MXPA06004858A

MXPA06004858A - Factores de virulencia bacteriana y sus usos.

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Publication number: MXPA06004858A
Application number: MXPA06004858A
Authority: MX
Inventors: Brett Finlay; Wanyin Deng; Samantha Gruenheid; Bruce Valllance; Jose L Puente
Original assignee: Univ British Columbia
Priority date: 2003-10-31
Filing date: 2004-10-29
Publication date: 2007-04-16
Also published as: CN1922324A; AR050050A1; RU2012122559A; AU2011201889A1; RU2006118803A; KR20110102956A; NO20062361L; EP2462948A1; KR20130018999A; CN1922324B; ZA200604412B; JP2011250790A; CA2543763A1; US20070041997A1; US8507249B2; AU2011201889B2; RU2465331C2; BRPI0415816A; JP2007531511A; AU2004286002B2

Abstract

La invencion se refiere, en parte, a proteinas de secrecion de agentes patogenos bacterianos y a metodos para su utilizacion. Mas especificamente, la invencion provee en parte varias proteinas de secrecion comunes nuevas, para agentes patogenos de adherencia y destruccion (agentes patogenos "A/E"). en algunas modalidades de la invencion, estos polipeptidos y las moleculas de acido nucleico que codifican para estos polipeptidos, o porciones de las mismas, son utiles como vacunas, como diagnosticos o como herramientas de seleccion de farmacos para infecciones patogenicas A/E, o como reactivos.

Description

FACTORES DE VIRULENCIA BACTERIANA Y SUS USOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a agentes patógenos bacterianos. Más específicamente, la invención se refiere, en parte, a proteínas de secreción de agentes patógenos bacterianos y a los métodos para su uso. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Escherichia coli es un organismo extremadamente versátil . Además de ser un miembro de la flora intestinal normal, ciertas cepas de E. coli también provocan infecciones de la vesícula biliar, meningitis y diarrea. Las E. coli diarreagénicas incluyen al menos cinco tipos de E. coli, las cuales causan varios síntomas que van desde la diarrea de tipo colérica hasta la colitis extrema. Cada uno de los tipos de E. coli diarreagénica posee un conjunto particular de factores de virulencia que incluyen adhesinas, invasinas y/o toxinas, las cuales son responsables de provocar un tipo específico de diarrea. La E. coli enteropatogénica (EPEC) es , causa predominante de diarrea infantil en todo el mundo. El mal de EPEC se caracteriza por una diarrea acuosa de severidad variable, con vómitos y fiebre a menudo acompañando la pérdida de fluido. Además de brotes aislados en salas de cuidados diurnos y en guarderías infantiles de países desarrollados, la EPEC plantea una importante amenaza endémica para la salud de niños pequeños (menores de 6 meses) en países en desarrollo. En todo el mundo, la EPEC es la principal causa de diarrea mediada por bacterias en niños pequeños, y se ha estimado que la EPEC mata a varios cientos de miles de niños por año. La E. coli enterohemorrágica (EHEC) , también llamada E. coli productora de toxina Shiga (STEC) , o E. coli productora de toxina Vero (VTEC) , provoca una diarrea más severa que la EPEC (colitis entérica) y en aproximadamente 10% de los casos esta enfermedad progresa hacia una enfermedad renal a menudo fatal, el síndrome urémico hemolítico (HUS) . La EHEC 0157 :H7 es el serotipo más común en Canadá y en los Estados Unidos, y está asociada al envenenamiento de los alimentos y el agua (3) . Otros serotipos de la EHEC también provocan problemas significativos en Asia, Europa, América del Sur y, en menor grado, en América del Norte. La EHEC coloniza el ganado y causa lesiones A/E, pero no provoca enfermedad en animales adultos, y en cambio propaga organismos en el ambiente. Esto sin embargo causa serios problemas sanitarios, ya que se necesitan relativamente pocas EHEC para infectar a los humanos . Contrariamente a lo que ocurre con otras diarreas causadas por E. coli , tal como la E. coli enterotoxigénica, la diarrea causada por EHEC y EPEC no está mediada por una toxina. En cambio, EPEC y EHEC se adhieren a las superficies intestinales (EPEC al intestino delgado, EHEC al intestino grueso) y provocan una lesión histológica característica conocida como lesión de adherencia y destrucción (A/E) (8) . Las lesiones A/E se destacan por la disolución de la superficie del ribete en cepillo intestinal y la pérdida (destrucción) de icrovellosidades epiteliales en los sitios de adherencia de las bacterias. Una vez adheridas, las bacterias residen sobre proyecciones en forma de copa o pedestales. Por debajo de este pedestal, en la célula epitelial hay varios componentes citoesqueléticos, tales como actina y proteínas citoesqueléticas asociadas a la actina. La formación de lesiones A/E y de pedestales ricos en actina por debajo de las bacterias adheridas son el sello distintivo de los agentes patógenos A/E (1, 2) . Esta patología puede ser recapitulada en células cultivadas in vitro, y la formación de pedestales puede observarse mediante una técnica de tinción fluorescente de la actina (2, 11). La formación de la lesión A/E puede ser responsable de la destrucción del ribete en cepillo y de las microvellosidades, de la secreción de fluido y de la diarrea. EPEC y EHEC pertenecen a una familia de agentes patógenos A/E que incluye varios agentes patógenos del tipo EPEC de animales, que provocan la enfermedad en conejos (REPEC) , cerdos (PEPEC) y ratones { Ci trobacter rodentium) . Estos agentes patógenos contienen islas de patogenicidad (PAIs) que codifican para sistemas de secreción especializados y factores de virulencia secretados que son críticos para la enfermedad. Se cree que los genes requeridos para la formación de lesiones A/E están agrupados en una única isla cromosómica de patogenicidad conocida como locus de destrucción de enterocitos (LEE) , el cual incluye elementos reguladores, un sistema de secreción del tipo III (TTSS) , proteínas efectoras secretadas, y chaperonas cognadas (4-8) . El LEE contiene 41 genes, lo cual lo hace uno de los PAIs más complejos. La función principal del TTSS del LEE es liberar efectores dentro de las células hospedadoras, donde subvierten las funciones de la célula hospedadora e interceden en la enfermedad (9, 10, 34). Se han identificado cinco efectores codificados por el LEE (Tir, EspG, EspF, Map y EspH) (35, 40) . El Tir (receptor translocado de la intimina) es translocado dentro de las células hospedadoras, donde se adhiere a proteínas citoesqueléticas y de señalización, y da inicio a la polimerización de la actina en el sitio de adhesión bacteriana (31, 44) , dando como resultado la formación de estructuras de actina del pedestal por debajo de las bacterias adheridas, las cuales interactúan directamente con el circuito extracelular del Tir a través de la proteína intimina de la membrana bacteriana externa. El CesT juega un papel de acompañante para la estabilidad y secreción del Tir (18, 19) . Se han caracterizado otros cuatro efectores translocados por el TTSS y codificados por el LEE en agentes patógenos A/E : el EspH promueve el alargamiento de los pedestales de actina (40) ; el EspF juega un papel en el desensamble de las uniones fuertes entre las células del epitelio intestinal (38) ; el EspG está relacionado al efector VirA de unión a microtúbulos de Shigella (36, 55) ; y el Map se localiza en mitocondrias (37) pero también tiene un papel en la dinámica de la actina (48) . El Ler (regulador codificado por el LEE) es el único regulador codificado por el LEE que ha sido identificado. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Esta invención se basa, parcialmente, en la identificación de diversas nuevas proteínas de secreción comunes en agentes patógenos A/E. La invención provee, en un aspecto, composiciones que incluyen un polipéptido o un fragmento o variante del mismo, o un sobrenadante de cultivo celular que incluye tal polipéptido, donde el polipéptido sustancialmente puro incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera o cualesquiera de las SEQ ID Nos: 22-43, 59 ó 73-84, o a fragmentos o variantes de las mismas . La invención también provee composiciones que incluyen una molécula de ácido nucleico, donde la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera o cualesquiera de las SEQ ID NO: 22-43, o a fragmentos de las mismas. Las composiciones pueden además incluir un portador fisiológicamente aceptable, o pueden además incluir un adyuvante. Las composiciones también pueden incluir una molécula polipeptídica o de ácido nucleico tal como EspA, EspB, EspD, EspP, Tir, toxina Shiga 1, toxina Shiga 2, o intimina. Los polipéptidos o las moléculas de ácido nucleico pueden ser sustancialmente puras . La invención también provee, en aspectos alternativos, una bacteria o una preparación de la misma, donde la bacteria incluye una mutación en un gen tal como nleA, nleB, nleC, nleD, nleE, nleF, nleG, nleH, o un homólogo de los mismos, o incluye una mutación en el genoma bacteriano en una secuencia nucleotídica que es sustancialmente idéntica a las SEQ ID Nos: 1-21 ó 60-72. En algunas modalidades, la bacteria puede ser un agente patógeno A/E, tal como la E. coli enterohemorrágica (EHEC; por ejemplo, EH?C 0157 :H7 ó EHEC 0157 :NM) , la E. coli enteropatogénica (EPEC/ por ejemplo, EPEC 0127 :H6) , o CitroJbater rodentium. En algunas modalidades, la mutación puede atenuar la virulencia, o puede estar presente en una secuencia nucleotídica en el genoma del agente patógeno A/E que es sustancialmente idéntica a la secuencia seleccionada a partir del grupo consistente en las SEQ ID NOs: 1-21 ó 60-72. La bacteria puede ser provista como una composición, en combinación con un adyuvante. En algunas modalidades, la bacteria puede estar viva. En algunas modalidades, la bacteria puede estar muerta. El modo de administración puede ser oral o parenteral. La invención también provee, en aspectos alternativos, un método para detectar la presencia de un agente patógeno A/E en una muestra, mediante la provisión de una muestra; y para detectar la presencia de una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a una secuencia seleccionada a partir de las SEQ ID NOs: 1-21 ó 60-72, ó un fragmento o variante de las mismas; una secuencia nucleotídica codificadora de una secuencia polipeptídica sustancialmente idéntica a una secuencia seleccionada a partir de las SEQ ID NOs: 22-43, 59 ó 73-84, ó un polipéptido que incluya una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia seleccionada a partir de las SEQ ID NOs: 22-43, 59 ó 73-84, ó un fragmento o variante de las mismas, donde la presencia de la secuencia nucleotídica o la secuencia de aminoácidos indica la presencia de un agente patógeno A/E en una muestra (por ejemplo, huevo, heces, sangre o intestino) . La detección puede incluir el poner en contacto la secuencia nucelotídica con una sonda o cebador sustancialmente idéntico a una secuencia seleccionada a partir del grupo compuesto por las SEQ ID NOs: 1-21 ó 60-72, o una secuencia nucleotídica que codifique para una secuencia polipeptídica sustancialmente idéntica a la secuencia seleccionada a partir del grupo compuesto por las SEQ ID NOs: 22-43, 59 ó 73-84, o una porción de las mismas, o puede incluir poner en contacto la secuencia de aminoácidos con un anticuerpo que se ligue específicamente a una secuencia seleccionada a partir del grupo compuesto por las SEQ ID NOs: 22-43, 59 ó 73-84, ó un fragmento o variante de las mismas. La invención también provee, en aspectos alternativos, métodos para producir una respuesta inmune contra un agente patógeno A/E o un componente del mismo, o para reducir la colonización o la difusión de un agente patógeno A/E en un animal (por ejemplo, un humano, un rumiante, tal como ovejas -sujeto ovino-, cabras, vacas -sujeto bovino-, etc.; o cualquier otro animal, por ejemplo, cerdos, conejos, aves de corral -por ejemplo, patos, pollos, pavos-, etc.), mediante la identificación de un animal infectado con -o en riesgo de ser infectado por- un agente patógeno A/E; y para administrar al animal una cantidad efectiva de una composición que comprenda un polipéptido que incluya una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera o cualesquiera de las SEQ ID NOs : 22-43, 59 ó 73-8443; una secuencia nucleotídica que codifique para una secuencia polipeptídica sustancialmente idéntica a una secuencia seleccionada a partir de las SEQ ID NOs: 22-43, 59 ó 73-84; una molécula de ácido nucleico que incluya una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera o cualesquiera de las SEQ ID NOs : 1-21 ó 60-72; o un sobrenadante de cultivo celular que incluya tales polipéptidos, por ende produciendo una respuesta inmune, o reduciendo la colonización o la difusión del agente patógeno A/E en el animal . La invención también provee, en aspectos alternativos, un método para atenuar la virulencia de un agente patógeno A/E mediante la provisión de un agente patógeno A/E; y para mutar un gen tal como nleA, nleB, nleC, nleD, nleE, nleF, nleG o nleH, o un homólogo de los mismos en el agente patógeno A/E, o mutar una o más secuencias nucleotídicas en el genoma del agente patógeno A/E, donde la secuencia nucleotídica es seleccionada a partir de las SEQ ID NOs : 1-21 ó 60-72, de tal modo atenuando la virulencia. La invención también provee, en aspectos alternativos, un método de selección para un compuesto que atenúa la virulencia de un agente patógeno A/E mediante la provisión de un sistema (por ejemplo, una célula, tal como una célula de EHEC, EPEC o C. rodentiu , un modelo animal, o un sistema in vitro) que incluye: un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera o cualesquiera de las SEQ ID NOs: 22-43, 59 ó 73-84, o un fragmento o variante de las mismas; una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia polipeptídica sustancialmente idéntica a una secuencia seleccionada a partir de las SEQ ID NOs: 22-43, 59 ó 73-84, o un fragmento o variante de las mismas; o una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera o cualesquiera de las SEQ ID NOs: 1-21 ó 60-72, o un fragmento o variante de las mismas; la provisión de un compuesto de prueba; y la determinación de si el compuesto de prueba modula la expresión, secreción o actividad biológica del polipéptido o de la molécula de ácido nucleico, donde un cambio, por ejemplo, la disminución de la expresión, secreción o actividad biológica del polipéptido o la molécula de ácido nucleico, indica un compuesto que atenúa la virulencia de un agente patógeno A/E. La invención también provee, en aspectos alternativos, un método para la producción de un factor de virulencia de un agente patógeno A/E mediante la provisión de una célula recombinante que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 22-43, 59 ó 73-84, o un fragmento o variante de las mismas; una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia polipeptídica sustancialmente idéntica a una secuencia seleccionada a partir del grupo compuesto por las SEQ ID NOs: 22-43, 59 ó 73-84, o un fragmento o variante de las mismas; o una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs : 1- 21 ó 60-72, o un fragmento o variante de las mismas; cultivar la célula recombinante bajo condiciones que permitan la expresión y/o la secreción del polipéptido, y opcionalmente, aislar el polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido puede ser secretado a partir de la célula. La invención también provee, en aspectos alternativos, un método para tratar o prevenir la infección por un agente patógeno A/E mediante la identificación de un mamífero que tenga, oque esté en riesgo de tener, una infección por un agente patógeno A/E; y administrar al mamífero una cantidad efectiva de un compuesto que atenúe la virulencia de un agente patógeno A/E, donde el compuesto inhibe la expresión o secreción de un polipéptido que incluya una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 22-43, 59 ó 73-84, o un fragmento o variante de las mismas. En algunas modalidades, el compuesto puede ser una molécula de ácido nucleico antisentido que es complementaria de una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-21 ó 60-72, o un fragmento o variante de las mismas, o puede ser un ARNsi. La invención también proporciona, en aspectos alternativos, un polipéptido recombinante que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de las SEQ ID NOs: 22-43, 59 ó 73-84, o una molécula aislada de ácido nucleico que incluye una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a la secuencia de las SEQ ID NOs: 1-21 ó 60-72; y/o un vector que incluye tales secuencias nucleotídicas; y/o una célula hospedadora (por ejemplo, un agente patógeno A/E tal como la E. coli enterohemorrágica (EHEC) , la E. coli enteropatogénica (EPEC) o Citrobacter rodentium, incluidos tales vectores) . El vector puede ser capaz o incapaz de integrarse dentro del genoma de un agente patógeno A/E. En aspectos alternativos, la invención también provee usos de las composiciones, bacterias, polipéptidos o las moléculas de ácido nucleico de acuerdo a la invención, para la preparación de un medicamento para la producción de una respuesta inmune contra un agente patógeno A/E o componentes del mismo, o para la reducción de la propagación o colonización de un agente patógeno A/E en un animal. En aspectos alternativos, la invención también provee equipos que incluyen un reactivo para la detección de un agente patógeno en una muestra, y un prospecto con instrucciones para la detección del agente patógeno A/E en la muestra. El reactivo puede incluir una sonda o una sonda iniciadora o un cebador sustancialmente idéntico a: una secuencia nucleotídica seleccionada a partir del grupo que comprende una o más de las SEQ ID NOs: 1-21 ó 60-72, o un fragmento o variante de las mismas, o una secuencia nucleotídica codificadora de un polipéptido sustancialmente idéntico a una o más de las SEQ ID NOs: 22-43, 59, 73-84 ó un fragmento o variante de las mismas, o un anticuerpo que se une específicamente a una secuencia seleccionada a partir del grupo que comprende una o más de las SEQ ID NOs: 22-43, 59, 73-84, ó un fragmento o variante de las mismas. Un "agente patógeno A/E" es un agente patógeno, por ejemplo una bacteria patogénica E. coli , que puede adherirse a las superficies intestinales de un animal, por ejemplo un mamífero, por ejemplo, vacas, ovejas, cabras, cerdos, conejos, perros, gatos, etc., o una especie de ave, por ejemplo, pollos, patos, pavos, etc., y causar una lesión histológica característica llamada lesión de adherencia y destrucción (A/E) (8) . En general, una infección patogénica A/E puede dar como resultado diarrea, colitis entérica, una enfermedad renal (tal como el síndrome urémico hemolítico) . Sin embargo, una infección con un agente patógeno A/E no necesariamente se manifiesta como síntomas de enfermedad; un mamífero hospedador infectado con un agente patógeno A/E puede ser un portador del agente patógeno y permanecer sano y libre de enfermedad. De esta manera, los mamíferos infectados con -o en riesgo de infección por- un agente patógeno A/E incluyen animales, por ejemplo, animales de granja, tales como aves de corral, por ejemplo, pollos, pavos, patos, o rumiantes, por ejemplo, vacas, ovejas, cabras, etc., u otros animales de granja, por ejemplo, cerdos, que no manifiestan síntomas de enfermedad, y también incluyen humanos, que son susceptibles a enfermedades entéricas severas como resultado de una infección patogénica A/E. Agentes patógenos A/E que sirven de ejemplo incluyen, sin limitación, las E. coli enterohemorrágicas (EHEC) (también conocidas como E. coli productoras de toxina Shiga (STEC) o E. coli productoras de toxina Vero (VTEC) , por ejemplo los seroptipos EHEC 0157 (por ejemplo, EHEC 0157 :H7, cuya secuencia genómica se describe en los Accesos No. AE005594, AE005595, AP002566, AE 005174, NC_002695 ó NC_002655) , ó 0158, 05, 08, 018, 026, 045, 048, 052, 055, 075, 076, 078, 084, 91, 0103, 0104, 0111, 0113, 0114, 0116, 0118, 0119, 0121, 0125, 028, 0145, 0146, 0163, 0165; las E. coli enteropatogénicas (EPEC) ; y también a las E. coli patogénicas que infectan a ratones (por ejemplo, Citrobacter rodentium) ; conejos (por ejemplo, las cepas RDEC-1, tales como 015 :H-); cerdos; ovejas; perros; y otros mamíferos.

