientemente segregada, a proteína Y é empacotada nos ovos.

Noutro aspecto da invenção, as sequências de codificação dos vectores utilizados em qualquer um dos métodos da presente invenção são proporcionadas com uma região 3' não traduzida (UTR 3') para conferir estabilidade ao ARN produzido. Para ilustração, quando uma UTR 3' é adicionada a um vector retroviral, a orientação do promotor de ovalbumina, gene X e UTR 3' fundidos tem de ser invertida na construção, para que a adição da UTR 3' não interfira com a transcrição do ARN genómico inteiro. Numa forma de realização actualmente preferida, a UTR 3' pode ser a dos genes da ovalbumina ou da lisozima, ou qualquer UTR 3' que 29 seja funcional numa célula do magno, i.e. a região tardia de SV40.

Na presente invenção é utilizado um promotor constitutivo para expressar a sequência de codificação de um transgene no magno de uma ave. Neste caso, a expressão não está limitada apenas ao magno; a expressão ocorre também noutros tecidos da ave. No entanto, a utilização de um tal transgene é ainda adequada para efectuar a expressão de uma proteína no oviduto e subsequente secreção da proteína para a clara de ovo se a proteína não for tóxica para a ave na qual é expressa. A Fig. 3(a) mostra um esquema do vector baseado em vírus de leucose das aves (ALV) deficiente na replicação, pNLB, um vector que é adequado para utilizar nesta forma de realização da invenção. No vector pNLB, a maior parte do genoma de ALV é substituída pelo gene de resistência à neomicina (Neo) e o gene lacZ, que codifica a β-galactosidase. A Fig. 3 (b) mostra o vector pNLB-CMV-BL, no qual lacZ foi substituído pelo promotor de CMV e a sequência de codificação da β-lactamase (β-La ou BL) . A construção do vector está relatada no exemplo específico, Exemplo 1, abaixo. A fi-lactamase é expressa a partir do promotor de CMV e utiliza um sinal de poliadenilação (pA) na repetição terminal longa (LTR) a 3'. A β-lactamase tem um péptido sinal natural; assim, verifica-se no sangue e na clara de ovo.

Embriões de ave foram transduzidos com sucesso com partículas de transdução pNLB-CMV-BL (ver exemplos específicos, Exemplo 2 e 3, abaixo). Verificou-se que as claras de ovo de ovos de galinhas transduzidas estavelmente resultantes continham até 20 mg de β-lactamase segregada, 30 activa, por ovo (ver exemplos específicos, Exemplo 4 e 5, abaixo).

Numa forma de realização alternativa da invenção, são utilizados transgenes contendo promotores constitutivos, mas os transgenes são concebidos para que a expressão dos transgenes se torne eficazmente específica do magno. Assim, um método para produção de uma proteína exógena num oviduto de aves proporcionado pela presente invenção envolve a geração de uma ave transgénica que possui dois transgenes nas suas células glandulares tubulares. Um transgene compreende uma primeira sequência de codificação operativamente ligada a um promotor constitutivo. O segundo transgene compreende uma segunda sequência de codificação que está operativamente ligada a um promotor específico do magno, onde a expressão da primeira sequência de codificação é directamente ou indirectamente dependente da presença celular da proteína expressa pela segunda sequência de codificação.

Opcionalmente, sistemas de recombinação específicos do local, tais como os sistemas Cre-loxP ou FLP-FRT, são utilizados para implementar a activação específica do magno de um promotor constitutivo concebido. Numa forma de realização, o primeiro transgene contém uma sequência de bloqueio ligada a FRT que bloqueia a expressão da primeira sequência de codificação na ausência de FTP, e a segunda sequência de codificação codifica FTP. Noutra forma de realização, o primeiro transgene contém uma sequência de bloqueio ligada por loxP que bloqueia a expressão da primeira sequência de codificação na ausência da enzima Cre, e a segunda sequência de codificação codifica Cre. A sequência de bloqueio ligada por loxP pode ser posicionada na região não traduzida a 5' da primeira sequência de 31 codificação e a sequência ligada por loxP pode conter opcionalmente um enquadramento de leitura aberto.

Por exemplo, numa concretização da invenção, a expressão especifica do magno é conferida num transgene constitutivo, através da ligação de um promotor de citomegalovirus (CMV) à sequência de codificação da proteína a segregar (CDS) (Figs. 6 (a) e 6 (b)) . A região 5' não traduzida (UTR) da sequência de codificação contém um sequência de bloqueio ligada por loxP. A sequência de bloqueio ligada por loxP contém dois locais loxP, entre os quais está um codão de inicio (ATG) seguido de um codão de terminação, criando um enquadramento de leitura aberto (ORF) curto, sem sentido. Observe-se que a sequência de loxP contém dois codões de inicio na mesma orientação. Portanto, para impedir que interfiram com a tradução da sequência de codificação após a excisão de loxP, os locais loxP têm de ser orientados de modo a que os ATGs fiquem na cadeia oposta.

