CN102178927A

CN102178927A - 干扰素诱导跨膜蛋白3在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的用途

Info

Publication number: CN102178927A
Application number: CN2011100484684A
Authority: CN
Inventors: 王升启; 王学军; 李丹丹; 赵海峰; 李英; 杨静
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2011-03-01
Filing date: 2011-03-01
Publication date: 2011-09-14

Abstract

本发明涉及一种干扰素诱导跨膜蛋白家族分子(Interferon-induced transmembrane protein，IFITMs)在制药工程中的新用途，更具体地说是干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)在制备治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染相关疾病的药物中的应用。本实验室利用分子生物学的方法分别构建了IFITM1、IFITM2、IFITM3的真核表达载体，通过体内外实验发现IFITM1、IFITM2、IFITM3均可显著抑制HBV的复制，其中以IFITM3效果最为显著。因此，本发明涉及IFITM3蛋白及其编码基因有望成为治疗乙型肝炎病毒相关疾病，减少乙型肝炎相关性疾病危害性的新型治疗药物。

Description

干扰素诱导跨膜蛋白3在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的用途

技术领域

本发明涉及一种生物化学物质在基因工程、蛋白质工程和制药工程中的新用途，更具体地说就是干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)及其核苷酸编码序列在制备治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染相关性疾病药物中的应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染严重威胁人类健康，是导致肝炎、肝硬化和肝癌的重要诱因。全世界有3.5亿乙型肝炎病毒携带者，中国约有1.2亿HBV携带者，其中2000多万人为慢性乙肝患者，每年我国在慢性病毒性肝炎方面的直接治疗费用超过500亿人民币。HBV感染不仅给患者及其家庭造成巨大的经济和精神负担，而且给国家造成了巨大的劳动力和经济损失，乃至导致严重的就业等社会问题。

目前仍然缺乏有效的HBV治疗药物，疫苗虽然可起到一定的预防作用，但对已感染者及免疫耐受者无效。临床应用的抗HBV药物主要有干扰素以及一些核苷类似物。干扰素的治愈率有限，副作用较多，停用后通常会出现复发现象。核苷类似物如拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦等是HBV DNA聚合酶的强抑制剂，能有效阻断病毒复制，但长期用药会导致病毒变异，产生耐药性，而且部分病人停药后会复发。因此，新型抗HBV药物的研制具有重大的社会和经济效益。

乙肝病毒的基因组含有四个基本阅读框架，编码四种蛋白，它们分别是表面蛋白(又称为表面抗原，HBs)、核心蛋白(核心抗原，HBc)、聚合酶和X蛋白(HBx)。乙肝病毒基因的表达受到病毒四个基本启动子和两个增强子的调控，即核心蛋白启动子/增强子II(ENII/Cp)、前表面蛋白启动子(Sp1)、表面蛋白启动子(Sp2)和X蛋白启动子/增强子(ENI/Xp)。细胞内一些转录调控因子通过结合上述调控区从而调控乙肝病毒基因的表达。由于乙肝病毒基因组复制过程存在反转录，其模板是前基因组RNA(pgRNA)，因此，乙肝病毒基因的表达，特别是由Cp/ENII启动的pgRNA的转录将直接关系到乙肝病毒能否顺利复制和增殖，其在病毒的生活史中具有中心的地位。

干扰素诱导跨膜蛋白蛋白家族分子是一类人体自身产生的蛋白，首次发现于1984年，大多数细胞里这种蛋白的表达水平较低。最近研究显示其家族分子IFITM1、IFITM2和IFITM3分子体外可显著抑制H1N1流感病毒、西尼罗河病毒和登革热病毒的感染。目前有关IFITMs蛋白分子抗乙型肝炎病毒的作用尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种IFITMs蛋白家族分子用于治疗HBV感染相关疾病中的新用途。具体说，本发明涉及IFITM3蛋白及其核苷酸编码序列在制备治疗HBV感染引起的相关疾病的药物中的应用。