Muchas cepas de agentes patógenos A/E están disponibles comercialmente, por ejemplo, a través de la American Type Culture Collection (ATCC) , Manassus, VA, EU. Los agentes patógenos A/E también pueden ser aislados a partir de individuos infectados, por ejemplo, mediante cultivo directo en agar MacConkey de sorbitol suplementado con cefixima y telurito o mediante inoculación en el mismo medio luego de enriquecerlo inmunomagnéticamente (72, 107, 108). Una "proteína" , un "péptido" o un "polipéptido" es cualquier cadena de dos o más aminoácidos, comprendiendo aminoácidos o análogos de aminoácidos naturales o no naturales, sin tener en cuenta modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, glucosilación o fosforilación) . Una "secuencia de aminoácidos" , un "polipéptido" , un "péptido" o una "proteína" de la invención puede incluir péptidos o proteínas que tienen uniones anormales, enlaces cruzados y capuchones terminales, uniones no peptidílicas o grupos modificadores alternativos. Tales péptidos modificados también están dentro del alcance de la invención. El término "grupo modificador" pretende incluir a estructuras que están directamente acopladas a la estructura peptídica (por ejemplo, por acoplamiento covalente) y a aquéllas que están acopladas indirectamente a la estructura peptídica (por ejemplo, mediante una asociación no covalente estable o por acoplamiento covalente a residuos de aminoácidos adicionales, o a miméticos, análogos o derivados de los mismos, que puedan flanquear la estructura peptídica central) . Por ejemplo, el grupo modificador puede estar acoplado al extremo amino o al extremo carboxilo de una estructura peptídica, o a una región peptídica o péptido-mimética que se encuentre flanqueando el dominio central. Alternativamente, el grupo modificador puede estar acoplado a una cadena lateral de al menos un residuo de aminoácido de una estructura peptídica, o a una región peptídica o péptido-mimética que se encuentre flanqueando el dominio central (por ejemplo, a través del grupo epsilon amino de uno o más residuos lisilo, a través del grupo carboxilo de uno o más residuos de ácido aspártico o uno o más residuos de ácido glutámico, a través de un grupo hidroxi de uno o más residuos tirosilo, uno o más residuos de serina, o uno o más residuos de treonina, u otro grupo reactivo apropiado en una cadena lateral de aminoácido) . Los grupos modificadores que están acoplados en forma covalente a la estructura peptídica pueden ser enlazados mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica para ligar estructuras químicas, incluyendo por ejemplo los enlaces amida, alquilamino, carbamato o urea. Los términos "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" comprenden tanto al ARN (hebras positiva y negativa) como al ADN, incluidos el ADNc, el ADN genómico, y el ADN sintético (por ejemplo, sintetizado químicamente) . El ácido nucleico puede ser de hebra doble o hebra única. Si es de hebra única, el ácido nucleico puede ser la hebra con sentido o la hebra antisentido. Una molécula de ácido nucleico puede ser cualquier cadena de dos o más nucleótidos ligados en forma covalente, incluidos los nucleótidos naturales o no naturales, o análogos o derivados de nucleótidos . Por "ARN" se entiende una secuencia de dos o más ribonucleótidos naturales o modificados, ligados en forma covalente. Un ejemplo de ARN modificado incluido dentro de este término es el ARN fosforotioato. Por "ADN" se entiende una secuencia de dos o más desoxirribonucleótidos naturales o modificados, ligados en forma covalente. Por "ADNc" se entiende el ADN copia o complementario producido a partir de una plantilla de AR? por la acción de una ADN polimerasa ARN-dependiente (transcriptasa inversa) . De esta manera, un "clon de AD?c" significa una secuencia dúplex de AD? complementaria a una molécula de ARN de interés, portada en un vector de clonado. Por "complementaria" se entiende que dos ácidos nucleicos, por ejemplo, AD? o AR?, contienen un número suficiente de nucleótidos capaces de formar pares de bases atson-Crick para producir una región de hebra doble entre los dos ácidos nucleicos. De esta manera, la adenina en una de las hebras de AD? o ARN se aparea con timina en una hebra complementaria y opuesta de AD?, o con uracilo en una hebra complementaria y opuesta de AR?. Se comprenderá que cada nucleótido en una molécula de ácido nucleico no necesita formar un par correspondiente de bases Watson-Crick con un nucleótido en una hebra complementaria y opuesta para formar un dúplex. Una molécula de ácido nucleico es "complementaria" de otra molécula de ácido nucleico si se híbrida, en condiciones muy estrictas, con la segunda molécula de ácido nucleico. Un "sobrenadante de cultivo celular" , tal como se usa aquí, se refiere generalmente a un sobrenadante derivado del cultivo de una bacteria u otro organismo (por ejemplo, levadura) o célula (por ejemplo, célula de insecto) con la capacidad de secretar uno o más polipéptidos con una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs : 22-43, 59, 73-84, ó a un fragmento o variante de las mismas, o a una porción inmunogénica de las mismas, en el medio de cultivo celular. En algunas modalidades, el sobrenadante de cultivo celular es sustancialmente puro, por ejemplo, sustancialmente libre de células bacterianas o del lisato de tales células. En algunas modalidades, el sobrenadante de cultivo celular también puede contener uno o más de los polipéptidos EspA, EspB, EspD, Tir, intimina, toxina Shiga 1 ó 2, ó EspP, o fragmentos o agregados de los mismos. La bacteria puede ser un agente patógeno A/E, por ejemplo EHEC, EPEC o Ci trobacter rodentium que, en algunas modalidades, puede ser modificado o mutado para expresar o secretar preferentemente las proteínas descritas aquí, o puede ser alguna otra bacteria, por ejemplo una bacteria no patogénica, por ejemplo, una E. coli no patogénica tal como HB101, o un agente patógeno no-A/E, que ha sido modificada o mutada, por ejemplo, por técnica recombinante u otra, de manera tal que secrete una o más proteínas descritas aquí, por ejemplo un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 22-43, 59, 73-84, ó a un fragmento o variante de las mismas, o a una porción inmunogénica de las mismas, en el medio de cultivo celular. En algunas modalidades, la bacteria no es EHEC o EPEC. En algunas modalidades, donde la bacteria es un agente patógeno A/E, ésta también puede portar una modificación adicional que perjudica su capacidad de expresar o secretar un polipéptido (por ejemplo, EspA, EspB, EspD, Tir, intimina, toxina Shiga 1 ó 2, ó EspP) que normalmente secretaría en ausencia de tal modificación. En algunas modalidades, el otro organismo (por ejemplo, levadura) o célula (por ejemplo, célula de insecto) ha sido modificado o mutado, por ejemplo por técnica recombinante u otra, de manera tal que secreta una o más de las proteínas aquí descritas, por ejemplo un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 22 a 43, o a una porción inmunogénica de las mismas, en el medio de cultivo celular. Un compuesto es "sustancialmente puro" o "aislado" cuando éste es separado de los componentes que lo acompañan naturalmente. Típicamente, un compuesto es sustancialmente puro cuando es al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ó 60%, o más generalmente al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 99% en peso, del material total en una muestra. De esta manera, por ejemplo, un polipéptido que es sintetizado o producido químicamente mediante tecnología recombinante, generalmente estará sustancialmente libre de sus componentes asociados naturales. Un polipéptido también generalmente será sustancialmente puro si es separado de sus componentes asociados naturales mediante técnicas físicas, tales como centrifugación, precipitación, cromatografía en columna, electroforesis en gel, HPLC, etc. Una molécula de ácido nucleico generalmente será sustancialmente pura o "aislada" cuando no es inmediatamente contigua con (por ejemplo, ligada en forma covalente a) las secuencias codificadoras con las cuales es normalmente contigua en el genoma natural del organismo del cual fue derivado el ADN de la invención. Por lo tanto, un gen o molécula de ácido nucleico "aislado" pretende significar un gen o molécula de ácido nucleico que no está flanqueado por las moléculas de ácido nucleico que normalmente (en la naturaleza) flanquean al gen o a la molécula de ácido nucleico (tal como en secuencias genómicas) y/o ha sido completa o parcialmente purificado a partir de otras secuencias transcritas (como en una biblioteca de ADNc o ARN) . Por ejemplo, un ácido nucleico aislado de la invención puede ser sustancialmente aislado con respecto al complejo ambiente celular en el cual naturalmente se presenta. En algunas ocasiones, el material aislado formará parte de una composición (por ejemplo, un extracto crudo que contiene otras sustancias) , un sistema amortiguador u una mezcla de reactivos. En otras circunstancias, el material puede ser purificado hasta la homogeneidad esencial, por ejemplo como la determinada por PAGE o cromatografía en columna tal como HPLC. El término por lo tanto incluye, por ejemplo, un ácido nucleico recombinante incorporado en un vector, tal como un plásmido o virus replicante en forma autónoma; o en ADN genómico de un procariote o eucariote, o el cual existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o por tratamiento con endonucleasas de restricción) , independiente de otras secuencias . También incluye un ácido nucleico recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica para secuencias polipeptídicas adicionales. Preferentemente, un ácido nucleico aislado comprende al menos aproximadamente 50%, 80% ó 90% (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. De esta manera, un gen o molécula de ácido nucleico aislado puede incluir un gen o molécula de ácido nucleico que es sintetizado químicamente o por medios recombinantes . Los ADN recombinantes contenidos en un vector están incluidos en la definición de "aislados" tal como se la usa aquí . También, las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen moléculas recombinantes de ADN en células hospedadoras heterólogas, así como moléculas de ADN parcial o sustancialmente purificadas en solución. Las moléculas de ácido nucleico "aisladas" también comprenden a las transcritos de ARN in vivo e in vitro de las moléculas de ADN de la presente invención. Tales moléculas de ácido nucleico aisladas son útiles para la fabricación del polipéptido codificado, como sondas para aislar secuencias homologas (por ejemplo, a partir de otras especies de mamíferos) , para el mapeo de genes (por ejemplo, por hibridación in situ con cromosomas) , o para detectar la expresión del gen en tejidos (por ejemplo, tejido humano, tal como sangre periférica) , tal como mediante análisis de transferencia de Northern. Un compuesto sustancialmente puro puede obtenerse, por ejemplo, por extracción a partir de una fuente natural; por expresión de una molécula recombinante de ácido nucleico que codifique para un compuesto polipeptídico; o por síntesis química. La pureza puede medirse usando cualquier método apropiado, tal como cromatografía en columna, electroforesis en gel, HPLC, etc. Una preparación sustancialmente pura de una célula, por ejemplo una célula bacteriana, es una preparación de células en la cual las células contaminantes que no tienen el genotipo mutante deseado o que no expresan o secretan el polipéptido deseado en cantidades suficientes, constituye menos del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ó 90% del número total de células en la preparación. Varios genes y secuencias de ácido nucleico de la invención pueden ser secuencias recombinantes . El término "recombinante" significa que algo ha sido recombinado, de manera que cuando se lo aplica en referencia a una construcción de ácido nucleico, el término se refiere a una molécula que está compuesta por secuencias de ácido nucleico las cuales son unidas o producidas mediante técnicas de biología molecular. El término "recombinante" , cuando es aplicado en referencia a una proteína o un polipéptido, se refiere a una proteína o molécula polipeptídica que se expresa usando una construcción de ácido nucleico recombinante, creada mediante técnicas de biología molecular. El término "recombinante" , cuando es aplicado en referencia a la composición genética, se refiere a un gameto o progenie con nuevas combinaciones de alelos que no estaban presentes en los genomas paternos . Las construcciones recombinantes de ácido nucleico pueden incluir una secuencia nucleotídica ligada a -o manipulada para ser ligada a- una secuencia de ácido nucleico a la cual no se encuentra ligada en la naturaleza, o a la cual está ligada en un sitio diferente en la naturaleza. Referirse a una construcción de ácido nucleico como "recombinante" indica por lo tanto que la molécula de ácido nucleico ha sido manipulada por medio de ingeniería genética, por ejemplo, con intervención humana. Las construcciones recombinantes de ácido nucleico pueden por ejemplo ser introducidas en una célula hospedadora mediante transformación. Tales construcciones recombinantes de ácido nucleico pueden incluir secuencias derivadas a partir de la misma especie de célula hospedadora o a partir de diferentes especies de célula hospedadora, las cuales han sido aisladas y reintroducidas en células de la especie hospedadora. Las secuencias de las construcciones recombinantes de ácido nucleico pueden ser integradas al genoma de la célula hospedadora, ya sea como resultado de la transformación original de la célula hospedadora, o como el resultado de la subsiguiente recombinación y/o eventos de reparación. Tal como se emplea aquí, "heterólogo" en referencia a un ácido nucleico o proteína es una molécula que ha sido manipulada con intervención humana, de manera que está localizada en un lugar distinto del lugar en el cual se encuentra naturalmente. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de una especie puede ser introducida en el genoma de otra especie, o una secuencia de ácido nucleico de un locus genómico puede ser desplazada a otro locus genómico o extracromosómico en la misma especie . Una proteína heteróloga incluye, por ejemplo, una proteína expresada a partir de una secuencia codificadora heteróloga, o una proteína expresada a partir de un gen recombinante en una célula que naturalmente no expresaría la proteína. Una secuencia "sustancialmente idéntica" es una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que difiere de una secuencia de referencia sólo por una o más sustituciones conservativas, tal como se discute aquí, o por una o más sustituciones, supresiones o inserciones no conservativas localizadas en posiciones de la secuencia que no destruyen la función biológica del aminoácido o de la molécula de ácido nucleico. Tal secuencia puede ser cualquier número entero entre 10% y 99%, o más generalmente al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50, 55% ó 60%, ó al menos 65%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95%, ó tanto como 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica, al nivel de aminoácidos o nucleótidos, a la secuencia usada para comparación, usando por ejemplo el programa Align (96) o FASTA. Para polipéptidos, la longitud de las secuencias de comparación puede ser al menos de 2, 5, 10 ó 15 aminoácidos, o al menos de 20, 25 ó 30 aminoácidos. En modalidades alternativas, la longitud de las secuencias de comparación puede ser al menos de 35, 40 ó 50 aminoácidos, o superior a 60, 80 ó 100 aminoácidos. Para moléculas de ácido nucleico, la longitud de las secuencias de comparación puede ser al menos de 5, 10, 15, 20 ó 25 nucleótidos, o al menos de 30, 40 ó 50 nucleótidos. En modalidades alternativas, la longitud de las secuencias de comparación puede ser al menos de 60, 70, 80 ó 90 nucleótidos, o superior a 100, 200 ó 500 nucleótidos . La identidad de la secuencia puede ser fácilmente medida usando software de análisis de secuencias disponible al público (por ejemplo, Sequence Analysis Software Package del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, o el software BLAST de la National Library of Medicine, o como se describe aquí) . Los ejemplos de software útiles incluyen los programas Pile-up y PrettyBox. Tal software establece correspondencias entre secuencias similares mediante la asignación de grados de homología a varias sustituciones, supresiones y otras modificaciones . Alternativamente, o adicionalmente, dos secuencias de ácido nucleico pueden ser "sustancialmente idénticas" si se hibridan en condiciones muy estrictas . En algunas modalidades, condiciones muy estrictas son, por ejemplo, condiciones que permiten una hibridación comparable con la hibridación que ocurre al usarse una sonda de ADN de al menos 500 nucleótidos de longitud, en un amortiguador que contiene NaHP04 0.5 M, pH 7.2; SDS al 7%, EDTA lmM y BSA al 1% (fracción V) a una temperatura de 65°C, o un amortiguador que contiene formamida al 48%, 4.8x SSC, Tris-Cl 0.2 M, pH 7.6; Ix solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y SDS al 0.1%, a una temperatura de 42 °C. (Estas son condiciones típicas para hibridaciones de Northern y Southern de elevada exigencia.) Las hibridaciones pueden llevarse a cabo durante un periodo de alrededor de 20 a 30 minutos, o alrededor de 2 a 6 horas, o alrededor de 10 a 15 horas, o superior a 24 horas o más . De la hibridación en elevada exigencia depende también el éxito de numerosas técnicas ejecutadas en forma rutinaria por biólogos moleculares, tales como PCR de alta exigencia, secuenciación de ADN, análisis conformacional de polimorfismo de hebra única, e hibridación in situ. Contrariamente a las hibridaciones Norhern y Southern estas técnicas usualmente se realizan con sondas relativamente cortas (por ejemplo, usualmente alrededor de 16 nucleótidos o más larga para PCR o secuenciación, y alrededor de 40 nucleótidos o más larga para hibridación in situ) . Las condiciones de alta exigencia usadas en estas técnicas son bien conocidas para aquéllos expertos en la técnica de la biología molecular (61) . Una secuencia sustancialmente idéntica puede ser por ejemplo una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 22-43, 59 ó 73-84, o un fragmento o variante de las mismas, o una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs : 1-21 ó 60-72, o un fragmento o variante de las mismas. En algunas modalidades, una secuencia sustancialmente idéntica puede ser por ejemplo una secuencia nucleotídica que es complementaria a -o se híbrida con- la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-21 ó 60-72, o un fragmento o variante de las mismas. En algunas modalidades, una secuencia sustancialmente idéntica puede ser derivada de un agente patógeno A/E. Una "sonda" o "cebador" es una molécula de ADN o ARN de secuencia definida y con una sola hebra, que puede aparearse por sus bases a una segunda molécula de AD? o AR? que contiene una secuencia complementaria (el blanco u objetivo) . La estabilidad de la molécula híbrida resultante depende del grado de apareamiento de bases que tiene lugar, y es afectada por parámetros tales como el grado de complementariedad entre la sonda y la molécula objetivo, y el grado de exactitud de las condiciones de hibridación. El grado de exactitud de hibridación es afectado por parámetros tales como la temperatura, la concentración de sales, y la concentración de moléculas orgánicas tales como formamida, y se determina por métodos que son conocidos a aquéllos expertos en la técnica. Las sondas o cebadores específicos para las secuencias de ácido nucleico descritas aquí, o porciones de las mismas, pueden variar en longitud por cualquier número entero desde al menos 8 nucleótidos hasta más de 500 nucleótidos, incluyendo cualquier valor entre éstos, dependiendo del propósito para el cual -y las condiciones en las cuales- la sonda o cebador es usado. Por ejemplo, una sonda o cebador puede tener al menos 8, 10, 15, 20 ó 25 nucleótidos de longitud, o puede tener al menos 30, 40, 50 ó 60 nucleótidos de longitud, o puede tener más de 100, 200, 500 ó 1000 nucleótidos de longitud. Las sondas o cebadores específicos para las moléculas de ácido nucleico descritas aquí pueden ser cualquier número entero desde 10% hasta 99% , o más generalmente al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55% ó 60%, o al menos 65%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95%, o tanto como 96%, 97%, 98% ó 99% idénticas a las secuencias de ácido nucleico descritas aquí usando por ejemplo el programa Align (96) . Las sondas o los cebadores pueden marcarse detectablemente, ya sea radiactivamente o no radiactivamente, mediante métodos que son conocidos para aquéllos expertos en la técnica. Las sondas o cebadores pueden usarse para métodos que implican la hibridación de ácido nucleico, tales como la secuenciación de ácido nucleico, amplificación de ácido nucleico por reacción en cadena de polimerasa, análisis de polimorfismo conformacional de hebra única (SSCP) , análisis de polimorfismo de fragmentos de restricción (RFLP) , hibridación de Southern, hibridación de Northern, hibridación in situ, ensayo de desplazamiento por movilidad electroforética (EMSA) , y otros métodos que son conocidos para aquéllos expertos en la técnica. Las sondas o cebadores pueden ser derivadas de ADNc o ADN genómico, por ejemplo por amplificación, o de segmentos de ADN clonados, o pueden ser sintetizados químicamente. Una "mutación" incluye cualquier alteración en la secuencia de ADN, por ejemplo, genoma, de un organismo cuando se lo compara con la cepa progenitora. Las alteraciones pueden surgir espontáneamente o por exposición del organismo a un estímulo mutagénico tal como un compuesto químico mutagénico, energía, radiación, técnicas recombinantes, apareamiento o cualquier otra técnica empleada para alterar ADN. Una mutación puede incluir una alteración en cualquiera de las secuencias nucleotídicas aquí descritas, o puede incluir una alteración en una secuencia nucleotídica que codifique para cualquiera de los polipéptidos descritos aquí. Una mutación puede "atenuar la virulencia" si, como resultado de la mutación, el nivel de virulencia de la célula mutante disminuye al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 100% respecto de la cepa progenitora. La disminución de la virulencia también puede medirse por una disminución de al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 100% en la expresión de un polipéptido, por ejemplo un polipéptido que incluya una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 22-43, 59 ó 73-84, o un fragmento o variante de las mismas, en la cepa mutante cuando se la compara con la cepa progenitora. La virulencia de un agente patógeno A/E puede medirse según se describe aquí o tal como es conocido en la técnica. Una disminución de la virulencia también puede medirse por un cambio de al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 100% en la actividad biológica de un polipéptido, por ejemplo un polipéptido que incluya una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 22-43, 59 ó 73-84, o un fragmento o variante de las mismas. "Modular" o "modula" significa cambiar, ya sea por aumento o disminución. El aumento o la disminución puede ser un cambio de cualquier valor entero entre 10% y 90%, o de cualquier valor entero entre 30% y 60%, o puede ser superior a 100%, cuando se la compara con un control o una muestra o compuesto de referencia. Un "compuesto de prueba" es cualquier compuesto químico natural o derivado artificialmente. Los compuestos de prueba pueden incluir, sin limitación, péptidos, polipéptidos, moléculas orgánicas sintetizadas, moléculas orgánicas naturales, moléculas de ácido nucleico. Un compuesto de prueba puede "competir" con un compuesto conocido tal como cualquiera de los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico descritos aquí, por ejemplo, interfiriendo con la virulencia o interfiriendo con cualquier respuesta biológica inducida por el compuesto conocido. Generalmente, un compuesto de prueba puede exhibir cualquier valor entre 10% y 200%, o superior a 500% de modulación cuando se lo compara con un compuesto de referencia. Por ejemplo, un compuesto de prueba puede exhibir al menos cualquier valor entero positivo o negativo entre 10% y 200% de modulación, o al menos cualquier valor entero positivo o negativo entre 30% y 150% de modulación, o al menos cualquier valor entero positivo o negativo entre 60% y 100% de modulación, o cualquier valor entero positivo o negativo superior a 100% de modulación. Un compuesto que es un modulador negativo en general disminuirá la modulación relativa a un compuesto conocido, mientras que un compuesto que es un modulador positivo en general aumentará la modulación relativa a un compuesto conocido. Un "vector" es una molécula de ADN derivada, por ejemplo, de un plásmido, bacteriófago, virus de mamífero o de insecto, o cromosoma artificial, en la cual puede insertarse una molécula de ácido nucleico, por ejemplo una secuencia nucleotídica substancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs; 1-21 ó 60-72 ó un fragmento o variante de las mismas. Un vector puede contener uno o más sitios únicos de restricción y puede ser capaz de replicación autónoma en un definido organismo hospedador o vehículo, de manera tal que la secuencia clonada sea reproducible. Un vector puede ser un vector de expresión de ADN, por ejemplo, cualquier elemento autónomo capaz de dirigir la síntesis de un polipéptido recombinante, y puede por lo tanto ser usado para expresar un polipéptido, por ejemplo un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 22-43, 59 ó 73-84, o un fragmento o variante de las mismas, en una célula hospedadora. Los vectores de expresión de ADN incluyen plásmidos y fagos bacterianos, y plásmidos y virus de mamíferos e insectos. Un vector puede ser capaz de integrarse al genoma de la célula hospedadora, de manera tal que cualquier modificación introducida en el genoma de la célula hospedadora por el vector se vuelve parte del genoma de la célula hospedadora. Un vector puede ser incapaz de integrarse al genoma de la célula hospedadora, y por lo tanto permanecerá como una unidad autónomamente replicante, tal como un plásmido. Un anticuerpo se "une específicamente" a un antígeno cuando lo reconoce y se une al antígeno, por ejemplo, un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 22-43, 59 ó 73-84, o un fragmento o variante de las mismas, pero sustancialmente no reconoce y no se une a moléculas en una muestra. Tal anticuerpo tiene, por ejemplo, una afinidad por el antígeno que es al menos 10, 100, 1000 ó 10000 veces mayor que la afinidad del anticuerpo por otra molécula de referencia en una muestra . Una "muestra" puede ser cualquier órgano, tejido, célula o extracto de células aislado de un sujeto, tal como una muestra aislada de un animal infectado con un agente patógeno A/E, o un animal al cual se le ha administrado uno o más de los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico de la invención, o fragmentos inmunogénicos de las mismas. Por ejemplo, una muestra puede incluir, sin limitación, tejido (por ejemplo, de una biopsia o autopsia) , células, sangre, suero, leche, orina, deposiciones, saliva, heces, huevos, cultivo de células de mamífero o medio de cultivo, o cualquier otro espécimen, o cualquier extracto de los mismos, obtenido de un paciente (humano o animal) , sujeto de prueba o animal experimental. Una muestra también puede incluir, sin limitación, productos producidos en un cultivo celular por células normales o transformadas (por ejemplo, mediante ADN recombinante o tecnología de anticuerpos monoclonales) . Una "muestra" también puede ser una célula o línea celular creada en condiciones experimentales, que no son aisladas directamente de un sujeto. Una muestra también puede ser libre de células, derivada artificialmente o sintetizada. La muestra puede ser analizada para detector la presencia de un gen, genoma, polipéptido, o molécula de ácido nucleico derivada de un agente patógeno A/E, o para detectar una mutación en un gen derivado de un agente patógeno A/E, para detectar niveles de expresión de un gen o polipéptido derivado de un agente patógeno A/E, o para determinar la función biológica de un gen o polipéptido derivado de un agente patógeno A/E, usando métodos que son conocidos en la técnica y/o descritos aquí. Por ejemplo, métodos tales como secuenciación, análisis de polimorfismo conformacional de hebra única (SSCP) , o análisis de restricción del polimorfismo de la longitud de fragmentos (RFLP) de los productos de PCR derivados de una muestra pueden usarse para detectar una mutación en un gen; para medir los niveles de afinidad de los polipéptidos o anticuerpos puede usarse ELISA o transferencia de Western; para medir los niveles de ARNm puede usarse transferencia de Northern, o puede usarse PCR para medir el nivel de una molécula de ácido nucleico. Una "respuesta inmune" incluye, pero no está limitada, a una o más de las siguientes respuestas en un mamífero: inducción de anticuerpos, células B, células T (incluidas células T cooperadoras, células T supresoras, células T citotóxicas, células T ?d) dirigidos específicamente a el/los antígeno/s en una composición o vacuna, seguido de la administración de la composición o vacuna. Una respuesta inmune a una composición o vacuna, por lo tanto, generalmente implica el desarrollo, en el mamífero hospedador, de una respuesta celular y/o mediada por anticuerpos hacia la composición o vacuna de interés . En general, la respuesta inmune dará como resultado la prevención o la reducción de la infección por un agente patógeno A/E; la resistencia del intestino a la colonización por un agente patógeno A/E; o la reducción de la difusión del agente patógeno A/E . Un "fragmento inmunogénico" de un polipéptido o de una molécula de ácido nucleico se refiere a una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que produce una respuesta inmune. Por lo tanto, un fragmento inmunogénico puede incluir, sin limitación, cualquier porción de cualquiera de las secuencias descritas aquí, o una secuencia sustancialmente idéntica a las mismas, que incluyan uno o más epitopos (el sitio reconocido por una célula específica del sistema inmunitario, tal como una célula T o una célula B) . Por ejemplo, un fragmento inmunogénico puede incluir, sin limitación, péptidos con un número cualquiera entre 6 y 60, o superior a 60, de aminoácidos de longitud, por ejemplo, péptidos con un número cualquiera entre 10 y 20 aminoácidos de longitud, o entre 20 y 40 aminoácidos de longitud, derivados de cualquiera o cualesquiera de las secuencias descritas aquí . Tales fragmentos pueden identificarse usando métodos estándares conocidos para aquéllos expertos en la técnica, tales como técnicas de mapeo de epitopos o antigenicidad o diagramas de hidropatía usando, por ejemplo, la versión 1.0 del programa Omiga del Oxford Molecular Group (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,708,871) (76, 77, 81, 92, 73). BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A-1F muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del NleA de C. rodentium, EPEC, y EHEC (SEQ ID ?Os : 1-3 y 22-24) . Las Figuras 2A-2J muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del ?leB y ?leB2 de C. rodentíum, EPEC, y EHEC (SEQ ID ?Os : 4-7 & 25-29 y 60) . Las Figuras 3A-3F muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del ?leC de C. rodentium, EPEC, y EHEC (SEQ ID ?Os : 8-10 y 30-32) . Las Figuras 4A-4F muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del ?leD de C. rodentium, EPEC, y EHEC (SEQ ID ?Os : 11-13 y 33-35) . Las Figuras 5A-5H muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del ?leE de C. rodentium, EPEC, y EHEC (SEQ ID ?Os: 14-17 y 36-39) .

Las Figuras 6A-6H muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del NleF de C. rodentium, EPEC, y EHEC (SEQ ID NOS : 18-21 y 40-43) . La Figura 7 muestra un alineamiento secuencial de aminoácidos de C. rodentium Orfll/GrlA (SEQ ID NO: 56) con un regulador transcripcional positivo, CaiF (SEQ ID NO: 57) , y con la secuencia de aminoácidos deducida de una proteína no caracterizada de Salmonella (SEQ ID NO: 58) . La estructura de hélice-giro-hélice esperada, característica de las proteínas de unión del ADN, está subrayada. Los residuos de aminoácidos idénticos están señalados con *, mientras que los cambios conservados está marcados con + . La Figura 8 muestra la complementación del ?orfll de C. rodentium por el orf11 de C. rodentium (pCRorf11) , EHEC (pEHorf11) , o EPEC (pEPorfll) , y la complementación del mutante doble ?ler -?orfll de C. rodentium por el 1er o el orfll de C. rodentium. La Figura 9 es un diagrama esquemático que muestra las localizaciones relativas de las islas con los 6 genes efectores recientemente identificados en el genoma EHEC 0157 :H7. También se muestran las localizaciones de los genes de la toxina Shiga (stx) , el LEE, y el TTSS inv-spa.

