WO2010125816A1 - ２種類以上の外来性の機能性ｒｎａを保持するトランスジェニック動物 - Google Patents

２種類以上の外来性の機能性ｒｎａを保持するトランスジェニック動物 Download PDF

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WO2010125816A1
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virus
transgenic animal
cells
functional rna
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渡邉裕幸
桝谷真貴
京極健司
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株式会社カネカ
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    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a transgenic animal that retains two or more kinds of exogenous functional RNA in a cell and has resistance to a pathogen.
  • Livestock is an important industrial animal for human life, but some infectious diseases transmitted by livestock can cause serious damage to livestock and humans.
  • influenza viruses are pathogens that infect not only birds but also humans and livestock and cause serious infections. Mankind has been developing anti-influenza drugs and vaccines against such influenza viruses. However, preventive measures against the unknown new influenza virus that continues to evolve are still not sufficient. Influenza viruses are known to mutate due to repeated infection between birds, between birds and other animal species, or between birds and humans, and therapeutic drugs and vaccines may not be effective. is there.
  • Non-Patent Document 1 RNA interference, RNAi
  • Patent Document 2 RNA interference, RNAi
  • Patent Document 3 the production of chickens introduced with shRNA (short hairpin RNA) that suppresses the growth of avian influenza virus was examined (Patent Document 3), but in this case as well, resistance when pathogens are mutated There is a problem of sexuality.
  • the inventors have solved the above problems by producing a transgenic animal that retains two or more types of exogenous functional RNA in the cell. Specifically, taking poultry as an example, a chicken expressing a plurality of exogenous functional RNAs was produced, and the present invention was achieved.
  • the present invention is as follows.
  • the functional RNA is one or more polynucleotides (RNA) selected from shRNA, miRNA, ribozyme, siRNA and aptamer.
  • the functional RNA is RNA composed of a base sequence having 50% or more sequence identity with a complementary strand of a partial base sequence of a pathogen genome, described in (1) or (2) Transgenic animals.
  • a transgenic animal having excellent resistance to a pathogen can be produced, and a great damage to livestock and human beings due to an infectious disease transmitted in livestock can be prevented.
  • poultry represented by chickens the following two effects can be mentioned. The first is that it can prevent infection between birds or avians with zoonotic diseases represented by avian influenza, and can prevent a pandemic of serious viruses unknown to humans represented by new influenza. It is. Second, by making poultry resistant to pathogens, it is possible to suppress the spread of pathogenic viruses among birds and to reduce enormous economic losses at poultry farms and the like.
  • FIG. 1 is a graph of virus titer and hatching rate (survival rate) by comparison of single expression of shRNA and multiple expression of shRNA.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of an introduction vector for verifying the pathogenic virus growth inhibitory effect of shRNA expressed in animal cells.
  • FIG. 3 is a graph showing the growth inhibitory effect of pathogenic virus in chicken cells expressing one type of shRNA (NP or M2) and two types of shRNA (NP and M2).
  • the present invention is characterized by producing a transgenic animal having resistance to a pathogen by the following steps.
  • a functional RNA that suppresses the growth of pathogens is selected.
  • a vector that allows multiple expression of the functional RNA (1) in an animal cell is constructed.
  • a transgenic animal is produced using the vector of (2).
  • Pathogenic viruses include RNA viruses and DNA viruses.
  • pathogenic viruses include pathogenic viruses that are transmitted in livestock and the like. For example, foot-and-mouth disease, rabies, and swine cholera can be exemplified. It is also preferred to target pathogenic viruses or variants thereof that are transmitted in poultry or wild birds, in particular pathogenic viruses or variants thereof that are transmitted in chickens.
  • influenza viruses examples include influenza viruses, especially avian influenza viruses, particularly H5N1 avian influenza virus or mutants thereof.
  • influenza viruses are RNA viruses that are classified in the Orthomyxoviridae family.
  • Newcastle disease virus chicken infectious bronchitis virus, chicken leukemia virus, chicken encephalomyelitis virus, chicken nephritis virus, chicken infectious pharyngeal tracheitis virus, reticuloendotheliosis virus, Marek's disease virus
  • viruses transmitted in poultry such as infectious bursal disease virus, avian reovirus, avian adenovirus, EDS-76 virus, chicken anemia virus, turkey rhinotracheitis virus, avian paramyxovirus, fowlpox virus, or mutants thereof
  • examples include viruses that can be transmitted in all birds including water birds and wild birds, or mutants thereof.
  • avian influenza virus Marek's disease virus, Newcastle disease virus, etc. are more emphasized because of widespread spread in poultry and the damage is enormous, and avian influenza is especially emphasized from the fear of human infection .
  • the animals in the present invention include mammals and birds that can be kept by humans. Examples thereof include mammals such as cows, horses, sheep, goats, pigs, dogs and cats, and birds (poultry) such as chickens, quails, turkeys, geese, ducks, ducks and ostriches.
  • the functional RNA for suppressing the growth of pathogens in the present invention refers to functional RNA including RNA having a base sequence complementary to a partial base sequence of the target pathogen genome.
  • the partial base sequence of the genome is 5 bases or more, preferably 10 bases or more, more preferably 15 bases or more, and particularly preferably 20 bases or more.
  • Functional RNA containing RNA consisting of a base sequence complementary to these partial base sequences can be preferably used in the present invention.
  • the functional RNA is 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, especially 90%, with a base sequence complementary to the partial base sequence of the target pathogen genome.
  • Functional RNA containing RNA consisting of a base sequence exhibiting sequence identity of at least%, most preferably 100% can be suitably used in the present invention.
  • the region of the partial base sequence of the target pathogen genome is preferably a region with low mutation frequency.
  • the region having a low mutation frequency herein refers to a DNA genome or RNA genome having a nucleotide sequence of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and most preferably, among a plurality of different strains of a pathogen.
  • a region that is 100% identical, and a region that functions for replication and structure maintenance of a pathogen can be targeted.
  • animal cells the expressed functional RNA is not limited in length or structure as long as it has a function of suppressing the growth of a target pathogen.
  • animal cells refer to cells derived from animals such as birds and mammals. This collection of cells is called an animal.
  • the function of suppressing the growth of a pathogen refers to a cell or animal into which a functional RNA has been introduced having a pathogen growth rate of 50% or less, preferably 40, as compared to a non-manipulated control cell or animal. % Or less, more preferably 30% or less.
  • the virus growth rate can be measured by any known method such as serum agglutination test, hemagglutination inhibition test, neutralization reaction, agar gel precipitation reaction, antigen-antibody reaction, fluorescent antibody method, and quantitative PCR method.
  • RNA in the present invention a functional RNA capable of taking a two-dimensional or three-dimensional structure such as a loop or a hairpin can be preferably used.
  • functional RNA examples include shRNA, siRNA, miRNA, ribozyme or aptamer.
  • shRNA is processed in a cell and may exist as a short double-stranded RNA dimer (siRNA), and may be present in association with a biomolecule such as protein or lipid to form a complex.
  • shRNA, siRNA, and the like often have a function of inducing an RNA interference effect, have a remarkable effect of degrading and suppressing the target pathogen genome, and can be preferably used in the present invention.
  • RNA interference effect is a protein in which a single-stranded or double-stranded RNA sequence having a sequence that is somewhat complementary to the base sequence of the target pathogen genome is called an RNA-induced silencing complex (RISC) in a cell It is a phenomenon that forms an RNA complex and cleaves the genome of a target pathogen.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • RNA sequences that have a high growth inhibitory effect on specific pathogens can be selected from in vivo tests such as in vitro tests or animal infection experiments using target pathogens or their pathogen genomes, or animal infection experiments, or functions. Selection can be made based on all known test methods such as ex vivo tests using cells isolated from animals expressing sex RNA or literature information.
  • RNA expressed in animals are expressed in animal cells. It is possible to maintain resistance to pathogens by expressing multiple types of functional RNAs against rapidly mutated pathogens.
