JPH03251194A - ヒトエンドセリン―２の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト腎臓細胞を用いたヒト血管収縮ペプチドた
るエンドセリン−２の製造方法に関する。

〔従来の技術〕

内皮依存性の血管拡張反応とならんで、種々の刺激に対
する内皮依存性の血管収縮反応が報告されている。血管
の伸張や内圧の先進といった機械的負荷による収縮、ト
ロンビンによる収縮、血中酸素の減少による収縮、さら
にはニューロペプチドＹ〔プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ
・ザ・ニー・ニス・ニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、ＩＪ、Ｓ。

Ａ、）、７９．５４８５（１９８２）；同、　８Ｌ４５
７７（１９１１４）］によるノルアドレナリン収縮の増
強などがその例である。

アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー（Ａ＋
＋＋ｅｒ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、２４８．Ｃ５
５０（１９８５）およびジャーナル・オブ・セル・フィ
ジオロジ−（Ｊ、　Ｃｅ１ｌＰｈｙｓｉｏ１．）、１３
２，２６３（１９８７）には内皮細胞由来の冠血管収縮
因子（分子量はそれぞれ８，５００．３，０００）が記
載されているが構造は不明である。また、ジャーナル・
オブ・ファーマコロジー・アンド・エクスペリメンタル
・セラビューティクス（Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｌ。

Ｅｘｐ、　Ｔｈｅｒ、）　２３６．３３９　（１９８５
）にも内皮細胞由来のペプチド様物質が記載されている
が、これも構造は不明である。

一方、血管収縮作用を有するペプチドとしてバソプレッ
シン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）が知られていて、その
アミノ酸配列も明確にされているが、バソプレッシンが
哺乳類または鳥類の血管内皮細胞をオリジンとして得ら
れたという報告はない。また、血管収縮作用を有するア
ンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎ５ｉｎ）がウシ大動
脈の内皮細胞から得られるという報告［サーキュレーシ
ョン・リサーチ（ＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒ
ｃｈ）、６０，４２２（１９８７）］があるが、アンジ
オテンシンは分子量的１　、０００のペプチドである。

また本出願人は同様の血管収縮作用を有するペプチドと
して、先にブタ大動脈内皮細胞よりブタ・エンドセリン
を単離することに成功しく特開平１−２０６９９７号）
、また本出願人はヒト・エンドセリンの単離、ブタ・エ
ンドセリンおよびヒト・エンドセリンの相補ＤＮＡのク
ローニングにも成功している（特願昭６２−２７５６１
３号、同６２−３１３１５５号、同６３−１４８１５８
号および同６３−２７４４５４号）。このブタおよびヒ
ト・エンドセリンの成熟ポリペプチドのアミノ酸配列は
同一で、これをエンドセリン−１と呼んでいる。

更に、本出願人は、ラット・エンドセリンの単離、相補
ＤＮＡのクローニングについても８願を行っており（特
願昭６３−１７４９３５号、および特願昭６３−１８８
０８３号）、これをエンドセリン−３と呼んでいる。

更に本出願人はマウス・エンドセリンの単離、相補ＤＮ
Ａのクローニングについても出願を行っており（特願昭
６３−２２３３８９号）、これをエンドセリンＢと呼ん
でいる。

更に、本出願人は先に出願したヒト・エンドセリンの一
部をコートする合成りＮＡをプローブとして使用して、
ヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、先のエンドセリン
−１〔ヒト・エンドセリン（エンドセリンＡ））とは異
なるアミノ酸配列をもつエンドセリンをコードするＤＮ
Ａをクローニングすることに成功し、この新規なアミノ
酸配列のヒト・エンドセリンをエンドセリン−２（ヒト
・エンドセリンＡ−ＩＩと呼ぶこともある）と命名した
。