Adviértase la asociación de muchos de estos genes con profagos (CP-933 y PB-933) . Las Figuras 10A-10B muestran el análisis proteómico de las proteínas EHEC secretadas. A. Gel SDS-PAGE unidimensional de proteínas secretadas totales de EHEC de tipo silvestre (wt) y del mutante de secreción del tipo III (EscN-) . La migración de los marcadores de peso molecular (en kDa) está indicada a la izquierda del gel. B. Gel bidimensional de proteínas secretadas totales de EHEC de tipo silvestre. La migración de los marcadores de peso molecular (en kDa) está indicada a la izquierda, y los valores aproximados de pl se muestran arriba del gel . Las manchas de proteína analizadas por espectroscopia de masa (ver Tabla I) están encerradas en círculos y numeradas . Las Figuras 11A-11C muestran la organización genómica, distribución y conservación del NleA. A. Representación gráfica de la región alrededor de nleA en el genoma EHEC. La dirección transcripcional de cada ORF está indicada con una flecha. La anotación de los ORF está modificada de (3). El NleA está destacado en negritas. B. Análisis por transferencia de Southern del ADN genómico de EPEC, EHEC, REPEC, Ci trobacter rodentium (Citro.), y la cepa no patogénica HB101 de E. coli. Cada una de las muestras de ADN genómico fue digerida con BamHI (líneas 1, 4, 7, 10, 13) , EcoRI (líneas 2, 5, 8, 11, 14), y PstI (líneas 3, 6, 9, 12, 15) . C. Alineamiento de secuencias de proteínas múltiples de ?leA de EHEC, el profago de una cepa EHEC intimina-positiva y no-0157 (084 :H4), EPEC y Citrobacter rodentium.

Los residuos idénticos están representados por un punto ( . ) , los aminoácidos ausentes en una secuencia en particular están representados con un guión (-) . Dos tramos hidrofóbicos que podrían ser dominios putativos transmembranals están destacados en negritas en la secuencia de EHEC. Las Figuras 12A-12C muestran un análisis de transferencia de Western de proteínas secretadas (líneas a la izquierda) y pellas bacterianas (líneas a la derecha) de EHEC de tipo silvestre (wt) y el mutante de secreción de tipo III (escN-) que expresa pNleA-HA y los controles no transformados. Las manchas de transferencia fueron sondeadas con anti-HA (A.), anti-DnaK (B . ) , anti-Tir (C). Las Figuras 13A-13B muestran secreción de tipo III y translocación en la EHEC ?nleA. A. Gel de SDS-PAGE de las proteínas secretadas totales de la EHEC silvestre (wt) y el mutante ?nleA. La migración de marcadores de peso molecular (en kDa) está indicada a la izquierda del gel. B. El análisis de transferencia de Western de proteínas secretadas de la EHEC de tipo silvestre (wt) y el mutante ?nleA con antisuero anti-NieA. La migración de los marcadores de peso molecular (en kDa) está indicada a la izquierda del gel. Las Figuras 14A-14B muestran en análisis de transferencia de Western de fracciones de células hospedadoras infectadas. A. Las células HeLa fueron infectadas con EHEC de tipo silvestre (wt) o escN- que expresan NleA marcado con HA y sometido a fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial . Las fracciones analizadas fueron: bacterias, células y citoesqueletos sanos (pella de baja velocidad) , citosol de la células hospedadora (citosol hospedador) , y membranas de células hospedadoras (membrana hospedadora) . Las fracciones fueron analizadas por transferencia de Western usando anticuerpos anti-HA, anti-DnaK, anti-Calnexina, y antitubulina. B. Se aislaron fracciones de membrana de células infectadas con EHEC de tipo silvestre que expresanm NleA marcado con HA. Las fracciones de membrana luego fueron extraídas sobre hielo en condiciones de alto nivel de sal (NaCl 1M) , alto pH (pH 11.4), pH neutro y sal isotónica (control) , o pH neutro y sal isotónica conteniendo 1% de tritón xlOO (Tritón XlOO) , y centrifugadas para obtener fracciones de membrana solubles (S) e insolubles (P) . Estas fracciones fueron sometidas a análisis de transferencia de Western con anticuerpos anti-HA (panel superior) , anticalnexina (panel medio) y anti-calreticulina (panel inferior) . Las Figuras 15A-15D muestran estudios de virulencia de Ci trobacter rodentium en ratones. A. Análisis de transferencia de Western de extractos bacterianos totales de C. rodentium de tipo silvestre (wt) y el mutante ?nleA, sondeados con antisuero anti-NieA. La migración de los marcadores de peso molecular (en kDa) está indicada a la izquierda del gel. B. gráficos de supervivencia para ratones C3H/HeJ infectados con C. rodentium de tipo silvestre (cuadrados negros), C. rodentium ?nleA (circuios blancos), y ratones previamente infectados con el mutante ?nleA y subsiguientemente expuestos a C. rodentium de tipo silvestre (barras verticales) . Los ratones fueron monitoreados diariamente durante el curso de la infección y cuando se tornaban moribundos eran sacrificados inmediatamente. Se indica el porcentaje del número inicial de ratones en cada grupo que eran viables cada día. C. Títulos de C. rodentium del colon de ratones suizos NIH infectados. Los ratones fueron infectados con C. rodentium de tipo silvestre (círculos negros) o la cepa ?nleA (círculos blancos) y sacrificados al día 10 post-infección. El tejido del colon y las pellas fecales fueron homogeneizadas y cultivadas en agar MacConkey para determinar la carga total de C. rodentium en el colon del ratón al momento del sacrificio. Cada ratón en el experimento está representado por un único punto. La media de cada grupo está indicada en el gráfico mediante barras horizontales. D. Pesos del colon y el bazo de los ratones suizos NIH infectados. Los ratones fueron infectados con C. rodentium de tipo silvestre (cuadrados y triángulos negros) o la cepa ?nleA (cuadrados y triángulos blancos), y sacrificados al día 10 post-infección. Los cólones (cuadrados) y bazos (triángulos) fueron disectados y pesados.

Cada ratón en el experimento está representado por un único punto . La media de cada grupo está indicada en el gráfico mediante barras horizontales. Las Figuras 16A-16B muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del homólogo de NleG de EHEC (SEQ ID NOs: 61 y 73) . Las Figuras 17A-17B muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del homólogo de NleHl de EHEC (SEQ ID NOs: 62 y 74) . Las Figuras 18A-18B muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del homólogo de NleH2 de EHEC (SEQ ID NOs: 63 y 75) . Las Figuras 19A-19B muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del Z2076 de EHEC (SEQ ID NOs: 64 y 76) . Las Figuras 20A-20B muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del Z2149 de EHEC (SEQ ID NOs: 65 y 77) . Las Figuras 21A-21B muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del Z2150 de EHEC (SEQ ID NOs: 66 y 78) . Las Figuras 22A-22B muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del Z2151 de EHEC (SEQ ID NOs: 67 y 79) . Las Figuras 23A-23B muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del Z2337 de EHEC (SEQ ID NOs: 68 y 80) . Las Figuras 24A-24B muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del Z2338 de EHEC (SEQ ID NOs : 69 y 81) . Las Figuras 25A-25B muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del Z2339 de EHEC (SEQ ID NOs : 70 y 82) . Las Figuras 26A-26B muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del Z2560 de EHEC (SEQ ID ?Os : 71 y 83) . Las Figuras 27A-27B muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del Z2976 de EHEC (SEQ ID ?Os : 72 y 84) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Hemos identificado varias proteínas de secreción nuevas y comunes para agentes patógenos A/E (Tabla 2) , usando un regulador LEE positivo (Regulador Global del Activador LEE, o GrlA) las cuales pueden usarse para aumentar significativamente la secreción, y nos ha permitido seleccionar funcionalmente las proteínas secretadas vía el TTSS codificado por LEE mediante un procedimiento basado en proteómicos. Estas nuevas proteínas, llamadas Nle (efector no codificado por LEE) desde A hasta H, están presentes en agentes patógenos que contienen LEE, y están ausentes en cepas no patogénicas de E. coli y en agentes patógenos que no son LEE; sonán codificadas fuera del LEE por 3 PAIs presentes en los agentes patógenos A/E y han coevolucionado con el LEE (3, 8). La identificación de estas proteínas ha permitido, en algunos casos, la asignación de funciones a los ORFs con funciones previamente desconocidas . Una proteína que sirve de ejemplo, NleA (p54) , es un efector del tipo III en agentes patógenos A/E, incluso en C. rodentium, EPEC y EHEC, y juega un papel crítico en la virulencia. La ?leA es codificada en una isla de patogenicidad asociada a un fago, dentro del genoma de EHEC, separado del LEE. El TTSS codificado por LEE dirige la translocación de la ?leA hacia dentro de la célula hospedadora, donde se localiza al aparato de Golgi. La ?leA está presente en agentes patógenos con LEE, y está ausente en cepas no patogénicas de E. coli y en agentes patógenos no LEE. En algunas modalidades de la invención, estos polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico que codifican para estos polipéptidos, o porciones de las mismas, pueden ser útiles como vacunas, terapéuticas, diagnósticos, o herramientas para la selección de fármacos para infecciones por agentes patógenos A/E, o como reactivos. Polipéptidos y compuestos de prueba Los compuestos de acuerdo a la invención incluyen, sin limitación, a los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico descritas en, por ejemplo, las SEQ ID NOs: 1-56, 59- 84, y a los fragmentos, análogos y variantes de las mismas. Los compuestos de acuerdo a la invención también incluyen a los productos de los genes orfll/grlA, nleA, nleB, nleB2, nleC, nleD, nleE, nleF, nleG, nleH (nle Hl y/o nle H2) , o los homólogos de los mismos. Los compuestos de acuerdo a la invención también incluyen a los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico descritas en, por ejemplo, la secuencia genómica de EHEC (por ejemplo, AE005174) como los números Z0985 (NleB2), Z0986 (NleC), Z0990 (NleD) , Z6020 (NleF) , Z6024 (NleA) , Z4328 (NleB) , Z4329 (NleE) , Z6025 (NleG homólogo), Z6021 (NleHl) , Z0989 (NleH2) , Z2076, Z2149, Z2150, Z2151, Z2337, Z2338, Z2339, Z2560, Z2976, ó L0043 (Orfll/GrlA) (Acceso No. AF071034) , y a los fragmentos, análogos y variantes de las mismas . Los compuestos pueden prepararse, por ejemplo, remplazando, eliminando o insertando un residuo de aminoácido en cualquier posición de un polipéptido aquí descrito, con otros residuos de aminoácidos conservativos, por ejemplo, residuos con similares propiedades físicas, biológicas o químicas, y seleccionando, por ejemplo, por la capacidad del compuesto para atenuar la virulencia. En algunas modalidades de la invención, los compuestos de la invención incluyen anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos aquí descritos, por ejemplo, las SEQ ID NOs: 22-43, 59 ó 73-84.

Es bien conocido en la técnica el hecho de que algunas modificaciones y cambios pueden hacerse en la estructura de un polipéptido sin alterar sustancialmente la función biológica de ese péptido, para obtener un polipéptido biológicamente equivalente. En un aspecto de la invención, los polipéptidos de la presente invención se extienden también a péptidos o "variantes" biológicamente equivalentes que difieren de una porción de la secuencia de los polipéptidos de la presente invención por sustituciones conservativas de aminoácidos, o difieren por sustituciones no conservativas que no afectan la función biológica, por ejemplo, la virulencia. Tal como se lo emplea aquí, el término "sustituciones conservadoras de aminoácidos" se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro en una posición dada del péptido, donde la sustitución puede hacerse sin pérdida sustancial de la función relevante . En la realización de tales cambios, las sustituciones de residuos de aminoácidos parecidos puede hacerse sobra la base de la similitud relativa de los sustituyentes en la cadena lateral, por ejemplo, su tamaño, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y similares, y tales sustituciones pueden ser sometidas a ensayos respecto de su efecto sobre la función del péptido mediante pruebas de rutina. Tal como se lo emplea aquí, el término "aminoácidos" se refiere a aquellos L-aminoácidos comúnmente hallados en proteínas presentes en la naturaleza, D-aminoácidos y tales aminoácidos cuando han sido modificados. De acuerdo a esto, los aminoácidos de la invención pueden incluir, por ejemplo: Acido 2-Aminoadípico; Acido 3-Aminoadípico; beta-Alanina; Acido beta-Aminopropiónico; Acido 2-Aminobutírico; Acido 4-Aminobutírico; Acido piperidínico; Acido 6-Aminocaproico; Acido 2-Aminoheptanoico; Acido 2-Aminoisobutírico; Acido 3-Aminoisobutírico; Acido 2 -Aminopimélico; Acido 2,4 Diaminobutírico; Desmosina; Acido 2 , 2 ' -Diaminopimélico; Acido 2 , 3-Diaminopropiónico; N-Etilglicina; N-Etilasparagina; Hidroxilisina; alo-Hidroxilisina; 3-Hidroxiprolina; 4-Hidroxiprolina; Isodesmosina; alo-Isoleucina; N-Metilglicina; sarcosina; N-Metilisoleucina; 6-N-metil-lisina; N-Metilvalina; Norvalina; Norleucina; y Ornitina. En algunas modalidades, las sustituciones conservadas de aminoácidos pueden hacerse donde un residuo de aminoácido es sustituido por otro con un similar valor de hidrofilicidad (por ejemplo, dentro de un valor de más o menos 2,0; o más o menos 1,5; o más o menos 1,0; o más o menos 0,5), donde los siguientes, que pueden ser un aminoácido con un índice hidropático de aproximadamente -1.6 tal como Tyr (-1.3) o Pro (-1.6), son asignados a residuos de aminoácidos (tal como se detalla en la patente de los Estados Unidos No. 4.554.101, incorporada aquí como referencia) : Arg (+3.0); Lys (+3.0); Asp (+3.0); Glu (+3.0); Ser (+0.3); Asn (+0.2); Gln (+0.2); Gly (0); Pro (-0.5); Thr (-0.4); Ala (-0.5); His (-0.5); Cys (-1.0); Met (-1.3); Val (-1.5); Leu (-1.8); He (-1.8); Tyr (-2.3); Phe (-2.5); y Trp (-3.4). En modalidades alternativas, las sustituciones conservativas de aminoácidos pueden ser hechas donde un residuo de aminoácido es sustituido por otro con un similar índice hidropático (por ejemplo, dentro de un valor de más o menos 2.0; o más o menos 1.5; o más o menos 1.0; o más o menos 0.5) . En tales modalidades, a cada residuo de aminoácido se le puede asignar un índice hidropático con base en su hidrofobicidad y carga características, tal como sigue He (+4.5); Val (+4.2); Leu (+3.8); Phe (+2.8); Cys (+2.5) Met (+1.9); Ala (+1.8); Gly (-0.4); Thr (-0.7); Ser (-0.8) Trp (-0.9); Tyr (-1.3); Pro (-1.6); His (-3.2); Glu (-3.5) Gln (-3.5); Asp (-3.5); Asn (-3.5); Lys (-3.9); y Arg (-4.5). En modalidades alternativas, las sustituciones conservativas de aminoácidos pueden ser hechas usando familias de matrices de similitud, disponibles al público (60, 70, 102, 103, 94, 104, 86) . La matriz PAM está basada sobre recuentos derivados de un modelo evolutivo, mientras que la matriz Blosum emplea recuentos derivados de bloques altamente conservados dentro de un alineamiento. Un valor de similitud superior a cero tanto en la matriz PAM como en la matriz Blosum puede usarse para realizar sustituciones conservativas de aminoácidos .

En modalidades alternativas, las sustituciones conservativas de aminoácidos pueden ser realizadas donde un residuo de aminoácido es sustituido por otro de la misma clase, donde los aminoácidos están divididos en no polares, ácidos, básicos y neutros, de la siguiente manera: no polares: Ala, Val, Leu, He, Phe, Trp, Pro, Met; ácidos: Asp, Glu; básicos: Lys, Arg, His; neutros: Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr. Los cambios conservativos de aminoácidos pueden incluir la sustitución de un L-aminoácido por el correspondiente D-aminoácido, por un D-aminoácido conservativo, o por una forma natural de aminoácido codificada no genéticamente, así como una sustitución conservativa de un L-aminoácido. Los aminoácidos naturales no genéticamente codificados incluyen: beta-alanina, ácido 3-amino-propiónico, ácido 2, 3-diaminopropiónico, ácido alfa-aminoisobutírico, ácido 4-amino-butírico, N-metilglicina (sarcosina) , hidroxiprolina, ornitina, citrulina, t-butilalanina, t-butilglicina, N-metilisoleucina, fenilglicina, ciclohexilalanina, norleucina, norvalina, 2-naftilalanina, piridilalanine, 3-benzotienil alanine, 4-clorofenilalanina, 2-fluorofenilalanina, 3-fluorofenilalanina, 4-fluorofenilalanine, penicilamina, ácido 1,2,3 , 4-tetrahidro-isoquinolin-3-carboxílico, beta-2-tienilalanina, sulfóxido de metionina, homoarginina, N-acetil lisina, ácido 2-amino butírico, ácido 2-aminobutírico, ácido 2,4, -diaminobutírico, p-aminofenilalanina, N-metilvalina, homocisteína, homoserina, ácido cisteico, ácido epsilon-aminohexanoico, ácido delta-aminovalérico, o ácido 2,3-diaminobutírico. En modalidades alternativas, los cambios conservativos de aminoácidos incluyen cambios basados en consideraciones de hidrofilicidad o hidrofobicidad, tamaño o volumen, o carga. Los aminoácidos pueden caracterizarse generalmente como hidrofóbicos o hidrofílicos, dependiendo primariamente de las propiedades de la cadena lateral del aminoácido. Un aminoácido hidrofóbico muestra una hidrofobicidad superior a cero, y un aminoácido hidrofílico exhibe una hidrofilicidad inferior a cero, basado en la escala de hidrofobicidad de consenso normalizada de Eisenberg et al. (71). Los aminoácidos hidrofóbicos genéticamente codificados incluyen: Gly, Ala, Phe, Val, Leu, He, Pro, Met y Trp, y los aminoácidos hidrofílicos genéticamente codificados incluyen: Thr, His, Glu, Gln, Asp, Arg, Ser y Lys. Los aminoácidos hidrofóbicos no genéticamente codificados incluyen a la t-butilalanina, mientras que los aminoácidos hidrofílicos no genéticamente codificados incluyen a la citrulina y la homocisteína. Los aminoácidos hidrofóbicos o hidrofílicos pueden además subdividirse según las características de sus cadenas laterales. Por ejemplo, un aminoácido aromático es un aminoácido hidrofóbico con una cadena lateral que contiene al menos un anillo aromático o heteroaromático, el cual puede contener uno o más sustituyentes tales como -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -N02, -NO, -NH2, -NHR, -NRR, -C(0)R, -C(0)OH, -C(0)OR, -C(0)NH2, -C(0)NHR, -C(0)NRR, etc., donde R es independientemente alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, alquinilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquinilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, arilo de 5 a 20 átomos de carbono, arilo sustituido de 5 a 20 átomos de carbono, alcarilo de 6 a 26 átomos de carbono , alcarilo sustituido de 6 a 26 átomos de carbono, heteroarilo de 5 a 20 miembros, heteroarilo sustituido de 5 a 20 miembros, alc-heteroarilo de 6 a 26 miembros o alc-heteroarilo sustituido de 6 a 26 miembros. Los aminoácidos aromáticos genéticamente codificados incluyen: Phe, Tyr y Trp, mientras que los aminoácidos aromáticos no genéticamente codificados incluyen: fenilglicina, 2-naftilalanina, beta-2 -tienilalanina, ácido 1,2,3, 4-tetrahidro-isoquinolina-3-carboxílico, 4-clorofenilalanina, 2-fluorofenilalanina, 3-fluorofenilalanina, y 4-fluorofenilalanina. Un aminoácido apolar es un aminoácido hidrofóbico con una cadena lateral que está libre de carga a pH fisiológico, y la cual tiene uniones en las cuales un par de electrones compartidos en común por dos átomos es mantenido igualmente por cada uno de los átomos (por ejemplo, la cadena lateral no es polar) . Los aminoácidos apolares codificados genéticamente incluyen Gly, Leu, Val, He, Ala y Met, mientras que los aminoácidos apolares no genéticamente codificados incluyen a la ciclohexilalanina. Los aminoácidos apolares pueden además ser subdivididos para incluir aminoácidos alifáticos, los cuales son aminoácidos hidrofóbicos con una cadena lateral de hidratos de carbono alifáticos. Los aminoácidos alifáticos genéticamente codificados incluyen Ala, Leu, Val e He, mientras que los aminoácidos alifáticos no genéticamente codificados incluyen a la norleucina. Un aminoácido polar es un aminoácido hidrofílico con una cadena lateral que está libre de carga a pH fisiológico, pero que tiene una unión en la cual el par de electrones compartidos en común por dos átomos está sostenido más próximamente por uno de los átomos . Los aminoácidos polares codificados genéticamente incluyen Ser, Thr, Asn y Gln, mientras que los aminoácidos polares no genéticamente codificados incluyen citrulina, N-acetil lisina y sulfóxido de metionina. Un aminoácido ácido es un aminoácido hidrofílico con una cadena lateral con un valor de pKa inferior a 7. Los aminoácidos ácidos típicamente tienen cadenas laterales cargadas negativamente a pH fisiológico a causa de la pérdida de un ion hidrógeno. Los aminoácidos ácidos codificados genéticamente incluyen Asp y Glu. Un aminoácido básico es un aminoácido hidrofílico con una cadena lateral con un valor de pKa superior a 7. Los aminoácidos básicos típicamente tienen cadenas laterales cargadas positivamente a pH fisiológico debido a la asociación con un ion hidronio. Los aminoácidos básicos codificados genéticamente incluyen Arg, Lys y His, mientras que los aminoácidos básicos no genéticamente codificados incluyen los aminoácidos no cíclicos ornitina, ácido 2, 3-diaminopropiónico, ácido 2, 4-diaminobutírico, y homoarginina . Quien sea experto en la técnica apreciará que las clasificaciones anteriores no son absolutas y que un aminoácido puede ser clasificado en más de una categoría. Además, los aminoácidos pueden ser clasificados con base en su comportamiento conocido y/o sus propiedades químicas, físicas o biológicas características, basadas en ensayos específicos o en comparación con aminoácidos previamente identificados. Los aminoácidos también pueden incluir porciones bifuncionales con cadenas laterales similares a aminoácidos . Los cambios conservadores también pueden incluir la sustitución de una porción químicamente derivatizada por un residuo no derivatizado, por ejemplo, por reacción de un grupo lateral funcional de un aminoácido. De esta manera, estas sustituciones pueden incluir compuestos cuyos grupos amino libres han sido derivatizados a aminoclorhidratos, grupos p-toluensulfonilo, grupos carbobenzoxi , grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. En forma similar, los grupos carboxilo libres pueden ser derivatizados para formar sales, esteres metílicos y etílicos u otros tipos de esteres o hidrazidas, y las cadenas laterales pueden ser derivatizadas para formar derivados O-acilo u O-alquilo para grupos hidroxilo libres o N-im-bencilhistidina para el nitrógeno del imidazol de la histidina. Los análogos de péptidos también incluyen aminoácidos que han sido químicamente alterados, por ejemplo, por metilación, por amidación del aminoácido C-terminal por una alquilamina tal como la etilamina, etanolamina o etilendiamina, o por acilación o metilación de una cadena lateral del aminoácido (tal como acilación del grupo epsilon-amino de la lisina) . Los análogos de péptidos también pueden incluir el reemplazo del enlace amida del péptido por una mida sustituida (por ejemplo, grupos de la fórmula -C (O) -NR, donde R es de alquilo 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo de 1 a 6 átomos de carbono, de alquinilo 1 a 6 átomos de carbono, alquilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo sustitiuido de 1 a 6 átomos de carbono, o alquinilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono) o un isostero de un enlace amida (por ejemplo, -CH2NH-, -CH2S, -CH2CH2-, -CH=CH- (cis y trans), -C(0)CH2, -CH(OH)CH2- ó -CH2SO-) . El compuesto puede estar ligado covalentemente, por ejemplo, por polimerización o conjugación, para formar homopolímeros o heteropolímeros. Pueden emplearse espaciadores y enlazadores, típicamente compuestos por pequeñas moléculas neutras tales como aminoácidos que están libres de carga en condiciones fisiológicas. Los enlaces pueden lograrse de varias maneras. Por ejemplo, los residuos de cisteína pueden agregarse a los extremos del péptido, y varios péptidos pueden ligarse covalentemente por oxidación controlada. Alternativamente, pueden usarse agentes heterobifuncionales tales como los agentes formadores de disulfuro/amida o los agentes formadores de tioéter/amida. El compuesto también puede ligarse a otro compuesto que puede, por ejemplo, modular una respuesta inmunogénica. El compuesto también puede ser restringido, por ejemplo, por tener porciones cíclicas. Los péptidos o análogos de péptidos pueden sintetizarse por técnicas químicas regulares, por ejemplo, por síntesis automática mediante la metodología de síntesis en soluciones o en fase sólida. Los sintetizadores automáticos de péptidos pueden adquirirse comercialmente y emplean técnicas bien conocidas en la materia. Los péptidos y análogos de péptidos también pueden prepararse mediante tecnología de ADN recombinante usando métodos regulares tales como los descritos en, por ejemplo, Sambrook et al. (110) o Ausubel et al. (111). En general, los compuestos candidatos son identificados a partir de extensas bibliotecas de productos naturales como de extractos sintéticos (o semisintéticos) o bibliotecas químicas según métodos conocidos en la técnica. Aquéllos expertos en el campo del descubrimiento y desarrollo de fármacos comprenderán que la fuente precisa de extractos o compuestos de prueba no es crítica para el/los método/s de la invención. Por lo tanto, puede examinarse virtualmente cualquier número de extractos o compuestos químicos mediante los métodos ejemplificados y descritos aquí. Los ejemplos de tales extractos o compuestos incluyen -pero no se limitan- a extractos basados en plantas, hongos, procariotes o animales, caldos de fermentación, y compuestos sintéticos, así como modificaciones de compuestos existentes. También existen numerosos métodos para generar síntesis aleatoria o dirigida (por ejemplo, semi-síntesis o síntesis total) de cualquier número de compuestos químicos, incluyendo -pero no limitado- a compuestos basados en sacáridos, lípidos, péptidos y ácidos nucleicos. Se encuentran comercialmente disponibles bibliotecas de compuestos sintéticos. Alternativamente, se encuentran comercialmente disponibles bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales, a partir de varias fuentes, incluyendo Biotics (Sussex, Reino Unido) , Xenova (Slough, Reino Unido) , Harbor Branco Oceanographic Institute (Ft. Pierce, FL, EEUU) y PharmaMar, MA, EEUU. Además pueden generarse, si se desea, bibliotecas de polipéptidos de agentes patógenos A/E producidos sintéticamente según métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por métodos regulares de extracción y fraccionamiento. Más aún, si se desea, cualquier biblioteca o compuesto puede modificarse fácilmente mediante métodos químicos, físicos o biológicos regulares. Cuando se verifica que un extracto crudo modula la virulencia, se requiere el fraccionamiento adicional del extracto principal positivo para aislar los constituyentes químicos responsables del efecto observado. Por lo tanto, el objetivo del proceso de extracción, fraccionamiento y purificación es la cuidadosa caracterización e identificación de una entidad química dentro del extracto crudo, con propiedades moduladoras de la virulencia. Los mismos ensayos descritos aquí para la detección de actividades en mezclas de compuestos pueden emplearse para purificar el componente activo y para someter a prueba sus derivados . Los métodos de fraccionamiento y purificación de tales extractos heterogéneos son conocidos en la técnica. Si se desea, los compuestos verificados como agentes útiles para el tratamiento se modifican químicamente de acuerdo a métodos conocidos en la técnica. Los compuestos identificados como terapéuticos, profilácticos, diagnósticos, o con otro valor, pueden ser subsecuentemente analizados mediante un modelo de Citrobacter o bovino para infecciones patogénicas A/E, o cualquier otro modelo animal para infecciones patogénicas A/E. Vacunas Una vacuna es una composición que incluye materiales que producen una respuesta inmune deseada. Una vacuna puede seleccionar, activar o expandir células B y T de memoria del sistema inmune para, por ejemplo, permitir la eliminación de agentes infecciosos tales como patógenos A/E o componentes de los mismos. En algunas modalidades, una vacuna incluye un portador adecuado, tal como un adyuvante, que es un agente que actúa de una manera no específica para aumentar la respuesta inmune a un antígeno específico o a un grupo de antígenos, permitiendo la reducción de la cantidad de antígeno en cualquier dosis dada de vacuna, o la reducción de la frecuencia de la dosificación requerida para generar la respuesta inmune deseada. Una respuesta inmune deseada puede incluir la protección total o parcial contra la propagación (presencia en las heces de un animal infectado, por ejemplo, un mamífero) o la colonización (presencia en el intestino de un animal infectado, por ejemplo, un mamífero) por un agente patógeno A/E. Por ejemplo, una respuesta inmune deseada puede incluir cualquier valor desde 10% a 100%, por ejemplo, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% de protección contra la propagación o colonización por un agente patógeno A/E en un animal vacunado, en comparación a un animal no vacunado . Las vacunas de acuerdo a la invención pueden incluir a los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico aquí descritas, o a fragmentos inmunogénicos de las mismas, y pueden ser administradas mediante cualquier forma de administración conocida en la técnica o descrita aquí. En algunas modalidades de la invención, la vacuna puede incluir un agente patógeno A/E vivo, un agente patógeno A/E muerto, o componentes de los mismos. Los agentes patógenos vivos, que pueden ser administrados en la forma de una vacuna oral, pueden contener alteraciones genéticas no reversibles que afectan la virulencia del agente patógeno A/E, pero no su inducción de una respuesta inmune. Una vacuna viva puede ser capaz de colonizar el intestino de un animal inoculado, por ejemplo, un mamífero. En algunas modalidades, los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico aquí descritas, o fragmentos inmunogénicos de los mismos, o las bacterias mutadas (por ejemplo, bacterias atenuadas) descritas aquí, pueden ser administradas a aves de corral, por ejemplo, pollos, patos, pavos, etc., de forma tal que produzcan una respuesta inmune, por ejemplo, aumento de anticuerpos, en las aves de corral. Los huevos, o productos de los mismos, obtenidos de tales aves de corral , que exhiban una respuesta inmune contra los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico descritas aquí, o contra fragmentos inmunogénicos de las mismas, pueden ser administrados a un animal, por ejemplo, humanos, vacas, cabras, ovejas, etc., para producir una respuesta inmune a los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico descritas aquí, o a fragmentos inmunogénicos de las mismas, en el animal. Métodos para cultivar anticuerpos en aves de corral, y para administrar tales anticuerpos, se describen en, por ejemplo: Patente de los Estados Unidos 5,750,113 expedida a Cook el 12 de mayo de 1998; Patente de los Estados Unidos 6,730,822 expedida a Ivarie et al. el 4 de mayo de 2004; y las publicaciones 113-117 citadas aquí. Las vacunas de acuerdo a la invención pueden ser suplementadas adicionalmente mediante la adición de antígenos recombinantes o purificados tales como EspA, EspB, EspD, EspP, Tir, toxina Shiga 1 ó 2, y/o intimina, usando técnicas regulares conocidas en la materia. Por ejemplo, se ha descrito la producción de recombinantes y el uso de las proteínas de la EHEC 0157 :H7 tales como EspA, Tir, EspB e intimina (Publicación PCT No. WO 97/40063; Publicación PCT No. WO 99/24576; 51) .