Na ausência da enzima Cre, o promotor de citomegalovirus dirige a expressão do pequeno enquadramento de leitura aberto (ORF) (Fig. 6(a)) . Os ribossomas iniciam no primeiro ATG, o codão de inicio do ORF, depois terminam sem serem capazes de reiniciar a tradução no codão de inicio da sequência de codificação. Para assegurar que a sequência de codificação não é traduzida, o primeiro ATG está desenquadrado do ATG da sequência de codificação. Se a enzima Cre for expressa em células contendo o transgene CMV-ADNc, a enzima Cre recombinará os locais loxP, excisando o ORF interveniente (Fig. 6(b)). Agora a tradução começará no codão de inicio da sequência de codificação, resultando na síntese da proteína desejada. 32

Para tornar este sistema específico do tecido, a enzima Cre é expressa sob o controlo de um promotor específico do tecido, tal como o promotor de ovalbumina específico do magno, na mesma célula que o transgene CMV-loxP-sequência de codificação (Fig. 6 (b)) . Embora um promotor da ovalbumina truncado possa ser razoavelmente fraco, é ainda específico do tecido e expressará quantidades suficientes da enzima Cre para induzir uma excisão eficiente do ORF interferente. De facto, níveis baixos de recombinase devem permitir uma expressão mais elevada da proteína recombinante uma vez que não compete contra os transcritos da sequência de codificação pela maquinaria de tradução. Métodos alternativos de bloqueio da tradução da sequência de codificação incluem a inserção de um sinal de terminação da transcrição e/ou um sinal de processamento entre os locais loxP. Estes podem ser inseridos juntamente com o ORF de bloqueio ou sozinhos. Noutra forma de realização da invenção, um codão de terminação pode ser inserido entre os locais loxP no péptido sinal da sequência de codificação (ver Fig. 7). Antes da recombinase ser expressa, o péptido termina antes da sequência de codificação. Após a recombinase ser expressa (sob a direcção de um promotor específico do tecido), o codão de terminação é excisado, permitindo a tradução da sequência de codificação. 0 local loxP e a sequência de codificação são justapostos para que fiquem enquadrados e os codões de terminação de loxP fiquem desenquadrados. Uma vez que os péptidos sinal são capazes de aceitar uma sequência adicional (Brown et al., Mol. Gen. Genet. 197: 351-7 (1984)), a inserção de loxP ou outras sequências alvo da recombinase (i.e. FRT) é improvável que interfira com a secreção da sequência de codificação desejada. No vector de expressão mostrado na Fig. 7, o local loxP está presente no péptido sinal para que os 33 aminoácidos codificados por loxP não estejam presentes na proteína madura, segregada. Antes da enzima Cre ser expressa, a tradução termina no codão de terminação, impedindo a expressão da β-lactamase. Após a recombinase ser expressa (apenas em células do magno), os locais loxP recombinam e excisam o primeiro codão de terminação. Portanto, a β-lactamase é expressa apenas selectivamente em células do magno.

Nas concretizações acima mencionadas, o ORF de bloqueio pode ser qualquer péptido que não seja prejudicial para as galinhas. 0 ORF de bloqueio pode também ser um gene que seja útil para a produção de partículas de transdução de ALV e/ou aves transgénicas. Numa forma de realização, o ORF de bloqueio é um gene marcador.

Por exemplo, o ORF de bloqueio pode ser o gene de resistência à neomicina, que é necessário para a produção de partículas de transdução. Uma vez o transgene integrado no genoma de galinha, o gene de resistência à neomicina não é necessário e pode ser excisado.

Alternativamente, a β-lactamase pode ser utilizada como ORF de bloqueio uma vez que é um marcador útil para a produção de aves transgénicas. (Para exemplos específicos da utilização de β-lactamase como marcador em aves transgénicas, ver Exemplo 4, abaixo). Como exemplo, o ORF de bloqueio na Fig. 6 (a) é substituído por β-lactamase e a sequência de codificação a jusante codifica agora um biofarmacêutico segregado. A β-lactamase será expressa no sangue e noutros tecidos; não será expressa no magno após expressão específica do magno da Cre e excisão mediada por recombinação da β-lactamase, permitindo a expressão da proteína desejada. 34

Os transgenes de Cre e loxP podem ser inseridos no genoma de galinha através de transgénese mediada simultaneamente ou separadamente. Qualquer método de transgénese que resulte em integração estável no genoma de galinha é adequado. Tanto o transgene promotor de ovalbumina-recombinase como CMV-loxP-CDS podem ser colocados simultaneamente em galinhas. No entanto, as eficiências da transgénese são baixas e portanto a eficiência de obtenção de ambos os transgenes no genoma de galinha simultaneamente é baixa. Num método alternativo e preferido, é produzido um bando que possui o transgene promotor específico do magno/recombinase e é produzido um segundo que possui o transgene CMV-loxP-CDS. Os bandos serão então cruzados uns com os outros. As galinhas cruzadas a partir deste cruzamento expressarão a sequência de codificação e apenas no seu magno.

Tal como mencionado acima, os vectores produzidos de acordo com os métodos da invenção podem ser opcionalmente proporcionados com uma UTR 3' contendo um local de poliadenilação para conferir estabilidade ao ARN produzido. Numa forma de realização preferida, a UTR 3' pode ser a do gene exógeno, ou seleccionada a partir do grupo que consiste na ovalbumina, lisozima ou região tardia de SV40. c) Produção de Proteína Exógena

Os métodos da invenção que proporcionam a produção de proteína exógena no oviduto de uma ave e a produção de ovos que contêm a proteína exógena envolvem um passo adicional subsequente ao proporcionar de um vector adequado e introdução do vector em células embrionárias da blastoderme para que o vector seja integrado no genoma da ave. 0 passo subsequente envolve a derivação de uma ave transgénica 35 madura a partir das células transgénicas da blastoderme produzidas nos passos anteriores. A derivação de uma ave transgénica madura a partir de células da blastoderme envolve opcionalmente a transferência das células transgénicas da blastoderme para um embrião e permitindo que o embrião se desenvolva completamente, para que as células se incorporem na ave à medida que se deixa o embrião desenvolver. A galinha resultante é então criada até à maturidade. Numa forma de realização alternativa, as células de um embrião blastodérmico são transfectadas ou transduzidas com o vector directamente dentro do embrião. 0 embrião resultante é deixado desenvolver-se e a galinha deixada amadurecer.

