JP2991745B2 - ヒトエンドセリン―２の製造法 - Google Patents
ヒトエンドセリン―２の製造法Info
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- JP2991745B2 JP2991745B2 JP17538890A JP17538890A JP2991745B2 JP 2991745 B2 JP2991745 B2 JP 2991745B2 JP 17538890 A JP17538890 A JP 17538890A JP 17538890 A JP17538890 A JP 17538890A JP 2991745 B2 JP2991745 B2 JP 2991745B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト腎臓細胞を用いたヒト血管収縮ペプチド
たるエンドセリン−２の製造方法に関する。
たるエンドセリン−２の製造方法に関する。
〔従来の技術〕 内皮依存性の血管拡張反応とならんで、種々の刺激に
対する内皮依存性の血管収縮反応が報告されている。血
管の伸張や内圧の亢進といった機械的負荷による収縮、
トロンビンによる収縮、血中酸素の減少による収縮、さ
らにはニューロペプチドＹ〔プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オ
ブ・ザ・ユー・エス・エー（Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.
A.），79,5485（1982）；同,81,4577（1984）〕による
ノルアドレナリン収縮の増強などがその例である。
対する内皮依存性の血管収縮反応が報告されている。血
管の伸張や内圧の亢進といった機械的負荷による収縮、
トロンビンによる収縮、血中酸素の減少による収縮、さ
らにはニューロペプチドＹ〔プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オ
ブ・ザ・ユー・エス・エー（Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.
A.），79,5485（1982）；同,81,4577（1984）〕による
ノルアドレナリン収縮の増強などがその例である。
アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー（Am
er.J.Physiol.）,248,C550（1985）およびジャーナル・
オブ・セル・フィジオロジー（J.Cell Physiol.），13
2,263（1987）には内皮細胞由来の冠血管収縮因子（分
子量はそれぞれ8,500,3,000）が記載されているが構造
は不明である。また、ジャーナル・オブ・ファーマコロ
ジー・アンド・エクスペリメンタル・セラビューティク
ス（J.Pharmacl.Exp.Ther.）236,339（1985）にも内皮
細胞由来のペプチド様物質が記載されているが、これも
構造は不明である。
er.J.Physiol.）,248,C550（1985）およびジャーナル・
オブ・セル・フィジオロジー（J.Cell Physiol.），13
2,263（1987）には内皮細胞由来の冠血管収縮因子（分
子量はそれぞれ8,500,3,000）が記載されているが構造
は不明である。また、ジャーナル・オブ・ファーマコロ
ジー・アンド・エクスペリメンタル・セラビューティク
ス（J.Pharmacl.Exp.Ther.）236,339（1985）にも内皮
細胞由来のペプチド様物質が記載されているが、これも
構造は不明である。
一方、血管収縮作用を有するペプチドとしてバソプレ
ッシン（Vasopressin）が知られていて、そのアミノ酸
配列も明確にされているが、バソプレッシンが哺乳類ま
たは鳥類の血管内皮細胞をオリジンとして得られたとい
う報告はない。また、血管収縮作用を有するアンジオテ
ンシン（Angiotensin）がウシ大動脈の内皮細胞から得
られるという報告〔サーキュレーション・リサーチ（Ci
rculation Research），60,422（1987）〕があるが、ア
ンジオテンシンは分子量約1,000のペプチドである。
ッシン（Vasopressin）が知られていて、そのアミノ酸
配列も明確にされているが、バソプレッシンが哺乳類ま
たは鳥類の血管内皮細胞をオリジンとして得られたとい
う報告はない。また、血管収縮作用を有するアンジオテ
ンシン（Angiotensin）がウシ大動脈の内皮細胞から得
られるという報告〔サーキュレーション・リサーチ（Ci
rculation Research），60,422（1987）〕があるが、ア
ンジオテンシンは分子量約1,000のペプチドである。
また本出願人は同様の血管収縮作用を有するペプチド
として、先にブタ大動脈内皮細胞よりブタ・エンドセリ
ンを単離することに成功し（特開平１−206997号）、ま
た本出願人はヒト・エンドセリンの単Ｒ、ブタ・エンド
セリンおよびヒト・エンドセリンの相補DNAのクローニ
ングにも成功している（特願昭62−275613号、同62−31
3155号、同63−148158号および同63−274454号）。この