本发明提供一种IFITM3蛋白的医药新用途：以IFITM3蛋白3为活性成分，配以制药可接受的载体，制成多种制剂，用以治疗和预防HBV感染及其相关疾病。

所说的制药可接受的载体包括药用稀释剂、稳定剂、赋形剂、吸收促进剂、促渗透剂、蛋白酶抑制剂、阻聚剂等，如甘氨酸、PH7.0磷酸盐缓冲液、右旋糖酐、乳糖、氯化钠、柠檬酸、明胶、注射用水、生理盐水、脂质体、胆盐、脂肪酸、皂角苷、辛酸钠、月桂酸钠、聚丙烯酸、梭链孢酸衍生物(如牛磺酸二氢梭链孢酸盐、环糊精等)、甘油、A-zone、表面活性剂、脂肪酸、胆盐、水杨酸钠、Zonula occludens toxin(ZOT)、甘胆酸钠、camostat mesilate、bacitracin、aprotinin、大豆胰酶抑制剂、非离子表面活性剂、糖、甘露醇、山梨醇、PEG、人血清白蛋白等，可同时使用其中的一种或多种。

本发明药物可制作适合于静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔给药、肺部给药、口服给药以及透皮给药用剂型，包括溶液型注射剂、冻干粉针、微球、粉末、粉雾剂、气雾剂、肠溶衣、毫微球、微乳、复乳等剂型。

根据本发明，细胞内高表达IFITM3蛋白或其突变体蛋白均可特异性抑制乙肝病毒的复制和表达，IFITM3可能成为治疗及预防HBV感染相关疾病的新型生物工程药物。

本发明另一方面提供了一种编码本发明蛋白的核苷酸序列。根据本发明，将含有IFITM3表达序列标签(CDS)序列构建到pAAVMCS载体中与HBV复制载体共转染HepG2细胞，能够特异性抑制乙肝病毒的复制和表达，因此含有编码IFITM3核苷酸序列的载体可能成为制备治疗及预防HBV感染相关疾病的生物工程药物。

本发明另一方面提供了一种基因治疗载体，所述构建物含有本发明上述核苷酸序列以及与所述核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。

本发明另一方面提供了一种细胞，所述细胞含有本发明上述的蛋白，核苷酸序列或构建物。

本发明获得的蛋白能抑制ENI/Xp、ENII/Cp、Sp1以及Sp2的活性，从而能够抑制乙肝病毒基因的表达和病毒DNA的复制，显示出该蛋白作为特异的抑制剂在抗乙肝病毒感染中的应用前景，为研制新型抗乙肝病毒感染药物奠定了基础。

本发明的实施对严重危害人类健康的乙型肝炎及其相关疾病的治疗具有重要的社会效益和经济效益。

附图说明

为了更好的理解本发明的实质，下面将结合图表、附图来说明其在制药领域的新用途。

图1HepG2细胞内过表达IFITMs(IFITM1、IFITM2、IFITM3)蛋白分子细胞活力检测结果

图2HepG2细胞内过表达IFITMs(IFITM1、IFITM2、IFITM3)蛋白分子抗HBV复制检测结果

图3HepG2细胞内过表达IFITMs(IFITM1、IFITM2、IFITM3)蛋白分子抑制HBV启动子活性检测结果

图4小鼠体内过表达IFITMs(IFITM1、IFITM2、IFITM3)蛋白分子抑制HBsAg表达检测结果

图5小鼠体内过表达IFITMs(IFITM1、IFITM2、IFITM3)蛋白分子抑制HBeAg表达检测结果

图6IFITM3蛋白全长或缺失突变体体外抗HBV复制检测结果

具体实施方式

本发明提供了一种生物化学物质在基因工程、蛋白质工程和制药工程中的新用途，更具体地说就是干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)在制备治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染相关性疾病药物中的应用，其特征在于，所述蛋白含选自以下的氨基酸序列，

(a)序列表SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

(b)对于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失，替代或插入且能抑制乙肝病毒基因表达和病毒基因组复制的氨基酸序列；

(c)相对于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列有90％以上同源性且能抑制乙肝病毒基因表达和病毒基因组复制的氨基酸序列。