Em ambos os casos, a ave transgénica assim produzida a partir das células transgénicas da blastoderme é conhecida como fundador. Alguns fundadores possuirão o transgene nas células glandulares tubulares no magno dos seus ovidutos. Estas aves expressarão a proteína exógena codificada pelo transgene nos seus ovidutos. Se a proteína exógena contiver as sequências sinal apropriadas, será segregada para o lúmen do oviduto e sobre a gema dos ovos.

Alguns fundadores são fundadores da linha germinativa. Um fundador da linha germinativa é um fundador que possui o transgene no material genético do tecido da sua linha germinativa, e pode também possuir o transgene nas células glandulares tubulares do magno do oviduto que expressam a proteína exógena. Portanto, de acordo com a invenção, a ave transgénica terá células glandulares tubulares expressando a proteína exógena e a descendência da ave transgénica terá também células glandulares tubulares do magno do oviduto que expressam a proteína exógena. (Alternativamente, a 36 descendência expressa um fenótipo determinado pela expressão do gene exógeno num tecido especifico da ave) . A invenção pode ser utilizada para expressar, com grandes rendimentos e a baixo custo, uma ampla variedade de proteínas desejadas incluindo as utilizadas como produtos farmacêuticos, de diagnóstico humanos e animais e aditivos alimentares para produção animal. Proteínas tais como a hormona de crescimento humana, interferão, lisozima e β-caseína são exemplos de proteínas que são desejavelmente expressas no oviduto e depositadas em ovos de acordo com a invenção. Outras proteínas possíveis de produzir incluem, mas não se limitam a, albumina, antitripsina a-1, antitrombina III, colagénio, factores VIII, IX, X (e semelhantes), fibrinogénio, ácido hialurónico, insulina, lactoferrina, proteína C, eritropoetina (EPO), factor estimulador de colónias de granulócitos (G-CSF), factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) , activador do plasminogénio do tipo tecidual (tPA), enzimas de aditivo alimentar, somatotropina e quimotripsina. Anticorpos concebidos geneticamente, tais como imunotoxinas que se ligam a antigénios de superfície em células tumorais humanas e as destroem, podem também ser expressos para utilização como produtos farmacêuticos ou de diagnóstico. d) Exemplos

Os seguintes exemplos específicos pretendem ilustrar a invenção e não devem ser entendidos como limitantes do âmbito das reivindicações.

Exemplo 1. Construção do Vector 0 gene lacZ de pNLB, um vector baseado no vírus de leucose aviária (ALV) deficiente na replicação (Cosset et al., 37 1991), foi substituído por uma cassete de expressão consistindo num promotor de citomegalovírus (CMV) e o gene repórter, $-lactamase (β-La ou BL) . As construções de vector pNLB e pNLB-CMV-BL estão esquematizadas nas Figuras 3 (a) e 3 (b), respectivamente.

Para substituir eficientemente o gene lacZ de pNLB com um transgene, foi primeiro criado um plasmídeo adaptador intermédio, pNLB-Adaptador. pNLB-Adaptador foi criado através da inserção do fragmento Apal/Apal digerido de novo de pNLB (Cosset et ai., J. Virol. 65: 3388-94 (1991)) (em pNLB, resíduos Apal a 5' 289 pb a montante de lacZ e resíduos Apal a 3' da LTR 3' e segmentos Gag) nos locais Kpnl/SacI digeridos de novo de pBluescriptKS(-). 0 fragmento Mlul/Xbal preenchido de pCMV-BL (Moore et al., Anal. Biochem. 247: 203-9 (1997)) foi inserido nos locais Kpnl/Ndel digeridos de novo de pNLB-Adaptador, substituindo lacZ pelo promotor de CMV e o gene BL (em pNLB, resíduos de Kpnl 67 pb a montante dos resíduos de lacZ e NdeI 100 pb a montante do codão de terminação de lacZ), criando deste modo pNLB-Adaptador-CMV-BL. Para criar pNLB-CMV-BL, a inserção Hlndlll/Blpl de pNLB (contendo lacZ) foi substituída pela inserção HindiII/Blpl de pNLB-Adaptador-CMV-BL. Esta clonagem em dois passos foi necessária porque a ligação directa de fragmentos terminados de forma cega nos locais Hlndlll/Blpl de pNLB produziu principalmente subclones rearranjados, por razões desconhecidas.

Exemplo 2. Produção de Partículas de Transdução

Sentas e Isoldes foram cultivadas em FIO (Gibco), soro de vitelo recém-nascido a 5% (Gibco) , soro de galinha a 1% (Gibco), 50 yg/mL de fleomicina (Cayla Laboratories) e 50 yg/mL de higromicina (Sigma). Foram produzidas partículas de transdução tal como descrito em Cosset et al., 1993 com 38 as seguintes excepções. Dois dias após a transfecção do vector retroviral pNLB-CMV-BL (do Exemplo 1, acima) em 9><105 Sentas, o virus foi colhido em meio fresco durante 6-16 horas e filtrado. Todos os meios foram utilizados para transduzir 3χ106 Isoldes em 3 placas de 100 mm com polibreno adicionado até uma concentração final de 4 pg/mL. No dia seguinte o meio foi substituído por media contendo 50 pg/mL de fleomicina, 50 pg/mL de higromicina e 200 pg/mL de G418 (Sigma). Após 10-12 dias, colónias G418r individuais foram isoladas e transferidas para placas de 24 poços. Após 7-10 dias, os titulos de cada colónia foram determinados através da transdução de Sentas seguida de selecção em G418. Tipicamente 2 de 60 colónias deram titulos a 1-3χ105. Essas colónias foram expandidas e o virus concentrado até 2-7χ107 tal como descrito em Allioli et al., Dev. Biol. 165: 30-7 (1994). A integridade da cassete de expressão CMV-BL foi confirmada através de ensaio da β-lactamase no meio das células transduzidas com partículas de transdução NLB-CMV-BL.