ブタおよびヒト・エンドセリンの成熟ポリペプチドのア
ミノ酸配列は同一で、これをエンドセリン−１と呼んで
いる。
として、先にブタ大動脈内皮細胞よりブタ・エンドセリ
ンを単離することに成功し（特開平１−206997号）、ま
た本出願人はヒト・エンドセリンの単Ｒ、ブタ・エンド
セリンおよびヒト・エンドセリンの相補DNAのクローニ
ングにも成功している（特願昭62−275613号、同62−31
3155号、同63−148158号および同63−274454号）。この
ブタおよびヒト・エンドセリンの成熟ポリペプチドのア
ミノ酸配列は同一で、これをエンドセリン−１と呼んで
いる。
更に、本出願人は、ラット・エンドセリンの単離、相
補DNAのクローニングについても出願を行っており（特
願昭63−174935号、および特願昭63−188083号）、これ
をエンドセリン−３と呼んでいる。
補DNAのクローニングについても出願を行っており（特
願昭63−174935号、および特願昭63−188083号）、これ
をエンドセリン−３と呼んでいる。
更に本出願人はマウス・エンドセリンの単離、相補DN
Aのクローニングについても出願を行っており（特願昭6
3−223389号）、これをエンドセリンＢと呼んでいる。
Aのクローニングについても出願を行っており（特願昭6
3−223389号）、これをエンドセリンＢと呼んでいる。
更に、本出願人は先に出願したヒト・エンドセリンの
一部をコードする合成DNAをプローブとして使用して、
ヒトゲノムDNAライブラリーから、先のエンドセリン−
１〔ヒト・エンドセリン（エンドセリンＡ）〕とは異な
るアミノ酸配列をもつエンドセリンをコードするDNAを
クローニングすることに成功し、この新規なアミノ酸配
列のヒト・エンドセリンをエンドセリン−２（ヒト・エ
ンドセリンＡ−IIと呼ぶこともある）と命名した。
一部をコードする合成DNAをプローブとして使用して、
ヒトゲノムDNAライブラリーから、先のエンドセリン−
１〔ヒト・エンドセリン（エンドセリンＡ）〕とは異な
るアミノ酸配列をもつエンドセリンをコードするDNAを
クローニングすることに成功し、この新規なアミノ酸配
列のヒト・エンドセリンをエンドセリン−２（ヒト・エ
ンドセリンＡ−IIと呼ぶこともある）と命名した。
第２図にこれらエンドセリン−1,B,−2,−３のアミノ
酸配列を比較して示す。
酸配列を比較して示す。
なお、ここでエンドセリンは総称して、分子量2500±
300で、アミノ酸21個からなるペプチドであり、そのア
ミノ酸配列のＮ末端から数えて第１番目、第３番目、第
11番目、第15番目に位置する４個のCysが２組のＳ−Ｓ
結合を形成している構造を有するものである。このジス
ルフィド結合の組合せとしては、１−15、３−11の組合
せ、および１−11、３−15の組合せがあるが、前者の組
合せのものの方が生成の割合が高く、また活性も高い。
300で、アミノ酸21個からなるペプチドであり、そのア
ミノ酸配列のＮ末端から数えて第１番目、第３番目、第
11番目、第15番目に位置する４個のCysが２組のＳ−Ｓ
結合を形成している構造を有するものである。このジス
ルフィド結合の組合せとしては、１−15、３−11の組合
せ、および１−11、３−15の組合せがあるが、前者の組
合せのものの方が生成の割合が高く、また活性も高い。
なお、これまで各種エンドセリンについては種々の呼
び方がされていたが、この呼び方を統一した。従来の呼
び方と比較して示すと、以下のとおりとなる。
び方がされていたが、この呼び方を統一した。従来の呼
び方と比較して示すと、以下のとおりとなる。
本発明 従来 エンドセリン−１ エンドセリンＡ（ヒト・エンドセ
リン，ブタ・エンドセリン） エンドセリンα エンドセリン−Ｂ エンドセリンＢ エンドセリンβ マウス・エンドセリン エンドセリン−３ エンドセリンＣ エンドセリンγ ラット・エンドセリン 一方、ET−１（２）およびET−３の高感度EIA系が設
定され（特願昭63−47431号、特願昭63−148159号、お
よび特願平１−188873号）、エンドセリンの病態生理学
的研究に利用され始めている。
リン，ブタ・エンドセリン） エンドセリンα エンドセリン−Ｂ エンドセリンＢ エンドセリンβ マウス・エンドセリン エンドセリン−３ エンドセリンＣ エンドセリンγ ラット・エンドセリン 一方、ET−１（２）およびET−３の高感度EIA系が設
定され（特願昭63−47431号、特願昭63−148159号、お
よび特願平１−188873号）、エンドセリンの病態生理学
的研究に利用され始めている。
上記のように、血管収縮活性を有する21個のアミノ酸
から成る血管収縮ペプチドエンドセリンは、そのcDNAお
よびゲノムDNAの解析から三種類、すなわちエンドセリ
ン−１（ET−１）、エンドセリン−２（ET−２）、エン
ドセリン−３（ET−３）等の構造が知られており、エン
ドセリン−１および−３の前駆体をコードするcDNAの構
造は既に出願されているが、ヒトエンドセリン−２の遺
伝子の発現や、もし発現されているとしても、その前駆
体の構造などについての情報は不十分であった。このこ
とは、ヒトエンドセリン−２を分泌、生産している臓
器、あるいは組織が不明であることに基因するものであ