  • the vector capable of introducing two or more functional RNA genes into animal cells for suppressing the growth of various pathogens described above is prepared.
  • the vector may be a plasmid-type DNA or a double-stranded DNA fragment as long as it can be introduced into the target animal cell.
  • the plasmid DNA in the present invention refers to a double-stranded DNA having a circular structure.
  • the vector is introduced into animal cells by a known gene transfer method such as a calcium phosphate method, a lipofection method, or an electric transfer method. At this time, the introduced vector is preferably integrated into the chromosome of the animal cell.
  • the chromosome in the present invention refers to genomic DNA that is replicated during cell division and inherited by daughter cells.
  • RNA vectors can be used as a vector for efficiently incorporating a functional RNA gene into a chromosome.
  • a viral vector such as a retroviral vector
  • Retro derived from Moloney murine leukemia virus, Moloney murine sarcoma virus, avian leukemia virus (ALV), mouse hepatocyte virus (MSCV), mouse embryonic hepatocyte virus (MESV), etc.
  • retroviral vectors derived from Moloney murine leukemia virus, Moloney murine sarcoma virus, avian leukemia virus (ALV), mouse hepatocyte virus (MSCV), mouse embryonic hepatocyte virus (MESV), etc.
  • retroviral vector derived from Moloney murine leukemia virus
  • Moloney murine sarcoma virus avian leukemia virus (ALV), mouse hepatocyte virus (MSCV), mouse embryonic hepatocyte virus (MESV), etc.
  • a vector in which the functional RNA is incorporated into an expression cassette is constructed.
  • the vector is not particularly limited, but in addition to a functional RNA sequence, a promoter, an enhancer, a regulatory factor, etc., that is appropriately designed to express the functional RNA in an animal that is a cell or a collection of cells. It is preferable to use it.
  • Promoter is a DNA sequence that has a function of determining the transcription start site of a gene and directly controlling its frequency.
  • the promoter is not limited as long as it is a promoter that functions effectively for RNA expression, but pol III promoters such as U6 promoter and H1 promoter that are commonly used for RNA expression are generally used for short RNA expression. Is preferred.
  • pol II promoters include EF1 ⁇ promoter, thymidine kinase promoter, simian virus 40 (SV40) promoter, murine phosphoglycerokinase (PGK) promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, Rous sarcoma virus (RSV) promoter
  • Virus-derived promoters animal-derived promoters such as chicken beta actin promoter, and inducible promoters such as a tetracycline-inducible promoter can also be used.
  • SV40 simian virus 40
  • PGK murine phosphoglycerokinase
  • CMV cytomegalovirus
  • RSV Rous sarcoma virus
  • Virus-derived promoters animal-derived promoters such as chicken beta actin promoter
  • inducible promoters such as a tetracycline-inducible promoter
  • it can be expressed in specific tissues / cells using a tissue-specific promote
  • Enhancer is a sequence that promotes transcription from a promoter.
  • the combination with the promoter is not particularly limited.
  • the enhancer include, but are not limited to, SV40, CMV, thymidine kinase enhancer, steroid response element, lysozyme enhancer, and the like.
  • a regulatory factor is a DNA sequence that contributes to transcriptional regulation and stabilization of RNA after transcription.
  • Examples of the regulatory factor include, but are not limited to, a woodchuck hepatitis virus-derived regulatory element (woodchucks post-transcriptional regulatory element: WPRE, US Pat. No. 6,136,597).
  • the vector thus prepared can express two or more kinds of functional RNAs in animal cells by including two or more expression units containing a promoter and / or enhancer. It is known that the same effect can be obtained even if two or more kinds of functional RNAs are expressed as a result of RNA being transcribed by RNA being processed in cells.
  • a plurality of functional RNAs can be coexpressed in the cells.
  • the expression units may be connected in tandem in the same direction or may be arranged in both directions.
  • a viral vector etc. can be used.
  • its titer titer
  • it is 1 ⁇ 10 6 cfu / ml or more, preferably 1 ⁇ 10 7 cfu / ml or more, more preferably 1 ⁇ 10 8 cfu / ml or more, further preferably 1 ⁇ 10 9 cfu / ml or more, and particularly 1 ⁇ 10 10 cfu / ml or more.
  • the above vector may be introduced into the cell by a known technique.
  • a known technique can be used in which a vector is introduced into a fertilized egg or early embryo, then transplanted into the uterus of a host animal, and generated into an individual.
  • a known technique for introducing a vector into an early embryo and hatching using a sperm egg can be used. Thereby, it is possible to obtain a cell or an animal that expresses two or more types of functional RNA in the cell.
  • the number of gene transfer copies (average) into cells or animals that express two or more functional RNAs (such as shRNA) in the cells thus prepared is usually 0.01 or more, preferably 0.1 or more. , More preferably 1 or more, and still more preferably 2 or more.
  • Any known technique can be used as a method for evaluating cells or animals that express two or more types of functional RNA (such as shRNA) in the cells thus prepared. Evaluation can be made by a method for detecting a functional RNA sequence expressed as an in vitro test, a virus resistance test in vivo, and the like.
  • RNA is extracted from animal cells that express two or more functional RNAs in the prepared cells, and the target RNA is detected by Northern blotting or quantitative or semi-quantitative real-time PCR. Is possible.
  • an animal that expresses two or more types of shRNA in the prepared cells is infected with a pathogenic virus, and the survival rate and the presence or absence of antibody production are examined, thereby improving resistance to the pathogenic virus. Can be evaluated.
  • the degree of reporter gene expression suppression may be measured.
  • the reporter gene is designed so that expression is suppressed by functional RNA.
  • Inhibition of reporter gene expression in cells expressing functional RNA is quantified by a known technique such as real-time PCR.
  • the degree of suppression of expression of the reporter gene may be measured by a known technique such as real-time PCR.
  • an animal that expresses two or more types of functional RNA in the produced cell can be used to produce offspring that exhibit excellent resistance to pathogens by mating with each other or with a wild-type animal. Obtainable.
  • vector or “vector construct” refers to a circular double-stranded DNA (so-called plasmid-type vector).
  • plasmid-type vector a virus having no replication ability for gene transfer was used.
  • hU6 promoter A human-derived U6 promoter sequence was synthesized as a polIII promoter. The DNA sequence described in SEQ ID NO: 4 was synthesized (SIGMA Genosys).
  • SEQ ID NO: 4 Construction of shRNA expression vector construct SEQ ID NO: 4 was digested with restriction enzymes EcoRI and restriction enzymes BamHI, electrophoresed on 3% agarose gel, stained with ethidium bromide, and a band around 300 bp was excised with a cutter knife, and then QIAEXII (QIAGEN) was used. DNA was purified from an agarose gel and eluted in 10 ⁇ l of TE to form an insert.
  • 1 ⁇ g of a retroviral vector construct based on the pMSCVneobactfEPOwpre vector disclosed in the patent document (JP 2007-89578, Example 6) is digested with restriction enzyme EcoRI and restriction enzyme BamHI, and subjected to 1% agarose gel electrophoresis. After staining with ethidium bromide, a band around 6000 bp was cut out with a cutter knife, and then DNA was purified from an agarose gel using QIAEXII (QIAGEN) and eluted into 10 ⁇ l of TE to obtain a vector.
  • QIAEXII QIAGEN
  • the insert and the vector were mixed 1 ⁇ l at a time, and 2 ⁇ l of MilliQ water and 4 ⁇ l of Solution I (DNA Ligation Kit Ver2.1: TAKARA) were added and mixed well, followed by a ligation reaction at 16 ° C. for 30 minutes. 1 ⁇ l of the reaction solution was transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ (TAKARA) (after mixing, heat shock at 42 ° C. for 45 seconds), and colonies were formed on an LB agar medium containing ampicillin. The next day, a single colony was picked up and cultured at 37 ° C. for 16 hours in an LB liquid medium.