在本发明中，术语“蛋白质”、“肽”或“多肽”可互换使用。它们指通过肽键或酰胺键连接在一起的两个或多个氨基酸的链，无论是否经过翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)。本发明中的全长IFITM3蛋白即是具有序列表SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白。然而，本发明定义内还包括与所述IFITM3具有进化相关性的其他物种的IFITM3蛋白。

本发明的蛋白还包括了所述蛋白的具有相同或相似生物活性或功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：相对于天然蛋白的氨基酸序列有若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失，插入和/或取代。另外，所述缺失或插入(增加)也可发生在C末端和/或N末端(通常有20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内的氨基酸缺失或增加)。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。提供功能相似氨基酸的保守性置换表是本领域所熟知的。下列5组各自含有能相互保守置换的氨基酸：脂族：甘氨酸(G)，丙氨酸(A)，氨酸(V)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)；芳族：苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；含硫：甲硫氨酸(M)，半胱氨酸(C)；碱性：精氨酸(R)，酪氨酸(K)，组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)，天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)。另外，该术语还包括了蛋白的片段或衍生物，条件是该片段或衍生物保留了所希望的蛋白生物活性。

上述变异形式还包括上述蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然蛋白的差别可以使氨基酸序列上的差异和/或不影响序列的修饰形式上的差异。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

本发明的蛋白多肽还包括与其相同(同源)或基本上相同(同源)的多肽，例如，有至少60％，更佳70％，还要佳80％，90％，甚至95％以上的同源性或相同性的多肽。

本发明所用的术语“所希望的生物活性”指该蛋白可以通过抑制Xp/ENI、Cp/ENII，Sp1或Sp2的活性或通过抑制HBV DNA的形成从而达到抑制乙肝病毒基因表达和复制的目的。

本发明的蛋白还可与其他基因或基因片段形成融合蛋白。适用于本发明的所述其他基因没有特别限制，几乎所有的基因，基因片段或多聚核苷酸都可用于本发明。代表性的例子包括(但并不限于)：谷胱甘肽S-转移酶(GST)或麦芽糖结合蛋白(MBP)。

本发明另一方面还涉及编码本发明上述蛋白的核苷酸序列，以及含有所述核苷酸序列以及与所述核苷酸序列操作性相连的表达调控序列的一种基因治疗载体。

本发明的核苷酸序列通常可以是PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

本文所用的术语“基因治疗载体”是指包含编码本发明的寡肽，短肽，多肽或蛋白的核苷酸序列以及指导其转录起始，翻译起始，转录终止和翻译终止的调控序列的载体或质粒。“载体”指本领域熟知的原核或真核克隆和表达质粒，病毒载体(噬菌体，植物病毒，昆虫病毒，哺乳动物病毒)或其他载体。

上述载体可用于转化或转染适当的原核和真核细胞，以使其能够表达所编码的本发明的蛋白。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如昆虫细胞和哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，毕赤酵母，果蝇S2或Sf9细胞，哺乳细胞CHO，COS，293细胞等。可采用的转化，转染方法包括并不限于：磷酸钙共沉淀法，显微注射，电穿孔，脂质体介导等。

因此，本发明另一方面还提供了含有本发明上述的蛋白，核苷酸序列、基因治疗载体及其细胞。

本发明的蛋白可在细胞内表达，或在细胞膜上表达，或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的，化学的和其他特性通过各种方法分离和纯化表达产物。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但不限于：常规的复性处理，用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)，离心，渗透破菌，超离心，分子筛层析(凝胶过滤)，吸附层析，离子交换层析，高效液相层析(HPLC)和其他各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明还涉及上述蛋白，核苷酸序列，基因治疗载体或细胞在制备治疗乙肝病毒感染或乙型肝炎的药物中的用途，以及含有所述蛋白，核苷酸序列、基因治疗载体或细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的，过敏的或其他不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的蛋白，核苷酸序列、基因治疗载体或细胞相容，即能与其共混而不会再通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其他组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和甲基纤维素；西黄芪胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油；如花生油，棉籽油，芝麻油，橄榄油，玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇，甘油，山梨糖醇，甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热源水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可有医师根据患者种类，年龄，体重和大致疾病框状况，给药方法等因素确定对病人有益的剂量进行施用。为了提高用药效果，本发明的蛋白也可以与其他药物共同使用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。