Cultivo celular Los agentes patógenos A/E pueden ser cultivados según cualesquiera de los métodos conocidos en la técnica o descritos aquí. Por ejemplo, los agentes patógenos A/E pueden ser cultivados primero en medio Luria-Bertani (LB) por un periodo de aproximadamente 8 a 48 horas, o aproximadamente 12 a 24 horas, y luego diluidos aproximadamente entre 1:5 y 1:100, por ejemplo, 1:67, o aproximadamente entre 1:5 y 1:25, o aproximadamente 1:10, en medio mínimo M-9 suplementado con NaHCC ó NaHCOs 20-100 mM, o aproximadamente 30-50 mM, o NaHC02 ó NaHCC^ aproximadamente 44 mM; MgS044-20 trM, o aproximadamente 5-10 mM; o ¡yfcjS0 aproximadamente 0.8 mM a 8 mM, glucosa al 0.1 a 1.5%, o aproximadamente 0.2 a 1%, o glucosa aproximadamente al 0.4%, casaminoácidos aproximadamente entre 0.05 y 0.5%, o aproximadamente entre 0.07 y 0.2%; o casaminoácidos aproximadamente al 0.1%. Los cultivos generalmente se mantienen aproximadamente a 37 grados C, opcionalmente en 2-10% de C02, u opcionalmente en alrededor de 5% de C02, y cultivados hasta una densidad óptica de aproximadamente 600 nm de 0.7 a 0.8. Luego se sacan las células enteras mediante cualquier medio apropiado, por ejemplo, microfiltración o centrifugación, y el sobranadante puede concentrase, por ejemplo, 10-1000 veces o más, por ejemplo 100 veces, usando diálisis, ultrafiltración y métodos similares. La proteína total puede determinarse fácilmente mediante métodos bien conocidos en la técnica.

Los sobrenadantes de los cultivos celulares pueden ser producidos con cultivos de cualquier agente patógeno A/E, por ejemplo, EHEC, como se describe aquí o como es conocido para aquéllos expertos en la técnica, incluso agentes patógenos A/E de tipo silvestre o mutantes. Generalmente, el agente patógeno A/E se cultiva en un medio apropiado, en condiciones que favorecen la secreción del antígeno de tipo III (Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,136,554 y 6,165,743) (51, 74) . Aislamiento e identificación de genes adicionales Con base en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos descritas aquí, por ejemplo, en SEQ ID NOs.-l- 56 ó 59-84, es posible el aislamiento y la identificación de genes adicionales usando técnicas regulares. Cualquier agente patógeno A/E puede servir como fuente de tales genes . En algunas modalidades, las secuencias de ácido nucleico aquí descritas pueden usarse para diseñar sondas o cebadores, incluso sondas o cebadores de oligonucleótidos degenerados, con base en la secuencia de cualquiera de las hebras de ADN. Las sondas o cebadores pueden luego usarse para examinar bibliotecas genómicas o de ADNc en busca de genes de otros agentes patógenos A/E, usando técnicas regulares de amplificación o hibridación. En algunas modalidades, las secuencias de aminoácidos descritas aquí pueden usarse para generar anticuerpos u otros reactivos que pueden usarse para seleccionar polipéptidos de agentes patógenos A/E que se unan a estos anticuerpos. En algunas modalidades, pueden identificarse socios de enlace mediante la marcación de los polipéptidos de la invención (por ejemplo, aquéllos sustancialmente idénticos a las SEQ ID NOs; 22-43, 59 ó 73-84) con una secuencia epitopo (por ejemplo, FLAG ó 2HA) , y la introducción en células hospedadoras por transfección con un vector apropiado que contiene una secuencia de ácido nucleico codificadora de un polipéptido de la invención, o bien por emisión bacteriana endógena de tipo III, seguida de inmunoprecipitación e identificación del socio de enlace. Las células HeLa pueden infectarse con cepas que expresan las fusiones FLAG o 2HA, seguido por lisis e inmunoprecipitación con anticuerpos anti-FLAG y anti-2HA. Los socios de enlace pueden identificarse por espectroscopia de masa. Si el polipéptido de la invención no es producido en cantidades suficientes, tal método puede no emitir suficiente proteína marcada como para identificar a su socio. Como parte de un procedimiento complementario, cada polipéptido de la invención puede ser clonado en un vector de transfección de mamíferos fusionado a, por ejemplo, 2HA, GFP y/o FLAG. Luego de la transfección, las células HeLa pueden ser lisadas y el polipéptido marcado puede ser inmunoprecipitado. El socio de enlace puede identificarse por SDS PAGE seguido de espectroscopia de masa. En algunas modalidades, los polipéptidos de la invención pueden marcarse, sobreproducirse, y usarse en columnas de afinidad y en inmunoprecipitaciones para identificar compuestos objetivo y/o confirmar aquéllos identificados. Pueden usarse proteínas marcadas con FLAG, HA y/o His para que tales columnas de afinidad extraigan los factores de las células hospedadoras a partir de los extractos celulares, y cualesquiera de los aciertos pueden ser validados por ensayos regulares de enlace, curvas de saturación, y otros métodos como los que se describen aquí o son conocidos para aquéllos expertos en la técnica. En algunas modalidades, puede usarse un sistema bacteriano de dos híbridos para estudiar las interacciones proteína-proteína. Las secuencias de ácido nucleico aquí descritas, o las secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, pueden clonarse en el plásmido cebo pBT del sistema de dos híbridos, y puede usarse una biblioteca de bazo de múrido, con 5 x 106 clones independientes y disponible comercialmente, como biblioteca objetivo para los cebos. Los aciertos potenciales pueden caracterizarse adicionalmente recuperando los plásmidos y retransformándolos para reducir los falsos positivos que resultan de las variantes del cebo clonal y clones objetivo de la biblioteca que activan a los genes reportadores independientes del cebo clonado. Los aciertos reproducibles pueden estudiarse más en profundidad como se describe aquí . En algunas modalidades, una cepa patógena A/E que expresa GrlA, por ejemplo una cepa EHEC 0157 que expresa un GrlA clonado, puede usarse para el análisis proteómico de los proteomas A/E de tipo III secretados, mediante, por ejemplo, el análisis en gel 2D de los sobrenadantes. Además, se pueden usar agentes patógenos A/E completos (por ejemplo, arreglos de EHEC) para definir cuáles genes son regulados por GrlA. La virulencia puede ser comprobada según lo descrito aquí o según la forma conocida por aquéllos expertos en la técnica. Una vez que las secuencias codificadoras han sido identificadas, éstas pueden aislarse mediante técnicas regulares de clonación, e insertarse en cualquier vector o replicón apropiado para, por ejemplo, la producción de polipéptidos. Tales vectores y replicones incluyen, sin limitación: bacteriófago X (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bacterias gram-negativas), pGVl 106 (bacterias gram-negativas) , pLAFRl (bacterias gram-negativas) , pME290 (bacterias gram-negativas no-E. coli) , pHV14 (E. coli y Bacillus subtilis) , pBD9 (Bacillus) , pIJ61 (Streptomyces) , pUC6 (Streptomyces) , YIp5 (Saccharomyces) , YCpl9 (Saccharomyces) o virus del papiloma bovino (células de mamífero) .

En general, los polipéptidos de la invención pueden producirse en cualquier célula hospedadora transformada o transfectada con un vector apropiado (69) . El método de transformación o transfección y la elección del vehículo de expresión dependerá del sistema hospedador seleccionado. Puede usarse una gran variedad de sistemas de expresión, y la célula hospedadora exacta a ser usada no es crítica para la invención. Por ejemplo, un polipéptido de acuerdo a la invención puede producirse en un hospedador procariótico (por ejemplo, E. coli) o en un hospedador eucariótico (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, células de insecto, por ejemplo, células Sf21, o células de mamífero, por ejemplo, células NIH 3T3, HeLa o COS) . Tales células pueden conseguirse de una amplia variedad de orígenes (por ejemplo, la American Type Culture Collection, Manassus, VA.). Los sistemas bacterianos de expresión para la producción de polipéptidos incluyen al sistema de expresión pET de E. coli (Novagen, Inc. , Madison, Wis.) y al sistema de expresión pGEX (Pharmacia) . Ensayos Los compuestos candidatos, incluyendo polipéptidos, moléculas de ácido nucleico y pequeñas moléculas, pueden ser seleccionados y sometidos a prueba mediante una variedad de técnicas descritas aquí o conocidas para aquéllos expertos en la técnica. Un compuesto que reduce el nivel de expresión de cualquiera de los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico de la invención puede ser útil, por ejemplo, como un terapéutico contra una infección patogénica A/E. Los ensayos de selección pueden realizarse, por ejemplo, midiendo la expresión génica por análisis de transferencia de Western, usando cualquier fragmento apropiado de ácido nucleico de acuerdo a la invención como una sonda de hibridación, donde el nivel de expresión génica en presencia del compuesto candidato es comparado con el nivel de expresión génica en ausencia del compuesto candidato. Alternativamente, o adicionalmente, el efecto de un compuesto candidato puede determinarse por el nivel de expresión o secreción del polipéptido, usando por ejemplo inmunoprecipitación o transferencia de Western. Otros ensayos pueden ser realizados de la siguiente manera: Confirmación de Secreción de Tipo III y Translocación hacia Células Hospedadoras Para determinar cuáles de los compuestos candidatos requieren el TTSS para secreción, cada gen o porción de los mismos puede fusionarse a una FLAG por su extremo C, y los sobrenadantes pueden colectarse a partir de los WT y de los mutantes TTSS, por ejemplo la EHEC WT y el mutante isogénico EscN tipo III, tal como se describe aquí o como es conocido en la técnica. Métodos alternativos para determinar la secreción incluyen el examen de sobrenadantes por pérdida de producto secretado en la cepa mutante, o el desarrollo de anticuerpos para la proteína y el uso de análisis Western para los sobrenadantes de WT y de tipo III. Para confirmar que ninguna de las proteínas de interés es un componente TTSS, los sobrenadantes de cada uno de los compuestos candidatos, cultivados en condiciones de inducción de tipo III, pueden ser examinados en busca de secreción de tipo III. El TTSS LEE secreta dos clases de proteínas : el translocón (EspA, B y D) , el cual está montado sobre la superficie de la célula bacteriana, y los efectores, que son translocados directamente dentro de la célula hospedadora. Los compuestos candidatos pueden ser sometidos a prueba para determinar si son efectores o translocadores . Por ejemplo, los efectores putativos marcados con FLAG en EHEC o en otros patógenos A/E pueden usarse para infectar células epiteliales HeLa cultivadas, y examinarse por microscopía de inmunofluorescencia luego de colorear con anticuerpos anti-FLAG. Tal visualización usualmente demuestra la emisión bacteriana dentro de la célula hospedadora, y a menudo indica a cuál organelo está dirigido el efector (por ejemplo, Tir a membrana, NleA a Golgi) . Pueden usarse anticuerpos para varios compartimientos celulares para confirmar la localización. Para complementar la visualización, las células HeLa infectadas pueden fraccionarse en fracciones citosol, insoluble y membranal, usando métodos conocidos de fraccionamiento (30) , y análisis de Western realizado con anticuerpos anti-FLAG para definir a cuál de las fracciones celulares está dirigido el efector. Como control, las células pueden ser infectadas con el efector marcado expresado en una cepa TTSS defectuosa. Si está dirigido a la fracción de membrana, puede usarse un tratamiento con alto nivel de sales o pH alcalino para determinar si es una proteína integral de membrana. Si el compuesto candidato se expresa a un nivel bajo, y la detección de translocaciones por inmunofluorescencia es dificultosa, se pueden hacer fusiones genéticas a la adenilato ciclasa, una enzima que requiere un cofactor citoplasmático de mamífero (calmodulina) para su actividad (87) . Efectos sobre la formación del pedestal y la captación Dado que la condensación de actina y la formación del pedestal son sellos distintivos de los agentes patógenos A/E, los compuestos candidatos pueden ser examinados en cuanto a acumulación de actina y formación de pedestales en, por ejemplo, células epiteliales HeLa cultivadas. La invasión de EPEC y EHEC es otro fenotipo de cultivo celular que se mide fácilmente y brinda una indicación de interacciones con células epiteliales cultivadas y de la capacidad para alterar el citoesqueleto del hospedador (los mutantes del tipo III no invaden, como tampoco lo hacen las cepas sin Tir ni intimina) . Los niveles de invasión de varios compuestos candidatos pueden ser comparados en patógenos A/E wt y de tipo silvestre, por ejemplo, EHEC WT y mutantes TTSS en células HeLa, usando un ensayo de protección de gentamicina. Además, la capacidad de un compuesto candidato para bloquear la fagocitosis de macrófagos cultivados puede someterse a prueba, ya que EPEC y EHEC inhiben la fagocitosis en macrófagos cultivados por inhibición de la actividad de la Pl-3-kinasa en el hospedador de una manera tipo III-dependiente (Celli, J. , M. Olivier y B. B. Finlay, 2001, Enteropathogenic Escherichia coli mediates antiphagocytosis through the inhibition of Pl 3-kinase-dependent pathways . Embo. J. , 20: 1245-58). Si cualesquiera compuestos candidatos son incapaces de inhibir la fagocitosis, puede realizarse un Segundo ensayo de inhibición de la PI-3 kinasa. Efectos sobre monocapas epiteliales polarizadas La integridad de los empalmes entre células juega un papel preponderante en la diarrea. Además de la formación de pedestales, los agentes patógenos A/E causan otros efectos LEE de tipo III sobre células epiteliales polarizadas, incluyendo pérdida de microvellosidades (destrucción de microvellosidades) y pérdida de resistencia eléctrica transmonocapa, una medida de uniones firmes. Usando monocapas intestinales humanas polarizadas de células Caco-2, puede realizarse microscopía electrónica de barrido de alta resolución sobre monocapas infectadas con patógenos A/E WT (por ejemplo, EHEC WT) , mutantes TTSS de patógenos A/E, e.g, EHEC escN, y cada uno de los compuestos candidatos. Las monocapas pueden ser infectadas por diversos tiempos, lavadas y procesadas para SEM usando técnicas regulares (66) y examinadas en busca de pérdida de resistencia eléctrica luego de infectar células Caco-2 polarizadas. Efectos sobre la inmunidad innata y la inflamación Un tema que crece rápidamente con respecto a los agentes patógenos es la capacidad para inhibir la inmunidad innata y las respuestas inflamatorias . Tales efectos han sido reportados para patógenos A/E tales como EHEC y EPEC, y estos ensayos pueden usarse para examinar a los compuestos candidatos en cepas de patógenos A/E WT y mutantes TTSS . Por ejemplo, EHEC provoca la inhibición de NF-g?ß, dando como resultado la supresión de varias citocinas tales como 11-8, 11-6 e H-la en células HeLa (80) , y este proceso requiere del TTSS LEE . Los compuestos candidatos pueden ser sometidos a ensayos de la inhibición de estos factores seguidos de, por ejemplo, infección de células HeLa, usando métodos regulares tales como RT-PCR (PCR en tiempo real) , y ensayos de ELISA disponibles comercialmente. Estudios funcionales basados en información de localización Además de ensayos fenotípicos, los compuestos candidatos pueden ser sometidos a prueba según su localización en una célula hospedadora. Por ejemplo, si un compuesto candidato se localiza en el aparato de Golgi, éste puede ser envaluado para determinar si afecta la función del aparato de Golgi, incluyendo estudios bioquímicos para examinar la glucosilación, y ensayos funcionales del aparato de Golgi en levaduras que expresan al compuesto candidato. Si el compuesto candidato se localiza en mitocondrias, pueden utilizarse ensayos sobre apoptosis y otras funciones mitocondriales . Si el compuesto candidato tiene como objetivo al retículo endoplásmico, pueden diseñarse ensayos de síntesis y secreción de proteínas. Si el objetivo es el núcleo, pueden llevarse a cabo estudios transcripcionales. Papel en la virulencia Los índices competitivos (Cl) se han usado extensivamente para determinar el . papel de factores de virulencia menores, y si dos factores de virulencia pertenecen al mismo "curso" de virulencia (63) . En síntesis, dos cepas caracterizadas por diferentes resistencias a antibióticos, son coinfectadas en un animal y luego de un tiempo de incubación apropiado las bacterias son cosechadas y se determina la proporción entre las dos cepas . Un valor de 1 indica igual virulencia. Si los compuestos identificados tienen un efecto sobre la virulencia, pueden determinarse su Cl en comparación a WT. También pueden usarse el Cl para determinar a cuáles cursos de virulencia pertenece el compuesto candidato. Por ejemplo, los Cl pueden determinarse comparando cada uno contra WT. Cuando se comparan los mutantes simples y contra un mutante doble, una proporción Cl de 1 indica que éstos pertenecen al mismo curso general de virulencia, mientras que cualquier valor distinto de 1 indica que están en diferentes "cursos" de virulencia. Estudios de microscopía Para caracterizar enfermedades causadas por agentes patógenos A/E pueden usarse técnicas de microscopía, incluidas microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía electrónica de barrido (SEM) , para examinar folículos linfoides en placas de Peyer ileales distales de conejos infectados con REPEC para confirmar la formación de lesiones A/E (63) , microscopía confocal para mostrar la emisión hacia vellosidades murinas, y análisis histológico del proceso de la enfermedad en ratones infectados . Estas técnicas pueden emplearse para examinar compuestos candidatos en modelos animales apropiados, por ejemplo, ratones infectados con varias cepas de Citrobacter portadoras de mutaciones en las secuencias candidatas. Para cada compuesto candidato puede emprenderse un estudio detallado para seguir la progresión (o la falta de progresión) de la enfermedad en este sistema. Además, puede determinarse el nivel de colonización de estos mutantes en las superficies del intestino. Pueden usarse cepas marcadas con antibióticos para infectar animales, seguido de la cosecha del tejido intestinal. El tejido puede homogeneizarse y las bacterias cuantificadas por recuento en placas selectivas. Una de las principales características de la infección por agentes patógenos A/E, por ejemplo, infección por Citrobacter, es una extensa inflamación. Los eventos celulares de la inflamación pueden seguirse por microscopía confocal para varios mutantes en compuestos candidatos . Etiquetando tejidos con anticuerpos o lectinas, seguido por microscopía confocal, las células inflamatorias que reclutadas hacia el lugar de la infección por los mutantes pueden ser definidas en comparación con la cepa progenitora. Existen anticuerpos para varios factores innatos de respuesta que también pueden usarse para analizar los fenotipos mutantes durante la infección, examinando factores innatos de respuesta y células tales como macrófagos, neutrófilos, la producción de iNOS, células dendríticas, etc. Estudios histológicos Pueden realizarse estudios histológicos de tejido teñido. Por ejemplo, pueden estudiarse secciones ileales de conejo infectado con REPEC y teñidas con hematoxilina y eosina, y cepas con supresiones en compuestos candidatos para comparar la inflamación y el daño tisular, y caracterizar las infecciones por patógenos A/E (58) . Una tinción similar puede realizarse con cepas de Citrobacter carentes de compuestos candidatos en ratones. Existen varias otras coloraciones histológicas que pueden definir más ampliamente la inflamación asociada con Citrobacter y mutantes isogénicos, incluyendo Giemsa y Azul de Toluidina 0 (para morfología general) , Acido Schiff Periódico (colorea hidratos de carbono, permitiendo el examen de la capa de moco intestinal y células en copa) , tinción de Gram, cloracetato-sterasa (una tinción de células inflamatorias) , y un ensayo de caspasa (para apoptosis) . La inmunohistoquímica permite la utilización de anticuerpos dirigidos contra antígenos de células bacterianas y de mamíferos. Anticuerpos Los compuestos de la invención pueden usarse para preparar anticuerpos para los polipéptidos de la invención, mediante técnicas regulares de preparación (45) o conocidas para aquéllos expertos en la técnica. Por ejemplo, una secuencia codificadora de un polipéptido de la invención puede purificarse hasta el grado necesario para la inmunización de conejos. Para intentar minimizar los problemas potenciales de baja afinidad o especificidad de los antisueros, pueden generarse dos o tres construcciones de polipéptidos para cada proteína, y cada construcción se inyecta en por lo menos dos conejos. Los antisueros pueden cultivarse por inyecciones en serie, preferentemente incluyendo al menos tres inyecciones de refuerzo. Las inmunizaciones primarias pueden llevarse a cabo con el adyuvante completo de Freund, y las inmunizaciones subsiguientes con el adyuvante incompleto de Freund. Las titulaciones de anticuerpos pueden ser monitoreadas por análisis de transferencia de Western e inmunoprecipitación, usando la proteína purificada. Los sueros inmunes pueden purificarse por afinidad mediante la Proteína Acoplada a CNBr-Sefarosa. La especificidad del antisuero puede determinarse mediante un panel de proteínas no relacionadas. Alternativamente o adicionalmente, los péptidos correspondientes a regiones inmunogénicas relativamente únicas de un polipéptido de la invención pueden generarse y acoplarse a la hemocianina cerradura de lapa (KLH) a través de una lisina C-terminal introducida. El antisuero para cada uno de estos péptidos puede purificarse por afinidad sobre péptidos conjugados a BSA, y la especificidad puede ser examinada por ELISA y transferencia de Western usando conjugados de péptidos, y por transferencia de Western e inmunoprecipitación. Alternativamente, se preparan anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a cualquiera de los polipéptidos de la invención, de acuerdo a la tecnología regular de hibridomas (91, 90, 89, 78) . Una vez producidos, los anticuerpos monoclonales también pueden ser analizados en cuanto a su reconocimiento específico por transferencia de Western o inmunoprecipitación. Los anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido de la invención son considerados como útiles; tales anticuerpos pueden emplearse, por ejemplo, en un inmunoensayo. Alternativamente, los anticuerpos monoclonales pueden 4prepararse usando el polipéptido de la invención descrito anteriormente y una biblioteca de exposición de fagos (112) . En algunas modalidades, los anticuerpos pueden producirse usando fragmentos de polipéptidos que parecen ser inmunogénicos, por criterios tales como alta frecuencia de residuos cargados . Los anticuerpos pueden ser adaptados para minimizar una respuesta inmune adversa por parte del hospedador mediante, por ejemplo, el uso de anticuerpos quiméricos que contienen un dominio de unión al antígeno de una especie, y la porción Fc de otra especie, o mediante el uso de anticuerpos hechos a partir de hibridomas de la especie apropiada. En algunas modalidades, los anticuerpos contra cualquiera de los polipéptidos aquí descritos pueden emplearse para tratar o prevenir la infección por un agente patógeno A/E. Modelos Animales Los compuestos pueden ser fácilmente examinados en varios modelos animales de infección patógena A/E.