  • TAKARA Escherichia coli DH5 ⁇
  • plasmid was extracted (QIAprep Spin Miniprepkit: QIAGEN). This plasmid was designated as pMSCVneoU6wpre.
  • the DNA fragments of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 were digested with restriction enzymes in the same manner as described above, the DNA was purified and used as inserts, and each was inserted downstream of the hU6 promoter of pMSCVneo6wpre. PMSCVneoU6M2wpre and pMSCVneoU6GFPwpre.
  • the region of hU6 and NP was amplified by PCR using pMSCVneoU6NPwpre as a template.
  • the DNA fragment of about 300 bp obtained at this time was designated as U6NP.
  • PMSCVneo6NPU6M2wpre which is a retroviral vector construct incorporating two shRNA expression units, was constructed by ligation using pMSCVneoU6M2wpre as a vector and U6NP as an insert.
  • Example 2 Preparation of retrovirus vector 2-1: Preparation of transient retrovirus
  • the vector construct (pMSCVneo6NPwpre) prepared in Example 1 was transformed into E. coli DH5 ⁇ (TAKARA), and a single colony was prepared in 100 ml of LB medium. After shaking culture at 37 ° C. for 16 hours, the cells were collected by centrifugation and purified endotoxin-free (EndoFree-plasmic Maxi Kit: QIAGEN).
  • the culture supernatant was aspirated from the culture dish, and 9 ml of D-MEM (containing 10% FBS) and 200 ⁇ l of 1M HEPES Buffer Solution (GIBCO) were added, and the culture was continued for another 24 hours.
  • D-MEM containing 10% FBS
  • GEBCO 1M HEPES Buffer Solution
  • the culture supernatant was passed through a 0.45 ⁇ m cellulose acetate filter (manufactured by Advantech), and the filtrate was collected in a centrifuge tube.
  • the retrovirus expressed transiently by ultracentrifugation (50000G, 1.5 hours, 4 ° C.) was concentrated using an ultracentrifuge CS100GXL (manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.). The concentrated retrovirus was suspended in 20 ⁇ l of TE to prepare a transient retrovirus preparation.
  • GP293 cells were seeded on a 96-well collagen-coated plate (IWAKI) at 1 ⁇ 10 4 cells / well, and polybrene was added at a final concentration of 8 ⁇ g / ml. Thereafter, 20 ⁇ l of the transient retrovirus preparation prepared in 2-1 was added for infection. The GP293 cells after infection were diluted with D-MEM medium at a limit of 0.5 cells / well on a 96-well collagen-coated plate (IWAKI).
  • Drug selection was performed with D-MEM High-Glucose (GIBCO) (containing 10% FBS) to which G418 (SIGMA) was added to a final concentration of 1 mg / mg. The same medium was exchanged once every three days, and colony formation was observed in the plate. A clone having a high cell growth rate was selected and selected as a packaging cell line (pMSCVneo6NPwpre / GP293).
  • pMSCVneoU6NPU6M2wpre vector construct prepared in Example 1 a packaging cell line was selected in the same manner as described above to obtain pMSCVneo6NPU6M2wpre / GP293.
  • high titer retroviral vector packaging cell lines prepared in Preparation 2-2 and (pMSCVneoU6NPwpre / GP293) were seeded 5 ⁇ 10 6 cells in 100mm collagen-coated dish (IWAKI), and cultured overnight (10% D-MEM medium containing FBS).
  • LipofectAMINE2000 was used to transfect 24 ⁇ g of pVSVG plasmid. After 6 hours, the medium was changed (D-MEM medium containing 10% FBS), and 200 ⁇ l of 1M HEPES Buffer Solution (GIBCO) was added, followed by further incubation for 24 hours.
  • the culture supernatant was passed through a 0.45 ⁇ m cellulose acetate filter (manufactured by Advantech), and the filtrate was collected in a centrifuge tube.
  • the retrovirus expressed transiently by ultracentrifugation (50000G, 1.5 hours, 4 ° C.) was concentrated using an ultracentrifuge CS100GXL (manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.).
  • the concentrated retrovirus was suspended in 20 ⁇ l of TE and used as a concentrated virus solution in 2-4 injection experiments.
  • a packaging cell line of pMSCVneoU6NPU6M2wpre / GP293 was prepared in the same manner by preparing a high-titer retroviral vector and microinjecting the chicken fertilized egg.
  • Retroviral vector titration NIH3T3 cells were seeded in a 6-well plate (IWAKI) at 1.5 ⁇ 10 4 cells / well, and after 24 hours medium (10% FBS (GIBCO) D-MEM containing, Polybrene (Sigma) added to a final concentration of 8 ⁇ g / ml) was exchanged. Add serially diluted retrovirus prepared in 2-3 to each well (10 3 to 10 8 ). After 24 hours, add G418 to D-MEM containing 10% FBS to a final concentration of 1 mg / ml. ) was replaced.
  • Retroviral vectors with titers of 10 8 to 10 9 cfu / ml were prepared from both pMSCVneo6NPwpre / GP293 and pMSCVneoU6NPU6M2wpre / GP293 packaging cell lines.
  • Chicken fertilized eggs (Shiroyama breeding ground: Kakogawa) were incubated for 55 hours at 38 ° C. and humidity of 50% or more. At that time, 90-degree turning was performed every 1 hour (Showa Franchi Incubator).
  • the opening was covered with Saran wrap (Asahi Kasei) using egg white as a paste, and incubated again at 38 ° C. and 30 degrees of egg-turning for one hour to hatch (Table 1).
  • the virus titer introduced at that time (10 8 cfu / ml or more) and the hatching rate are shown in FIG.
  • the hatching rate is the same as that when a low titer vector is used.
  • the hatching rate is clearly higher than that of an individual expressing one type of shRNA. Showed the rate.
  • the number of introduced copies was calculated using a real-time PCR device (LightCycler: Roche) and a kit (LightCycler First Start DNA Masterhybrobe: Roche), an amplification primer (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6: SIGMA Genosys) SEQ ID NO: 8: Japan Genetic Research Laboratories) according to the kit protocol.
  • SEQ ID NO: 7 is labeled with FITC on the 3 ′ side
  • SEQ ID NO: 8 is labeled with LCRed 640 on the 5 ′ side.
  • the reaction conditions for real-time PCR were as follows. Thermal denaturation reaction 95 ° C, 10 minutes amplification detection reaction 95 ° C, 10 seconds ⁇ 58 ° C, 15 seconds ⁇ 72 ° C, 10 seconds (45 cycles) Cooling reaction 40 ° C.
  • Table 2 shows the number of transgene copies to transgenic chickens expressing 2 types (NP ⁇ M2) of shRNA prepared in 2-5.
  • Example 3 Expression analysis of transgenic chicken Whole blood was collected from each of the transgenic chickens produced in Example 2 (two types of expression: NP ⁇ M2) and a wild-type chicken as a negative control by blood sampling under the wing.
  • siRNAs of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 with known concentrations were synthesized (SIGMA Genosys), a calibration curve was created using this as a standard, and shRNA expressed in a transgenic chicken using a negative control as a reference Was quantified (Table 3).
  • Example 4 Verification of anti-influenza virus effect Using chicken embryo fibroblasts (CEF), the effect of suppressing the expression of the target gene by the expression of shRNA was verified.
  • CEF chicken embryo fibroblasts
  • the prepared CEF was seeded on a plate so as to be 1 ⁇ 10 5 cells, and cultured for 24 hours.
  • the cultured CEF was infected with 20 ⁇ l of the pMSCVneoU6NPU6M2wpre retroviral vector prepared by the method of Example 2, and after 24 hours of culture, the medium was changed to D-MEM supplemented with G418 (SIGMA) to a final concentration of 1 mg / ml. Thereafter, the cells were cultured for 1 week in a medium containing G418. The cells thus obtained were designated as NM / CEF.
  • CEF cells expressing three shRNAs of NP / CEF, M2 / CEF, and GFP / CEF were prepared using three types of transient retroviral vectors of pMSCVneo6NPwpre, pMSCVneo6M2wpre, and pMSCVneo6GFPwpre.