实施例一细胞内过表达IFITMs蛋白分子抑制HBV复制

材料与方法

1.细胞培养

所用细胞为肝癌细胞HepG2，用含10％胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM细胞培养液37℃、5％CO₂条件下培养。

2.质粒

pAAVMCS质粒(Stratagene公司)由本实验室保存。根据NCBI公布的IFNa和IFITMs各蛋白的CDS区序列设计引物，通过扩增、酶切等将其插入pAAVMCS质粒中，经阳性克隆PCR鉴定、测序、BLAST比对，结果显示pAAVMCS-IFNa、pAAVMCS-IFITM1、pAAVMCS-IFITM2和pAAVMCS-IFITM3构建成功。HBV复制型质粒pHBV1.31含1.31拷贝HBV DNA并有完整复制单元，其能在转染HepG2细胞内完成病毒的复制，细胞培养液上清中可检测到HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌，细胞内及细胞上清可检测到病毒复制中间体。

3.细胞转染

HepG2细胞在含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM培养液中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将HepG2细胞接种24孔板，8×10⁴细胞/孔，37℃，5％CO2孵育24-36小时，待长至70％-90％细胞汇合后，采用Fugene HD(Roche)转染试剂并参照说明书操作转染，同时设pHBV131与空质粒pAAV-MCS共转染作为对照。转染后72h收集细胞培养液立即检测或者置-20℃保存备用。

4.细胞活力检测(CCK-8方法)

HepG2细胞在含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM培养液中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将HepG2细胞接种96孔板，8×10³细胞/孔，37℃，5％CO2孵育24-36小时，待长至70％-90％细胞汇合后，采用Fugene HD(Roche)转染试剂并参照说明书操作转染，同时设pHBV131与空质粒pAAV-MCS共转染作为对照。转染后72h后每孔加入CCK-8工作液10ul，避光，37℃，5％CO2培养1小时，在酶标仪(BIO-RAD Model680)上测定450nm处吸光值A。同时在倒置显微镜下每日观察细胞形态。根据A_样品/A_对照计算细胞相对活力。

5.HBsAg、HBeAg检测

取收集好的细胞培养液，按照HBsAg，HBeAg定量ELISA检测试剂盒(郑州安图绿科生物工程有限公司)说明书操作步骤检测。取50μl细胞培养液加入乙肝表面抗原或e抗原检测96孔板中，每孔加入50μl表面抗原或e抗原对应的酶标结合物，37℃孵育1h后，用洗液洗板6次，加入发光液A 25μl，再加入发光液B 25μl，37℃孵育10min后检测发光值并计算相应浓度。

6.HBV DNA检测

取细胞培养液，经DNAaseI处理后，采用一管式病毒DNAout试剂(天泽基因工程有限公司)，严格按操作说明书提取HBV DNA。荧光定量PCR按本实验室建立的复合探针PCR定量检测HBV的方法操作(何云燕，王升启等，中华肝脏病杂志，2001，V9N6：376-377)。定量检测HBV DNA的引物序列为：P1：5’-GGA GTA TGG ATT CGC ACT CCT C-3’；P2：5’-TTG TTG TTG TAG GGG ACC TGC CT-3’；荧光探针序列F：5’-ACT TCC GGA AAC TAC TGT TAG ACG A-3’；淬灭探针序列Q：5’-GTA GTT TCC GGA AGT-3’。20μl反应体系含200nmol/L引物，670nmol/L荧光探针F，180nmol/L淬灭探针，200μmol/LdNTP，4.0mmol/L的Mg²⁺，2μl模板，混匀后将各反应管与标准曲线反应管一起放入iCycle自动PCR仪中进行扩增，扩增条件为：94℃30s，55℃30s，72℃30s，共40个循环，反应结束后由电脑自动计算出定量结果。