El modelo de infección murina por Citrobacter es un modelo de una enfermedad natural, y el modelo de propagación de EHEC en bovinos adultos es un modelo de transporte de una no-enfermedad natural (las vacas no están enfermas, sin embargo EHEC no es parte de la flora normal) . Para el modelo de Ci trobacter, los mutantes pueden ser examinados en cuanto a su virulencia en ratones, tal como se describe anteriormente . Pueden usarse ratones suprimidos en un gen (Knock out (KO) ) para estudiar el papel de las secuencias candidatas en la infección. Se han desarrollado varias líneas de ratones KO, incluso definiendo el papel de iNOS (20) , células T y C (106) , Tlr-4 y estableciendo un intervalo de variación de la susceptibilidad del hospedador (54) , tanto como Nck. Para el modelo bovino, los mutantes EHEC pueden investigarse en vacas erales (ver, por ejemplo, la publicación PCT No. WO 02/053181) . En breve, se administran 108 CFU de mutante o WT 0157 a las vacas vía intubación oral-gástrica. 14 días post-inoculación se monitorea la propagación fecal mediante el cultivo selectivo en placas, y las colonias se verifican por PCR múltiple, niveles de propagación y análisis histológico y microscópico de la región perianal donde se concentra EHEC (97) . Otro modelo es el modelo de bucle intestinal de bovino, en el cual los bucles intestinales son inyectados con EHEC y examinados histológicamente y microscópicamente en distintos momentos, y también se cuantifican las bacterias adherentes mediante cultivo en placas . Un modelo de infección natural en conejos con RDEC-1 puede realizarse de la siguiente manera: Se colectan por centrifugación los cultivos bacterianos desarrollados durante una noche, y se resuspenden en un ml de solución salina con amortiguador de fosfato. Se someten a ayuno conejos blancos de Nueva Zelanda (peso : 1.0 a 1.6 kg) y luego se les inoculan dentro del estómago, mediante tubos orogástricos, cinco ml de bicarbonato de sodio estéril al 2.5% y un ml de RDEC-1 ó cepas mutantes de secuencias candidatas (2: -5x1010). La misma dosificación de bacterias se inocula en cada conejo al día siguiente. Cada conejo es pesado diariamente y se colecta el contenido fecal de bacterias con hisopos rectales y a partir de pellas fecales. Los hisopos rectales se hacen rodar en mitad de la superficie de placas MacConkey con ácido nalidíxico. Cinco pellas fecales o la misma cantidad de deposiciones líquidas se re colectan de cada conejo y se resuspenden en tres ml de solución salina con amortiguador de fosfato y 0.1 ml de cada suspensión fecal se cultiva en placa MacConkey con ácido nalidíxico. El crecimiento de colonias nalidíxico-resistentes se clasifica de la siguiente manera: 0, sin crecimiento; 1, colonias ampliamente espaciadas; 2, colonias estrechamente espaciadas; 3, crecimiento confluente de colonias. Los tejidos se extirpan inmediatamente después del sacrificio por inyección intravenosa de cetamina y sobredosificando con fenobarbital de sodio. La proporción de la colonización bacteriana en tejidos intestinales se verifica de la siguiente manera: los segmentos intestinales (10 cm) , a excepción del ciego, son doblemente ligados en sus extremos proximal y distal, y disecados entre las partes doblemente ligadas, luego lavados con 10 ml de solución salina con amortiguador de fosfato helada. Se agrega un gramo del contenido viscoso del ciego a 9 ml de solución salina con amortiguador de fosfato. Las suspensiones de solución salina con amortiguador de fosfato resultantes se diluyen y se cultivan en placas MacConkey con ácido nalidíxico. Las muestras de tejido se extirpan con un sacabocados de 9 mm de diámetro, se lavan tres veces con solución salina con amortiguador de fosfato, se agregan a dos ml de solución salina con amortiguador de fosfato helada, y se homogeneizan con un homogeneizador, luego las muestras seriales diluidas se cultivan en placas MacConkey. El número de bacterias adheridas a cada tejido por centímetro cuadrado se calcula de la siguiente manera: CFU/cm2=el número de bacterias/placa x factor de dilución x 2 ml/-0,452. Terapéutica y Diagnóstico Los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico descritas aquí pueden usarse como agentes terapéuticos, por ejemplo, para la preparación de vacunas o composiciones terapéuticas, o la construcción de patógenos A/E que están atenuados en su virulencia. Tales patógenos A/E pueden construirse como se describe aquí, por ejemplo, designando cebadores basados en las secuencias de ácido nucleico aquí descritas, y usando una técnica de intercambio alélico basada en el gen sac-B (29) . Los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico pueden usarse solas o combinadas entre ellas o con otras moléculas apropiadas, tales como EspA, EspB, EspD, EspP, Tir, toxina Shiga 1, toxina Shiga 2, ó moléculas de intimina. En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico aquí descritas ' pueden usarse en técnicas antisentido. Por "antisentido", tal como se usa aquí en referencia a ácidos nucleicos, se quiere dar a entender una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a la hebra codificadora de una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un gen, tal como los genes nleA, nleB, nleC, nleD, nleE o nleF, o que es complementario a una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-21 ó 60-72 ó un fragmento o variante de las mismas. En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico antisentido es una con la capacidad de disminuir el nivel del polipéptido codificado por el gen complementario cuando ambos son expresados en una célula. En algunas modalidades, el nivel del polipéptido es disminuido en cualquier número desde al menos 10% a por lo menos 25%, o en cualquier número desde al menos 25% a por lo menos 50%, o en cualquier número desde al menos 50% a por lo menos 75%, o en cualquier número desde al menos 75% a 100%, cuando se lo compara al nivel del polipéptido en una célula que expresa sólo el gen, y no la molécula de ácido nucleico antisentido complementari . En algunas modalidades, la expresión de un gen o región codificadora o no codificadora de interés puede ser inhibida o anulada mediante tecnología basada en ARN de interferencia (ARNi) , un tipo de silenciamiento génico post-transcripcional . El ARNi puede usarse para crear un "knockout" funcional, por ejemplo, un sistema en el cual la expresión de un gen o región codificadora o no codificadora de interés está reducida, dando como resultado una reducción general del producto codificado. Como tal, el ARNi puede realizarse apuntando a un ácido nucleico de interés o fragmento o variante del mismo, para, a cambio, reducir su expresión y el nivel de actividad del producto que codifica. Tal sistema puede usarse para estudios funcionales del producto, tanto como para tratar infecciones por patógenos A/E. El AR?i es descrito, por ejemplo, en las solicitudes de patentes de los Estados Unidos publicadas ?o. 20020173478 (Gewirtz, publicada el 21 de noviembre de 2002) y ?o. 20020132788 (Lewis et al.; publicada el 7 de noviembre de 2002) (79, 67) . Los reactivos y los equipos para realizar ARNi pueden conseguirse comercialmente de, por ejemplo, Ambion Inc. (Austin, TX, EEUU) y New England Biolabs Inc. (Beverly, MA, EEUU) . El agente inicial para ARNi en algunos sistemas parece ser la molécula ARNds correspondiente a un ácido nucleico "objetivo". Se cree que el AR?ds es luego escindido en ARN de interferencia coirtos (AR?si) con una longitud de 21-23 nucleótidos (dúplex de 19-21pb, cada uno con dos proyecciones nucleotídicas 3Y. La enzima que parece afectar este primer paso de escición a sido llamada "Cortadora" y es categorizada como miembro de la familia AR?asa III de ribonucleasas AR?ds-específicas. Alternativamente, el ARNi puede ser elaborado mediante la introducción directa dentro de la célula -o la generación dentro de la célula mediante la introducción dentro de la célula- de un precursor apropiado (por ejemplo, un vector, etc.) de tal ARNsi o molécula similar a un AR?si . Un AR?si puede estar asociado con otros componentes intracelulares para formar un complejo silenciador inducido por ARN (RISC) . El RISC así formado puede subsecuentemente transformar en "objetivo" a una transcripción de interés a través de las interacciones de apareamiento de bases entre su componente AR?si y la transcripción "objetivo" por virtud de la homología, resultando en la escisión de la transcripción "objetivo" aproximadamente a los 12 nucleótidos a partir del extremo 3^ del ARNsi . Luego el AR?m "objetivo" es escindido y se reduce el nivel del producto proteico que éste codifica. El AR?i puede ser realizado mediante la introducción en las células de apropiados AR?si -o moléculas similares a ARNsi- sintetizados in vitro. El AR?i puede ser realizado, por ejemplo, usando AR? sintetizado químicamente (64) , para lo cual las moléculas apropiadas de AR? pueden sintetizarse químicamente mediante métodos conocidos. Alternativamente, pueden usarse vectores de expresión apropiados para transcribir tal AR? in vitro o bien in vivo. La transcripción in vitro de hebras antisentido (codificadas por secuencias que están presentes en el mismo vector o en vectores separados) puede realizarse usando por ejemplo la AR?-polimerasa T7, en cuyo caso el vector puede comprender una secuencia de codificación apropiada ligada operativamente a un promotor T7. En algunas modalidades, el AR? transcrito in vivo puede ser procesado (por ejemplo, usando ARNasa III de E. coli) in vitro hasta un tamaño que conduce a ARNi . Las transcripciones en sentido y antisentido combinadas para formar un dúplex de ARN que es introducido en una célula "objetivo" de interés. Pueden usarse otros vectores que expresan pequeños ARNs en horquilla (ARNsh) que pueden procesarse en moléculas similares a AR?si . Se conocen en la técnica varios métodos basados en vectores (65, 93, 95, 98, 99, 105, 109). Se conocen en la técnica varios métodos para introducir tales vectores dentro de células, ya sea in vitro o in vivo (por ejemplo, terapia génica) . Por lo tanto, en una modalidad, la expresión de un polipéptido con una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO : 22 a 43 puede ser inhibida por la introducción o la generación dentro de una célula de un ARNsi o molécula similar al ARNsi correspondiente a una molécula de ácido nucleico codificadora del polipéptido o fragmento del mismo, o a un homólogo de ácido nucleico del mismo. En varias modalidades, tal método puede implicar la administración directa del ARNsi o molécula similar al ARNsi dentro de la célula, o el uso de los métodos basados en vectores arriba descritos. En una modalidad, el ARNsi o molécula similar al ARNsi tiene una longitud menor a aproximadamente 30 nucleótidos. En otra modalidad, los ARNsi o moléculas similares al ARNsi tienen una longitud de aproximadamente 21-23 nucleótidos. En una modalidad, los ARNsi o moléculas similares al ARNsi comprenden una porción dúplex de 19-21 pb, y cada hebra tiene una proyección 3' de dos nucleótidos. En algunas modalidades, el AR?si o molécula similar al AR?si es sustancialmente idéntica a un ácido nucleico codificador del polipéptido o un fragmento o variante (o un fragmento de una variante) del mismo. Tal variante es capaz de codificar una proteína que tiene la actividad de un polipéptido codificado por las SEQ ID NO: 22-43. En algunas modalidades, la hebra en sentido del ARNsi o molécula similar al ARNsi es sustancialmente idéntica a las SEQ ID ?O: 1-21 o a un fragmento de las mismas (el AR? teniendo residuos U en lugar de T de la secuencia del AD?) . En algunas modalidades, los anticuerpos desarrollados contra los polipéptidos de la invención pueden usarse como terapia contra la infección por agentes patógenos A/E. En algunas modalidades, las moléculas polipetídicas y de ácido nucleico de la invención pueden usarse para detectar la presencia de un agente patógeno A/E en una muestra. Las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para diseñar sondas o cebadores que podrían, por ejemplo, hibridarse al AD? de un patógeno A/E en una muestra, o podrían usarse para amplificar el AD? de un patógeno A/E en una muestra mediante, por ejemplo, técnicas de reacción en cadena de polimerasa. Los polipéptidos podrían usarse por ejemplo para desarrollar anticuerpos que se unan específicamente a un polipéptido expresado por un agente patógeno A/E . Tales sondas o cebadores o anticuerpos pueden ser marcados en forma detectable. Se entiende por "marcados en forma detectable" cualesquiera medios para marcar e identificar la presencia de una molécula, por ejemplo, una sonda o cebador oligonucleotídico, un gen o fragmento del mismo, o una molécula de ADNc. Los métodos para marcar en forma detectable una molécula son bien conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, la marcación radiactiva (por ejemplo, con un isótopo tal como 32P ó 35S) y marcación no radiactiva tal como la marcación enzimática (por ejemplo, usando peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina) , la marcación quimioluminiscente, marcación fluorescente (por ejemplo, usando fluoresceína) , marcación bioluminiscente, o detección por anticuerpos de un ligando adherido a una sonda.

Se incluye también en esta definición a una molécula que es marcada en forma detectable por medios indirectos, por ejemplo, una molécula que está unida con una primera porción (tal como biotina) que está, a su vez, unida a una segunda porción que puede ser observada o sometida a ensayo (tal como la estreptavidina marcada con fluoresceína) . Las etiquetas o marcadores incluyen también la digoxigenina, luciferasas, y a la aecuorina. Composiciones, Dosificaciones y Administración de Uso Farmacéutico y Veterinario Los compuestos incluyen las moléculas polipeptídicas y de ácido nucleico descritas aquí, así como compuestos identificados según los métodos de la invención. Los compuestos de acuerdo a la invención pueden proveerse solos o en combinación con otros compuestos (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico, pequeñas moléculas, polipéptidos, péptidos o análogos de péptidos) , en presencia de un liposoma, un adyuvante, o cualquier portador farmacéuticamente aceptable, en una forma apropiada para ser administrados a mamíferos, por ejemplo, humanos, vacas, ovejas, etc. Si se desea, el tratamiento con un compuesto de acuerdo a la invención puede combinarse con más terapias tradicionales y existentes para una infección por patógenos A/E. Puede emplearse la práctica farmacéutica convencional para proveer formulaciones o composiciones apropiadas para administrar los compuestos a sujetos infectados por un agente patógeno A/E. Puede emplearse cualquier ruta de administración adecuada, por ejemplo, parenteral, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intracraneal, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intracapsular, intraespinal, intracisternal, intraperitoneal, intranasal, aerosol o administración oral. Las formulaciones pueden ser en forma de suspensiones o soluciones líquidas; tabletas o cápsulas; polvos, gotas nasales o aerosoles. Los métodos para hacer formulaciones son bien conocidos en la técnica (57) . Las formulaciones para administración parenteral pueden, por ejemplo, contener excipientes, agua estéril, o solución salina, polialquilen-glicoles tales como polietilen-glicol, aceites de origen vegetal, o naftalenos hidrogenados. Para controlar la liberación de los compuestos pueden usarse polímeros de láctido, copolímeros de láctido/glicólido, o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno biocompatibles y biodegradables. Otros sistemas de administración partenteral potencialmente útiles incluyen a las partículas de copolímeros de etilen-vinil-acetato, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables, y liposomas. Las formulaciones para inhalación pueden contener excipientes, por ejemplo lactosa, o pueden ser soluciones acuosas que contengan, por ejemplo, éter de polioxietilen-9-laurilo, glicolato y desoxicolato, o pueden ser soluciones aceitosas para administración en la forma de gotas nasales, o como un gel. Para composiciones terapéuticas o profilácticas, los compuestos se administran a un individuo en cantidades suficientes para detener o reducir una infección por agentes patógenos A/E . "Cantidades suficientes" de un compuesto de acuerdo a la invención implican cantidades terapéuticamente efectivas o cantidades profilácticamente efectivas. Las "cantidades terapéuticamente efectivas" se refieren a cantidades efectivas, a dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios, como para lograr el resultado terapéutico deseado, tal como la reducción de la colonización o la diseminación de un patógeno A/E. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del sujeto, y la capacidad del compuesto para producir la respuesta deseada en el sujeto. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proveer la óptima respuesta terapéutica. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual los efectos terapéuticamente beneficiosos pesan más que cualquier efecto tóxico o perjudicial del compuesto. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado, tal como la prevención de la colonización por un agente patógeno A/E. Típicamente, una dosis profiláctica se usa en sujetos antes -o durante un estadio temprano de- la enfermedad, de manera que una cantidad profilácticamente efectiva puede ser menor que una cantidad terapéuticamente efectiva. Un valor apropiado para cantidades terapéuticamente u profilácticamente efectivas de un compuesto puede ser cualquier número entre 0.1 nM - 0.1 M; 0.1 nM - 0.05 M; 0.05 nM - 15 µM; ó 0.01 nM - 10 µM. Debe advertirse que los valores de dosificación pueden variar según la severidad de la condición a ser aliviada. Para cualquier sujeto en particular, pueden ajustarse regímenes de dosificación específicos a lo largo del tiempo de acuerdo con los requerimientos individuales y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones. Los intervalos de dosificación aquí expuestos son sólo a modo de ejemplo y no limitan los intervalos de dosificación que pueden seleccionarse por profesionales de la medicina. La cantidad de compuesto activo en la composición puede variar de acuerdo a factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proveer la óptima respuesta terapéutica. Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, varias dosis divididas pueden administrarse a lo largo del tiempo o la dosis puede ser proporcionalmente reducida o aumentada según lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Puede resultar ventajoso formular composiciones parenterales en la forma de unidades de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de las dosis. En el caso de formulaciones para vacunas, una cantidad efectiva de un compuesto de la invención puede proveerse sola o en combinación con otros compuestos, y con uno o más adyuvantes inmunológicos para inducir una respuesta inmune. Los adyuvantes de acuerdo a la invención pueden incluir emulsificantes, dipéptidos de muramilo, avridina, adyuvantes acuosos tales como hidróxido de aluminio, adyuvantes basados en quitosano, saponinas, aceites, Amphigen®, LPS, extractos de paredes celulares bacterianas, ADN bacteriano, complejos bacterianos, oligonucleótidos sintéticos y combinaciones de los mismos (100) . El adyuvante puede incluir un extracto de paredes celulares de Mycobacterium phlei (M. phlei; MCWE) (Patente de los Estados Unidos No. 4.744.984), un complejo de paredes celulares de ADN de M. phlei (M-ADN) o de micobacterias (MCC) . Los emulsionantes incluyen agentes emulsificantes naturales o sintéticos. Los agentes emulsificantes sintéticos incluyen agentes iónicos (por ejemplo, sales de potasio, sodio y amonio de ácido láurico y oleico, las sales de calcio, magnesio y aluminio de ácidos grasos, por ejemplo, jabones de metales, y sulfonatos orgánicos tales como el laurilsulfato de sodio) , agentes catiónicos (por ejemplo, bromuro de cetiltrimetilamonio) , y agentes no iónicos (por ejemplo, esteres de glicerol tales como el monoestearato de glicerol, esteres y éteres de polioxietilenglicol, y los esteres de ácidos grasos de sorbitan tales como el monopalmitato de sorbitan y sus derivados de polioxietileno, por ejemplo, monopalmitato de sorbitan polioxietileno) . Los agentes emulsificantes naturales incluyen: acacia, gelatina, lecitina y colesterol . Otros adyuvantes adecuados incluyen un aceite que puede ser un aceite simple, una mezcla de aceites, una emulsión de aceite en agua (e.g, EMULS IGENTM , EMULSIGE? PLUSTM o VSA3 ) , o una emulsión no-aceite en agua (por ejemplo, una emulsión de aceite, una emulsión de agua en aceite, o una emulsión de agua-en aceite-en agua) . El aceite puede ser un aceite mineral, un aceite vegetal o un aceite animal. Los aceites animales adecuados incluyen, por ejemplo, aceite de hígado de bacalao, aceite de hipogloso, aceite de lacha, aceite de "reloj anaranjado", o aceite de hígado de tiburón, todos los cuales están disponibles comercialmente. Los aceites vegetales adecuados incluyen, sin limitación, aceite de cañóla, aceite de almendras, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de maní, aceite de cártamo, aceite de ajonjolí o aceite de soya. Alternativamente, pueden usarse varias bases nitrogenadas alifáticas como adyuvantes con las formulaciones de vacunas. Por ejemplo, los adyuvantes inmunológicos conocidos incluyen aminas, compuestos de amonio cuaternarios, guanidinas , benzamidinas y tiouronios (75) . Los compuestos adyuvantes específicos incluyen el bromuro dimetildioctadecil-amonio (DDA) (Patente de los Estados Unidos No. 5,951,988) (88, 59, 85, 68, 84, 82, 83) y el N, N-dioactadecil-N,N-bis (2-hidroxietil) propandiamina ("avridina") (Patente de los Estados Unidos No. 4,310,550, Patente de los Estados Unidos No. 5,151,267) (62). Un adyuvante de acuerdo a la invención puede incluir por ejemplo un aceite mineral y bromuro dimetildioctadecil-amonio. Las composiciones de vacunas pueden prepararse usando técnicas estándares que incluyen -aunque no están limitadas a- mezclado, sonicación y microfluidización. El adyuvante puede comprender aproximadamente 10 a 50% (v/v) de la vacuna, o aproximadamente 20 a 40% (v/v) o aproximadamente 20 a 30% ó 35% (v/v) , o cualquier valor dentro de estos intervalos. El compuesto puede también estar ligado a una molécula portadora, tal como albúmina de suero bovino o hemocianina de lapa en forma de cerradura para aumentar la inmunogenicidad. En general, los compuestos de la invención deberían usarse sin causar una sustancial toxicidad. La toxicidad de los compuestos de la invención puede determinarse usando técnicas corrientes, por ejemplo, mediante pruebas en tejidos celulares o en animales experimentales y determinando el índice terapéutico, por ejemplo, la relación entre el LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y el LD100 (la dosis letal para el 100% de la población) . En algunas circunstancias, sin embargo, tal como en severas condiciones de enfermedad, puede ser necesario administrar sustanciales excesos de las composiciones. Los siguientes ..ejemplos pretenden ilustrar modalidades de la invención, y no debieran ser considerados como limitaciones del alcance de la invención. EJEMPLO 1 Generación de mutantes Las cepas de bacterias usadas son las siguientes: EHEC 0157 :H7 cepa 86//24 (32), EHEC EDL933 (producto de aislamiento 0127:H7 de E. coli de tipo silvestre; 3); EHEC escN- (47), EPEC E2348/69 de tipo silvestre (producto de aislamiento 0127:H6 de E. coli de tipo silvestre; 50), DBS100 de C. rodentium (ATCC 51459; 53), REPEC 0103:K-:H2 85/150 (52) , E. coli HB101. Los plásmidos usados fueron los siguientes: Para PCR y PCR inversa, se usó como rutina el sistema de lectura de pruebas ELONGASA Amplification System (GIBCO BRL/Life Technologies) para minimizar la tasa de error del PCR. Los productos de PCR fueron clonados utilizando el equipo de clonación Topo TA de Invitrogen con pCR2 I TOPO o pCR II TOPO. La secuencia del ADN se determinó mediante el método terminador Taq Dye y un secuenciador automatizado de ADN 373A (Applied Biosystems) . Para la clonación, transformación e infecciones de rutina, las bacterias se cultivaron en agar Luria-bertani (LB) o en caldo LB suplementados con los antibióticos apropiados a 37°C. Se utilizaron varios antibióticos con las siguientes concentraciones: Ampicilina 100 µg/ml, carbenicilina 100 µg/ml, kanamicina 50 µg/ml y cloranfenicol 30 µg/ml. El crecimiento en el Medio de Eagle modificado por Dullbecco (MEMD) se usó para la inducción de la expresión génica del LEE y la secreción de la proteína de tipo III. Para generar los mutantes se usaron el intercambio alélico basado en genes sacB (14) y el sistema de recombinasa Rojo lambda (17) . En general, se eliminó el 75% o más de la porción interna de cada gen para asegurar la interrupción de la función del gen. El primer gen se mutó mediante el método de la recombinasa rojo lambda y los genes 1er, orfll/grlA, y cesT se mutaron mediante el método de intercambio alélico basado en genes sacB. El mutante doble de 1er/orf11 se generó también utilizando el método sacB. La generación de los mutantes tir y escD fue descrita en otras partes (20,56) . Los mutantes eran mutantes de supresión intraestructural, con la introducción de un sitio de enzima de restricción (tanto Nhe I, BamHI como Sal I) en el lugar de la supresión, como se indica a continuación: Estos mutantes se verificaron con múltiples reacciones de PCR. La complementación se sometió a prueba para los mutantes ?tir, ?ler y ?orfll suministrando los genes respectivos en un plásmido. Todos estos mutantes pueden ser complementados, confirmando que las mutaciones generadas por ambos métodos de intercambio alélico no afectaron la función de los genes corriente abajo y son por lo tanto no-polares. Para hacer EHEC-pNleA-HA, la región codificadora de nleA fue amplificada mediante el sistema de prueba de lectura ELONGASE A plification System (Invitrogen) y los siguientes cebadores: Z6024F: 5 'AGATCTGAAGGAGATATTATGAACATTCAACCGACCATAC (SEQ ID NO: 44); Z6024R: 5 ' CTCGAGGACTCTTGTTTCTTCGATTATATCAAAG (SEQ ID NO: 45). Los productos de PCR fueron clonados utilizando el equipo de clonación TOPO TA (Invitrogen) y la secuencia de ADN se verificó usando el método del terminador Taq Dye y un secuenciador automatizado de ADN 373A (Applied Biosystems) . El producto fue luego subclonado en pCRespG-2HA/BglII, un plásmido derivado de pACYC desarrollado para conducir una expresión proteínica desde un promotor EspG de C. rodentium y para agregar dos hemaglutininas de influenza (HA) al extremo C de la proteína expresada. Las construcciones de plásmidos se introdujeron luego en EHEC y EHEC escN de tipo silvestre mediante electroporación. Se creó un mutante de supresión en nleA en una cepa de EHEC resistente al ácido nalidíxico mediante un intercambio alélico basado en el gen sacB (29) . Dos fragmentos de ADN que flanquean al nleA fueron amplificados usando ADN cromosómico de EHEC como plantilla. El fragmento A fue amplificado por PCR usando el cebador NT10 5 ' CCGGTACCTCTAACCATTGACGCACTCG (SEQ ID NO: 46) y un cebador NT11 5 'AACCTGCAGAACTAGGTATCTCTAATGCC (SEQ ID NO: 47) para generar un producto de 1.3 Kb. El fragmento B fue amplificado usando el cebador NT12 5 'AACCTGCAGCTGACTATCCTCGTATATGG (SEQ ID NO: 48) y un cebador NT13 5 ' CCGAGCTCAGGTAATGAGACTGTCAGC (SEQ ID NO: 49) para generar un producto de 1,3 Kb Los fragmentos A y B fueron luego digeridos con PstI por 1 hora y luego la enzima fue inactivada por calor durante 20 minutos a 65°C. Aproximadamente 50 ng de cada fragmento digerido se ligó con ADN-ligasa T4 por 1 hora a temperatura ambiente. La reacción de ligadura se diluyó 1/10 y fue agregado lµl a una PCR utilizando cebadores NT10 y NT13. El producto de PCR de 2.3 Kb resultante fue luego digerido con Sacl y Kpnl, ligado a los sitios correspondientes de pRE112 (14) y transformados en DH5a?pir para generar pNT225. El pNT225 fue transformado en la cepa conjugativa SMIO?pir que funcionó como cepa donante en una conjugación con el EHEC de tipo silvestre. Se seleccionaron exoconjugantes resistentes al ácido nalidíxico y al cloranfenicol, en agar LB. Los exoconjugantes se sembraron luego en agar LB con sacarosa al 5% (p/v) y sin NaCl. Las colonias resultantes fueron luego examinadas en cuanto a su sensibilidad al cloranfenicol, seguido de PCR para identificar productos de aislamiento con la supresión nleA y con pérdida de secuencias de plásmidos . Un mutante de supresión nleA fue luego aislado y usado para trabajo ulterior. Se generó un mutante nleA de C. rodentium usando PCR para crear, en pRElld (14) , un vector suicida con una supresión interna de nleA. Se usaron los siguientes cebadores: dellF: 5 ' GGTACCACCACACAGAATAATC (SEQ ID NO: 50); delIR: 5 ' CGCTAGCCTATATACTGCTGTTGGTT (SEQ ID NO: 51); del2F: 5 ' GCTAGCTGACAGGCAACTCTTGGACTGG (SEQ ID NO: 52); del2R: 5 'GAGCTCAACATAATTTGATGGATTATGAT (SEQ ID NO: 53). El plásmido resultante fue introducido en C. rodentium por electroporación para crear una cepa merodiploide resistente a los antibióticos. La pérdida de secuencias del plásmido a través de un segundo evento de recombinación fue seleccionada como se describió anteriormente . Se examinaron por PCR las colonias resistentes a la sucrosa y sensibles a los antibióticos, en busca del evento de recombinación apropiado mediante PCR, utilizando cebadores que flanquean la región eliminada. La ausencia de NleA se verificó aplicando transferencia de Western a los lisados de células enteras con antisuero policlonal anti-NleA.