  • CEF obtained as described above were seeded on a 6-well plate so as to be 1 ⁇ 10 5 cells, and cultured for 24 hours. This was transfected with 3 ⁇ g of the reporter expression vector construct described in 4-1, using LipofectAMINE2000, the medium was changed after 6 hours (D-MEM medium containing 10% FBS), and 200 ⁇ l of 1M HEPES Buffer Solution (GIBCO). And further cultured for 24 hours.
  • the expression of the reporter gene was confirmed by real-time PCR using specific primers (LightCycler RNA Master SYBRGreen I: Roche).
  • the conditions for the real-time PCR method were as follows. Reverse transcription reaction 61 ° C, 20 minutes heat denaturation reaction 95 ° C, 30 seconds amplification reaction 95 ° C, 5 seconds ⁇ 55 ° C, 10 seconds ⁇ 72 ° C, 25 seconds (45 cycles) Cool 40 ° C.

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Abstract

　本発明は、細胞内に２種類以上の外来性の機能性ＲＮＡを保持し、ウイルスなどの病原体に対する抵抗性を有するトランスジェニック動物である。１種類の外来性の機能性ＲＮＡを保持する動物と比較し、複数の外来性の機能性ＲＮＡを保持する動物の方が、顕著に病原体の増殖を抑制することができる。

Description

２種類以上の外来性の機能性ＲＮＡを保持するトランスジェニック動物
　本発明は、細胞内に２種類以上の外来性の機能性ＲＮＡを保持し、病原体に対する抵抗性を有することを特徴とするトランスジェニック動物に関する。
　家畜は人間の生活に重要な産業動物であるが、家畜で伝播する伝染病の中には、家畜や人間に甚大な被害をもたらすものもある。
　哺乳類においては、口蹄疫や、狂犬病、豚コレラなどは感染力が強く、ひとたび発生すると、同居群や接触の恐れのある家畜を全殺し、焼却処分し、周囲を消毒することで封じ込めることしか対策はない。
　また家禽においては、鳥類間で伝播する病原体が多く知られている。中でもインフルエンザウイルスなどは、鳥類だけでなくヒトや家畜にも感染し、重篤な感染症を引き起こす病原体である。人類は、このようなインフルエンザウイルスに対して、抗インフルエンザ薬やワクチンを開発して対抗してきた。ところが、進化を続ける未知の新型インフルエンザウイルスに対する予防策は未だ充分ではない。インフルエンザウイルスは、鳥類間、または鳥類と他の動物種間、または鳥類とヒトとの間で感染を繰返すことにより、変異する事が知られており、治療薬やワクチンが効果を発揮できない事がある。
　病原体に対して抵抗性を示す動物を得る事は極めて重要であるが、その動物の作製方法として、育種による方法と遺伝子組換えによる方法が考えられる。
　育種による方法の例として、遺伝的に病原体に抵抗性を持ったニワトリの系統同士の交配を繰返すことによって病原体に対する抵抗性が強化されたニワトリ種を作製する方法が知られている。具体的には、インフルエンザ抵抗性ニワトリやマレック病抵抗性ニワトリの作製が試みられたが、この方法で抵抗性ニワトリを作製するには、極めて長い年月を要し、また、作製された抵抗性ニワトリは、抵抗性を示すがゆえに病原体のキャリアとなって、他の動物に伝播するという問題も指摘されている。加えて、病原体が変異した場合に、必ずしも充分な抵抗性を発揮させることができない。
　遺伝子組換えによる方法の例としては、各種ベクターを用いた遺伝子組換え技術とＲＮＡ干渉（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）技術（非特許文献１）を融合して、特定の病原体に対して抵抗性を示す（病原体の増殖を抑制する）動物を作製する方法が知られている（特許文献１および特許文献２）。この方法を応用した例として、トリインフルエンザウイルスの増殖を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ）を導入したニワトリの作製が検討された（特許文献３）が、この場合も、病原体が変異した場合の抵抗性の発揮という問題がある。
国際公開公報ＷＯ２００５－００３３４８ 国際公開公報ＷＯ２００６－１０２４６１ 米国公開公報ＵＳ２００８－０２２２７４３
Ｆｉｒｅ　ら　Ｎａｔｕｒｅ　３９１, ８０６－８１１ (１９９８)
　病原体が変異したとしても充分な抵抗性を有するトランスジェニック動物を作製することを課題とした。
　発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、細胞内に２種類以上の外来性の機能性ＲＮＡを保持するトランスジェニック動物を作製することにより、上記課題を解決した。具体的には、家禽を例として、複数の外来性の機能性ＲＮＡを発現したニワトリを作製し、本発明に至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）細胞内に２種類以上の外来性の機能性ＲＮＡを発現し、病原体に対する抵抗性を有することを特徴とするトランスジェニック動物。
（２）機能性ＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡおよびアプタマーから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ＲＮＡ）であることを特徴とする（１）に記載のトランスジェニック動物。
（３）機能性ＲＮＡが、病原体のゲノムの部分塩基配列の相補鎖と５０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＲＮＡであることを特徴とする、（１）または（２）に記載のトランスジェニック動物。
（４）病原体に対する抵抗性が、病原体の増殖を５０％以下に抑制することを特徴とする、（１）から（３）のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
（５）病原体が、ウイルスであることを特徴とする、（１）から（４）のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
（６）ウイルスが、インフルエンザウイルスであることを特徴とする、（５）に記載のトランスジェニック動物。
（７）トランスジェニック動物が、鳥類であることを特徴とする（１）から（６）のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
（８）鳥類が家禽であることを特徴とする、（７）に記載のトランスジェニック動物。
（９）家禽が、ニワトリであることを特徴とする、（８）に記載のトランスジェニック動物。
　本発明により、病原体に対して優れた抵抗性を有するトランスジェニック動物を作製することができ、家畜で伝播する伝染病による家畜や人間への甚大な被害を防止することができる。例えば、ニワトリに代表される家禽の場合には、以下の２つの効果が挙げられる。１つ目は、トリインフルエンザに代表される人獣共通感染症の鳥類間または鳥類からヒトへの感染を予防でき、新型インフルエンザに代表される人類にとって未知の恐るべきウイルスのパンデミックを予防できるという点である。２つ目は、家禽に病原体に対する抵抗性を持たせることによって、鳥類間での病原性ウイルスの蔓延を抑止し、養鶏場などでの甚大な経済損失を低減させることが可能となる。
図１はｓｈＲＮＡの単数発現とｓｈＲＮＡの複数発現の比較による、ウイルスタイターと孵化率（生存率）のグラフである。 図２は動物細胞で発現させたｓｈＲＮＡの病原性ウイルス増殖抑制効果を検証するための導入ベクターの模式図である。 図３はｓｈＲＮＡを１種類（ＮＰあるいはＭ２）、ｓｈＲＮＡを２種類（ＮＰおよびＭ２）発現したニワトリ細胞における病原性ウイルスの増殖抑制効果のグラフである。
　以下、本発明を実施する好ましい形態について述べるが、本発明の本質は記載の内容によって限定されるものではない。
　本発明は、以下の工程によって病原体に抵抗性を有するトランスジェニック動物を作製することを特徴とする。
（１）病原体の増殖を抑制する機能性ＲＮＡを選択する。
（２）動物細胞で（１）の機能性ＲＮＡの複数発現を可能とするベクターを構築する。
（３）（２）のベクターを用いてトランスジェニック動物を作製する。
　それぞれの工程について以下に詳述する。
　（１）病原体（例えば病原性ウイルス）の増殖を抑制するための機能性ＲＮＡを選択する。病原性ウイルスにはＲＮＡウイルスとＤＮＡウイルスが含まれる。また、病原性ウイルスとしては、家畜等で伝播する病原性ウイルスが挙げられる。例えば、口蹄疫、狂犬病、豚コレラなどが例示できる。家禽または野鳥で伝播する病原性ウイルスまたはその変異株、特にニワトリで伝播する病原性ウイルスまたはその変異株を対象とすることも好ましい。