り、これらを解決することが一つの課題であった。
から成る血管収縮ペプチドエンドセリンは、そのcDNAお
よびゲノムDNAの解析から三種類、すなわちエンドセリ
ン−１（ET−１）、エンドセリン−２（ET−２）、エン
ドセリン−３（ET−３）等の構造が知られており、エン
ドセリン−１および−３の前駆体をコードするcDNAの構
造は既に出願されているが、ヒトエンドセリン−２の遺
伝子の発現や、もし発現されているとしても、その前駆
体の構造などについての情報は不十分であった。このこ
とは、ヒトエンドセリン−２を分泌、生産している臓
器、あるいは組織が不明であることに基因するものであ
り、これらを解決することが一つの課題であった。
課題を解決するための手段 ヒト・エンドセリン−２のcDNAのクローニング、ある
いはエンドセリン変換酵素の阻害剤のアッセイ系の開発
を目的として、上記のEIA系を使用し、血管内皮細胞以
外の種々の細胞がETを産生するのかどうかを検討した結
果、ヒトの腎ガン細胞（Human renal adenocarcinoma,A
CHN）がETを産生している事を見出した。このETを逆相
のHPLC（High performance liquid chromatography）で
分離して、ETの種類を検討したところ、ACHN細胞が分泌
するETはET−２であることが判明した。このACHN細胞は
ET−２以外のET−１およびET−３を全く分泌せず、ET−
２だけを生産するものであることが明らかとなったので
ある。このET−２だけを特異的に産生する細胞ACHNを大
量培養し、ET−２だけを製造することができると同時
に、又ACHN細胞はET−２の産生を阻害する阻害剤の開発
に利用できると考えられる。
いはエンドセリン変換酵素の阻害剤のアッセイ系の開発
を目的として、上記のEIA系を使用し、血管内皮細胞以
外の種々の細胞がETを産生するのかどうかを検討した結
果、ヒトの腎ガン細胞（Human renal adenocarcinoma,A
CHN）がETを産生している事を見出した。このETを逆相
のHPLC（High performance liquid chromatography）で
分離して、ETの種類を検討したところ、ACHN細胞が分泌
するETはET−２であることが判明した。このACHN細胞は
ET−２以外のET−１およびET−３を全く分泌せず、ET−
２だけを生産するものであることが明らかとなったので
ある。このET−２だけを特異的に産生する細胞ACHNを大
量培養し、ET−２だけを製造することができると同時
に、又ACHN細胞はET−２の産生を阻害する阻害剤の開発
に利用できると考えられる。
即ち、本発明はヒト腎臓細胞を培養しヒトエンドセリ
ン−２を製造する方法に関し、詳しくはヒト腎臓細胞
（ACHN細胞）を培養し培養液上清よりヒト・エンドセリ
ン−２を回収することからなるヒト・エンドセリン−２
の製造法に関するものである。
ン−２を製造する方法に関し、詳しくはヒト腎臓細胞
（ACHN細胞）を培養し培養液上清よりヒト・エンドセリ
ン−２を回収することからなるヒト・エンドセリン−２
の製造法に関するものである。
ACHN細胞としては、アメリカのATCC（American Type
Culture Collection）より購入することができ、例えば
ATCC CRL1611などが挙げられる。
Culture Collection）より購入することができ、例えば
ATCC CRL1611などが挙げられる。
培養の際の培地としては、たとえば約５〜20％の胎児
牛血清を含むMEM培地〔サイエンス（Science）122,501
（1952）〕,DMEM培地〔ヴィロロジー（Viro−logy），
８,396（1959）〕,RPMI1640培地〔ジャーナル・オブ・
ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The
Jounal of the American Medical Association）199,51
9（1967）〕,199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソ
サイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Pro−ceeding of the Society for the Biological M
edicine）73,1（1950）〕などが挙げられる。pHは約６
〜８であるのが好ましい。培養は通常約30〜40℃で約15
〜60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
牛血清を含むMEM培地〔サイエンス（Science）122,501
（1952）〕,DMEM培地〔ヴィロロジー（Viro−logy），
８,396（1959）〕,RPMI1640培地〔ジャーナル・オブ・
ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The
Jounal of the American Medical Association）199,51