Evaluación de proteínas totales y secretadas/proteómicas Las proteínas secretadas fueron preparadas como se describió anteriormente (51) . Las cepas de C. rodentium se cultivaron durante una noche en un agitador en 4 ml de caldo Luria (LB) a 37°C. Los cultivos fueron subcultivados 1 a 50 en 4 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) , el cual fue preincubado en un incubador de cultivos de tejido (con 5% de C02) durante una noche, y cultivados durante 6 horas en el mismo incubador para inducir la expresión génica del LEE.

Los cultivos fueron centrifugados dos veces a 13.000 rpm durante 10 min. para extraer las bacterias, y el sobrenadante fue precipitado con ácido tricloroacético (TCA) para concentrar las proteínas secretadas en el medio de cultivo. La pella bacteriana se disolvió en amortiguador 2X SDS-PAGE y fue designado como proteínas bacterianas totales . Las proteínas secretadas precipitadas del sobrenadante también fueron disueltas en amortiguador 2X SDS-PAGE y el TCA residual fue neutralizado con 1 µl de Tris saturado. Los volúmenes de amortiguador usados para re-suspender la pella bacteriana y las proteínas secretadas fueron normalizados a OD600 del cultivo para asegurar la carga igual de las muestras. Las proteínas secretadas fueron analizadas en SDS-PAGE al 12% ó 17%, y teñidas con Azul de Coomassie G250 al 0,1%. Para el análisis de transferencia de Western, las proteínas totales o secretadas fueron separadas en SDS-PAGE al 10%, y transferidas a membrana de celulosa (Bio-Rad) . Los anticuerpos usados fueron anticuerpos policlonales de rata contra Tir de Ci trobacter marcado con His, y anticuerpo monoclonal de ratón contra EspB de EPEC. Se siguieron los protocolos regulares de transferencia de Western ECL (Amersham Life Science) . EHEC de tipo silvestre y EHEC CVD451 se cultivaron durante la noche en medio LB. Los cultivos luego se disolvieron 1:100 en medio mínimo M-9 suplementado con NaHC03 44 mM, MgS04 8 mM, glucosa 0,4% y casaminoácidos 0.1%, y se cultivaron a 37°C en 5% de C02 hasta un OD600 de 0.6 a 0.8. Las proteínas secretadas se cosecharon centrifugando los cultivos a 800 Og durante 30 minutos, luego separando los sobrenadantes de las pellas. Los sobrenadantes se filtraron a través de filtros de 0,45 micrones y se determinó la concentración de proteína mediante el ensayo de BCA (Sigma) . Las proteínas se prepararon para electroforesis mediante precipitación con 1/9 del volumen de TCA frío al 100%, sobre hielo durante 45 a 120 min, seguido por centrifugación a 17600g durante 30 min. Las pellas se enjuagaron en acetona fría al 100% y solubilizada en amortiguador laemmli IX (para geles SDS-PAGE unidimensionales) o amortiguador de muestra 2D para geles 2D (urea 8M, tiourea 2M, CHAPS al 4%, Tris 20 mM, azul de bromofenol al 0.002%) . Para los geles 2D, se agregó DTT hasta 6 mg/ml, y amortiguador IPG (pH 3-10: Amersham Biosciences) hasta 0.5% antes de la carga. Se rehidrataron tiras secas Immobiline (Immobiline Dry Strips) de 18 cm (pH 3-10: Amersham) en la muestra durante toda la noche a 20 °C. Luego las muestras fueron enfocadas a 15 °C por 65,000 Vh. Luego de ser enfocadas, las tiras se equilibraron en EB + 10 mg/ml de DTT durante 15 minutos, y luego EB + 25 mg/ml de yodoacetamida durante 15 minutos (EB es Tris 50 M, urea 6M, glicerol al 30%, SDS al 2%, pH 8.8). Las tiras equilibradas se sellaron sobre la parte superior de geles de SDS-PAGE de formato grande (acrilamida al 12% ó 14%) usando agarosa al 0.5% en amortiguador de corrida SDS-PAGE + azul bromofenol al 0.002%, y los geles se corrieron hasta que el frente de la tinción corriera fuera del gel . Los geles se colorearon con Sypro Ruby siguiendo las instrucciones de los fabricantes (BioRad) y se visualizaron en un iluminador UV o por MS/MS en un espectrómetro de masa LCQ Deca Ion Trap (Thermo Finnigan) equipado con un sistema de cromatografía líquida Nanoflow (LC Packings-Dionex) . Para geles visualizados con un iluminador UV, las manchas de interés se extrajeron manualmente. La digestión intra-gel de las proteínas fue realizada en el Investigator ProGest Robot (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI) , tal como es descrito (23) . Las muestras con elevada abundancia de proteínas se analizaron mediante un sistema LC-MS consistente en un sistema de cromatografía líquida ?anoflow equipado con un automuestreador FAMOS (LC Packings -Dionex, San Francisco, CA) , y un espectrómetro de masa LCQ Deca Ion Trap (Thermo Finnigan, San José, CA) (24) . Se usaron columnas PicoFrit de fase invertida PFC7515-PP18-5 (?ew Objective, Woburn, MA, EEUU) para la separación de péptidos, y el efluente de la columna fue rociado directamente dentro del espectrómetro de masa. Se usó un flujo de 200 nL/min, y el tiempo total de adquisición fue igual a 45 min. por muestra. Las muestras con bajas concentraciones de proteína se analizaron en un espectrómetro de masa API QSTAR Pulsar Hybrid MS/MS (Applied Biosystems/MDS SCIEX, Concord, Canadá) (12) equipado con una fuente de iones Nanospray (Proxeon, Odense, Denmark) . Previo al análisis, las muestras se purificaron y concentraron en ZipTips (Millipore, Billerica, MA) . El API QSTAR Pulsar también se usó para la secuenciación peptídica de novo. Los espectros se analizaron contra la base de datos NCBI (Bethesda, MD) con los buscadores Mascot (Matrixscience) o Sonar (Proteometrics Canadá Ltd.). Construcción de las fusiones transcripcionales cat y el ensayo CAT Los fragmentos de PCR que portaban los promotores y todos los elementos reguladores corriente-arriba del 1er (LEE1) y el tir (LEE5) de Citrafoacter fueron digeridos con BamHI y HindIII, y clonados en el plásmido pKK232-8, el cual contiene un gen cat carente de promotor. Las posiciones ocupadas por los fragmentos clonados son como se indican aquí. La actividad de CAT dirigida por estas fusiones en diferentes cepas de Citrojbacter fue determinada como se describió previamente (21, 22) . Las muestras se colectaron en diferentes puntos de tiempo a partir de cultivos bacterianos desarrollados en DMEM como se describió anteriormente . Análisis de secuencias y herramientas bioinformáticas El análisis de secuencias y la búsqueda de homologías del ADN y las proteínas con BLASTN, TBLASTN y BLASTP se llevaron a cabo usando programas disponibles en el sitio de la red de NCBI (http: //www.ncbi .nih.org/) . Las bases de datos usadas incluyen las del sitio de NCBI, el Centro de Genoma Sanger (http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microbes) , y el SwissProt (http://www.expasy.org/sprot/) . Las posiciones del LEE PAI así como los profagos en el genoma de EHEC fueron obtenidas a partir de datos generados por el programa IslandPath (http : //www . pathogenomics . sfu . ca/islandpath/ ) (13 ) . Análisis de transferencia de Southern Las muestras de ADN genómico para el análisis de transferencia de Southern se prepararon usando el equipo DNeasy Tissue (Qiagen) . La sonda se preparó mediante digestión del pNleA-HA con las enzimas Salí y BglII para obtener un fragmento de 500 pb que fue marcado con el equipo de marcación no isotópico BrightStar Psoralen-Biotin (Ambion) . Se digirieron completamente cinco microorganismos de cada muestra de ADN genómico con 25 unidades de BamHI , EcoRI y PstI durante una noche . Las muestras se resolvieron por electroforesis en gel de agarosa al 1% , y se transfirieron durante una noche a una membrana de nailon BrightStar-Plus (Ambion) mediante elución descendente pasiva y levemente alcalina . El ADN fue ligado en forma cruzada a la membrana exponiendo a ésta última a luz UV durante 2 min, seguido por 30 min de calentamiento a 80 °C . La membrana fue prehibridada lavándola en 10 ml de amortiguador de hibridación ultrasensible ULTRAhyb (Ambion) a 42°C durante 30 min. Diez microlitros de la sonda preparada fueron luego agregados a la membrana prehibridada en amortiguador y la sonda fue hibridada a la membrana durante una noche a 42°C. La membrana se lavó dos veces 5 min en amortiguador de lavado de baja exactitud (Ambion) y 2 veces 15 min en amortiguador de lavado de alta exactitud (Ambion) a temperatura ambiente . La sonda hibridada fue detectada con el equipo de detección no isotópico BrightStar BioDetect (Ambion) , seguido por exposición a una película Kodak. Generación de antisuero anti-NieA La porción codificadora de nleA fue amplificada a partir del ADN genómico de EHEC y clonada en un vector de expresión marcado con His (pET28a, Novagen) usando los siguientes cebadores: 5' TTCCATATGAACATTCAACCGACC (SEQ ID NO: 54) y 5 ' GGAATTCAATAATAGCTGCCATCC (SEQ ID NO: 55) . Este plásmido fue introducido en BL21 (?DE3) , desarrollado hasta una densidad óptica (A600) de 0.8 e inducido con IPTG 0.5 mM durante 16 horas a 20°C. La proteína marcada con His fue purificada en una columna Ni-NTA siguiendo las instrucciones de fabricante (Qiagen) . Las fracciones con NleA fueron agrupadas y se agregó trombina (500:1), y la proteína se dializó durante la noche contra tris 20 mM pH 8.2; NaCl 50 mM. Al día siguiente la proteína fue cargada en una columna monoQ de FPLC y la columna fue desarrollada con un gradiente lineal de NaCl desde 50 a 500 mM. Las fracciones con NleA fueron agrupadas. Después de este paso, la proteína fue >90% pura. La proteína purificada se usó para inmunizar dos ratas macho Sprague Dawley, 300 µg de proteína/rata, usando el adyuvante completo de Freund (Sigma) , y el antisuero resultante fue purificado por afinidad usando el soporte activado de inmunoafinidad Affi-Gel 15 según las instrucciones del fabricante (BioRad) . Para los experimentos de inmunofluorescencia, el antisuero fue ulteriormente purificado por absorción contra polvos de acetona preparados a partir de células HeLa y a partir de EHEC. NleA tal como se describe en (45) . La especificidad del antisuero fue confirmada mediante el análisis de transferencia de Western de extractos celulares de EHEC de tipo silvestre y NleA de EHEC. Análisis de inmunotransferencia Las muestras para análisis de transferencia de Western fueron resueltas por SDS-PAGE (9% a 12% de poliacrilamida) . Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa y las inmunotransferencias se bloquearon en leche en polvo descremada (NFDM) al 5% en TBS con pH 7.2, y con Tween 20 (TBST) al 0.1%, durante la noche a 4°C, y luego incubadas con anticuerpo primario en TBST NFDM al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) . Las membranas se lavaron 6 veces en TBST y luego se incubaron con una dilución 1:5000 de peroxidasa de rábano - anticuerpo anti-ratón de cabra (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc . ) durante una hora a temperatura ambiente . Las membranas fueron luego lavadas como se describiera anteriormente. Los complejos antígeno-anticuerpo se visualizaron con el equipo mejorado de detección por quimioluminiscencia (Amersham) , seguido por exposición a película Kodak (Perkin Elmer) . Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-HA.11 (Covance) , anti-DnaK (Stressgen) , anti-EHEC Tir, anti-NleA (este estudio) , anti-Calnexina (Stressgen) , anti-Calreticulina (Affinity Bioreagents) , anti-tubulina (Sigma) . Inmunofluorescencia Las células HeLa se cultivaron sobre cubreobjetos de vidrio en placas para cultivo de tejidos de 24 pocilios e infectadas durante 6 horas con 1 µl (EHEC) de un cultivo del día anterior de OD~0,4. A las 6 horas postinfección las células se lavaron 3 veces en PBS con Ca2+ y Mg2+, y fijadas en paraformaldehído al 2.5% en PNS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron permeabilizadas en saponina al 0.1% en PBS, bloqueadas en suero de cabra al 5% ó BSA al 5% en PBS + saponina al 0,1%, e incubadas con los siguientes anticuerpos primarios diluidos en solución bloqueadora durante 1 hora a temperatura ambiente: anti-EHEC Tir, 1:1000; anti-E. coli 0157 (Difco), 1:200; anti-NleA policlonal de rata purificado por afinidad (este estudio) , 1:100; anti-manosidasa II (gentilmente provista por la Dra.

Marilyn Farquhar, UCSD) , 1:1000. Luego de 3 lavados en PBS/saponina, las células se incubaron en anticuerpos secundarios (Anti-ratón, conejo, rata conjugado con Alexa-488 ó -568 [Molecular Probes], 1:400), durante 30 minutos a temperatura ambiente, lavadas 3 veces en PBS/saponina y una vez en PBS, y montadas en portaobjetos de vidrio usando mowiol + DABCO. Para la visualización de la actina polimerizada, se incluyó faloidina conjugada con Alexa-488 (Molecular Probes) con los anticuerpos secundarios a una dilución 1:100. Donde así se lo indica, las células se incubaron con 5 µg/ml de brefeldina A (Boehringer Mannheim) durante 30 minutos antes de la fijación. Las imágenes se detectaron con un microscopio Zeiss Axioskop, se capturaron con una cámara digital E pix DVC1300, y se analizaron con el software para tratamiento de imágenes Northern Eclipse, o en un microscopio confocal BioRad Radiance Plus usando el software Lasersharp. Fraccionamiento de células hospedadoras infectadas Para cada muestra, dos cajas confluentes de 100 mm de células HeLa se infectaron con EHEC-pNleA-HA de tipo silvestre o EHECescN-pNleA-HA usando una MOI inicial de 1:10. A las 6 horas postinfección, las células se lavaron tres veces con PBS helado y se sometieron a fraccionamiento bioquímico como se describiera previamente (30, 49) . En breve, las células se resuspendieron en 300 µL de amortiguador de homogeneización (imidazol 3 mM, sacarosa 250 mM, EDTA 0.5 mM, pH 7.4) suplementado con el cóctel inhibidor de proteasa COMPLETE (Roche) y desintegradas mecánicamente mediante el paso a través de una aguja de tamaño 22. El homogeneizado fue centrifugado a baja velocidad (3000g) durante 15 minutos a 4°C hasta transformar en pellas las células no desintegradas, las bacterias, los núcleos y los componentes citoesqueléticos (pella de baja velocidad). El sobrenadante fue sometido a ultracentrifugación de alta velocidad (41,000g) durante 20 minutos a 4°C en un rotor TLS55 en una centrífuga TL100 (Beckman) para separar las membranas de las células hospedadoras (pella) del citoplasma (sobrenadante) . Las pellas fueron resuspendidas en 300 µL de amortiguador laemmli IX, y el sobrenadante se llevó a amortiguador laemmli IX usando una reserva 5X. Iguales volúmenes de todas las fracciones se resolvieron por SDS-PAGE (9% de poliacrilamida) y se transfirieron a nitrocelulosa y se analizaron por transferencia de Western. Para los estudios de extracción del NleA asociado a la membrana, se fraccionaron dos cápsulas de 100 mm de células HeLa infectadas como se describiera anteriormente para cada una de las condiciones de extracción. Las pellas de alta velocidad (la fracción de membrana hospedadora) fueron resuspendidos en 300 µL de uno de los siguientes amortiguadors de extracción: (i) Tris 10 mM, MgCl2 5 mM, pH 7.4; (ii) Tris 10 mM, MgCl2 5 mM, NaCl 1 M, pH 7,4; (iii) NaHC03 0.2 M, MgCl2 5 mM, pH 11.4; (iv) Tris 10 mM, MgCl2 5 M, 1% Tritón X-100 pH 7,4. La extracción se realizó sobre hielo tomando con pipeta las muestras arriba y abajo cada 5 minutos durante 30 minutos, y las muestras fueron recentrifugadas a lOO.OOOg durante 30 minutos. LA pella (fracción insoluble) fue resuspendida en 300 µL de amortiguador laemmli IX; el sobrenadante (fracción soluble) fue precipitado en ácido tricloroacético al 10% sobre hielo durante 30 minutos, lavado en acetona al 100% y resuspendido en 300 µL de amortiguador laemmli IX. Iguales volúmenes fueron resueltos por SDS-PAGE (9% de poliacrilamida) y transferidos a nitrocelulosa y analizados por transferencia de Western. Análisis de infección por C. rodentium en ratones En el servicio animal de la Universidad de British Columbia se alojaron ratones C3H/HeJ (Jackson Laboratory) y ratones ?IH Swiss (Harían Sprague-Dawley) de 5 semanas de edad, directamente de acuerdo con las normas esbozadas por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad de British Columbia y el Consejo Canadiense sobre el Uso de Animales de Laboratorio. C. rodentium de tipo silvestre y el mutante de supresión nleA se cultivaron en caldo LB durante una noche en un agitador a 200 rpm, y 100 µl del cultivo fueron usados para infectar a los ratones por cebadura oral . El inoculo fue titulado por dilución serial y cultivo en placa, y se hallo que era 4 x 108 cfu/ratón para ambos grupos. Para la infección de los ratones C3H/HeJ altamente susceptibles por C. rodentium, la supervivencia de los ratones infectados fue evaluada diariamente en el curso de la infección. Cuando un ratón se tornaba moribundo, éste era inmediatamente sacrificado. Para los ensayos sobre virulencia bacteriana usando ratones NIH Swiss, los animales fueron sacrificados al día 10 post-infección. Para cuantificar la hiperplasia colónica, se colectaron y pesaron los primeros 4 cm del colon distal medidos a partir del borde anal, luego de retirar cualquier pella fecal . Para evaluar la colonización bacteriana, los tejidos colónicos más las pellas fecales fueron homogeneizadas en PBS usando un Homogeneizador de Tejido Polytron, y fueron diluidas serialmente antes de cultivarlos en agar MacConkey (Difco Laboratories) . El tejido colónico y las pellas fecales se combinaron para determinar la carga bacteriana total en el colon del ratón al momento de sacrificarlo. El agar MacConkey es selectivo para las bacterias Gram negativas, sobre el cual C. rodentium forma colonias con una morfología altamente distintiva e identificable, no típica de E. coli (26) . Para el análisis histológico los últimos 0.5 cm del colon de ratones infectados se fijaron en formalina con amortiguador neutro al 10%, se procesaron, se cortaron en secciones de 3 µm y se tiñeron con hematoxilina y eosina. El análisis histológico fue hecho por el Laboratorio de Servicios Morfológicos del Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad de British Columbia. EJEMPLO 2 Análisis de la Regulación de la Expresión Génica del LEE Para determinar cuáles genes en el LEE son los que regulan la expresión génica del LEE en C. rodentium, se analizaron mutantes LEE en busca de la expresión de EspB y Tir, las cuales son codificadas por los operones LEE4 y LEE5, respectivamente. Los lisados celulares totales de bacterias desarrolladas en DMEM se analizaron por transferencia de Western con sueros anti-Tir y anti-EspB. Nuestros resultados confirmaron el papel esencial del Ler en la expresión del LEE, ya que no se produjeron Tir ni EspB en ?ler. Tal como se esperaba, ?tir y ?espB no produjeron Tir y EspB, respectivamente. No se observó Tir en ?cesT, lo cual es consistente con el papel de los CesT como acompañante para la estabilidad y secreción de Tir (18, 19) . codificada por el LEE, Orf11, también era requerida para la expresión de Tir y EspB. La expresión de Tir y EspB en ?orfll fue complementada por un plásmido que portaba sólo el orfll de Citrobacter (Fig. 8) . El gen orfll es altamente conservado entre patógenos A/E, y tanto el orfll de EHEC como de EPEC complementaban al ?orfll de Citrobacter (Fig. 8), indicando que Orfll es funcionalmente equivalente en la regulación positiva de la expresión génica del LEE en patógenos A/E. El análisis secuencial indicó que Orfll/GrlA muestra 23% de identidad respecto de CaiF, un activador transcripcional de los operones cai y fix de las Snterojacteriaceae (15) , y 37% de identidad respecto de la secuencia de aminoácidos deducida de un producto no caracterizado de Salmonella codificado por un gen localizado corriente abajo (3') del operón fimbrial std (16) (Fig. 7). Este homólogo de Salmonella está indicado como SGH (Homólogo GrlA de Salmonella) en la figura. Estas tres proteínas contienen una estructura hélice-giro-hélice esperada, que es característica de las proteínas de enlace al ADN. Para determinar la jerarquía de Orfll y Ler en la regulación de la expresión génica del LEE, nosotros creamos un mutante doble de ler y orfll en C. rodentium. Si bien la expresión de Tir y EspB en ?ler ?orfll puede restaurarse mediante la expresión de Ler in posición trans, el Orfll similarmente expresado no tenía este efecto (Fig. 8) , sugiriendo que Orfll actúa corriente arriba (5') respecto de Ler en la cascada regulatoria. El análisis de extensión de cebadores confirmó esta jerarquía regulatoria mostrando que el promotor ler de Citrobacter es similar al ler de EPEC y su expresión fue reducida en ?orfll.