第２図にこれらエンドセリン−１，Ｂ、−２゜−３のア
ミノ酸配列を比較して示す。

なお、ここでエンドセリンは総称して、分子量２５００
±３００で、アミノ酸２１個からなるペプチドであり、
そのアミノ酸配列のＮ末端から数えて第１番目、第３番
目、第１１番目、第１５番目に位置する４個のＣｙｓが
２組のＳ−８結合を形成している構造を有するものであ
る。このジスルフィド結合の組合せとしては、■−１５
，３−１１の組合せ、および１−１１．３−１５の組合
せがあるが、前者の組合せのものの方が生成の割合が高
く、また活性も高い。

なお、これまで各種エンドセリンについては種々の呼び
方がされていたが、この呼び方を統一した。従来の呼び
方と比較して示すと、以下のとおりとなる。

杢Ｊ１吐 エンドセリン−１ ■ エンドセリンＡ （ヒト・エンドセリン。

ブタ・エンドセリン） エンドセリンα エンドセリンＢ エンドセリンβ マウス・エンドセリン エンドセリンＣ エンドセリンγ ラット・エンドセリン エンドセリン−Ｂ エンドセリン−３ 一方、ＥＴ−１（２）およびＥＴ−３の高感度ＥＩＡ系
が設定され（特願昭６３−４７４３１号、特願昭６３−
１４８１５９号、および特願平１−１８８８７３号）、
エンドセリンの病態生理学的研究に利用され始めている
。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記のように、血管収縮活性を有する２１個のアミノ酸
から成る血管収縮ペプチドエンドセリンは、そのｃＤＮ
ＡおよびゲノムＤＮＡの解析から三種類、すなわちエン
ドセリン−１（ＥＴ−１）。

エンドセリン−２（ＥＴ−２）　、エンドセリン３　（
ＥＴ−３）等の構造が知られており、エンドセリン−１
および−３の前駆体をコードするｃＤＮＡの構造は既に
出願されているが、ヒトエンドセリン−２の遺伝子の発
現や、もし発現されているとしても、その前駆体の構造
などについての情報は不十分であった。このことは、ヒ
トエンドセリン−２を分泌、生産している臓器、あるい
は組織が不明であることに基因するものであり、これら
を解決することが一つの課題であった。

課　を解決するための手段 ヒト・エンドセリン−２のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのクローニン
グ、あるいはエンドセリン変換酵素の阻害剤のアッセイ
系の開発を目的として、上記のＥＩＡ系を使用し、血管
内皮細胞以外の種々の細胞がＥＴを産生するのかどうか
を検討した結果、ヒトの胃ガン細胞（Ｈｕ＋ｓａｎ　ｒ
ｅｎａｌ　ａｄｅｎｏ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ、　Ａ　Ｃ
ＨＮ）がＥＴを産生じている事を見出した。このＥＴを
逆相のＨＰ　Ｌ　Ｃ（）ｌｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｎ＋ａ
ｎｃｅ　１ｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
）で分離して＋ＥＴの種類を検討したところ、ＡＣＨＮ
細胞が分泌するＥＴはＥＴ−２であることが判明した。

このＡＣＨＮ細胞はＥＴ−２以外のＥＴ−１およびＥＴ
−３を全く分泌せず、ＥＴ−２だけを生産するものであ
ることが明らかとなったのである。このＥＴ−２だけを
特異的に産生する細胞ＡＣＨＮを大量培養し、ＥＴ−２
だけを製造することができると同時に、又ＡＣＨＮ細胞
はＥＴ−２の産生を阻害する阻害剤の開発に利用できる
と考えられる。

即ち、本発明はヒト腎臓細胞を培養しヒトエンドセリン
−２を製造する方法に関し、詳しくはヒト腎臓細胞（Ａ
ＣＨＮ細胞）を培養し培養液上清よりヒト・エンドセリ
ン−２を回収することからなるヒト・エンドセリン−２
の製造法に関するものである。

ＡＣＨＮ細胞としては、アメリカのＡＴＣＣ（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ）より購入することができ１例えばＡＴＣＣＣＲ
Ｌ１６１１などが挙げられる。