Exemplo 3. Produção de Galinhas Transgénicas

Embriões em estádio X em ovos acabados de por foram transduzidos com partículas de transdução NLB-CMV-BL (do Exemplo 2, acima) tal como descrito em Thoraval et al., Trangenic Res. 4: 369-377 (1995), aqui incorporada por referência, excepto que o furo na casca do ovo foi coberto com 1-2 camadas de membrana da casca do ovo e, uma vez seca, cimento modelo Duco.

Foram produzidas aproximadamente 120 White Leghorns através de transdução dos embriões em estádio X com partículas de transdução NLB-CMV-BL. Estas aves constituem fundadores quiméricos, não aves completamente transgénicas. A análise extensiva do ADN no sangue e esperma das galinhas 39 transduzidas indica que apenas 10-20% tinham níveis detectáveis do transgene em qualquer dado tecido. Dessas aves, apenas 2-15% das células em qualquer dado tecido eram de facto transgénicas.

Exemplo 4. Ensaio da Actividade da β-lactamase no Sangue e Clara de Ovo

Quando as galinhas produzidas no Exemplo 3, acima, começaram a por ovos, as claras de ovo desses ovos foram ensaiadas quanto à presença de β-lactamase. O ensaio de β-lactamase foi realizado tal como descrito em Moore et al., Anal. Biochem. 247: 203-9 (1997), aqui incorporada por referência, com as seguintes modificações.

Para ensaiar o sangue de galinhas com dois a dez dias de idade, a veia da perna foi picada com um bisturi. Foram colhidos 50 pL de sangue num tubo capilar heparinizado (Fisher) , dos quais 25 pL foram transferidos para 100 pL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) numa placa de 96 poços. Foram adicionadas várias diluições de β-lactamase purificada (Calbiochem) a alguns poços antes da adição de sangue de pintos de controlo (não transduzidos) para estabelecer uma curva padrão da β-lactamase. Após um dia a 4°C, a placa foi centrifugada durante 10 minutos a 730 xg. Foram adicionados 25 pL do sobrenadante a 75 pL de PBS.

Foram adicionados 100 pL de ácido 7-(tienil-2-acetamido)-3-[2-(4-N,N-dimetilaminofenilazo)piridinio-metil]-3-cefem-4-carboxílico (PADAC, de Calbiochem) 20 pM em PBS, e os poços foram lidos imediatamente num leitor de placas numa leitura cinética de 10 minutos a 560 nm ou deixados de um dia para o outro no escuro à temperatura ambiente. Os poços eram registados positivos se o poço passasse de púrpura a amarelo. Para ensaiar o sangue de aves mais velhas, foi seguido o mesmo procedimento excepto que foram tirados 200- 40 300 pL de sangue da veia da asa utilizando uma seringa iniciada com 50 μL de heparina (Sigma). A análise do bando transduzido com NLB-CMV-BL revelou nove galinhas que tinham níveis significativos de β-lactamase no seu sangue. Três destas galinhas eram machos e estes foram os únicos três machos que tinham níveis significativos do transgene NLB-CMV-BL nos seus espermatozóides tal como determinado através de análise de PCR (ver Exemplo 10, abaixo). Assim, estes são os machos a cruzar para obter descendência Gi completamente transgénica. As outras seis galinhas eram as poedeiras que expressavam β-lactamase no tecido do seu magno (ver abaixo). Outras aves tinham níveis baixos de β-lactamase (imediatamente acima do nível de detecção) no seu sangue mas não tinham espermatozóides transgénicos nem ovos contendo β-lactamase. Assim, a expressão de β-lactamase no sangue é um forte indicador de se uma galinha foi transduzida com sucesso.

Para ensaiar a β-lactamase na clara de ovo, ovos acabados de serem postos foram transferidos nesse dia para um frigorífico a 4°C, ponto ao qual a β-lactamase é estável durante pelo menos um mês. (Foi determinado que a β-lactamase purificada, expressa de forma bacteriana adicionada à clara de ovo perde uma actividade mínima ao longo de várias semanas a 4°C, confinando a estabilidade da β-lactamase na clara de ovo). Para colher amostras de clara de ovo, os ovos foram partidos sobre película aderente. A clara de ovo foi pipetada para cima e para baixo várias vezes para mexer as claras de ovo espessa e fina. Uma amostra da clara de ovo foi transferida para uma placa de 96 poços. 10 pL da amostra da clara de ovo foram transferidos para uma placa de 96 poços contendo 100 pL de PBS suplementado com 1,5 pL de NaH2P04 1 M, pH 5,5 por poço. Após a adição de 100 pL de PADAC 20 pM, os poços 41 foram lidos imediatamente num leitor de placas numa leitura cinética de 10 minutos ou 12 horas a 560 nm. Várias diluições de β-lactamase purificada foram adicionadas a alguns poços juntamente com 10 yL de clara de ovo de galinhas de controlo (não transduzidas) para estabelecer uma curva padrão da β-lactamase. A clara de ovo de galinhas não tratadas e transduzidas com NLB-CMV-BL foi ensaiada quanto à presença de β-lactamase.

Niveis significativos de β-lactamase foram detectados na clara de ovo de seis galinhas, tal como mostrado na Fig. 4 e na Tabela 1, abaixo. Os ovos postos pela Galinha 1522 ("Betty Lu"), a primeira galinha a demonstrar expressão nos ovos, têm 0,3 mg ou mais de β-lactamase activa por ovo. É também mostrada a produção de β-lactamase a partir de três outras galinhas transduzidas com NLB-CMV-BL (Galinha 1549, Galinha 1790 e Galinha 1593) . Cada galinha que pôs ovos contendo β-lactamase tinha também niveis significativos de β-lactamase no seu sangue.