El papel de Orfll en la regulación de la expresión de ler fue ulteriormente demostrada mediante el monitoreo de las actividades de las fusiones transcripcionales entre las regiones regulatorias de los operones LEE1 (Ler) (pLEEl-CAT) o LEE5 (Tir) (pLEE5-CAT) y el gen reportador cat en cepas WT, ?ler y ?orfll de Citrobacter desarrolladas en Medio Esencial Modificado de Dulbecco (DMEM) durante 6 horas. La actividad de la fusión LEEl-cat fue disminuida en ?orfll, y la de las fusiones LEE5-cat fue drásticamente reducida tanto en ?ler como en ?orfll. Estos resultados indican que Orfll es un nuevo regulador positivo de la expresión de Ler, que subsecuentemente facilita la expresión de otros operones LEE. Dado que Orfll actúa corriente arriba de Ler en la cascada regulatoria, fue denominado GrlA (regulador global del activador de LEE) . EJEMPLO 3 Identificación de efectores secretados por TTSS codificado por LEE Los agentes patógenos A/E secretan varias proteínas hacia los cultivos de tejidos o medios mínimos, pero las proteínas secretadas son, predominantemente, los translocadores EspA, EspB y EspD. Las proteínas secretadas fueron concentradas por precipitación con TCA a partir de sobrenadantes de cultivos celulares desarrollados en DMEM y analizados por SDS-PAGE 12% seguido de tinción con Azul de Coomassie. Las C. rodentium que portaban un plásmido con orfll/grlA secretaban por lo menos 300% más EspA, EspB y EspD que la cepa WT. Para definir los efectores codificados por el LEE de Ci trobacter, marcamos varias proteínas, codificadas por LEE que no están involucradas en TTS y en la adhesión a la célula hospedadora, con un epitopo doble de hemaglutinina (2HA) en el extremo carboxilo, y analizamos su secreción en C. rodentium WT y mutantes. Solamente Tir, EspG, EspF, EspH y Map fueron secretados por el TTSS codificado por LEE en C. rodentium, sugiriendo que el LEE codifica sólo para 5 efectores . Una proteína de 54 kDa no reconocida previamente (p54) fue fácilmente detectada por tinción de Coomassie en un mutante que también tenía una muy elevada secreción de Tir, sugiriendo que representa un nuevo efector putativo codificado fuera del LEE. Para identificar p54 y para determinar si hay otros factores que sean codificadgos fuera del LEE en C. rodentium, aprovechamos la capacidad de GrlA para aumentar la expresión génica del LEE y/o la secreción de tipo III, e introdujimos el plásmido grlA en los mutantes que secretaban efectores pero no translocadores. La sobre-expresión de GrlA aumentó en gran medida (más del 400%) la secreción de Tir en estos mutantes, sin que se secretaran translocadores. Se observaron por lo menos otras 6 proteínas secretadas, indicando que el TTSS codificado por LEE secreta varias otras proteínas no codificadas por LEE. Para identificar estas proteínas, las proteínas secretadas fueron analizadas por geles 2-D. Dado que algunos de los efectores codificados por LEE (EspF, EspH y Map) tenían valores básicos de pl esperados, con EspF presentando un pl extremo de 11,00, las proteínas secretadas fueron en primer lugar enfocadas en Tiras Secas Immobiline con gradientes tanto ácidos (pH 3-10) como básicos (pH 6-11) , y luego resueltas en SDS-PAGE al 12% y 14%, respectivamente. Los geles fueron teñidos con Sypro Ruby, y las manchas de proteína seleccionadas fueron extraídas manualmente y analizadas por espectrometría de masa y por secuenciamiento peptídico de novo. Este análisis confirmó que la secreción de Tir, EspF, EspG, EspH y Map codificados por el LEE era de tipo III (Tabla 2) .

Tabla 2. Efectores y efectores putativos secretados por el TTSS codificado por el LEE en C. rodentium.

Número Nombre MW pl Ubicación Homólogos en EHEC y otros de serie propuesto estimado estimado del gen agentes patógenos Tir, conservado en todos los Tir 68 5.0 LEE patógenos A/E EspG, conservado en todos los EspG 44 7.3 LEE patógenos A/E Map, conservado en todos los C1&C2 Map 23 9,0 LEE patógenos A/E EspF, conservado en todos los C3 EspF 31 11.0 LEE patógenos A/E EspH, conservado en todos los C5&C6 EspH 21 8.7 LEE patógenos A/E No en EHEC Z6024 en isla-O 71 7 NleA 54 5,8 LEE cerca del profago CP-933P EHEC Z4328 en isla-O 122, RorfE de REPEC asociado a LEE, y STMF1 de S. typhimurium. También tiene No en homología con Z0985 de isla 12 NleB 39 5.9 LEE 0 36 No en EHEC Z0986 en isla O 36 13 NleC 40 4.6 LEE cerca del profago CP-933K EHEC Z0990 en isla O 36, en la misma isla O que Z0985 y Z0986. También tiene similitudes con el efector No en HopPtoH de P. syringae pv. 14 NleD 28 7.1 LEE de tomate EHEC Z4329 en la misma isla O 122 que Z4328, RorfE de No en REPEC asociado a LEE, y 17 NleE 27 6,3 LEE ORF122 de S. flexneri EHEC Z6020, en la misma isla O 71 que Z6024. Algunas similitudes con proteínas No en hipotéticas en Yersinia pestis 19 NleF 24 4.7 LEE y Helicobacter pylori Secuencia peptídica identificada: QQENAPSS(I/L)QTR. No No en se hallaron homólogos en base 20 NleG 26 5.8 LEE de datos Además de los cinco efectores codificados por LEE, nosotros identificamos siete proteínas secretadas no codificadas por LEE que probablemente sean efectores . Estas proteínas secretadas codificadas fuera del LEE fueron por lo tanto designadas NleA (p54) , NleB, NleC, NleD, NleE, NleF y NleG (QQENAPSS(I/L)QTR; SEQ ID NO: 59) (significando: efectores no codificados por LEE) para distinguirlas de las proteínas secretadas o efectores codificados por LEE (Esp) (Tabla 2) . Entre las siete proteínas identificadas, sólo NleG resultó única para C. rodentium, y las otras 6 proteínas tienen homólogos altamente conservados en EHEC 0157 (Tabla 2) . Los homólogos de EHEC son codificados por genes agrupados en tres regiones discretas del genoma, y cada región codifica al ' menos para dos proteínas que muestran homología con las proteínas secretadas de C. rodentium (Tabla 2) . Los genes Z6024 y Z6020 que codifican para los homólogos de NleA y NleF están localizados en la isla O 71 de EHEC associados al profago CP-933P. En forma similar, los genes Z4328 y Z4329 que codifican los homólogos NleB y NleE están localizados en la isla O 122, y aquéllas que codifican para los homólogos NleC y NleD (Z0986 y Z0990) están en la isla O 36 (Tabla 2, Fig. 9) . Más aún, Z4328 (isla 0 122) tiene una fuerte homología con Z0985, un gen localizado junto a Z0986 en la isla 0 36. Los homólogos de los seis nuevos genes efectores de EHEC están presentes también, y organizados similarmente, en EPEC, cuyo genoma está siendo secuenciado (http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microbes/). Salvo Z6024, que mostró un 89% de identidad nucleotídica con un gen de EPEC, los otros 5 genes de EHEC mostraron una identidad superior al 95% respecto de sus homólogos en EPEC. Más aún, algunos de estos efectores también están altamente conservados en otras bacterias patogénicas. NleD/Z0990 tiene similitud con el efector tipo III HopPtoH de tomate P. syringae pv. (41, 42) . NleA/Z4329 tiene una homología significativa a RorfD de EPEC de conejo (REPEC) y el Orf212 de S. flexneri (8, 33) , mientras que NleB/Z4328 tiene una fuerte similitud con RorfE de REPEC y dos proteínas hipotéticas de S. typhimurium. Los genes para Z4328 y Z4329 están localizados en forma adyacente en EHEC, similarmente a la disposición de genes de rorfD y rorfE en REPEC (8) . Sin embargo, rorfD y rorfE están localizados junto al LEE en REPEC, mientras que sus contrapartes en EHEC residen en una región (isla O 122) distante del LEE. La isla O 122 de EHEC que porta a Z4328 y Z4329 también contiene genes que codifican para dos citotoxinas y para un homólogo de PagC, un importante factor de virulencia regulado por PhoP/PhoQ en S. entérica (3, 43) . Las tres islas 0 de EHEC que codifican para los nuevos efectores tienen un sesgo dinucleotídico y bajo contenido de GC%, sellos distintivos de los PAIs (9) . Además, están asociadas con un profago o bien flanqueadas por secuencias de inserción móviles, y no están presentes en el genoma de E. coli no patogénicas (3) , sugiriendo la transferencia horizontal de estos genes . Colectivamente, esto sugiere la importancia de estas islas y de los efectores de EHEC y Cí troJbacter recientemente identificados en cuanto a la virulencia . También indica que , al diferir entre sí , los agentes patógenos relacionados mantienen un conjunto sorprendentemente conservado de PAIs , a pesar de las diversas ubicaciones de los PAIs en el cromosoma bacteriano . EJEMPLO 4 Identificación de NleA Si bien la secreción de tipo III es considerada generalmente como dependiente del contacto (46) , las condiciones de cultivo definidas in vitro pueden inducir a EHEC a secretar efectores de tipo III en el medio extracelular durante el crecimiento en cultivo líquido (28, 51) . Los sobrenadantes de cultivo se prepararon a partir de EHEC de tipo silvestre (wt) y un mutante de secreción tipo III (escN-) , cultivado en condiciones inductoras de secreción de tipo III . El análisis de las proteínas secretadas por SDS-PAGE reveló una abundante proteína de alto peso molecular, común a las proteínas secretadas de las muestras tanto de tipo silvestre como escN-, y varias otras proteínas abundantes, exclusivas de la muestra de tipo silvestre (Figura 10A) . Las proteínas secretadas fueron separadas por electroforesis en gel bidimensional y las abundantes manchas separadas de proteínas fueron extraídas del gel y analizadas por espectroscopia de masa (Figura 10B, Tabla I) .

Tabla I La mancha #1, que estuve presente en los sobrenadantes tanto de los cultivos del tipo silvestre como en los de escN-, fue identificado como EspP, una proteína de EHEC codificada por un plásmido, que es secretada por un mecanismo autotransportador que es independiente de la secreción de tipo III (25) . Cuatro manchas principales (#2, 3, 4, 5) fueron exclusivas de los sobrenadantes del tipo silvestre. Tres de estas manchas se identificaron como proteínas secretadas de tipo III ya conocidas, codificadas dentro del LEE: Ti (mancha #2), EspB (mancha #4) y EspA (mancha #5) (Figura 10B, Tabla I) . La mancha #3 fue identificada como una proteína con un peso molecular esperado de 48 kDa, codificada por una marco de lectura abierto, dentro del genoma de EHEC pero fuera del LEE (Figura 10C) .

Hemos denominado a esta proteína NleA (efector A no codificado por LEE) . EJEMPLO 5 Caracterización del locus que contiene a nleA El gen nleA es codificado en una isla O: una región del genoma de EHEC que está ausente del genoma de la cepa no patogénica K-12 (3) de E. coli. La región entre el último gen conservado en la espina dorsal de E. coli K12 (YciE) y los genes que codifican las proteínas estructurales de fago contenían varios fragmentos putativos de transposasa y un fragmento putativo específico de sitio, de recombinasa (Figura HA) . El análisis de esta región con Islandpath, un programa diseñado para identificar PAIs (13) , reveló que todos las ORFs dentro de esta región tienen un sesgo dinucleotídico y un contenido de GC divergente respecto de la media del genoma de EHEC. 10 ORFs dentro de la región tienen un contenido de GC al menos 1 desviación estándar por debajo de la media del genoma de EHEC, mientras que 2 de las 6 ORFs tienen un contenido de GC al menos 1 desviación estándar más alto que la media del genoma de EHEC. En conjunto, estos resultados sugieren que nleA está localizado en un PAI que contiene genes horizontalmente transferidos. Varios otros ORFs dentro de esta región tienen características que sugieren roles en la virulencia, incluyendo un acompañante putativo (Z2565) y dos proteínas con similitud a las proteínas secretadas de tipo III de otros agentes patógenos (Z6021, Z6020) , Para investigar más en profundidad la naturaleza y distribución del gen nleA, se preparó una sonda nleA y se realizó un análisis de transferencia de Western sobre un panel de ADN genómico de otros patógenos A/E y de otra cepa de E. coli no patogénica. Como se muestra en la Figura 11B, el gen nleA estuvo presente en todos los patógenos A/E examinados, pero ausente en E. coli no patogénicas. El análisis de la secuencia genómica "en progreso" de EPEC reveló que nleA está presente en forma muy próxima a un sitio de inserción de fago en el genoma de EPEC. nleA también está presente dentro de un profago de una cepa intimina-positiva no-0157 de EHEC, 084 :H4, pero ausente en cepas no patogénicas de E. coli, E. coli uropatogénica, la cual no contiene el LEE. nleA también está ausente en otros patógenos que contienen TTSS, tales como especies de Salmonella y Shigella . Por lo tanto, nleA parece haber sido específicamente adquirido o retenido en los agentes patógenos A/E. El alineamiento secuencial múltiple de las secuencias del gen nleA de C. rodentium, EPEC, EHEC y 084 :H4 revela un alto grado de conservación de secuencias en estos cuatro patógenos A/E (Figura 11C) .