9（1967）〕,199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソ
サイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Pro−ceeding of the Society for the Biological M
edicine）73,1（1950）〕などが挙げられる。pHは約６
〜８であるのが好ましい。培養は通常約30〜40℃で約15
〜60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
上記培養物からヒト・エンドセリン−２の成熟ペプチ
ド（エンドセリン−２）を分離精製するには、例えば下
記の方法により行なうことができる。
ド（エンドセリン−２）を分離精製するには、例えば下
記の方法により行なうことができる。
エンドセリン−２の成熟ペプチドを細胞から抽出する
に際しては、培養後、公知の方法で細胞を集め、これを
適当な緩衝液に懸濁し、超音波、凍結融解などによって
細胞を破壊したのち、10倍量の1M酢酸（10μg/mlペプス
タチン）を加えてホモゲナイズした後、100℃で10分間
加熱する。その後遠心分離やろ過によりヒト・エンドセ
リン−２の成熟ペプチドの粗抽出液を得る方法などが適
宜用い得る。
に際しては、培養後、公知の方法で細胞を集め、これを
適当な緩衝液に懸濁し、超音波、凍結融解などによって
細胞を破壊したのち、10倍量の1M酢酸（10μg/mlペプス
タチン）を加えてホモゲナイズした後、100℃で10分間
加熱する。その後遠心分離やろ過によりヒト・エンドセ
リン−２の成熟ペプチドの粗抽出液を得る方法などが適
宜用い得る。
培養液中にエンドセリン−２前駆体たんぱくや成熟ペ
プチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公
知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を
集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽
出液中に含まれるエンドセリン−２前駆体たんぱくや成
熟ペプチドは、自体公知の分離・精製法を適切に組み合
わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製
法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する
方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子
量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー
などの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマ
トグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相
高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用す
る方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する
方法などが挙げられる。
プチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公
知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を
集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽
出液中に含まれるエンドセリン−２前駆体たんぱくや成
熟ペプチドは、自体公知の分離・精製法を適切に組み合
わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製
法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する
方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子
量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー
などの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマ
トグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相
高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用す
る方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する
方法などが挙げられる。
かくして生成するエンドセリン−２前駆体たんぱくや
成熟ペプチドは特異抗体を用いたエンザイムイムノアッ
セイなどにより測定することができる。また生成物に血
管収縮活性がある場合は、該活性を指標にして測定する
こともできる。
成熟ペプチドは特異抗体を用いたエンザイムイムノアッ
セイなどにより測定することができる。また生成物に血