结果

首先为了确认IFITMs蛋白过表达是否具有抑制细胞生长的作用，采用CCK-8法检测了转染IFITMs的各组与空白组细胞的相对活力，结果如图1所示，结果显示IFNa和IFITM2具有较弱的抑制细胞生长的作用，IFITM1和IFITM3基本无抑制细胞生长活性。为检测IFITMs蛋白是否具有抑制HBV复制的作用，将pAAVMCS-IFNa、pAAVMCS-IFITM1、pAAVMCS-IFITM2和pAAVMCS-IFITM3分别与pHBV1.31质粒以1∶1比例共转染HepG2细胞，同时设空质粒pAAVMCS与pHBV1.31共转染细胞对照。72h后收集细胞培养液，ELISA定量试剂盒检测细胞上清HBsAg和HBeAg含量，荧光定量PCR检测各组细胞中分泌的HBV DNA拷贝数，并计算各样本相对于对照组的相对含量，结果如图2所示，由图中可见，IFITM1、IFITM2、IFITM3分子均可显著抑制HBV1.31瞬时转染细胞模型中HBsAg和HBeAg的表达以及HBV DNA的合成，以IFITM2和IFITM3的效果最为显著。

结论

细胞内过表达IFITM1、IFITM2、IFITM3分子均可显著抑制HBV复制，其中以IFITM2和IFITM3效果较好。

实施例二细胞内过表达IFITMs蛋白分子抑制HBV启动子转录活性

材料与方法

1.细胞培养

方法同实施例一。

2.质粒

受HBV不同启动子转录调控的Gaussia分泌型荧光素酶表达质粒pENI/Xp-Gluc、pENII/Cp-Gluc、pSp1-Gluc和pSp2-Gluc由本实验室构建保存。

3.细胞转染

基本方法同实施例一。将pAAVMCS、pAAVMCS-IFNa、pAAVMCS-IFITM1、pAAVMCS-IFITM2和pAAVMCS-IFITM3分别与等量的pENI/Xp-Gluc、pENII/Cp-Gluc、pSp1-Gluc和pSp2-Gluc共转染HepG2细胞，转染48h后收集细胞上清立即检测或者-20℃保存备用。

4.Gaussia荧光素酶活性检测

采用NEB公司Gaussia分泌型荧光素酶检测试剂盒检测。取20μl细胞上清加入96板中(黑，PerkinElmer公司)，按2s的间隔时间依次加入Gaussia荧光素酶检测试剂(按样品数预配)，立即放入微孔板发光检测仪中按2s的时间间隔读取数据。

结果

考虑到IFITMs对HBsAg和HBeAg的表达具有显著的抑制作用，推测IFITMs蛋白可能对HBV的启动子转录活性具有抑制作用，为验证这一假设，将pAAVMCS、pAAVMCS-IFNa、pAAVMCS-IFITM1、pAAVMCS-IFITM2和pAAVMCS-IFITM3分别与等量的pENI/Xp-Gluc、pENII/Cp-Gluc、pSp1-Gluc和pSp2-Gluc共转染HepG2细胞，48h后收集细胞培养液，检测细胞上清荧光素酶活性，相对活性结果如图3所示，IFITM1、IFITM2和IFITM3均可显著抑制HBV四个启动子的活性，以IFITM2和IFITM3最为显著。

结论

IFITMs抑制HBV基因表达的机制可能主要是通过抑制HBV各启动子的转录活性实现的。

实施例三小鼠体内过表达IFITM3蛋白分子显著抑制HBV基因的表达

材料与方法

1.动物造模

SPF级C57/BL6小鼠，18±2g，购自北京维通利华有限公司。以小鼠尾静脉快速注射大容量体积质粒的方式造模，分别将10μg的pAAVMCS、pAAVMCS-IFNα、pAAVMCS-IFITM1、pAAVMCS-IFITM2、pAAVMCS-IFITM3与10μg pHBV1.18(含1.18拷贝HBV DNA)共溶于小鼠体重1/10体积的PBS中，5-8秒内匀速注射完毕。