　そのような病原性ウイルスとしては、インフルエンザウイルス、中でもトリインフルエンザウイルス、特にＨ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルスまたはその変異株が例示できる。これらインフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に分類されるＲＮＡウイルスである。インフルエンザウイルスのほかにも、ニューカッスル病ウイルス、鶏伝染性気管支炎ウイルス、鶏白血病ウイルス、鶏脳脊髄炎ウイルス、鶏腎炎ウイルス、鶏伝染性咽頭気管炎ウイルス、細網内皮症ウイルス、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、トリレオウイルス、トリアデノウイルス、ＥＤＳ－７６ウイルス、鶏貧血ウイルス、七面鳥鼻気管炎ウイルス、トリパラミクソウイルス、鶏痘ウイルスといった家禽で伝播するウイルスまたはその変異株のほか、水鳥、野鳥を含むあらゆる鳥類で伝播可能なウイルスまたはその変異株が挙げられる。
　なかでも、家禽で広範に拡大し、被害が甚大である点からトリインフルエンザウイルスやマレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルスなどがより重視され、ヒトへの感染の恐れからは、トリインフルエンザが特に重視される。
　本発明における動物とは、人間によって飼養されうる哺乳類および鳥類が含まれる。例えば、牛、馬、羊、山羊、豚、犬、猫等の哺乳類、ニワトリ、ウズラ、七面鳥、ガチョウ、カモ、アヒル、ダチョウ等の鳥類（家禽）を挙げることができる。
　本発明における病原体の増殖を抑制するための機能性ＲＮＡとは、標的となる病原体のゲノムの部分塩基配列と相補的な塩基配列を有するＲＮＡを含む機能性ＲＮＡを指す。ゲノムの部分塩基配列は、５塩基以上、好ましくは１０塩基以上、さらに好ましくは１５塩基以上、特に好ましくは２０塩基以上である。これらの部分塩基配列と相補的な塩基配列からなるＲＮＡを含む機能性ＲＮＡを本発明に好適に使用できる。また、この機能性ＲＮＡは標的となる病原体のゲノムの部分塩基配列と相補的な塩基配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、とりわけ９０％以上、最も好ましくは１００％の配列同一性を示す塩基配列からなるＲＮＡを含む機能性ＲＮＡを本発明に好適に使用できる。
　標的となる病原体のゲノムの部分塩基配列の領域としては、変異頻度の低い領域が好ましい。ここでいう変異頻度の低い領域とは、ある病原体の複数の異なる株間において、そのＤＮＡゲノムまたはＲＮＡゲノムの塩基配列が８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％同一である領域のことをいい、病原体の複製や構造維持に機能している領域などが標的となり得る。例えばＡ型インフルエンザウイルスでは８つの遺伝子領域が存在するが、そのうちＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰと呼ばれるウイルスのＲＮＡゲノムを複製する領域や、Ｍと呼ばれるウイルスの構造維持に機能する遺伝子領域は好適な標的となり得る。
　動物細胞において、発現させた機能性ＲＮＡは標的となる病原体の増殖を抑制する機能を有する限り、その長さや構造において限定されることはない。ここでいう動物細胞とは、鳥類、哺乳類等の動物由来の細胞のことをいう。この細胞の集合体を動物という。
　本発明における、病原体の増殖を抑制する機能とは、機能性ＲＮＡが導入された細胞もしくは動物が、非操作対照の細胞もしくは動物との比較において、病原体の増殖速度が５０％以下、好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下に抑制されることを言う。ウイルスの増殖速度の測定方法は、血清凝集試験、赤血球凝集抑制試験、中和反応、寒天ゲル内沈降反応、抗原抗体反応、蛍光抗体法、定量的ＰＣＲ法等のあらゆる公知の手法で測定できる。
　本発明における機能性ＲＮＡは、ループやヘアピン等の２次元的あるいは３次元的な構造をとりうる機能性ＲＮＡを好適に用いることができる。このような機能性ＲＮＡとしては、たとえばｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムまたはアプタマーを例示することができる。また、ｓｈＲＮＡは細胞内においてプロセッシングを受け、短い二本鎖のＲＮＡダイマー（ｓｉＲＮＡ）として存在することもあり、タンパク質や脂質などの生体分子と会合し、複合体を形成して存在しうる。ｓｈＲＮＡやｓｉＲＮＡなどは、ＲＮＡ干渉効果を誘導する機能を持つことが多く、顕著に標的病原体ゲノムの分解、抑制効果があり、本発明で好ましく用いることができる。
　ＲＮＡ干渉効果とは、標的とする病原体のゲノムの塩基配列とある程度相補的な配列を有する１本鎖または２本鎖のＲＮＡ配列が、細胞内でＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）と呼ばれるタンパク質－ＲＮＡ複合体を形成し、標的とする病原体のゲノムを切断する現象である。
　特定の病原体に対して増殖抑制効果の高いＲＮＡ配列は、標的とする病原体または、その病原体ゲノムを用いて、培養細胞を用いるなどしたｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験または動物感染実験などのｉｎ　ｖｉｖｏ試験、あるいは、機能性ＲＮＡを発現させた動物から分離した細胞を用いたｅｘ　ｖｉｖｏ試験など、公知のあらゆる試験法または、文献情報に基づき、選択することができる。
　動物で発現させる機能性ＲＮＡは、動物細胞内で２種類以上を発現させることが好ましい。変異の速い病原体に対しては複数種の機能性ＲＮＡを発現させることで、病原体に対する抵抗性を持続させることが可能になる。
　（２）上記に記載の各種病原体の増殖を抑制するための、２種以上の機能性ＲＮＡ遺伝子を動物細胞に導入可能なベクターを作製する。ベクターとしては、対象とする動物細胞内に導入できれば、プラスミド型ＤＮＡでも良いし、２本鎖ＤＮＡ断片でもよい。本発明におけるプラスミド型ＤＮＡは、環状構造をした２本鎖ＤＮＡを指す。上記ベクターは、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、電気導入法など公知の遺伝子導入法で動物細胞内に導入される。この際、導入されたベクターは、動物細胞の染色体に組込まれることが好ましい。本発明における染色体とは、細胞分裂時に複製され、娘細胞に遺伝するゲノムＤＮＡのことをいう。
　染色体に効率的に機能性ＲＮＡ遺伝子を組込むベクターとしては、公知のものが利用できる。例えば、ウイルスベクター（レトロウイルスベクターなど）を使用することができる。レトロウイルスベクターとしては特に限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス、モロニーマウス肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、マウス肝細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、マウス胚性肝細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）等を由来とするレトロウイルスベクターの他、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等を由来とするレンチウイルスベクターが挙げられる。
　病原体の増殖を抑制する機能性ＲＮＡを動物細胞で発現させるために、機能性ＲＮＡを発現カセットに組込んだベクターを構築する。ベクターは、特に限定されないが、機能性ＲＮＡ配列のほかにプロモーター、エンハンサー、調節因子等、細胞または細胞の集合体である動物で該機能性ＲＮＡを発現させるために、適切にデザインされたものを用いることが好ましい。
　プロモーターとは遺伝子の転写開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節する機能を有するＤＮＡ配列のことである。プロモーターとしてはＲＮＡの発現に有効に機能するプロモーターであれば限定されないが、一般的にＲＮＡの発現によく用いられているＵ６プロモーターやＨ１プロモーターのようなｐｏｌIII系のプロモーターは、短いＲＮＡの発現に好適である。その他、ｐｏｌII系のプロモーターとして、ＥＦ１αプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ミューリン・フォスフォグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウスザルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーター等のウイルスプロモーター、ニワトリベータアクチンプロモーター等の動物由来のプロモーター、テトラサイクリン誘導型プロモーターのような誘導型プロモーターも用いることができる。また、組織特異的なプロモーターを用いて、特定の組織・細胞で発現させることも可能である。特に粘膜や消化器官で機能するようなプロモーターが好ましい。
　エンハンサーとは、プロモーターからの転写を促進する配列である。プロモーターとの組み合わせについては特に限定されない。エンハンサーとしては、特に限定されないが、ＳＶ４０、ＣＭＶ、チミジンキナーゼエンハンサー、ステロイド応答エレメントやリゾチームエンハンサー等が挙げられる。
　調節因子は、転写調節や、転写後のＲＮＡの安定化に寄与するＤＮＡ配列である。調節因子としては特に限定されないが、ウッドチャック肝炎ウイルス由来調節エレメント（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ　ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔ：ＷＰＲＥ、米国特許６１３６５９７号明細書）等が挙げられる。