管収縮活性がある場合は、該活性を指標にして測定する
こともできる。
作用 ACHN細胞はヒト・エンドセリンに関してはエンドセリ
ン−２だけを分泌することが明らかとなり、その利用面
としては次のようなものが挙げられる。
ン−２だけを分泌することが明らかとなり、その利用面
としては次のようなものが挙げられる。
ｉ）エンドセリン変換酵素の精製材料、 ii）エンドセリン変換酵素の阻害剤の開発のためのアッ
セイ細胞、 iii）ヒト・エンドセリン−２の前駆体をコードするcDN
Aをクローニングし、ビッグエンドセリン−２の構造を
知り、エンドセリン−1,3と共にエンドセリンの相互の
生理活性を検討するためのmRNAの供給細胞、および iv）ヒト・エンドセリン−２精製取得に利用し得るACHN
細胞。
セイ細胞、 iii）ヒト・エンドセリン−２の前駆体をコードするcDN
Aをクローニングし、ビッグエンドセリン−２の構造を
知り、エンドセリン−1,3と共にエンドセリンの相互の
生理活性を検討するためのmRNAの供給細胞、および iv）ヒト・エンドセリン−２精製取得に利用し得るACHN
細胞。
本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸な
どを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commision on Bi
ochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野に
おける慣用略号に基づくものであり、その例を下記す
る。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、
特に明示しなければＬ−体を示すものとする。
どを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commision on Bi
ochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野に
おける慣用略号に基づくものであり、その例を下記す
る。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、
特に明示しなければＬ−体を示すものとする。
DNA :デオキシリボ核酸 cDNA:相補的デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン RNA :リボ核酸 mRNA:メッセンジャーリボ核酸 dATP:デオキシアデノシン三リン酸 dTTP:デオキシチミジン三リン酸 dGTP:デオキシグアノシン三リン酸 dCTP:デオキシシチジン三リン酸 ATP :アデノシン三リン酸 EDTA:エチレンジアミン四酢酸 SDS :ドデシル硫酸ナトリウム GlyまたはG:グリシン AlaまたはA:アラニン ValまたはV:バリン LeuまたはL:ロイシン IleまたはI:イソロイシン SerまたはS:セリン ThrまたはT:スレオニン CysまたはC:システイン MetまたはM:メチオニン GluまたはE:グルタミン酸 AspまたはD:アスパラギン酸 LysまたはK:リジン ArgまたはR:アルギニン HisまたはH:ヒスチジン PheまたはF:フェニールアラニン TyrまたはY:チロシン TrpまたはW:トリプトファン ProまたはP:プロリン AsnまたはN:アスパラギン GlnまたはQ:グルタミン 実施例 以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこの実
施例に限定されるものでないことは言うまでもない。
施例に限定されるものでないことは言うまでもない。
実施例１ ヒトエンドセリン−２の製造 1.細胞の培養 アメリカのATCCより購入したACHN細胞CRL1611を、10
％の牛胎児血清を含むEagle's MEM中でストレプトマイ
シン、カナマイシンの存在下に37℃、５％のCO2の存在
下に、150cm2のプラスチック製フラスコ（ファルコン社
製）で４〜５日培養する。
％の牛胎児血清を含むEagle's MEM中でストレプトマイ
シン、カナマイシンの存在下に37℃、５％のCO2の存在
下に、150cm2のプラスチック製フラスコ（ファルコン社
製）で４〜５日培養する。
2.ACHN細胞培養液中のエンドセリンの測定 ACHN細胞培養開始後、４〜５日に無血清培地に交換
し、３〜４日後に培養液を回収した。
し、３〜４日後に培養液を回収した。
その培養液をTOMYの冷却遠心機で15,000回転、４℃で
遠心した後、上清をとり逆相HPLCにかけた。試料をODS
−80TMカラムに添加し、0.05％TFA（Trinitro fluoro a
cetice acid）含有の５％CH3CNおよび60％CH3CNの直線
勾配で溶出した後、吸光度をとり、N2ガスで乾固した。
遠心した後、上清をとり逆相HPLCにかけた。試料をODS
−80TMカラムに添加し、0.05％TFA（Trinitro fluoro a
cetice acid）含有の５％CH3CNおよび60％CH3CNの直線
勾配で溶出した後、吸光度をとり、N2ガスで乾固した。
試料をエンドセリン測定用EIAのサンプルバッファー