培養の際の培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児
牛血清を含むＭ　Ｅ　Ｍ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）１２２，５０１（１９５２））　、　Ｄ　Ｍ　Ｅ
　Ｍ培地〔ヴイロロジ−（Ｖｉｒｏ−１ｏｇｙ）、８，
３９６（１９５９））、　ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆｔｈｅ　
Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔ
ｉｏｎ）　１９９，５１９（１９６７））、　１９９培
地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー
・ザ・バイオロジカル・メデイスン（Ｐｒｏ−ｃｅｅｄ
ｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈ
ｅ　Ｂｉ。

ｌｏｇｉｃａｌ阿ｅｄｉｃｉｎｅ）７３．１　（１９５
０））などが挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好
ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間
行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。

上記培養物からヒト・エンドセリン−２の成熟ペプチド
（エンドセリン−２）を分離精製するには、例えば下記
の方法により行なうことができる。

エンドセリン−２の成熟ペプチドを細胞から抽出するに
際しては、培養後、公知の方法で細胞を集め、これを適
当な緩衝液に懸濁し、超音波、凍結融解などによって細
胞を破壊したのち、１０倍量の１Ｍ酢酸（１０μｇ　／
　ｍ　Ｑ　　ペプスタチン）を加えてホモゲナイズした
後、１００℃で１０分間加熱する。その後遠心分離やろ
過によりヒト・エンドセリン−２の成熟ペプチドの粗抽
出液を得る方法などが適宜用い得る。

培養液中にエンドセリン−２前駆体たんばくや成熟ペプ
チドが分泌される場合には、培養終了後。

それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離
し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、
あるいは抽出液中に含まれるエンドセリン−２前駆体た
んばくや成熟ペプチドは、自体公知の分離・精製法を適
切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の
分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度
を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、お
よび５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの
主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマ
トグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニ
ティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用す
る方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性
の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の
差を利用する方法などが挙げられる。

かくして生成するエンドセリン−２前駆体たんばくや成
熟ペプチドは特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセ
イなどにより測定することができる。また生成物に血管
収縮活性がある場合は、該活性を指標にして測定するこ
ともできる。

也■ ＡＣＨＮ細胞はヒト・エンドセリンに関してはエンドセ
リン−２だけを分泌することが明らかとなり、その利用
面としては次のようなものが挙げられる。

ｉ）エンドセリン変換酵素の精製材料、ｉｉ）エンドセ
リン変換酵素の阻害剤の開発のためのアッセイ細胞、 １ｉｉ）ヒト・エンドセリン−２の前駆体をコードする
ｃＤＮＡをクローニングし、ビッグエンドセリン−２の
構造を知り、エンドセリン−１，３と共にエンドセリン
の相互の生理活性を検討するためのｍＲＮＡの供給細胞
、および 泣）ヒト・エンドセリン−２精裏取得に利用し得るＡＣ
ＨＮ細胞。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　　Ｃｏａ
＋ａ＋１ｓｉｏｎ　　ｏｎ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
　　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下
記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合
は、特に明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　　：デオキシリボ核酸 。ＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ　　：アデニン Ｔ　　：チミン Ｇ　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ＲＮＡ　　：リボ核酸 ｍＲＮＡ　：メツセンジャーリポ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオ
キシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオ
キシシチジン三リン酸 ＡＴＰ　　：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ　　ニドデシル硫酸ナトリウム ＧｌｙまたはＧ　ニゲリシン ＡｌａまたはＡ　：アラニン ＶａｌまたはＶ　：バリン ＬｅｕまたはＬ　：ロイシン １１ｅまたは工　：イソロイシン Ｓｅｒまたは５ ＴｈｒまたはＴ ＣｙｓまたはＣ ＭｅｔまたはＭ ＧｌｕまたはＥ ＡｓｐまたはＤ ＬｙｓまたはＫ ＡｒｇまたはＲ ＨｉｓまたはＨ ＰｈｅまたはＦ ＴｙｒまたはＹ Ｔ　ｒ　ｐまたはＷ ＰｒｏまたはＰ ＡｓｎまたはＮ Ｇ　ｌ　ｎまたはＱ ：セリン ：スレオニン ：システイン ：メチオニン ：グルタミン酸 ：アスパラギン酸 ：リジン ：アルギニン ：ヒスチジン ：フエニールアラニン ：チロシン ：トリプトファン ：プロリン ：アスパラギン ：グルタミン 去」１朴 以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこの実施
例に限定されるものでないことは言うまでもない。