　このようにして作製されるベクターは、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む発現ユニットを２以上含むことにより、動物細胞中で複数種の機能性ＲＮＡを発現させることが可能であるが、１つの発現ユニットにより転写されたＲＮＡが細胞内でプロセッシングされることで、結果的に２種類以上の機能性ＲＮＡを発現させても同様の効果が得られることは知られている。もしくは、単独では１種類の機能性ＲＮＡを動物細胞で発現可能なベクターを２種類以上動物細胞に導入することにより、該細胞内で複数の機能性ＲＮＡを同時発現させることも可能である。発現ユニットを複数含むベクターの場合、発現ユニットは同一方向にタンデムに連結しても良いし、双方向に配置しても良い。
　ベクターとしては、特に制限されないが、ウイルスベクターなどを用いることができる。ウイルスベクターを用いる場合、その力価（タイター）は高力価であるほど好ましく、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞またはＨｅｌａ細胞を用いて測定した場合、１×１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上であり、好ましくは１×１０７ｃｆｕ／ｍｌ以上であり、より好ましくは１×１０８ｃｆｕ／ｍｌ以上であり、さらに好ましくは１×１０９ｃｆｕ／ｍｌ以上であり、とりわけ１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌ以上である。
　（３）上記ベクターを用いて、病原体に抵抗性を示す細胞または動物を作製する手法について詳述する。病原体に抵抗性を示す細胞を作製する場合、上記ベクターを公知の手法で細胞内に導入すればよい。病原体に抵抗性を示す動物を作製する場合は、例えば、哺乳類においては、受精卵または初期胚にベクターを導入後、ホスト動物の子宮へ移植し、個体まで発生させる公知手法を用いることができる。また鳥類においても、有精卵を用いて、初期胚にベクターを導入し、孵化させる公知手法を用いることができる。これにより、細胞内に２種類以上の機能性ＲＮＡを発現する細胞又は動物を得ることが可能である。
　このように作製した細胞内に２種類以上の機能性ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡなど）を発現する細胞又は動物への遺伝子導入コピー数（平均）は、普通０．０１以上であり、好ましくは０．１以上、より好ましくは１以上、さらに好ましくは２以上である。
　このように作製した細胞内に２種類以上の機能性ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡなど）を発現する細胞または動物の評価法としては、公知のあらゆる手法を用いることが可能である。Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験として発現させた機能性ＲＮＡ配列を検出する方法とＩｎ　ｖｉｖｏでのウイルス耐性試験などにより評価ができる。
　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験としては、作製した細胞内に２種類以上の機能性ＲＮＡを発現した動物細胞からＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット法や定量的もしく半定量的リアルタイムＰＣＲで目的のＲＮＡを検出することが可能である。
　またｉｎ　ｖｉｖｏ試験としては、作製した細胞内に２種類以上のｓｈＲＮＡを発現する動物に、病原性ウイルスを感染させ、生存率や抗体産生の有無を調べることにより、病原性ウイルスへの抵抗性を評価することができる。
　あるいは、病原性ウイルスを用いることなく、機能性ＲＮＡのウイルス増殖抑制効果を実験的に確認することも可能であり、その方法としては、例えば、レポーター遺伝子の発現抑制の程度を測定すればよい。レポーター遺伝子は、機能性ＲＮＡによって発現が抑制されるようデザインしておく。機能性ＲＮＡが発現した細胞内でレポーター遺伝子の発現抑制をリアルタイムＰＣＲ等の公知の手法で定量する。あるいは、レポーター遺伝子が発現した細胞を作製し、この細胞に機能性ＲＮＡを発現する遺伝子を導入した後に、レポーター遺伝子の発現抑制の程度をリアルタイムＰＣＲ等の公知の手法で測定してもよい。
　言うまでもなく、作製した細胞内に２種類以上の機能性ＲＮＡを発現する動物は、その動物同士で、あるいは、野生型の動物と交配することによって、病原体に対して優れた抵抗性を示す子孫を得ることができる。
　以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。遺伝子操作手法等について特に記述のないものについては代表的な方法に従った（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　Ｅｄ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。細胞培養については特に記述のないものについては代表的な手法に従った（小山秀機編集「細胞培養ラボマニュアル」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ　Ｔｏｋｙｏ　１９９９）。商品名もしくはメーカーを記載しているものに関しては、特に記載のない限り添付の説明書の指示に従った。ここで文言として用いる“ベクター”または“ベクターコンストラクト”とは、環状２本鎖ＤＮＡ（いわゆるプラスミド型ベクター）のことを言う。“レトロウイルスベクター”としては、遺伝子導入のための複製能のないウイルスを用いた。
　（実施例１）ｓｈＲＮＡ発現ベクターコンストラクトの構築
　Ｈ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルスの抑制効果のあるｓｈＲＮＡの発現ベクターを構築した。
　１－１：ｓｈＲＮＡの合成
　Ａ型インフルエンザウイルスのＮＰ、Ｍ２を標的としたｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を合成した。配列番号１、配列番号２をそれぞれ合成（ＳＩＧＭＡ　Ｇｅｎｏｓｙｓ）した。また、コントロールとしてＧＦＰを標的としたｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（配列番号３）を合成（ＳＩＧＭＡ　Ｇｅｎｏｓｙｓ）した。
　１－２：ｈＵ６プロモーターの合成
　ｐｏｌIII系プロモーターとしてヒト由来Ｕ６プロモーター配列を合成した。配列番号４に記載のＤＮＡ配列を合成（ＳＩＧＭＡ　Ｇｅｎｏｓｙｓ）した。
　１－３：ｓｈＲＮＡ発現ベクターコンストラクトの構築　
　配列番号４を制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、３％アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色後、３００ｂｐ付近のバンドをカッターナイフで切り出した後、ＱＩＡＥＸII（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてアガロースゲルからＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶出し、インサートとした。特許文献（特開２００７－８９５７８号公報実施例６）に公開されているｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔｆＥＰＯｗｐｒｅベクターをベースとするレトロウイルスベクターコンストラクト１μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色後、６０００ｂｐ付近のバンドをカッターナイフで切り出した後、ＱＩＡＥＸII（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてアガロースゲルからＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶出し、ベクターとした。インサートおよびベクターを１μｌづつ混合し、ミリＱ水２μｌ、ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ（ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ２．１：ＴＡＫＡＲＡ）４μｌを加え、よく混ぜた後、１６℃で３０分　Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応を行なった。反応液の１μｌを大腸菌ＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ）に形質転換（混合後、４２℃、４５秒間のヒートショック）し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させた。翌日、シングルコロニーをピックアップし、ＬＢ液体培地で３７℃１６時間培養し、培養上清を回収後、プラスミドを抽出した（ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｋｉｔ：ＱＩＡＧＥＮ）。このプラスミドをｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６ｗｐｒｅとした。配列番号１、配列番号２、配列番号３のＤＮＡ断片を上記の手法と同様に制限酵素で消化、ＤＮＡを精製して、インサートとし、それぞれｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６ｗｐｒｅのｈＵ６プロモーターの下流に組み込み、このベクターをそれぞれｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６ＮＰｗｐｒｅ、ｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６Ｍ２ｗｐｒｅ、ｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６ＧＦＰｗｐｒｅとした。
　ｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６ＮＰｗｐｒｅを鋳型として、ｈＵ６とＮＰの領域をＰＣＲで増幅した。このときに得られた３００ｂｐ程度のＤＮＡ断片をＵ６ＮＰとした。
　ｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６Ｍ２ｗｐｒｅをベクターとし、Ｕ６ＮＰをインサートとしてライゲーションすることで、２つのｓｈＲＮＡの発現ユニットを組み込んだレトロウイルスベクターコンストラクトであるｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６ＮＰＵ６Ｍ２ｗｐｒｅを構築した。
　（実施例２）レトロウイルスベクターの調製
　２－１：一過性レトロウイルスの調製
　実施例１で作製したベクターコンストラクト（ｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６ＮＰｗｐｒｅ）を大腸菌ＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ）に形質転換し、シングルコロニーを１００ｍｌのＬＢ培地で３７℃１６時間振とう培養した後、遠心分離により菌体を回収し、エンドトキシンフリーで精製した（ＥｎｄｏＦｒｅｅ－ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ：ＱＩＡＧＥＮ）。
　ＧＰ２９３細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を１００ｍｍコラーゲンコートした培養ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）に５×１０６細胞まき、Ｄ－ＭＥＭ　Ｈｉｇｈ－Ｇｌｕｃｏｓｅ（ＧＩＢＣＯ）（１０％ＦＢＳ含）で２４時間培養した後、上記のベクターコンストラクトとｐＶＳＶＧプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）それぞれ２４μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトした。トランスフェクトの条件はＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００のマニュアルに従った。６時間後に培養ディッシュから培養上清を吸引し、あらたに９ｍｌのＤ－ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含）と２００μｌの１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＩＢＣＯ）を加えてさらに２４時間培養を継続した。
　培養上清を０．４５μｍのセルロースアセテートフィルター（アドバンテック社製）に通し、ろ液を遠心管に集めた。超遠心機ＣＳ１００ＧＸＬ（日立工機社製）を用いて超遠心（５００００Ｇ、１．５時間、４℃）によって一過性発現させたレトロウイルスを濃縮した。濃縮したレトロウイルスを２０μｌのＴＥに懸濁し、一過性レトロウイルス調製液とした。
　２－２：パッケージング細胞株の樹立と選抜
　前日に９６ウェルコラーゲンコートプレート（ＩＷＡＫＩ）に１×１０４細胞／ウェルとなるようＧＰ２９３細胞を播種しておき、ポリブレンを終濃度８μｇ／ｍｌで加えた後、２－１で作製した一過性レトロウイルス調製液２０μｌを加えて感染させた。感染後の上記ＧＰ２９３細胞を９６ウェルコラーゲンコートプレート（ＩＷＡＫＩ）上で０．５細胞／ウェルとなるようにＤ－ＭＥＭ培地で限界希釈した。終濃度１ｍｇ／ｍｇとなるようにＧ４１８（ＳＩＧＭＡ）を加えたＤ－ＭＥＭ　Ｈｉｇｈ－Ｇｌｕｃｏｓｅ（ＧＩＢＣＯ）（１０％ＦＢＳ含）で薬剤選択を行った。同培地を３日に一度交換し、プレート内でコロニー形成の観察を行い、細胞増殖速度が速いクローンを選抜してパッケージング細胞株（ｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６ＮＰｗｐｒｅ／ＧＰ２９３）として選抜した。
　実施例１で作製したｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６ＮＰＵ６Ｍ２ｗｐｒｅのベクターコンストラクトに関しても上記と同様にパッケージング細胞株を選抜し、ｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６ＮＰＵ６Ｍ２ｗｐｒｅ／ＧＰ２９３とした。
　２－３：高力価レトロウイルスベクターの調製
　２－２で作製したパッケージング細胞株（ｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６ＮＰｗｐｒｅ／ＧＰ２９３）を１００ｍｍコラーゲンコートディッシュ（ＩＷＡＫＩ）に５×１０６細胞播き、一晩培養した（１０％ＦＢＳを含むＤ－ＭＥＭ培地）。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００を用いてｐＶＳＶＧプラスミド２４μｇをトランスフェクトし、６時間後に培地を交換（１０％ＦＢＳを含むＤ－ＭＥＭ培地）し、２００μｌの１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＩＢＣＯ）を加えてさらに２４時間培養した。
　培養上清を０．４５μｍのセルロースアセテートフィルター（アドバンテック社製）に通し、ろ液を遠心管に集めた。超遠心機ＣＳ１００ＧＸＬ（日立工機社製）を用いて超遠心（５００００Ｇ、１．５時間、４℃）によって一過性発現させたレトロウイルスを濃縮させた。濃縮したレトロウイルスを２０μｌのＴＥに懸濁し、濃縮ウイルス液として２－４のインジェクション実験に用いた。ｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６ＮＰＵ６Ｍ２ｗｐｒｅ／ＧＰ２９３のパッケージング細胞株も同様の操作により、高力価レトロウイルスベクターを調製し、ニワトリ受精卵へマイクロインジェクションを実施した。
　２－４：レトロウイルスベクターの力価測定
　ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ）を６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ）に１．５×１０４細胞／ウェルとなるように播き、２４時間後に培地（１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）を含むＤ－ＭＥＭ、終濃度８μｇ／ｍｌとなるようにＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（Ｓｉｇｍａ）を添加）を交換した。各ウェルに２－３で調製したレトロウイルスを段階希釈して加え（１０３～１０８）２４時間後に培地（１０％ＦＢＳを含むＤ－ＭＥＭにＧ４１８を終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるように添加）を交換した。以降２日ごとにＧ４１８を含む培地で選択培養し、コロニーの形成を確認後、カウントして力価を算出した。ｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６ＮＰｗｐｒｅ／ＧＰ２９３、ｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６ＮＰＵ６Ｍ２ｗｐｒｅ／ＧＰ２９３のどちらのパッケージング細胞株からも、１０８～１０９ｃｆｕ／ｍｌの力価をもつレトロウイルスベクターを調製した。
　２－５：トランスジェニックニワトリの作製
　特許文献（特開２００７－８９５７８、実施例７）の内容と同様の手法にて、ニワトリ受精卵へのレトロウイルスのマイクロインジェクションを行った。
　ニワトリ受精卵（城山種鶏場：加古川）を３８℃、湿度５０％以上の条件下で５５時間インキュベートした。その際９０度の転卵を１時間おきに行った（昭和フランキ社製孵卵機）。
　ダイアモンドカッターを付けたミニルーター（プロクソン社製）を用いて鈍端部を開口し、同様に鈍端部を直径４．５ｃｍ切り取り、中身を捨てたニワトリ二黄卵（城山種鶏場：加古川）に移し替えた。胚体が上にくるよう調整し、実体顕微鏡システムＳＺＸ１２（オリンパス社製）下でフェムトチップII（エッペンドルフ社製）にウイルス液を充填し、マイクロインジェクター（フェムトジェット：エッペンドルフ社製）を用いて２－３で調製したレトロウイルスを２μｌずつマイクロインジェクションした。
　インジェクション後、卵白を糊としてサランラップ（旭化成）で開口部を覆い、３８℃、一時間に３０度転卵の条件で再びインキュベートし、孵化させた（表１）。その際に導入したウイルスタイター（１０８ｃｆｕ／ｍｌ以上）と、孵化率を図１に示した。一般に、複数の機能性ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡなど）を発現した細胞を得ることは困難と言われているが、図１から分かるように、驚くべきことに、２種類のｓｈＲＮＡを発現した個体では、高タイターベクターを用いた場合でも低タイターベクターを用いた場合と同等の孵化率であり、また、高タイターベクターを用いた場合において、１種類のｓｈＲＮＡを発現した個体と比較して、明らかに高い孵化率を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　２－６：トランスジェニックニワトリの導入遺伝子の検出と導入遺伝子コピー数測定