に溶解した後、免疫反応性のあるエンドセリン活性を検
出した。また同時に化学合成したエンドセリン−1,2,3;
ヒトビッグエンドセリン−1,ブタビッグエンドセリン−
１を同一のカラムにかけて、その溶出位置を比較検討し
た結果、ACHN細胞が分泌する免疫反応性のあるエンドセ
リンはエンドセリン−２であることが判明した（第１
図）。
に溶解した後、免疫反応性のあるエンドセリン活性を検
出した。また同時に化学合成したエンドセリン−1,2,3;
ヒトビッグエンドセリン−1,ブタビッグエンドセリン−
１を同一のカラムにかけて、その溶出位置を比較検討し
た結果、ACHN細胞が分泌する免疫反応性のあるエンドセ
リンはエンドセリン−２であることが判明した（第１
図）。
実施例２ ヒトエンドセリン−２の精製 ヒトの腎臓癌細胞であるACHN細胞が、エンドセリンの
サブタイプの中でもエンドセリン−２だけを特異的に分
泌することを、RP−HPLC（逆相高速液体クロマトグラフ
ィー）とエンザイムイムノアッセイで明らかにし、精製
を行った。
サブタイプの中でもエンドセリン−２だけを特異的に分
泌することを、RP−HPLC（逆相高速液体クロマトグラフ
ィー）とエンザイムイムノアッセイで明らかにし、精製
を行った。
1.ACHN細胞の培養 American Type Culture Collection（ATCC）から購入
したACHN細胞をEagle minimun essential medium（Ｅ−
MEM）とRPMI−1640medium（1:1）に10％牛胎児血清と50
ug/mlの濃度にカナマイシンを添加し、５％CO2,95％空
気の条件で37℃で培養する。ファルコンの150cm2培養フ
ラスコに細胞を植え付けてから３−５日後に血清を含ま
ない上記の培養液に交換してから、更に７−10日間培養
を続けた後、培養液を集め精製に使用した。
したACHN細胞をEagle minimun essential medium（Ｅ−
MEM）とRPMI−1640medium（1:1）に10％牛胎児血清と50
ug/mlの濃度にカナマイシンを添加し、５％CO2,95％空
気の条件で37℃で培養する。ファルコンの150cm2培養フ
ラスコに細胞を植え付けてから３−５日後に血清を含ま
ない上記の培養液に交換してから、更に７−10日間培養
を続けた後、培養液を集め精製に使用した。
2.エンドセリン−２のカラムクロマトグラムを用いた精
製 ACHN細胞の無血清培養液、5.5リットルをエンドセリ
ン−２の精製に使用した。培養液中の免疫反応陽性（im
munoreactive）エンドセリン−２の含量は500−700pg/m
lであった。培養液にアセトニトリル（CH3CN）を最終濃
度20％となるように加え、pHを3.0−4.0となるように塩
酸を加えた。次いでPREPODS C18カラム（20×50mm）（G
ASUKURO Kogyo）にかけた。吸着物を0.05％のトリフル
オロ酢酸を含む５〜60％のアセトニトリル（CH3CN）で
溶出した（第３図）。
製 ACHN細胞の無血清培養液、5.5リットルをエンドセリ
ン−２の精製に使用した。培養液中の免疫反応陽性（im
munoreactive）エンドセリン−２の含量は500−700pg/m
lであった。培養液にアセトニトリル（CH3CN）を最終濃
度20％となるように加え、pHを3.0−4.0となるように塩
酸を加えた。次いでPREPODS C18カラム（20×50mm）（G
ASUKURO Kogyo）にかけた。吸着物を0.05％のトリフル
オロ酢酸を含む５〜60％のアセトニトリル（CH3CN）で
溶出した（第３図）。
免疫反応陽性なエンドセリン分画を集め、第２段階の
RR−HPLC（C18 TSK−ODS−80Tm 6.6×250mm,Tosoh）に
かけた。溶出物を凍結乾燥した後、0.05M NaCl,10mM H3
PO4,20％イソプロパノール,pH6.7の溶媒に溶解した。次
いで陰イオン交換HPLC（TSK−Quardernary amino,G200
SWカラム,6×10mm,Tosoh）にかけ、0.05〜0.2MのNaClを
含む、上記溶媒で溶出し（第４図）、免疫反応陽性なエ
ンドセリン分画をさらにRP−HPLCにかけた（第５図）。
再び陰イオン交換HPLCにかけ、0.05〜0.3MのNaClを含む
10mM H3PO4,20％イソプロパノールで溶出した（第６
図）。次いで第５、第６段階のHPLCを行って免疫反応陽
性なエンドセリンを精製した（第７図及び第８図）。
RR−HPLC（C18 TSK−ODS−80Tm 6.6×250mm,Tosoh）に
かけた。溶出物を凍結乾燥した後、0.05M NaCl,10mM H3
PO4,20％イソプロパノール,pH6.7の溶媒に溶解した。次
いで陰イオン交換HPLC（TSK−Quardernary amino,G200
SWカラム,6×10mm,Tosoh）にかけ、0.05〜0.2MのNaClを
含む、上記溶媒で溶出し（第４図）、免疫反応陽性なエ
ンドセリン分画をさらにRP−HPLCにかけた（第５図）。
再び陰イオン交換HPLCにかけ、0.05〜0.3MのNaClを含む
10mM H3PO4,20％イソプロパノールで溶出した（第６
図）。次いで第５、第６段階のHPLCを行って免疫反応陽