実施例１　ヒトエンドセリン−２の製造１、細胞の培養 アメリカのＡＴＣＣより購入したＡＣＨＮ細胞ＣＲＬ１
６１１を、１０％の牛胎児血清を含むＥａｇｌｅ’ｓ　
Ｍ　Ｅ　Ｍ中でストレプトマイシン、カナマイシンの存
在下に３７℃、５％のＣＯ□の存在下に、１５０ｄのプ
ラスチック製フラスコ（ファルコン社製）で４〜５日培
養する。

２、ＡＣＨＮ細胞培養液中のエンドセリンの測定ＡＣＨ
Ｎ細胞培養開始後、４〜５日に無血清培地に交換し、３
〜４日後に培養液を回収した。

その培養液をＴＯＭＹの冷却遠心機で１５，０００回転
、４℃で遠心した後、上清をとり逆相ＨＰＬＣにかけた
。試料をＯＤＳ−８０ＴＭカラムに添加し、０．０５％
Ｔ　Ｆ　Ａ　（Ｔｒｉｎｉｔｒｏ　ｆｌｕｏｒｏ　ａｃ
ｅｔｉｃｅ　ａｃｉｄ）含有の５％ＣＨ，ＣＮおよび６
０％ＣＨｙ　ＣＮの直線勾配で溶出した後、吸光度をと
り、Ｎ２ガスで乾固した。

試料をエンドセリン測定用ＥＩＡのサンプルバッファー
に溶解した後、免疫反応性のあるエンドセリン活性を検
出した。また同時に化学合成したエンドセリン−１，２
，３：ヒトビッグエンドセリンー１．ブタビッグエンド
セリン−１を同一のカラムにかけて、その溶出位置を比
較検討した結果、ＡＣＨＮ細胞が分泌する免疫反応性の
あるエンドセリンはエンドセリン−２であることが判明
した（第１図）。

実施例２　ヒトエンドセリン−２の精製ヒトの腎臓癌細
胞であるＡＣＨＮ細胞が、エンドセリンのサブタイプの
中でもエンドセリン−２だけを特異的に分泌することを
、ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）
とエンザイムイムノアッセイで明らかにし、精製を行っ
た。

１、ＡＣＨＮ細胞の培養 Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入したＡＣＨＮ細胞
をＥａｇｌｅ　＋ａｉｎｉｍｕｎ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ
　　ｍｅｄｉｕｍ（Ｅ　−Ｍ　Ｅ　Ｍ　）　　と　ＲＰ
　Ｍ　　Ｉ　−１６４０ｍｅｄｉｕｍ（１：１）に１０
％牛脂児血清と５０ｕｇ／ｍｌの濃度にカナマイシンを
添加し、５％Ｃｏ、、９５％空気の条件で３７℃で培養
する。ファルコンの１５０ｄ培養フラスコに細胞を植え
付けてから３−５日後に血清を含まない上記の培養液に
交換してから、更に７−１０日間培養を続けた後、培養
液を集め精製に使用した。

２、エンドセリン−２のカラムクロマトグラムを用いた
精製 ＡＣＨＮ細胞の無血清培養液、５．５リツトルをエンド
セリン−２の精製に使用した。培養液中の免疫反応陽性
（ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ）　　エンドセリン−
２の含量は５００−７００　ｐ　ｇ　／　ｍ　ｌであっ
た。培養液にアセトニトリル（ＣＨ，ＣＮ）を最終濃度
２０％となるように加え、ｐＨを３．０−４．０となる
ように塩酸を加えた。次いでＰＲＥＰＯＤＳ　　Ｃ１８
カラム（２０Ｘ　５０ｍ　ｍ　）　（ＧＡＳＵＫＵＲＯ
にｏｇｙｏ）にかけた。吸着物を０．０５％のトリフル
オロ酢酸を含む５〜６０％のアセトニトリル（ＣＨ３Ｃ
Ｎ）で溶出した（第３図）。

免疫反応陽性なエンドセリン分画を集め、第２段階のＲ
Ｒ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８ＴＳＫ−ＯＤＳ−８０Ｔｍ　６．
６Ｘ２５０ｍｍ、　Ｔｏｓｏｈ）にかけた。溶出物を凍
結乾燥した後、０．０５Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃｌ　、　１０ｍ
　Ｍ　Ｈ。

ＰＯ，，２０％イソプロパツール、ｐＨ６，７の溶媒に
溶解した。次いで陰イオン交換ＨＰＬＣ（ＴＳＫ−Ｑｕ
ａｒｄｅｒｎａｒｙ　ａｍｉｎｏ、　Ｇ２００　ＳＷカ
ラム、６Ｘ１０ｏｎ。

Ｔｏｓｏｈ）にかけ、０．０５〜０．２ＭのＮａＣ１を
含む。

上記溶媒で溶出しく第４図）、免疫反応陽性なエンドセ
リン分画をさらにＲＰ−ＨＰＬＣにかけた（第５図）。

再び陰イオン交換ＨＰＬＣにかけ、０．０５〜０．３Ｍ
のＮａＣ１を含む１０ｍＭ　Ｈ，ＰＯ，。

２０％イソプロパツールで溶出した（第６図）。次いで
第５、第６段階のＨＰＬＣを行って免疫反応陽性なエン
ドセリンを精製した（第７図及び第８図）。

３、アミノ酸組成の分析 精製試料（第５図の１ｖ−ＥＴ−１４分画）を６Ｎ−塩
酸で１３０℃、３０分間処理した後、Ｔｏｓｏｈのアミ
ノ酸分析機で分析した。

４、アミノ酸配列の決定 アミノ酸配列はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ＋
ｓ社のＭｏｄｅｌ　４７７Ａで行った。

５、分子量の測定 分子量の測定はＪＥＯＬ、ＬＭＳ−ＨＸＩＩＯＨＦで行
った。

以上の方法により精製した免疫反応陽性なエンドセリン
は、合成したエンドセリン−２とＨＰＬＣでの溶出位置
が合致し分子量は２５４７ダルトン、アミノ酸配列はＸ
−８−Ｘ−Ｓ−５−Ｗ−Ｌ−Ｘ−に−Ｅ−Ｘ−Ｖ−Ｙ−
Ｙ−Ｘ−Ｈ−Ｌ−Ｘ−Ｉ−Ｉ−Ｘと決定され（Ｘは未決
定部分）、ヒトエンドセリン−２と同等の筋収縮活性が
示されたことから、エンドセリン−２と推定された。

見吋叫免果 本発明でＡＣＨＮ細胞を培養することにより、ヒト・エ
ンドセリン−２のみを製造することができ、ヒト・エン
ドセリン−２の大量生産の道が拓けたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明でヒト・エンドセリン−２が得られてい
ることを示すクロマトグラフである。 第２図は各種エンドセリンのアミノ酸配列を比較して示
した図である。 第３図〜第８図は本発明で得られたエンドセリン−２の
カラムクロマトグラムによる精製状況を示す図であり、
第３図は第１段階のＨＰＬＣ１第４図は第２段階のＲＰ
−ＨＰＬＣ１第５図は第３段階のＲＰ−ＨＰＬＣ，第６
図は第４段階の陰イオン交換ＨＰＬＣ１第７図及び第８
図は第５．第６段階のＨＰＬＣに関する図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト腎臓細胞を培養しヒトエンドセリン−２を製
   造する方法。
2. （２）培養上清よりヒト・エンドセリン−２を回収する
   ことからなる請求項１記載の方法。