　２－４で作製したトランスジェニックニワトリより全血を翼下採血により採取した。抗凝固剤としてクエン酸を使用した。小型遠心機にてフラッシュし、上清を２０μｌ分取し、Ｍａｇ－Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ　Ｇｅｎｏｍｅ（ＴＯＹＯＢＯ）のキットを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．２００５　Ｓｅｐ；７９（１７）：１０８６４－７４．に記載のトランスジェニックニワトリ（１コピーの導入遺伝子を全身に持つ完全トランスジェニックニワトリ）のゲノムをスタンダードとして導入コピー数を算出した。導入コピー数の算出は、リアルタイムＰＣＲ装置（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ：Ｒｏｃｈｅ）およびキット（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔａｒｔ　ＤＮＡ　Ｍａｓｔｅｒｈｙｂｐｒｏｂｅ：Ｒｏｃｈｅ）、増幅プライマー（配列番号５および配列番号６：ＳＩＧＭＡ　Ｇｅｎｏｓｙｓ）、蛍光標識プローブ（配列番号７および配列番号８：日本遺伝子研究所）を用いてキットのプロトコルに従い測定した。尚、配列番号７は３´側にＦＩＴＣで標識され、配列番号８は５´側にＬＣＲｅｄ６４０で標識されている。リアルタイムＰＣＲの反応条件は以下で行なった。
熱変性反応　９５℃、１０分
増幅検出反応　９５℃、１０秒　→　５８℃、１５秒　→　７２℃、１０秒（４５サイクル）
冷却反応　　４０℃。
　２－５で作製した、２種類（ＮＰ・Ｍ２）のｓｈＲＮＡを発現するトランスジェニックニワトリへの導入遺伝子コピー数を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（実施例３）トランスジェニックニワトリの発現解析
　実施例２で作製したトランスジェニックニワトリ（２種類発現：ＮＰ・Ｍ２）および陰性コントロールとして野生型ニワトリより、それぞれ翼下採血により全血を採取した。抗凝固剤としてクエン酸を使用し、Ｔｒｉｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。これらのＴｏｔａｌ　ＲＮＡ　各０．９ｎｇをサンプルとして逆転写反応後、Ｃｕｓｔｏｍ　ＴａｑＭａｎ　Ｓｍａｌｌ　ＲＮＡ　Ａｓｓａｙｓ（ａｐｐｌｉｅｄ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　７３００　リアルタイムＰＣＲシステムを用いてｓｉＲＮＡの発現解析を実施したところ、２種類のｓｉＲＮＡを検出した。尚、スタンダードとして、濃度既知の配列番号９、配列番号１０のｓｉＲＮＡを合成（ＳＩＧＭＡ　Ｇｅｎｏｓｙｓ）し、これを標準として検量線を作成し、陰性コントロールを基準として、トランスジェニックニワトリで発現しているｓｈＲＮＡの量を数値化（表３）した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（実施例４）抗インフルエンザウイルス効果の検証
　ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を用いて、ｓｈＲＮＡの発現による、ターゲット遺伝子の発現抑制効果の検証を行なった。
　４－１：レポーター発現ベクターコンストラクトの作製
　ＮＰおよびＭ２のｓｈＲＮＡが認識する合成配列（配列番号１１）を合成した。配列番号１１をレポーター遺伝子下流につなぎ、レポーター発現ベクターコンストラクトを構築した（図２）。作製したベクターコンストラクトを大腸菌ＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ）に形質転換し、シングルコロニーを１００ｍｌのＬＢ培地で３７℃１６時間振とう培養した後、遠心分離により菌体を回収し、エンドトキシンフリーで精製した（ＥｎｄｏＦｒｅｅ－ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ：ＱＩＡＧＥＮ）。
　４－２：ＣＥＦの調製
　ニワトリ有精卵を実施例２記載の方法で７日間孵卵した。この孵卵した有精卵から胚を取り出し頭、内臓、四肢を取り除いた後、細断してトリプシン（ＧＩＢＣＯ）を加え、３７℃２０分間インキュベートした。そこにＤ-ＭＥＭ　Ｈｉｇｈ－Ｇｌｕｃｏｓｅ（ＧＩＢＣＯ）（１０％ＦＢＳ含）を加え遠心分離を行い、上清を除いた後Ｄ-ＭＥＭを加え３分間放置した。その後上清をシャーレにまきＣＥＦとした。
　４－３：ｓｈＲＮＡ及びレポーター遺伝子発現ＣＥＦの調製
　調製したＣＥＦを１×１０５細胞になるようにプレートに播種し、２４ｈｒ培養した。培養したＣＥＦに実施例２の方法で調製したｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６ＮＰＵ６Ｍ２ｗｐｒｅレトロウイルスベクター２０μｌを感染させ、２４ｈｒ培養後、最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるようにＧ４１８（ＳＩＧＭＡ）を加えたＤ－ＭＥＭに培地交換した。その後、Ｇ４１８を含む培地で一週間培養した。このようにして得られた細胞を、ＮＭ／ＣＥＦとした。同様に、ｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６ＮＰｗｐｒｅ、ｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６Ｍ２ｗｐｒｅ、ｐＭＳＣＶｎｅｏＵ６ＧＦＰｗｐｒｅの３種の一過性レトロウイルスベクターを用いて、ＮＰ／ＣＥＦ、Ｍ２／ＣＥＦ、ＧＦＰ／ＣＥＦの３種のｓｈＲＮＡを発現するＣＥＦ細胞を調製した。
　上記のようにして得られた４種のＣＥＦを１×１０５細胞になるように６ｗｅｌｌプレートに播種し、２４ｈｒ培養した。これにＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００を用いて４－１に記載のレポーター発現ベクターコンストラクト３μｇをトランスフェクトし、６時間後に培地を交換（１０％ＦＢＳを含むＤ－ＭＥＭ培地）し、２００μｌの１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＩＢＣＯ）を加えてさらに２４時間培養した。
　４－４：遺伝子抑制効果の検証
　４－３でレポーター発現ベクターコンストラクトを導入した４種のＣＥＦよりＴｏｔａｌＲＮＡを抽出した。レポーター遺伝子の発現を、特異的プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲ法により確認した（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　ＲＮＡ　Ｍａｓｔｅｒ　ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ：Ｒｏｃｈｅ）。リアルタイムＰＣＲ法の条件は以下で行なった。
逆転写反応　６１℃、２０分
熱変性反応　９５℃、３０秒
増幅反応　　９５℃、５秒　→　５５℃、１０秒　→　７２℃、２５秒（４５サイクル）
冷却　　　　４０℃。
　結果を図３に示す。図３から分かるように、１種類の機能性ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現させた場合と比較して、２種類の機能性ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現させた場合には、顕著にレポーター遺伝子の発現を抑制した。
　以上、上記実施例はニワトリを例に説明したが、本発明のコンセプトを用いれば、細胞内に２種類以上の機能性ＲＮＡを保持し、病原体に対する充分な抵抗性を有する他の鳥類、さらには哺乳類も作製しうる。

Claims (9)

  1. 細胞内に２種類以上の外来性の機能性ＲＮＡを発現し、病原体に対する抵抗性を有することを特徴とするトランスジェニック動物。
  2. 機能性ＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡおよびアプタマーから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ＲＮＡ）であることを特徴とする請求項１に記載のトランスジェニック動物。
  3. 機能性ＲＮＡが、病原体のゲノムの部分塩基配列の相補鎖と５０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＲＮＡであることを特徴とする、請求項１または２に記載のトランスジェニック動物。
  4. 病原体に対する抵抗性が、病原体の増殖を５０％以下に抑制することを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
  5. 病原体が、ウイルスであることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
  6. ウイルスが、インフルエンザウイルスであることを特徴とする、請求項５に記載のトランスジェニック動物。
  7. トランスジェニック動物が、鳥類であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
  8. 鳥類が家禽であることを特徴とする、請求項７に記載のトランスジェニック動物。
  9. 家禽が、ニワトリであることを特徴とする、請求項８に記載のトランスジェニック動物。
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
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