Com base no ensaio de actividade de β-lactamase, os niveis de expressão da β-lactamase pareceu variar de 0,1 a 1,3 mg por ovo (assumindo 40 mililitros de clara de ovo por ovo). No entanto, estas quantidades foram significativamente inferiores às quantidades obtidas através do ensaio de western blot (ver Exemplo 5, abaixo) e foram determinadas como sendo enganadoramente inferiores aos valores reais. Verificou-se que a diferença nos resultados entre o ensaio de actividade enzimática e a análise western blot (Exemplo 5) era devida à presença de um inibidor da β-lactamase na clara de ovo. Mostrou-se que a actividade da β-lactamase purificada era inibida pela clara de ovo tal que 50 mL de clara de ovo numa reacção de 200 mL resultaram em quase 100% de inibição, enquanto que 10 mL de clara de ovo numa reacção de 200 mL resultaram numa inibição apenas moderada. 42

Além disso, a quebra espontânea do substrato enzimático, PADAC, durante o curso do ensaio contribuiu também para o cálculo erroneamente baixo da concentração de β-lactamase.

Tabela 1. Expressão de β-lactamase em ovos de galinhas tratadas com NLB-CMV-BL Galinha # mg Médios de β- # de ovos ensaiados lactamase por ovo 1 Controlo 0,1 ± 0,07 29 2 1522 0,31 ± 0,07 20 3 1549 0,96 ± 0,15 22 4 1581 1,26 ± 0,19 12 5 1587 1,13 + 0,13 15 6 1790 0,68 ± 0,15 13 7 1793 1,26 ± 0,18 12 0 controlo são ovos de galinhas não tratadas. 0 nível baixo de BL nestes ovos é devido à quebra espontânea de PADAC durante o curso do ensaio cinético. As outras galinhas foram transduzidas com NLB-CMV-BL tal como descrito no Exemplo 3. A clara de ovo de cada ovo foi ensaiada em triplicado.

Exemplo 5. Western Blot da β-Lactamase na Clara de Ovo A análise western blot da mesma clara de ovo tal como ensaiada no Exemplo 4 confirmou a presença de β-lactamase e proporcionou uma medição mais precisa da quantidade de β-lactamase presente no ovo que o ensaio cinético do Exemplo 4, acima.

Para efectuar a análise, foram adicionados 10 pL de clara de ovo a 30 pL de Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8, dodecilsulfato de sódio a 10% (SDS), glicerol a 10%, 2-mercaptoetanol 1,43 M, azul de bromofenol a 0,001%. As amostras foram aquecidas até 95°C durante 5 min, separadas em SDS-PAGE a 12% e transferidas para membranas Immobilon P (Millipore). A β-lactamase foi detectada com uma diluição 1:500 de anti-β-lactamase de coelho (5 Linha-3 Linha) e uma diluição 1:5000 de IgG de cabra anti-coelho conjugado com HRP (Promega). Os Immunoblots forma visualizados com o Sistema de Western Blotting Enhanced Chemiluminescence (ECL) (Amersham). Várias amostras de β-lactamase foram analisadas através de western blotting e o anticorpo anti^-lactamase. Os resultados são mostrados na Fig. 5. As pistas 1-4 da membrana contêm 5,2, 1,3, 0,325, e 0,08 pg, 43 respectivamente, de β-lactamase expressa de forma bacteriana, purificada adicionada à clara de ovo de controlo, formando uma curva padrão. A pista 5 contém clara de ovo de controlo de uma galinha não tratada. Na pista 6 são 2 pL de clara de ovo da Galinha 1522 (Betty Lu) . As pistas 7-8 contêm 1 e 2 pL, respectivamente, de clara de ovo da Galinha 1790. As pistas 9-10 contêm 1 e 2 pL, respectivamente, de clara de ovo da Galinha 1793. Aliquotas de 1 e 2 pL de clara de ovo da Galinha 1549 foram corridas nas pistas 11-12. As pistas 13-14 mostram 1 e 2 pL, respectivamente, de clara de ovo da Galinha 1581. 2 pL de clara de ovo da Galinha 1587 são mostrados na pista 15. A posição dos padrões de peso molecular é observada na Fig. 5 à esquerda da membrana em quilodaltons (kDa). A banda a 31 kDa é β-lactamase. O peso molecular da β-lactamase na clara de ovo é semelhante ao da β-lactamase purificada. A β-lactamase da clara de ovo é também uma única espécie molecular, indicando que a síntese foi fiel à sequência de codificação da β-lactamase e que a β-lactamase é muito estável em células do magno bem como na clara de ovo. A banda a 13 kDa é uma proteína da clara de ovo que reage de modo cruzado com o anticorpo anti-p-lactamase.

Com base nos resultados de western blot, a β-lactamase na pista 6 (da Galinha 1522, Betty Lu) é estimada em 120 ng, ou 2,4 mg por ovo, assumindo 40 mL de clara de ovo por ovo. A β-lactamase na pista 9 (da Galinha 1793) é estimada em 325 ng o que corresponde a 13 mg por ovo. Os níveis de β-lactamase por ovo estimados através de análise western blot foram consideravelmente mais elevados (até 10 vezes mais elevados) que os níveis estimados pelo ensaio da enzima β-lactamase do Exemplo 4. Tal como explicado acima, crê-se que a discrepância nas estimativas da proteína seja causada 44 pela inibição da actividade enzimática pela clara de ovo e quebra do substrato.

Deve observar-se que os até 13 mg de β-lactamase por ovo aqui relatados foram produzidos por fundadores quiméricos, aves não completamente transgénicas. Tal como relatado acima, apenas 2-15% das células num dado tecido dos fundadores quiméricos eram de facto transgénicas. Assumindo que esta extensão de mosaicismo também se aplica a tecido do magno, então os magnos das seis galinhas com ovos positivos para a β-lactamase eram apenas parcialmente transgénicos. Portanto, espera-se que aves completamente transgénicas (descendência Gi) expressem níveis muito mais elevados, possivelmente tão elevados como 200 mg/ovo. Esta estimativa é significativa porque indica que promotores não específicos do magno tais como CMV podem competir eficazmente com genes específicos do magno tais como ovalbumina e lisozima pela maquinaria de síntese proteica da clara do ovo.

Exemplo 6. Isolamento e Transfecção Ex Vivo de Células da Blastoderme

Numa forma de realização alternativa da invenção, as células da blastoderme são transfectadas ex vivo com um vector de expressão.

Neste método, as células dadoras da blastoderme são isoladas de ovos fertilizados de galinhas Barred Plymouth Rock utilizando um anel anular estéril de papel de filtro Whatman que é colocado sobre a blastoderme e levantado após corte através da membrana vitelina do anel. O anel possuindo a blastoderme agarrada é transferido para solução salina tamponada com fosfato (PBS) numa caixa de petri com o lado ventral para cima, e a gema aderente é removida 45 através de pipetagem suave. A área opaca é dissecada com um uma ansa e a blastoderme translúcida de estádio X é transferida através de uma ponta de pipeta de diâmetro grande para um tubo de centrífuga. Cerca de 30 000-40 000 células são isoladas por blastoderme e para uma experiência típica são colhidas 10 blastodermes.

As células são dispersas através de rápida digestão com tripsina (0,2%), lavadas uma vez com centrifugação a baixa velocidade em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) e depois transfectadas com plasmídeos linearizados através de lipofectina (16 mg/200 mL, BRL) durante 3 horas à temperatura ambiente. Os vectores mostrados nas Figuras 2, 3 servirão agui como construções de expressão adeguadas. As células são lavadas da lipofectina com meio e depois 400-600 células são injectadas em embriões receptores de estádio X irradiados com γ (650 rads) da linha Athens-Canadian cruzada aleatoriamente (linha AC) . A injecção é através de uma pequena janela («0,5 cm) na cavidade subgerminal por baixo das blastodermes receptoras. As janelas são seladas com membrana de casca do ovo fresca e cimento plástico Duco. Os ovos são então incubados a 39,1°C numa incubadora humidificada com rotação de 90° a cada 2 h.

Exemplo 7. Identificação de Mosaicos Transgénicos através de Ensaio de PCR

Entre os pintos que eclodem de embriões contendo células de blastoderme transfectadas ou transduzidas, apenas os que exibiam mosaicismo de penas Barred Plymouth Rock são mantidos. Mesmo se não estiver presente gene repórter no transgene, os mosaicos transgénicos podem ser identificados através de ensaio de PCR. 46

Para identificar mosaicos transgénicos, o ADN do sangue e da polpa das penas negras de cada pinto é ensaiado através de PCR quanto à presença do transgene utilizando um par de iniciadores específicos para o transgene tal como descrito por Love et al., Bio/Technology 12: 60-63 (1994). As quimeras transgénicas são induzidas, retiradas e re-induzidas com pastilhas de dietilestilbestrol (DES) e os magnos excisados analisados quanto à expressão de actividade do repórter. O sangue e o figado são ensaiados para monitorizar a especificidade do tecido. ADN do sangue de machos e fêmeas foi colhido a 10 a 20 dias pós-eclosão. O ADN é extraído do sangue utilizando um novo método de extracção de ADN de elevada tiragem desenvolvido no nosso laboratório. Neste método, o sangue é retirado de uma veia da asa para uma seringa heparinizada e é imediatamente dispensada uma gota para um poço de uma placa de 96 poços de fundo plano contendo um tampão que lisa exclusivamente membranas citoplasmáticas. A placa é então brevemente centrifugada, o que sedimenta os núcleos. O sobrenadante é removido e um segundo tampão de lise é adicionado o que liberta o ADN genómico dos núcleos e degrada as nucleases. O ADN é precipitado em etanol na placa, lavado com etanol a 70%, seco e ressuspenso em 100 pL de água por poço. Tanto como 80 pg de ADN podem ser obtidos a partir de uma gota (8 μΐ) de sangue de pinto. Pelo menos 768 amostras podem ser processadas por uma pessoa num dia e o ADN é adequado para PCR e análise Taqman™ (Perkin Elmer/Applied Biosystems). O ADN isolado é então testado quanto à presença dos transgenes utilizando o ensaio de detecção de sequências Taqman para avaliar a eficiência do processo de transdução dos embriões. O sistema de detecção de sequências Taqman 47 permite a detecção directa de uma sequência especifica. Uma sonda oligonucleotidica marcada com fluorescência complementar a uma região interna de um produto de PCR desejado apenas fluoresce quando ligada ao produto de PCR desejado, que neste caso é complementar ao transgene. Como toda a detecção ocorre no tubo de PCR durante o processo de ciclização, o sistema Taqman permite uma PCR de elevada tiragem (não é necessária electroforese em gel) tão bem como a detecção de sequências análogas e tão sensível como a análise Southern. 1 pL do ADN isolado, que contém 600-800 ng de ADN, é utilizado para a reacção de Taqman. Cada reacção contém dois conjuntos de pares de iniciadores e sondas Taqman. O primeiro conjunto detecta o gene da gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) de galinha e é utilizado como um controlo interno para a qualidade do ADN genómico e também serve como padrão para a quantificação da dosagem do transgene. O segundo conjunto é específico para o transgene desejado. A fluorescência é detectada numa lupa de dissecção equipada com detecção de epifluorescência. As duas sondas Taqman são unidas a diferentes corantes que fluorescem a comprimentos de onda únicos: assim ambos os produtos de PCR são detectados simultaneamente num Detector de Sequências ABI/PE 7700. Estima-se que eclodirão até 180 aves e 20% (36 aves) conterão o transgene no seu sangue.