2.HBsAg、HBeAg检测

造模后第1、3、5、7天小鼠尾静脉取血，合适比例稀释后HBsAg和HBeAg按照ELISA定量检测试剂盒(郑州安图绿科生物工程有限公司)说明书操作步骤检测，取50μl合适浓度的血清加入96孔检测板中，每孔加入50μl表面抗原或e抗原对应的酶标结合物，37℃孵育1h后，用洗液洗板6次，加入显色液A 25μl，再加入显色液B 25μl，37℃孵育10min后，检测发光值并计算相应浓度。

结果

为考察IFITMs在小鼠水动力模型中是否具有抑制HBV基因表达的作用，将pAAVMCS、pAAVMCS-IFNa、pAAVMCS-IFITM1、pAAVMCS-IFITM2、pAAVMCS-IFITM3分别与等量pHBV1.18质粒共溶于小鼠体重1/10体积的PBS中，5-8秒内匀速注射完毕建立HBV小鼠水动力模型，其中pAAVMCS与pHBV1.18组为模型对照组，pAAVMCS-IFNa与pHBV1.18组为阳性对照组。造模后第1、3、5、7天小鼠尾静脉取血，检测HBsAg和HBeAg含量。结果如图4、图5所示。由图中可见，IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白分子小鼠体内均可显著抑制HBsAg和HBeAg的表达水平，其中以IFITM3效果最好，优于IFNa和同族分子IFITM1和IFITM2。

结论

IFITM3体内可显著降低乙型肝炎病毒HBsAg和HBeAg表达水平，效果优于IFNa和同族分子IFITM1、IFITM2。

实施例四IFITM3蛋白分子缺失突变体体外抗HBV复制检测结果

1.细胞培养

方法同实施例一。

2.质粒

含IFITM3不同长度氨基酸序列的pAAVMCS-IFITM3(56-133)和pAAVMCS-IFITM3(79-133)表达质粒由本实验室构建保存，pAAVMCS-IFITM3(56-133)含IFITM3第56到第133位氨基酸，pAAVMCS-IFITM3(79-133)含IFITM3第79到第133位氨基酸。

3.细胞转染

方法同实施例一。

4.HBsAg、HBeAg检测

方法同实施例一。

5.HBV DNA检测

方法同实施例一。

结果

为初步确认IFITM3蛋白分子抑制HBV基因表达的关键结构域，将pAAVMCS-IFNa、pAAVMCS-IFITM3、pAAVMCS-IFITM3(56-133)和pAAVMCS-IFITM3(79-133)分别与pHBV1.31质粒以1∶1比例共转染HepG2细胞，同时设空质粒pAAVMCS与pHBV1.31共转染细胞对照。72h后收集细胞培养液，ELISA定量试剂盒检测细胞上清HBsAg和HBeAg含量，并计算各样本相对于对照组的相对含量，结果如图6所示，由图中可见，当IFITM3蛋白分子跨膜结构域I(第57-78氨基酸)缺失后丧失了对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用。

结论

跨膜结构域I可能是IFITM3能够抑制HBV基因表达的关键结构域。

Claims

1.一种蛋白在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的新用途，其特征在于所述蛋白含有以下的氨基酸序列：

1.1序列表SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

1.2相对于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸的突变、缺失、添加且能抑制HBV转录或复制的氨基酸序列；

1.3相对于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列有90％以上同源性且能抑制HBV转录或复制的氨基酸序列。

2.一种核苷酸序列，其特征在于所述核苷酸序列编码权利要求1所述的蛋白。

3.一种基因治疗载体，其特征在于所述载体含有权利要求2所述的核苷酸序列。

4.一种能够生产权利要求1蛋白的细胞，其特征在于含有权利要求2的核苷酸序列。

5.一种治疗乙肝病毒感染相关疾病的治疗药物及其组合物，其特征在于含有权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的核苷酸序列或权利要求3所述的基因治疗载体。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述IFITM3蛋白可以经过聚乙二醇、跨膜肽、右旋糖酐、肝素、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸或多聚唾液酸修饰。

7.根据权利要求5所述的用途，其中所述药物可以制成注射剂、冻干粉针、微球、粉末、粉雾剂、气雾剂、肠溶衣、毫微球、微乳或复乳。