EJEMPLO 6 NleA es secretada por el sistema de secreción de tipo III codificado por el LEE Los efectores del TTSS codificado por LEE en EHEC y EPEC descritos hasta hoy son codificados dentro del LEE, en forma muy próxima a los genes que codifican para el propio aparato de secreción. Para determinar si la secreción de NleA era dependiente del TTSS codificado por LEE, una versión de NleA marcada con un epitopo fue expresada a partir de un plásmido en EHEC de tipo silvestre y una cepa escN-, la cual es deficiente para la secreción de tipo III (47) . Como se muestra en la Figura 12A, si bien la NleA marcada con HA fue expresada a niveles similares en EHEC de tipo silvestre y escN- , la proteína sólo fue secretada hacia el medio extracelular por las bacterias de tipo silvestre transformadas para NleA y HA. DnaK, una proteína bacteriana no secretada, fue usada como control para la ausencia de proteínas no secretadas en las muestras de proteína secretada (Figura 12B) . Tir fue secretada en las cepas de tipo silvestre no transformadas y transformadas para NleA-HA, pero no fue secretada por las cepas escN- (Figura 12C) , verificando los fenotipos TTSS esperados. Similares resultados se obtuvieron para la expresión de la NleA marcada con epitopo en EPEC de tipo silvestre y varios mutantes de EPEC para la secreción de tipo III, indicando que la NleA también puede ser secretada por el TRSS de EPEC. EJEMPLO 7 NleA es translocada hacia las células hospedadoras Cuando se cultiva EHEC en condiciones inductoras de secreción de tipo III, son secretados dos tipos de proteínas hacia el medio extracelular. Para determinar si NleA era un efector translocador o translocado, se investigó la translocación y la secreción de tipo III en ausencia de NleA mediante la generación de una cepa mutante por supresión. Se analizaron los perfiles de proteínas secretadas de EHEC de tipo silvestre y mutantes ?nleA. Las muestras del tipo silvestre contenían una abundante proteína de aproximadamente 50 kDa que estaba ausente en las proteínas secretadas por ?nleA (Figura 13A) . El análisis de transferencia de Western con antisueros dirigidos contra NleA demostró que NleA de 50 kDa estaba presente en las proteínas secretadas por el tipo silvestre, y ausente en la muestra de ?nleA (Figura 13B) . Sin embargo, además de la presencia o ausencia de NleA, los perfiles de las proteínas secretadas de las cepas de tipo silvestre y ?nleA eran idénticos (Figura 13A) . Por lo tanto, NleA no es necesaria para la secreción de otros efectores secretados de tipo III . Para determinar si NleA es necesaria para la translocación de otros efectores de tipo III hacia la célula hospedadora, se infectaron células HeLa con EHEC de tipo silvestre y EHEC ?nleA, y se monitorizó la translocación y la función de Tir mediante la tinción inmunofluorescente de las células infectadas . Se examinó la formación de pedestal por EHEC de tipo silvestre y mutantes ?nleA sometiendo las células infectadas a inmunofluorescencia con anticuerpos anti-EHEC y anti-Tir, y visualizando la actina filamentosa con faloidina. Los resultados indicaron que la EHEC ?nleA se adhería a las células HeLa a niveles similares EHEC de tipo silvestre . La tinción inmunofluorescente reveló que Tir era translocado hacia las células hospedadoras y enfocado bajo las bacterias infecciosas tanto en las cepas EHEC de tipo silvestre como en las ?nleA. Para confirmar la translocación funcional de Tir, las células infectadas fueron teñidas con faloidina fluorescente para visualizar la actina polimerizada involucrada en la formación del pedestal debajo de las bacterias adheridas. Los pedestales de actina eran evidentes en células infectadas tanto con EHEC de tipo silvestre como ?nleA, indicando que la translocación y función de otros efectores de tipo III pueden operar en ausencia de NleA. Estos resultados también indican que NleA no es necesaria para la formación del pedestal . Dado que NleA no parecía jugar un papel en la secreción o translocación de otros efectores, investigamos si la propia NleA era translocada. Se infectaron células HeLa durante 6 horas con EHEC de tipo silvestre o escN- que expresara NleA marcada con HA y se sometieron a fraccionamiento subcelular y análisis de transferencia de Western con un anticuerpo anti-HA. Como se indica en la Figura 14A, NleA es translocada hacia las céluas hospedadoras donde se asocia con la fracción de membrana de la célula hospedadora. No se observa translocación de NleA durante la infección de células con un mutante de secreción de tipo III que expresa NleA marcado con HA, indicando que la translocación de NleA y la asociación a la membrana del hospedador es dependiente de TTSS . El análisis de transferencia de Western de las fracciones con anticuerpos para proteínas específicas a cada fracción confirmó la ausencia de contaminación cruzada de las fracciones . La calnexina, una proteína integral de la membrana de la célula hospedadora, estaba ausente en la fracción citoplasmática del hospedador, y la tubulina, una proteína citoplasmática de la célula hospedadora, estaba ausente en la fracción de membrana del hospedador. DnaK, una proteína bacteriana no secretada, estaba presente sólo en la pella de baja velocidad, demostrando la ausencia de contaminación bacteriana de la membrana y fracciones citosólicas del hospedador. NleA y DnaK estaban ausentes en la pella de baja velocidad de las células infectadas con mutante de tipo III debido a la dependencia de tipo III de la adherencia de EHEC. Para descartar que la ausencia de NleA en las muestras infectadas por el mutante de tipo III pudiera deberse a un artefacto debido a la dependencia de tipo III de la adherencia de EHEC, también se llevarons a cabo experimentos similares expresando y liberando NleA-HA por EPEC de tipo silvestre y mutante de tipo III, ya que la adherencia de EPEC a las células HeLa es independiente de la secreción de tipo III. NleA estaba presente en la fracción de membrana de las células infectadas con cepas de EPEC de tipo silvestre, pero no con mutantes de tipo III. Tanto NleA como DnaK estaban presentes en las fracciones de pellas de baja velocidad tanto en las células infectadas con EPEC de tipo silvestre como en aquéllas infectadas por EPEC mutantes de tipo III. Para investigar la naturaleza de la asociación de NleA con las membranas de las células hospedadoras, las fracciones de membranas de células hospedadoras infectadas que contienen NleA marcada con HA, fueron extraídas sobre hielo en diversas condiciones y recentrifugadas para obtener fracciones de membrana solubles e insolubles (Figura 14B) . Estas fracciones fueron sometidas a un análisis de transferencia de Western con anticuerpo anti-HA para detectar NleA marcado con HA. El tratamiento con alta salinidad (NaCl ÍM) o pH alcalino (Na2C03 0.2M, pH 11.4) elimina las proteínas que están asociadas periféricamente con membranas a través de interacciones electrostáticas o hidrofílicas, respectivamente. La asociación de NleA con las membranas de células hospedadoras resistieron la disrupción con estos tratamientos (Figura 14B, panel superior) , tal como lo hizo la calnexina, una proteína integral de membrana (Figura 14B, panel medio) . En contraste con esto, una proporción significativa de calreticulina, una proteína periférica de membrana, fue extraída de la fracción de membrana tanto durante el tratamiento con alta salinidad como con pH alcalino (Figura 14B, panel inferior) . El tratamiento de las fracciones de membrana con el detergente no-iónico Tritón X-100, el cual solubiliza las proteínas integrales de membrana tales como la calnexina (Figura 14B, panel medio) , NleA casi completamente solubilizado, dando como resultado un desplazamiento de la proteína NleA marcada con HA desde la fracción insoluble hacia la soluble (Figura 14B, panel superior) . Estos resultados indican que NleA es translocada hacia las células hospedadoras, donde se comporta como una proteína integral de membrana. Efectivamente, el análisis secuencial de la proteína NleA mediante varios programas predictivos para dominios de transmembrana predice uno o dos dominios putativos de transmembrana dentro de la secuencia (Figura 11C) . EJEMPLO 8 NleA se localiza en el aparato de Golgi del hospedador A continuación se determinó la localización subcelular de NleA dentro de la célula hospedadora. Las células HeLa fueron infectadas con EHEC de tipo silvestre o EHEC ?nleA, y sometidas a inmunofluorescencia con anticuerpos dirigidos contra NleA y manosidasa II . Algunas muestras fueron tratadas con brefeldina A durante 30 minutos antes de la fijación. Se aplicaron dos capas de color a las tinciones de NleA y manosidasa II. Las células HeLa fueron transfectadas con una construcción de expresión que codifica para una proteína de fusión GFP-NleA, y sometidas a inmunofluorescencia con un anticuerpo dirigido contra la manosidasa II. La tinción inmunofluorescente de las células HeLa infectadas con EHEC de tipo silvestre, usando un anticuerpo anti-NleA, dio como resultado un patrón de tinción perinuclear que estaba ausente en células infectadas con EHEC ?nleA, o células no infectadas. Este patrón no se asemejaba a la tinción obtenida con marcadores para endosomas tardíos, lisosomas, RE, mitocondrias o núcleo. Sin embargo, se observó un patrón de tinción muy similar cuando las células fueron co-teñidas con anti-NleA y anticuerpos a los marcadores del aparato de Golgi, incluyendo a la manosidasa II, donde las dos proteínas se colocalizaban extensivamente. Para confirmar la localización de la NleA en Golgi, las células infectadas se incubaron con brefeldina A, un metabolito fúngico que destruye la estructura del Golgi (27) , antes de la fijación y la inmunofluorescencia. El tratamiento con brefeldina A provocó la difusión de la tinción de la manosidasa II y la NleA, como se esperaba para proteínas localizadas en Golgi. La colocalización de NleA se observó con varios otros marcadores del aparato de Golgi, y también se observó la localización de Golgi en experimentos para examinar NleA marcada con epitopo y teñida con anticuerpos anti-marca, utilizando tanto marcas epitópicas para HA como para FLAG. Para determinar si la localización de NleA en Golgi requería otros factores bacterianos o si era una propiedad inherente de NleA, las células fueron transfectadas con una construcción de expresión que codificaba una proteína de fusión GFP-NleA. La NleA GFP transfectada también se localizó en el Golgi, donde se superponía con la tinción de la manosidasa II. De este modo, nuestros resultados indican que NleA se localiza en el aparato de Golgi. La observación de que una proteína de fusión NleA-GFP transfectada se localiza en el aparato de Golgi sugiere que la proteína NleA contiene información que la dirige a Golgi, y que no requiere otros factores bacterianos para llegar a este destino. La NleA liberada por bacterias también se localiza en el aparato de Golgi . EJEMPLO 9 NleA es necesario para la virulencia El alto nivel de conservación de secuencia de NleA en agentes patógenos A/E (Figura 11C) sugiere que NleA cumple un papel similar en la infección. C. Rodentium es un agente patógeno natural de ratones (53) , y ha sido usado como un sistema modelo para estudiar la patogénesis A/E. En cepas susceptibles, la infección por C. Rodentium es fatal y típicamente provoca la muerte de los ratones infectados entre los días 6-10 de infección (54) . Las cepas de ratón más resistentes no mueren a causa de la infección por C. Rodentium, pero son colonizadas y desarrollan inflamación intestinal e hiperplasia colónica (54) . Para probar el papel de NleA en la virulencia, hemos creado una cepa de C. Rodentium con supresión en nleA y verificado la ausencia de NleA mediante análisis de transferencia de Western del total de los extractos bacterianos con el antisuero NleA (Figura 16A) , Los ratones fueron infectados con igual cantidad de bacterias de tipo silvestre ó ?nleA por sonda oral . En ratones C3H-HeJ susceptibles a C. Rodentium, NleA fue absolutamente necesario para la virulencia. Todos los ratones C3H-HeJ infectados con C. Rodentium de tipo silvestre murieron entre los días 6-10 de la infección (n=9) , mientras que todos los ratones infectados con ?nleA (n=13) demostraron algunos síntomas de enfermedad leve tal como heces blandas, pero igualmente subieron de peso y estuvieron activos durante la infección y sobrevivieron indefinidamente (Figura 16B) . Además, los ratones infectados con ?nleA fueron resistentes a sometimientos posteriores a C. Rodentium silvestre (n=5, figura 16B) . Por lo tanto, mientras la cepa ?nleA no es patogénica en los ratones susceptibles, interactúa en forma suficiente con el hospedador para estimular la inmunidad protectora. En oposición a los ratones C3H/HeJ, la infección por C. Rodentium no es letal para los ratones NIH Swiss de cruza. En estos ratones, la colonización del intestino grueso por C. rodentium produce inflamación intestinal, hiperplasia colónica y leves síntomas de diarrea. Los ratones NIH Swiss fueron infectados con C. Rodentium silvestre o la cepa ?nleA y sacrificados el día 10 después de la infección. Los ratones infectados con la cepa ?nleA tuvieron, en promedio, una titulación de C. Rodentium 20 veces menor en el colon en el día 10 (figura 16C) . El análisis histológico del colon de los ratones NIH infectados se realizó infectando ratones con C. Rodentium silvestre o la cepa ?nleA y sacrificándolos el día 10 después de la infección. Los últimos 0.5 cm del colon de los ratones infectados fue fijado en formalina con amortiguador neutro al 10%, procesado, cortado en secciones de 3 µm y teñido con hematoxilina y eosina. Las secciones de tejido fueron observadas y fotografiadas usando objetivos de 5X y 63X. Los resultados indicaron que, en los análisis histológicos de las biopsias tomadas del borde anal de los ratones infectados, se encontraron numerosas bacterias en el tejido infectado con el tipo silvestre, pero las bacterias eran pocas en las muestras infectadas con ?nleA. Todos los animales infectados con C. rodentium de tipo silvestre demostraron signos patológicos de hiperplasia colónica, mientras que todos los ratones infectados con ?nleA no tenían signos de hiperplasia. Las muestras infectadas con el tipo silvestre mostraron inflamación severa e hiperplasia hasta el punto en que el lumen intestinal ya no era evidente y la capa de músculo exterior estaba visiblemente distendida para acomodar el gran volumen de epitelio. En contraste, las muestras infectadas con ?nleA mostraron histología relativamente normal . El grado relativo de inflamación e hiperplasia intestinal también fue evidente en la diferencia en el peso del colon al momento del sacrificio en los dos grupos de ratones (Figura 16D) . Los ratones infectados con el tipo silvestre también tenían bazos más grandes que los ratones infectados con ?nleA tal como se refleja en los pesos esplénicos (Figura 16D) . De este modo, hemos demostrado un efecto sorprendente de NleA sobre la virulencia en un modelo de enfermedad en ratones. En el ratón susceptible, la presencia de NleA funcional en C. Rodentium produce una infección letal en 10 días. Los ratones infectados con una cepa sin NleA tuvieron pocos síntomas y sobrevivieron a la infección. En una cepa de ratones más resistentes , en los que la infección por C. Rodentium no es letal , NleA es necesario para el desarrollo de la hiperplasia colónica, y a los 10 días de infección, se hallan menos bacterias mutantes de NleA presentes en el intestino hospedador. Estos estudios indican un efecto claro de NleA en la virulencia de C. Rcdentium. Los presentes resultados de la infección por EHEC de células HeLa demuestran que in vi tro, NleA no afectará la adherencia de las bacterias a las células hospedadoras o translocación de otros efectores, lo que sugiere que NleA puede actuar al nivel de resistir la evacuación por el hospedador en lugar de mejorar la adherencia bacteriana. Además, la resistencia de los ratones infectados con ?nleA a posteriores infecciones por C. Rodentium de tipo silvestre provee evidencia de que una cepa mutante de Nle coloniza e interactúa con el hospedador en forma suficiente para estimular la inmunidad del hospedador . Esto está en oposición a mutantes tipo III de C. Rodentium que no colonizan el hospedador y no proveen protección para futuras infecciones . Por lo tanto, las cepas mutantes de NleA pueden ser usadas como una cepa de vacuna atenuada . REFERENCIAS Las siguientes publicaciones son incorporadas por referencia . 1. Nataro, J. P . y Kaper J. B . (1998) , Diarrheagenic Escherichia coli . Clin Microbiol Rev 11 : 142-201. 2 . Frankel G. , Phillips A. D . , Rosenshine I . , Dougan G., Kaper J. B., y Knutton S. (1998), Enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli: more subversive elements. Mol Microbiol 30: 911-921. 3. Perna N. T., Plunkett G., 3rd. Burland V., Mau B., Glasner J. D. , Rose D. J. , Mayhew, G. F., Evans P. S., Gregor J. , Kirkpatrick H. 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Tales modificaciones incluyen la sustitución de los equivalentes conocidos para cualquier aspecto de la invención a fin de lograr el mismo resultado esencialmente de la misma manera. Los números de acceso, tal como se usan aquí, se refieren a los números de acceso de las bases de datos múltiples, incluso GenBank, el European Molecular Biology Laboratory (Laboratorio de biología molecular europeo) (EMBL) , la ADN Datábase of Japan (Base de datos de ADN de Japón) (DDBJ) , o la Genome Seqúense Datábase (Base de datos de secuencias de genomas) (GSDB) , para secuencias nucleotídicas, e incluso Protein Information Resource (Fuente de información de proteínas) (PIR) , Swissprot, Protein Research Foundation (Fundación de Investigaciones sobre proteínas) (PRF) y Protein Data Bank (PDB) (secuencias de estructuras resueltas) , así como las traducciones de las regiones codificadas anotadas de las secuencias nucleotídicas en GenBank, EmBL, DDBJ o RefSEq, para secuencias de polipéptidos . Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. En la memoria descriptiva, la palabra "que comprende" se usa como un término abierto, sustancialmente equivalente a la frase "que incluye pero no se limita a" y la palabra "que comprende" tiene un significado correspondiente. Las citas de referencias en la presente no deberán entenderse como un reconocimiento de tales referencias como técnica previa a la presente invención. Todas las publicaciones son incorporadas a la presente por referencia como si cada publicación individual fuera indicada en forma específica e individual como incorporada a la presente por referencia. La invención incluye todas las modalidades y variaciones sustancialmente como se describe aquí y con referencia a los ejemplos y figuras . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una composición, caracterizada porque comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de las SEQ ID Nos. 22-43, 59 ó 73-84; o un fragmento o variante de ellos, en combinación con un portador fisiológicamente aceptable. 2. Una composición, caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico codificadora de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de las SEQ. ID Nos. 22-43, 59 ó 73-84, o un fragmento o variante de las mismas, en combinación con un portador fisiológicamente aceptable.
3. Una composición, caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a la secuencia de las SEQ. ID Nos. 1-21 ó 60-72 o un fragmento o variante de las mismas, en combinación con un portador fisiológicamente aceptable .
4. Una composición, caracterizada porque comprende un sobrenadante de cultivo celular que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de las SEQ. ID Nos. 22-43, 59 ó 73-84, o un fragmento o variante de las mismas, en combinación con un portador fisiológicamente aceptable.
5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el polipéptido comprende 20% de la proteína celular presente en la composición.
6. La composición de conformidad con la cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada además porque comprende EspA, EspB, EspD, EspP, Tir, toxina Shiga 1, toxina Shiga 2 o polipéptido de intimina.
7. La composición de conformidad con la cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada además porque comprende un adyuvante .
8. Una bacteria o una preparación de la misma, caracterizada porque la bacteria comprende una mutación en el genoma bacteriano en una secuencia nucleotídica que es sustancialmente idéntica a las SEQ. ID Nos. 1-21 ó 60-72.
9. Una bacteria o una preparación de la misma, caracterizada porque la bacteria comprende una mutación en un gen sustancialmente idéntico a nleA, nleB, nleC, nleD, nleE, nleF, nleG, ó nleH o un homólogo de los mismos.
10. La bacteria de conformidad con la cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, caracterizada porque la bacteria es un agente patógeno A/E.
11. La bacteria de conformidad con la cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizada porque la bacteria es E. Coli enterohemorrágica (EHEC) , E. Coli enteropatogénica (EPEC) ó Citrobacter rodentium.
12. La bacteria de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la EHEC es EHEC 0157 :H7 ó EHEC 0157 :NM.
13. La bacteria de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la EPEC es EPEC 0127 :H6.
14. La bacteria de conformidad con la cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, caracterizada porque la mutación atenúa la virulencia.
15. Una composición, caracterizada porque comprende la bacteria de conformidad con la cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14 , en combinación con un portador fisiológicamente aceptable.
16. La composición de conformidad con la reivindicación 15 caracterizada porque la bacteria está viva.
17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la bacteria es administrada por vía oral.
18. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la bacteria está muerta.
19. La composición de conformidad con la reivindicación 18 caracterizada porque la bacteria es administrada por vía parenteral .
20. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizada además porque comprende un adyuvante .
21. La composición de conformidad con las reivindicaciones 7 ó 20, caracterizada porque el adyuvante es una emulsión de aceite en agua o una emulsión de no-aceite en agua.
22. La composición de conformidad con las reivindicaciones 7 ó 20, caracterizada porque el adyuvante comprende un aceite mineral y bromuro de dimetildioctadecilamonio .
23. La composición de conformidad con las reivindicaciones 7 ó 20, caracterizada porque el adyuvante comprende uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en: un agente emulsificante, un dipéptido de muramilo, un agente acuoso, un agente a base de quitosano, una saponina, un aceite, un lipopolisacárido, un extracto de pared de célula bacteriana, un ADN bacteriano, un complejo bacteriano, un oligonucleótido sintético y una base nitrogenada alifática.
24. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el agente emulsionante es seleccionado del grupo que consiste en uno o más de un agente emulsificante natural, un agente emulsificante sintético, un agente emulsificante aniónico, un agente emulsificante catiónico y un agente no iónico.
25. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el agente emulsificante natural es seleccionado del grupo que consiste en uno o más de acacia, gelatina, lecitina y colesterol.
26. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el agente emulsificante aniónico es seleccionado de uno o más del grupo que consiste en una sal de potasio de ácido láurico, una sal de potasio de ácido oleico, una sal de sodio de ácido láurico, una sal de sodio de ácido oleico, una sal de amonio de ácido láurico, una sal de amonio de ácido oleico, una sal de calcio de un ácido graso, una sal de magnesio de un ácido graso, una sal de aluminio de un ácido graso, un jabón metálico y un sulfonato orgánico.
27. La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el sulfonato orgánico es laurilsulfato de sodio.
28. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el agente emulsificante catiónico es bromuro de cetiltrimetilamonio.
29. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el agente emulsificante sintético es seleccionado del grupo que consiste en uno o más de éster de glicerilo, éster de polioxietilenglicol, éter de polioxietilenglicol y éster de ácido graso de sorbitán.
30. La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque el éster de glicerilo es monoestearato de glicerilo.
31. La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque el éster de ácido graso de sorbitán es seleccionado de uno o más del grupo que consiste en monopalmitato de sorbitán y un derivado de polioxietileno del mismo.
32. La composición de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el derivado de polioxietileno es monopalmitato de sorbitán polioxietilenado.
33. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el agente acuoso es hidróxido de aluminio .
34. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el aceite es seleccionado del grupo que consiste en uno o más de un aceite mineral, un aceite vegetal o un aceite animal.
35. La composición de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el aceite vegetal es seleccionado del grupo que consiste en uno o más de aceite de cañóla, aceite de almendra, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de cacahuate, aceite de cártamo, aceite de ajonjolí y aceite de soya.
36. La composición de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el aceite animal es seleccionado del grupo que consiste en uno o más de aceite de hígado de bacalao, aceite de hipogloso, aceite de lacha, aceite de "reloj anaranjado" y aceite de hígado de tiburón.
37. La composición de conformidad con las reivindicaciones 7 ó 20, caracterizada porque el adyuvante comprende un componente de aceite .
38. La composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el componente de aceite es seleccionado del grupo que consiste en uno o más de un aceite único y una mezcla de aceites .
39. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la emulsión sin aceite en agua es seleccionada del grupo que consiste en uno o más de una emulsión de aceite, una emulsión de agua en aceite y una emulsión de agua en aceite en agua.
40. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la emulsión de aceite en agua es EMULSIGEN ™ ó EMULSIGEN PLUS™.
41. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el aceite es Amphigen® .
42. La composición de conformidad con la reivindicación 7 ó 20, caracterizada porque el adyuvante comprende un extracto de pared celular micobacteriana.
43. La composición de conformidad con la reivindicación 7 ó 20, caracterizada porque el adyuvante comprende un 7ADN micobacteriano.
44. La composición de conformidad con la reivindicación 7 ó 20, caracterizada porque el adyuvante comprende un complejo de pared de célula micobacteriana.
45. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la base nitrogenada alifática se selecciona del grupo que consiste en uno o más de una amina, un compuesto de amonio cuaternario, una guanidina, una benza idina y un tiouronio.
46. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la base nitrogenada alifática es N,N-dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil) propanodiamina .
47. La composición de conformidad con la reivindicación 7 ó 20, caracterizada porque el adyuvante comprende bromuro de dimetil-dioctadecilamonio.
48. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 47, caracterizada porque el adyuvante está presente en una composición a una concentración de entre 20% y 40% (v/v) .
49. Un método para detectar la presencia de un agente patógeno A/E en una muestra, caracterizado porque el método comprende : a) proporcionar una muestra; y b) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a una secuencia seleccionada de uno o más del grupo que consiste en las SEQ. ID Nos. 1-21 ó 60-72 o un fragmento o una variante de las mismas. c) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido sustancialmente idéntico a una secuencia seleccionada de uno o más del grupo que consiste en las SEQ. ID Nos. 22-43, 59, 73-84 o un fragmento o una variante de las mismas; d) detectar la presencia de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia seleccionada de uno o más del grupo que consiste en las SEQ. ID Nos. 22-43, 59, 73-84 o un fragmento o una variante de las mismas; en donde la presencia de una molécula de ácido nucleico o el polipéptido indica la presencia de un agente patógeno A/E en la muestra.
50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la muestra es materia fecal o sangre .
51. El método de conformidad con la reivindicación 49 ó 50, caracterizado porque el paso de detectar comprende poner en contacto la secuencia nucleotídica con una sonda o cebador sustancialmente idénticos a: a) una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en una o más de las SEQ: ID Nos. 1-21 ó 60-72 o un fragmento o una variante de las mismas, o b) una secuencia nucleotídica codificadora de un polipéptido sustancialmente idéntico a una o más de las SEQ. ID Nos. 22-43, 59, 73-84 o un fragmento o una variante de las mismas.
52. El método de las reivindicaciones 49 ó 50, caracterizado porque la detección comprende poner en contacto la secuencia de aminoácido con un anticuerpo que une específicamente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una o más de las SEQ ID Nos: 22-43, 59, 73-84 o un fragmento o una variante de las mismas.
53. Un método para producir una respuesta inmune contra un agente patógeno A/E, o un componente del mismo, en un animal, caracterizado porque el método comprende administrar al animal una cantidad efectiva de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 ó 15-48, o que comprende administrar al animal una cantidad efectiva de la bacteria de cualquiera de las reivindicaciones 8-14, produciendo así una respuesta inmune en el animal .
54. Un método para reducir la colonización de un agente patógeno A/E en un animal, caracterizado porque el método comprende administrar al animal una cantidad efectiva de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 ó 15-48 o que comprende administrar al animal una cantidad efectiva de la bacteria de cualquiera de las reivindicaciones 8-14, reduciendo así la colonización del agente patógeno A/E en el animal .
55. Un método para reducir la propagación de un agente patógeno A/E en un animal, caracterizado porque comprende administrar al animal una cantidad efectiva de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 ó 15-48, o que comprende administrar al animal una cantidad efectiva de la bacteria de cualquiera de las reivindicaciones 8-14, reduciendo así la propagación del agente patógeno A/E en el animal .
56. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 53 a 55, caracterizado porque el animal es un rumiante .
57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el rumiante es un bovino o un ovino.
58. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 53 a 55, caracterizado porque el animal es un ser humano .
59. Un método para tratar o prevenir la infección causada por un agente patógeno A/E, caracterizado porque el método comprende : a) identificar un animal que presenta, o que está en riesgo de contraer una infección por agente patógeno A/E; y b) administrar al animal una cantidad efectiva de un compuesto que atenúa la virulencia de un agente patógeno A/E, en donde el compuesto inhibe la expresión, secreción o actividad biológica de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ. ID. Nos: 22-43, 59, 73-84.
60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el compuesto es una molécula de ácido nucleico antisentido que es complementaria de una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ. ID Nos. 1-21, 59, 73-84.
61. El método de la reivindicación 59, caracterizado porque el compuesto es un ARNsi.
62. Un método para atenuar la virulencia de un agente patógeno A/E, caracterizado porque el método comprende mutar uno o más de un gen seleccionado del grupo que consiste en nleA, nleB, nleC, nleD, nleE, nleF, nleG y nleH, o un homólogo de los mismos en el agente patógeno A/E, o mutar una o más de una secuencia nucleotídica en el genoma del agente patógeno A/E, en donde la secuencia nucleotídica es seleccionada de las SEQ. ID. Nos. 1-21 ó 60-72, atenuando así la virulencia.
63. Un método para seleccionar un compuesto que atenúa la virulencia del agente patógeno A/E, caracterizado porque el método comprende : a) proporcionar un sistema que comprende: (i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a las SEQ. ID Nos: 1-21 ó 60-72 o un fragmento o una variante de las mismas; ó (ii) una molécula de ácido nucleico codificadora de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a las SEQ. ID Nos. 22-43, 59, 73-84 o un fragmento o una variante de las mismas; ó (iii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a las SEQ. ID. Nos. 22-43, 59, 73-84 o un fragmento o una variante de las mismas; b) proporcionar un compuesto de prueba; y c) determinar si el compuesto de prueba modula la expresión, secreción o actividad biológica del polipéptido o la molécula de ácido nucleico, en donde un cambio en la expresión, secreción o actividad biológica del polipéptido o la molécula de ácido nucleico indica un compuesto que atenúa la virulencia de un agente patógeno A/E.
64. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el sistema es una célula.
65. El método de conformidad con la reivindicación 63 ó 64, caracterizado porque la célula es E. Coli enterohemorrágica (EHEC) , E. Coli enteropatogénica (EPEC) o Citrobacter rodentium.
66. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el sistema es un sistema in vitro.
67. Un método para producir un polipéptido de agente patógeno A/E, caracterizado porque comprende: a) proporcionar una célula recombinante que comprende -. (i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a las SEQ. ID. Nos. 1-21 ó 60-72; ó (ii) una molécula de ácido nucleico codificadora de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido sustancialmente idéntica a las SEQ. ID. Nos. 22-43, 59 ó 73- 84; y b) cultivar la célula recombinante en condiciones que permitan la expresión del polipéptido.
68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado además porque comprende cultivar la célula recombinante en condiciones que permitan la secreción del polipéptido.
69. El método de conformidad con la reivindicación 67 ó 68, caracterizado porque el polipéptido se secreta desde la célula.
70. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67 a 69, caracterizado además porque comprende aislar el polipéptido.
71. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 70, caracterizado porque el agente patógeno A/E es E. Coli enterohemorrágica (EHEC) , E. Coli enteropatogénica (EPEC) ó Citrobacter rodentium.
72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la EHEC es EHEC 0157 :H7 ó EHEC 0157 :NM.
73. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la EPEC es EPEC 0127:H6.
74. Un polipéptido recombinante, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de las SEQ. ID Nos. 22-43, 59 ó 73- 84.
75. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a la secuencia de las SEQ. ID Nos. 1-21 ó 60-72.
76. Un vector, caracterizado porque comprende la secuencia nucleotídica de conformidad con la reivindicación 75.
77. El vector de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque el vector es capaz de integrarse al genoma del agente patógeno A/E.
78. El vector de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque el vector es incapaz de integrarse al genoma del agente patógeno A/E.
79. Una célula hospedadora, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 76 a 78.
80. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque la célula hospedadora es un agente patógeno A/E.
81. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada porque el agente patógeno A/E es E. Coli enterohemorrágica (EHEC) , E. Coli enteropatogénica (EPEC) o Citrobacter rodentium.
82. El uso de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 ó 15-48, la bacteria de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-14, el polipéptido de la reivindicación 74, o la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 75, para la preparación de un medicamento para producir una respuesta inmune contra un agente patógeno A/E, o un componente del mismo, o para reducir la propagación o la colonización de un agente patógeno A/E en un animal, o para tratar o prevenir la infección causada por un agente patógeno A/E.
83. Un equipo, caracterizado porque comprende un reactivo para detectar un agente patógeno A/E en una muestra y un prospecto con instrucciones para detectar el agente patógeno A/E en la muestra.
84. El equipo de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el reactivo comprende una sonda o una sonda iniciadora o un iniciador sustancialmente idéntico a: a) una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en una o más de las SEQ. ID No. 1-21 ó 60- 72 o un fragmento o una variante de las mismas; b) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido sustancialmente idéntico a una o más de las SEQ. ID Nos. 22-43, 59, 73-84 o un fragmento o una variante de las mismas.
85. El equipo de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el reactivo comprende un anticuerpo que une específicamente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una o más de las SEQ. ID No. 22-43, 59, 73-84 o un fragmento o una variante de las mismas .