Exemplo de Referência 8. Identificação de Células da Blastoderme com um Minigene Sem Promotor Correctamente Integrado (PMG)

Após transfecção com um vector direccionador de PMGI tal como os mostrados na Figura 8, as células são criadas numa linha de alimentação em meio condicionado para produzir colónias nas quais todas ou quase metade das células têm uniformemente fluorescência verde. A fluorescência é 48 detectada numa lupa de dissecção equipada com detecção de epifluorescência. Fluorescência uniforme indica que o vector se integrou estavelmente no genoma. Destes clones celulares, apenas um pequeno subconjunto tem de facto o PMG inserido no gene alvo. A maioria dos clones tem PMG integrado aleatoriamente no genoma. Para identificar clones contendo um PMG integrado correctamente, as colónias são pesquisadas utilizando um ensaio de PCR TaqMan, tal como descrito acima. São utilizados dois iniciadores para amplificar um segmento do transgene no seu local de integração. Um iniciador reside no gene X, o gene exógeno a expressar no oviduto, e o outro imediatamente fora da sequência direccionadora a 5', para que o fragmento possa apenas ser amplificado através da inserção correcta no gene alvo. As colónias contendo um transgene correctamente integrado são sujeitas a passagem limitada em cultura em células alimentadoras na presença de uma variedade de citocinas que promovem o seu crescimento na ausência de diferenciação. As células são injectadas em embriões receptores. Alternativamente, as colónias verdes são reunidas e injectadas em embriões receptores. Os pintos que eclodem são subsequentemente pesquisados quanto à presença do transgene correctamente inserido.

Exemplo de Referência 9. Detecção Azul/Verde para Inserção do Minigene Sem Promotor (PMGI)

Após transfecção com um vector direccionador de PMGI tal como o da Figura 4, as células são criadas durante um dia na ausência de uma camada alimentadora e as células verdes separadas das células azuis/verdes utilizando um separador de células activado por fluorescência no dia seguinte. As células verdes são então passadas rapidamente em células alimentadoras antes da injecção em embriões receptores. As 49 células verdes são então pesquisadas tal como acima quanto à inserção correcta.

Exemplo 10. Produção de Galinhas Gi Completamente Transgénicas

Os machos são seleccionados para criação porque um único macho pode dar origem a 20 a 30 descendentes Gi por semana em oposição a 6 descendentes Gi por fêmea por semana, acelerando deste modo a expansão de transgénicos Gi. A ração dos machos Go é suplementada com sulfametazina, que acelera a maturação sexual dos machos de modo a que possam iniciar a produção de esperma às 10-12 semanas de idade em vez de 20-22 semanas sem influenciar a sua saúde ou fertilidade (Speksnijder e Ivarie, dados não publicados). O ADN de espermatozóides de todos os machos é pesquisado quanto à presença do transgene. Os espermatozóides são colhidos e o ADN é extraído utilizando Chelex-100.

Resumidamente, são misturados 3 pL de espermatozóides e 200 pL de Chelex-100 a 5%, seguido da adição de 2 pL de proteinase K a 10 mg/mL e 7 pL de DTT 2 M. As amostras são incubadas a 56°C durante 30-60 minutos. As amostras são fervidas durante 8 minutos e sujeitas a vórtice vigorosamente durante 10 segundos. Após centrifugação a 10 a 15 kG durante 2-3 minutos, o sobrenadante está pronto para PCR ou análise Taqman. O ADNs são analisados através do ensaio Taqman utilizando uma sonda Taqman e iniciadores complementares ao transgene. Dos 90 machos Go, estima-se que 5%, ou 4 a 5, terão o transgene no ADN dos seus espermatozóides. nos seus

Tal como observado acima no Exemplo 4, o bando transduzido com NLB-CMV-BL incluiu três machos que tinham níveis significativos do transgene NLB-CMV-BL 50 espermatozóides tal como determinado através de análise de PCR (ver Exemplo 10) . Assim, estes machos são escolhidos para mais cruzamentos para obter descendência Gi completamente transgénica.

Ao cruzar machos de linha germinativa transgénica com 90 fêmeas White Leghorn não transgénicas por semana, estima-se que serão obtidos 16 descendentes Gi por semana. Os pintos que eclodiram são sexados por evacuação e pesquisados quanto à presença do transgene no ADN do seu sangue através do ensaio Taqman. Obter-se-ão vinte machos e fêmeas Gi transgénicos ou 40 no total, o que demorará até 3 semanas.

Os machos serão mantidos para mais cruzamentos e as fêmeas testadas quanto à expressão de transgenes no ovo.

Lisboa, 17 de Fevereiro de 2011

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Ave transgénica possuindo um vector retroviral no material genético do tecido da sua linha germinativa, em que o vector compreende um gene exógeno e um promotor constitutivo, numa relação operacional e posicionai para expressar o gene exógeno, e o gene exógeno é expresso no oviduto aviário da ave transgénica para produzir uma proteína exógena em que a proteína exógena contém uma sequência sinal e é segregada para o lúmen do oviduto de modo a que a proteína seja depositada na clara de um ovo.

2. Método para a produção de uma proteína exógena num oviduto de uma ave, compreendendo: proporcionar um vector retroviral que compreende uma sequência de codificação e um promotor constitutivo operativamente ligado à sequência de codificação, em que o promotor pode efectuar a expressão da sequência de codificação nas células glandulares tubulares de um oviduto aviário; criação de células transgénicas através da introdução do vector em células embrionárias da blastoderme de ave, em que a sequência do vector é inserida no genoma da ave e em que a introdução do vector nas células embrionárias da blastoderme é mediada por retrovírus; e derivação de uma ave transgénica madura a partir das células transgénicas, em que as células glandulares tubulares da ave transgénica expressam a proteína, e a proteína resultante é segregada para o lúmen do oviduto, para que a proteína seja depositada na clara de ovo de um ovo.

3*utr: região nao tradiffiida 3’ contendo local de poliadenilaçao

Alçsiiio vçctor que R sçni ckmentp LSI’ 3/12 Figura 2E

Féptido Sinal da Lisozima_ MG 5 L L I ti V L CFL í> L A Ncol Khel 51 CCACCATGSG GTCTTtSCTA ATCTTGGTGC TTTGCTTCCT GCCGCTAGC? GGTGGTACCC CaGAAACGAT TAGAACCACS AftACGAAGGA CGGCGA.TGÍ3A A L G^ SsuJêí XbaZ W . . , , .. . ,, _4 ........ Ϊ < ilt‘ divii^ruulw oc.mhdo suiíiI 101 SCCTTAGGSC CCTCTA&AG T C5GAATCCCG GGAGATCTC Clonagem por PCR do ADNc BáuJcI ___Mim ADNc +-ss 4/12 Figura 2F _f> r> 5’LTR aiiim ;; ;QVti;4;;; LSPUgane Xjjj ESigene Yj- 3'LTR local 4c injeto «ta transcrição 5' & 3' LTR: repetições terminais longas dcALV ψ sinal <lc impacotamento do vírus Neo: gene de resistência à neomkina OV-1.4; promotor -1,4 kb de oralbumma tSP: pèptídó sinal tla lisórima 9#ηβ X* gene ou ADXc codificando uma proteína exógena 3βηβ Vi gcric ou ADNc codificando uma proteína exógena IRES: local de entrada no ribnssoma interno 5/12 Figura 3 ο 3A 3B

ARN dirigida por CM.V β-La 6/12 Figura 4

iJe postura de ovos 7/12 tfi Μ·» Γ <

3. Método para produção de um ovo de ave que contém proteína exógena, compreendendo: 2 proporcionar um vector retroviral que compreende uma sequência de codificação e um promotor constitutivo operativamente ligado à sequência de codificação, em que o promotor pode efectuar a expressão da sequência de codificação nas células glandulares tubulares de um oviduto aviário; criação de células transgénicas através da introdução do vector em células embrionárias da blastoderme de ave, em que a sequência do vector é inserida na ave e em que a introdução do vector nas células embrionárias da blastoderme é mediada pelo retrovirus; e derivação de uma ave transgénica madura a partir das células transgénicas, em que as células glandulares tubulares da ave transgénica expressam a sequência de codificação, e a proteína resultante é segregada para o lúmen do oviduto, para que a proteína seja depositada na clara de ovo de um ovo.

4. Método de qualquer uma das reivindicações 2 a 3, compreendendo ainda a criação da referida ave transgénica madura para produzir descendência, em que as células glandulares tubulares das aves transgénicas descendentes expressam a sequência de codificação, e a proteína resultante é segregada para o lúmen do oviduto, para que a proteína seja depositada na clara de ovo de um ovo.

5. Método de qualquer uma das reivindicações 2 a 4, compreendendo ainda o passo de isolamento da proteína a partir do ovo.

6. Método de qualquer uma das reivindicações 2 a 5, em que o passo de introdução do vector nas células embrionárias da blastoderme inclui a administração de células ajudantes a 3 uma blastoderme embrionária, em que as células ajudantes produzem o retrovírus.

7. Ave transgénica da reivindicação 1 ou o método de qualquer uma das reivindicações 2 a 6, em que o promotor é seleccionado a partir do grupo que consiste no promotor de CMV, promotor de SV40 e o promotor do virus de sarcoma de Rous (RSV).

8/12 Figura 66A Ccliil» si m ser do mu faio

6B t tinia do mu faio

8. Ave transgénica da reivindicação 1 ou o método de qualquer uma das reivindicações 2 a 7, em que a proteína exógena é uma proteína farmacêutica.

9. Método de qualquer uma das reivindicações 2 a 8, em que o método compreende ainda a formulação da proteína como medicamento.

10. Ave transgénica da reivindicação 1 ou o método de qualquer uma das reivindicações 2 a 9, em que a proteína exógena é seleccionada a partir do grupo que consiste em interferão, antitripsina a-1, antitrombina III, colagénio, factores VIII, IX, X, fibrinogénio, insulina, lactoferrina, proteína C, activador de plasminogénio de tipo tecidual, somatotrofina, anticorpo, hormona de crescimento humana, imunotoxina, quimotripsina, factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos, factor estimulador de colónias de granulócitos e eritropoetina.

11. Ave transgénica da reivindicação 1 ou o método de qualquer uma das reivindicações 2 a 10, em que a ave transgénica é seleccionada a partir do grupo que consiste numa galinha e num peru. Lisboa, 17 de Fevereiro de 2011 1/12

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9/12 Figura 7 lATGjjfõx} · · (TAAlflõx I Pep Si I fi-La CD Recombinase 1 jÃTmfciPirsiTFi:à'CD^> Tradução Pre~ 3-La Processamento & secreção 3*Lâ madut :‘a 10/12 igura 8A

|6ftC X; 011 ADNc coditícumlti um» proteína exógena 5autr: nsgiao ufio traduzida 5' procedendo o c»xhu> de início 3‘ΚΪΓ^ l egiíío nao traduzida 3* contendo locai de poljiojensíaçiio ef.1 a: promotor do 'fnctar de alongamento 1 Qt Gm gene du proteínn verde tliioreseente humanizado 11/12 Figura 8B

gene du proteína verde, fluorescente liumuiti/Aid<* 12/12

;mk- ccidiflMiiulo protoma flumesmifc anil