性なエンドセリンを精製した（第７図及び第８図）。
3.アミノ酸組成の分析 精製試料（第５図のiv−ET−14分画）を6N−塩酸で13
0℃、30分間処理した後、Tosohのアミノ酸分析機で分析
した。
0℃、30分間処理した後、Tosohのアミノ酸分析機で分析
した。
4.アミノ酸配列の決定 アミノ酸配列はApplied Biosystems社のModel477Aで
行った。
行った。
5.分子量の測定 分子量の測定はJEOL,LMS−HX110HFで行った。
以上の方法により精製した免疫反応陽性なエンドセリ
ンは、合成したエンドセリン−２とHPLCでの溶出位置が
合致し分子量は2547ダルトン、アミノ酸配列はＸ−Ｓ−
Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｗ−Ｌ−Ｘ−Ｋ−Ｅ−Ｘ−Ｖ−Ｙ−Ｙ−Ｘ
−Ｈ−Ｌ−Ｘ−Ｉ−Ｉ−Ｘと決定され（Ｘは未決定部
分）、ヒトエンドセリン−２と同等の筋収縮活性が示さ
れたことから、エンドセリン−２と推定された。
ンは、合成したエンドセリン−２とHPLCでの溶出位置が
合致し分子量は2547ダルトン、アミノ酸配列はＸ−Ｓ−
Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｗ−Ｌ−Ｘ−Ｋ−Ｅ−Ｘ−Ｖ−Ｙ−Ｙ−Ｘ
−Ｈ−Ｌ−Ｘ−Ｉ−Ｉ−Ｘと決定され（Ｘは未決定部
分）、ヒトエンドセリン−２と同等の筋収縮活性が示さ
れたことから、エンドセリン−２と推定された。
発明の効果 本発明でACHN細胞を培養することにより、ヒト・エン
ドセリン−２のみを製造することができ、ヒト・エンド
セリン−２の大量生産の道が拓けたものである。
ドセリン−２のみを製造することができ、ヒト・エンド
セリン−２の大量生産の道が拓けたものである。
第１図は本発明でヒト・エンドセリン−２が得られてい
ることを示すクロマトグラフである。 第２図は各種エンドセリンのアミノ酸配列を比較して示
した図である。 第３図〜第８図は本発明で得られたエンドセリン−２の
カラムクロマトグラムによる精製状況を示す図であり、
第３図は第１段階のHPLC、第４図は第２段階のRP−HPL
C、第５図は第３段階のRP−HPLC、第６図は第４段階の
陰イオン交換HPLC、第７図及び第８図は第５、第６段階
のHPLCに関する図である。
ることを示すクロマトグラフである。 第２図は各種エンドセリンのアミノ酸配列を比較して示
した図である。 第３図〜第８図は本発明で得られたエンドセリン−２の
カラムクロマトグラムによる精製状況を示す図であり、
第３図は第１段階のHPLC、第４図は第２段階のRP−HPL
C、第５図は第３段階のRP−HPLC、第６図は第４段階の
陰イオン交換HPLC、第７図及び第８図は第５、第６段階
のHPLCに関する図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ
Claims (3)
- 【請求項１】ヒト腎ガン細胞ACHN細胞を培養しヒト・エ
ンドセリン−２を製造する方法。 - 【請求項２】培養上清よりヒト・エンドセリン−２を回
収することからなる請求項１記載の方法。 - 【請求項３】ヒト・エンドセリン−２がCys Ser Cys
Ser Ser Trp Leu Asp Lys Glu Cys Val Tyr
Phe Cys His Leu Asp Ile Ile Trpで表される
アミノ酸配列を有するペプチドである請求項１または請
求項２記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-2439 | 1990-01-11 | ||
| JP243990 | 1990-01-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03251194A JPH03251194A (ja) | 1991-11-08 |
| JP2991745B2 true JP2991745B2 (ja) | 1999-12-20 |
Family
ID=11529308
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17538890A Expired - Fee Related JP2991745B2 (ja) | 1990-01-11 | 1990-07-04 | ヒトエンドセリン―２の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2991745B2 (ja) |
-
1990
- 1990-07-04 JP JP17538890A patent/JP2991745B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８９）Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．１３，ｐ．５３８９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03251194A (ja) | 1991-11-08 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |