JPS6344597A

JPS6344597A - 新規基質ペプチド

Info

Publication number: JPS6344597A
Application number: JP62195443A
Authority: JP
Inventors: スチーブン　ポール　アダムス; ルイス　グレイサー; ドウワイト　アーノルド　トウラー
Original assignee: University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1986-08-07
Filing date: 1987-08-06
Publication date: 1988-02-25
Anticipated expiration: 2012-11-12
Also published as: JPH09235295A; AU585167B2; EP0258203A3; DE3751398T2; US4740588A; JP2674753B2; ATE124955T1; CA1308217C; DE3751398D1; EP0258203A2; ES2076933T3; GR3017297T3; AU7662387A; EP0258203B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は新規ペプチドに関する。更に詳細には、本発明
は、５−８個のアミノ酸残基を有し、ミリストイル化酵
素の基質として有用なユニークなペプチドに関する。

く背景技術〉真核生物の特定の蛋白質での脂肪酸アシル化はよく知ら
れた工程であシ、かかる工程は２つに大別することがで
きｂ０即ち、１つは、遺伝子の翻訳後に恐らくゴルジ体
においてパルミテート（Ｃｘ６）が、エステル又はチオ
エステル結合を介して膜蛋白質に結合する工程である。

他の１つは、蛋白質生合成の初期の段階において、ミリ
ステー）　（Ｃ１４）がアミド結合を介し″′ｃ＠解性
の膜蛋白質に共有結合する工程である。Ｎ−ミリストイ
ル化蛋白質においては、アミノ末端グリシン残基がアシ
ル化部位であることが知られている［　Ａｉｔｋｉｎら
、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ−１５０，３１４−３１ｓ　（１
９８２）；３ＱｈｕｌｔＺら、３ｃｉｅｎＯθ２２７．
４２７−４２９ＱＺＯ１Ｂら、Ｊ、Ｂｌｏｌ、　０ｈｅ
ｍ、　２５９．１３３４９−１３３５４（１９８４）；
及びＨｅｎａｅｒａｏｎら、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、
Ａｃａａ、３ｃｉ、ＵＳＡ　８０、３６９−３４３（１
９８３）］。

蛋白質のＮ−ミ＋）ストイル化については、その機ｎ２
がようやく理解され始めたところである。公昶の４つの
Ｎ−ミリストイル化蛋白質として、Ｐ２Ｏ”０？　サイ
クリックＡＭＰ依存性プロティンキナーゼ触媒サブユニ
ット、カルシノイリンＢ−サブユニット及びマウス白血
病ウィルス発癌遺伝子ｇａｇ−ａｂ１融合蛋白質があり
、これらは、プロティンキナーゼあるいは細胞の生合成
経路を調節するホスホプロティンホスファターゼ（カル
シノイリン）の調節因子のいずれかである。ｐ　６０Ｖ
−８ｒ　Ｃについては、膜に結合してその細胞形質転換
能を発現するためには、ミリストイル化が必要であるこ
とが示されている［　Ｃｒｏｓｓら、Ｍｏ１ｅｃ、　（
’４３１１゜Ｂｉ、ＯＬ、４．１８３４−１８４２（１
９８４）；［ａｍｐａら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａａ、　３ｃ１．　ＵＳＡ　　８２．４６２５−４６
２８（１９８５））。

ペプチド合成法により慣用的に合成することのできる比
較的短い合成ペプチドの開発は、同定する上で非常に好
ましり、マた脂肪咳アシル化における酵素活性の調節を
研究する上でも非常に望ましい。このようなペプチドは
、酵母及び哺乳動物細胞のミリストイル化酵素の基質と
して提供される。またこれら合成ペプチドは、天然基質
の極めて特異的な競争的抑制因子として提供されること
もできる。

ミリストイル化反応は以下の如くに表わすことがで＠る
。

ＣＨ３（ＣＨｚ）ｘｚ”ゝＮ−ｇｌｙ−蛋白質＋ＣｏＡ
〈発明の袂旨〉本発明によれば、以下に示すアミノ酸配列からなる群よ
り選ばれたアミノ酸配列を有する、ミリストイル化酵素
の基質ペプチド又はその生理学的忙許容し得るアミド誘
導体もしくは塩誘導体が提供されろ。

Ｇｌｙ−Ｒ−８−Ｔ−Ｗ−Ｘ−Ｙ　　又％＠（こごでＲ
はＡｌａ　、　Ａｓｎ　、　　（）Ｉｎ又はｓｅｒ　；
ＳはＡｌａ　、　Ａｒｇ　、　Ｇｌｎ　、　Ｇｌｕ　、
　ｐｈｅ又はＳｅｒ　；ＴはＡｌａ又はＬ７８　；ＷはＡｈａ又はｓｅｒ　；ＸはＡｌａ　、　Ｔｙｒ　、又はＬｙＢ；ＹはＡｒｇ又
＆’：Ｊ、Ｐｒｏ；ＺはＡｒｇ　＊　　Ｌｅｕ又はＬ７８を表わし、但し５
−Ｔ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−ＺがＡＩａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＡＩＩＬ−Ａｒｇ−Ａｒｇで
あるときＲはＡｓｎでない。）。

これら基質ペプチドの例としては、例えば、Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒなどのペンタペプチド；
Ｇｌｙ−Ａｆｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ４１１Ｌ−Ａｌａな
どのへキサペプ−ＩＦ−）’；　Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌ
ａ−Ａ１１Ｌ−八ｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇなどのへブタペ
プチド；　（）ｌｙ−Ｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
１．ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（ＲはＧｌｎ又はＢａｒを示す
）。

Ｇｌｙ−Ｒ−８−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ　（ＲはＡｌ５Ｌ又はＡｓｎ、Ｓはｋ”ｇ　、　Ｇ
ｌｎ又はｐｈｅを示す）。

Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ。

Ｇｌｙ−Ａｅｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−’］’ｈｙ
−Ｐｒｏ−Ｉ、ｅｕ　。

Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｅ−Ｓｅｒ−Ｉ、ｙｓ−
Ｐｒｏ−４，ｙｓなどのオクタペプチドが挙げられる。

これらペプチドのアミド誘導体としては、カルボキシア
ミドが挙げられ、塩誘導体として１工ＨＣＩ塩が挙げら
れる。

〈発明の詳細な記述〉本発明の新規ペプチドは、慣用的なペプチド合成法を適
当に採用することにより合成することができる。しかし
て、ペプチド鎖に構成アミノ酸を、目的とする配列で付
加して行く一連の縮合反応によって、最終的に目的とす
るペプチド鎖を調製することができる。各種の試薬、即
ち、カルボベンジルオキシ基、ｔ−ブトキシカルボニル
（ＢＯＣ）基などのＮ−保獲基；ジシクロへキシルカル
ボジイミド、カルボニルジイミダゾールなどの縮合剤；
ｌＪ−ヒドロキシフタルイミドのエステル、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドのエステルなどの活性エステルニト
リフルオロ酢酸、ＨＣＩジオキサン溶液、ボロントリス
（トリフルオロアセテート）、シテノデンブロマイドな
どの開裂剤等の各種試薬を使用することはペプチド合成
法ではよく知られたことであり、また単離体と溶液中で
反応させろこと、あるいは中間体のｆ−Ｊ製法もよく知
られた事項である。

本発明のペプチドは、好ましくはよく知られたＭｅｒｒ
ｉｆｉｅｌａの固相支持法［：　ＭＪｒｒｉｆｉｅｌｄ
　、　Ｊ。

Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　５Ｏｃ−８５，２１４９−５
４（１９６３）；３ｃｉｅｎｃａ　　１５０．１７８−
８５（１９６５））忙よジ調製することができろ。この
方法は、同様の化学反応及び典型的なペプチド合成に用
いる保護基を何回も使用する方法ではあるが、この方法
によれば、通常架橋ポリスチレン、スチレンジビニルベ
ンゼンコポリマーなどの固相支持体にそのカルボキシ末
端が固定されたペプチド鎖が得られる。この方法では、
各工程におけろ過剰な試薬を、単にポリマーを洗浄する
だけで除去しているため、多くの操作が簡略化されてい
る。

慣用的なＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄのペプチド合成法の反応
工程を以下に説明する。

（ここで、ＰＳはポリスチレン残基を示す）ム塩との反
応ＯＲ１（ＣＨ３ＣＨ２）Ｎ＋ＨＣＩ″″ ド使用）山り　　　　　　　　　　　　　　　　　＋この工程ｍに
続いて、例えば２５％トリフルオロ酢酸メチレンクロラ
イド溶液などの処理によるｔ　−ＢＯＣの脱保護が行な
われ、次いで過剰のトリエチルアミン処理によりＮ−末
端アミノ基が遊離化され、これにより、次の保護さｉ’
したアミノ酸（Ｒ２）の活性化カルボキシル基との反応
が可能となる。最終工程においては、例えば無水ＨＦア
ニンール沼液による処理により、完成されたペプチドを
ＰＳ樹脂′から脱離せしめる。

確立された同相合成法についての更に評細な技術事項に
ついては、３ｔｅ’Ｅａｒｔとｙｏｕｎｇの論文１固相
ペプナド合成法”、Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃ
ｏ、。

３ａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　、　　ｉ　９６９　；　
１．Ａｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　Ｏ，’）総説Ａａｖａｎｃ
ｅｓ　ｔｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　３２　、　　ｐ
ｐ、　２２１−２　９　６　　、　　Ｆ、　　Ｆ、　　
Ｎ０Ｉ（Ｌ　　、　　　Ｅａ、、　　　Ｉｎｔａｒｓｃ
ｉａｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　、　Ｎｅｗ　ＹＯｒ
ｋ　、　　１９６９　、ｅ及び文献Ｅｒ１ｃｋｓｏＢと
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　、　Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
　、　Ｖｏｌ。

２、　ｐ、　２５５　ｅｔ、　ｓｅｑ、（ｅｃＬ、　Ｎ
ｅｕｒａｔ、ｈとＨｌｌｌ）。

Ａｃａａｅｍｉｃ　ｐｒｅｓ日、）１θＷＹｏｒｋ、１
９７６などを参照することかで＠る。

本発明の好ましい基質ペプチドとしては、Ｇｌｙ−Ａｓ
ｎ−Ｐｈｅ−ＡＬａ−Ａ１１Ｌ−Ａ１１Ｌ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ　。

（）１７−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−
八ｒｇ−Ａｒｇ　ｓＧ’１７−８８ｒ−Ｓｅｒ−Ｌ７Ｂ
−３６ｒ−Ｌ７Ｂ−Ｐｒｏ−Ｌ７Ｂなどが挙げられる。

、これらのすべてのオククペプナドは、０．０４　ｍＭ
　−０，０７ｍｕのＫＩＬＬ値を竹している。

これらペプチドのカルボキシ末端がカルボキサミドの形
態にあるもの、例えは、Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−Ａｇ−Ｎｌ２は、カルボキシレートの形態にある
ものよｐも好ユしい。

後者のオクタペプチドは、失心筋のｃＡＭＰ依存プロテ
ィンキナーゼの６個のアミノ末為残基のうち５個（３番
目の位置のＡｌａの代わシにＰｈｅがある）を含んでお
９、これに続いて２つのフルギニン残基を■している。

かかるアルイニン残基は、（’ａｒｒらによって報告さ
れた（　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７９．　６１　２８−６１　３１　
　（１９８２））Ｎ−末端へブタペプチド配列のりシン
残基に代わるものに相当する。Ｃａｒｒのへブタペプチ
ドは、天然の蛋白質のシアノデンブロマイド開裂断片を
分解して生じろ、ブロックされたトリプシン断片として
得られたものである。内因性の蛋白質は、すでにミリス
トイル化されているため、かかるペプチドをｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏでアシルアクセプターとして使用することはでき
ない。

’Ｉ’ＣＩＷｌ１３ｒとＧｌａｓｅｒによって報告され
た、Ｃ）１７−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌ
ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇの合成オクタペプチド（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、３ｃｉ、３３　。

２８１２−２８１６（１９８６）］を、本発明では標準
コントロールペプチドとして使用して、ミリスチン酸な
、このあるいは他のペプチドの７ミノ末端グリシンに移
動せしめるユニークな酵素活性の同定を行なった。ミリ
ストイル化酵素に対する新規ペプチドの基質活性は、３
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃθ８ｃａｒｅｖｉａｉａｅ　　の
Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシンセターゼ（Ｎ−
ミリストイルトランスフェラーゼ）によって証明するこ
とができる。〔３Ｈ〕−ミリスチン酸のアクセプターペ
プチドへの移動を測定するｉｎ　ＶｉｔｒＯアッセイ法
により、酵素活性を測定した。移動反応は、アデノシン
トリホスフェート（ＡＴＰ　）とコエンデイムＡ　（Ｃ
ＯＡ　）に依存している。高速液体クロマトグラフィー
テ、化学的に合成したミリストイルペプチド標準物質と
共に溶出せしめろことによって、酵素生成物を同定した
。酵素反応生成物と化学的に合成した標準物質とは同一
であり、グリシンに共有結合したミリステートを含んで
いることを証明するために、ＨＰＬＣで精製した標率’
４ｍ負と酵素生成物とをともにプロナーゼで消化し、逆
相ＨＰＬＣで分析した。

両者とも、Ｍ−ミリストイル化グリシンを含んでいた。

本発明のペプチドへのアシルドナーとしてのミリストイ
ルＣＯＡに対して、ミリストイルグリシルペプチドシン
セターゼ酵素は極めて高い特異性を有している。ペプチ
ドのＮ−木端アミノ敵の１番目の位置のグリシンは、こ
の目的のための基質活性に対して臨界的であり、１査目
の位置にアラニンな有するペプチドは、この酵素に対す
る基質として機能しない。また２番目の位置のＬ−アス
ハラｊｒ’Ｔンをアスパラギン酸、ナロシン、フェニル
アラニンあるいはＤ−アスパラギンステレオアイソマー
に置換した場合には、不活性な基質となることも判った
。同様に、Ｎ−末端グリシンを有する短いペプチドある
いは長いペプチドもテストした質、不活性であった。即
ち、以下に示す如きペプチドも不活性な基質であった。

（）１ｙ−Ａｓｎ　。

Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ　。

Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｙｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ　０この最後のペプチド
は、基質として使用することができなかった。またこれ
ら丁ぺては、活性ペプチドＧｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇのミリストイル
化を起こすことが出来なかった。

Ｂａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
プロテアーゼ欠損株Ｊ　Ｒ１５３（Ｈ６Ｈ６ｌｍｍ１ｎ
ら、Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７８　＊　　４３５−４３９　（
１９８１）　）を、Ｎ−ミリストイルグリシルペプテド
シンセタ−ゼの原料として用いて、オクタペプチドのア
シル化を証明した。この酵母を（３Ｈ”Ｊ”ｌＪスナン
酸でラベル化し、細胞を溶解し次いでドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドｒル電気泳動（ＳＤＳ　−Ｐ
ＡＧＥ　）で細胞蛋白鋼を分析した所、この株は内因性
のＮ　−ｚ　’）ストイル化蛋白質な舊していることが
判った。プロナーゼで消化し、分離し次いで逆相ＨＰＬ
Ｃで分析することにより、Ｎ−（３Ｈ）ミリストイル化
グリシンを、ラベル化した内因性のアシル化蛋白質から
単離することができた。

ＢＣ３Ｈ１細胞（５ｃｌｌｕｂｅｒｔ　　らの報告した
マウス筋肉セ、ｖライン（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂ１０１
．６１　＊　　３９８−４１３（１９７４）］を用いて
、同様にして、より高度な真核生物の細胞内に存在する
Ｎ−ミリストイル化酵素によるオクタペプチドのアシル
化を証明した。

以下に、本発明を実施例を用いて更に詳細に説明するが
、本発ＩＭはこれら実施例になんら限定されるものでは
ない。

実施例１本明細書に示す全てのペプチドは、比較基質である標準
コントロールペプチドの以下に記載した製造方法に１本
質的に従って調製した。

Ａ、　　Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２の合成）Ａｅｒｒｉｆｉｅｌｄの方法［：　Ｒ，Ｂ、Ｍｅｒｒ
ｉｆｉｅｌｄ　ｈ　Ｊ。

Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、　、　８５　、２１４
９−２１５４（１９６３）〕に従い、樹脂１ｇ当り０．
３５ｆｉＪのアミノ基を置換基として有するｐ−メチル
ベンズヒドリルアミン上にペプチドを合成した。ＢＯＣ
で保腹したアミノ酸を用い、このアミノ酸とジクロロへ
キシルカルボジイミドとを２：１の割合でジクロロメタ
ン中で１５分間混合して対称性の無水物を形成した。浴
媒を減圧下に留去し、無水物をジメチルホルムアミドに
再溶解して、樹脂と混合し、次いで１時間激しく攪拌し
た。アスパラギンとの反応では（グルタミン、アルギニ
ノの場合モ同様）、等モル（アミノ酸に基づく）のヒド
ロキシベンゾトリアゾールを反応混合物中に加えた。

ＢＯＣ保穫基を、５０％トリフルオロ酢酸（ＴＦ’Ａ　
）のジクロロメタン溶液を用いて脱離せしめ、アミノ酸
との縮合反応を行なう前に、１０％ジイソプロぎルエチ
ルアミンのジメチルホルムアミドＰＭ　？ａで中和した
。

ペプチドを樹脂から脱離せしめ、液体ＨＦ／アニソール
（９：　１　、　Ｖ／Ｖ　）を用いて０　’Ｃで１時間
で脱保護せしめた。粗ペプチドを、５ｏ％酢酸水浴液で
樹脂から抽出し、凍結乾燥した。

Ｂ、精製粗ペプチドを水に浴解し、ｗａｔｅｒｓ　μｍＢｏｎｄ
ａｐａｋＣ１Ｂカラム（１９朋ｘ　１５０　ｍｒｐｔ　
）　ｋＣ付し、０−１５％アセトニトリルＣ０，０５％
ＴＦＡ　）　ｔｖ水ｆｅｒｎ（０，０５％ＴＦ’Ａ　）
の勾配で、流速９　ｍｌ　／　ｍｉｎで１５分間溶出せ
しめた。生成物を含む画分を集めて凍結乾燥し、ペプチ
ドの同定及び純度ｙ１１定全、アミノ酸分析、ＨＰＬＣ
によ）行なった。

実施例２酵母（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株、、ｒＲ１５３，
９配型ａｌｐｈａ、　ｚｒｐｌ、　ｐｒｄｌ、　ｐｒｃ
Ｌ　ｐｅｐ　４−３　）を、ロータリーシェーカーのＹ
ＰＯ培地（１係酵母抽出物、２％バタトペゾトン、２％
デキストロース蒸留水浴液）中で６０°Ｃで生育せしめ
て、光学密度が６６０　ｎｍで１−３となるようにした
。酵母培養液の１５ｍＪアリコートを、〔３Ｈ〕脂肪酸
１　ｍＣｉのエタノール溶液１０μｌを加えて同様の条
件下で３０分間ラベル化した。ラベル化反応の終シに、
培養液を氷で５分間冷却し、４℃で７６００　ｘｇで１
０分間遠心してａ＠をペレット化した。次いで細胞を、
ｉ　Ｑ　ｍＭ　ＮａＮ３の１４０　ｍＭ　Ｎａ（Ｊ　／
　１０二Ｍホスフェート浴液（ｐＨ７，２）１ｍＪに再
懸濁せしめ、ポリプロピレン製の円椎状の１．５凝遠心
チユーブに移し、４℃で上記したと同様にして遠心して
細胞を集めた。上清液を捨て、細胞を、５ＩｎＭＴｒｉ
ｓ　（ｐＨ７，４）、３　ｍＭジスレイトール、１％Ｓ
ＤＳ及ヒ１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド
を含む溶液１００μｌに懸濁し、氷で冷却しながら、６
０秒間の渦動を６回行ない、細Ｉ＠１個と等容量の０．
５１がラスビーズで細＠を崩壊した。テーブルトップ（
ｚａｂｌｅ　ｚｏｐ　）　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機で
８００　口ｘｇで６０秒間遠心して細胞の破片を除いた
。次いで、上清液を、８Ｉ１１ＭＴｒｉｓ　（Ｐ）１８
．０　）　１２　Ｓ　ｐｉ中で、室温下１時間、２０ｍ
Ｍヨードアセトアミドによジアルキル化した。２０μ！
アリコート１Ｄ１慣用的５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び０１ｓｏ
ｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５９．５３６４’−
５３６７（１９８４）に記載されたと本質的に同様のフ
ルオログラフィー法によシ分析した。

還元され且つアルキル化された、〔３Ｈ〕脂肪酸ラベル
化蛋白負２０μｌ　を、新たに調製した４Ｍヒドロキシ
ルアミン／　２０　ｍＭ　クリシフ（ｐｉ（１０）７μ
！で処理した。２６℃で４時間処理後、電気泳動用及び
上記したフルオログラフィー用にサンプルを調製した。

ＪＲ１５３の２　［１，０００ダルトンのアシル蛋白質
への、〔３Ｈ〕ミリスチン酸のヒドロキシルアミン安定
化結合を測定するため、脂肪酸を加える前にセルレニン
２μｇ／ｍｌで１５分間細胞を処理する以外は前記した
と同様にして培養液をラベル化した。

セルレニンは、酵母の脂肪酸合成の抑制因子として知ら
れたものであＪ、ＪＲ１５３の特定のアシル蛋白質のラ
ベル化を数倍に促進するものである。

次いで細胞蛋白質を調製し、前記したと同様にしＣＳＤ
８１２％ポリアクリルアミドデル電気泳動によシ分離し
た。この時、サンプルレーンに隣接して、あらかじめ発
色した分子量標準蛋白質を同時に電気泳動に付した。電
気泳動後１．２０，０００ダルトンの分子量領域におけ
る、未乾燥デルサンプルレーンから、２龍のゲルスライ
スを切シ出した。

ケ９ルスライスを、１０ｃｌ）メタノール水’Ｒ１ａ　
０．５　ｍｌで素早くリンスし、次いで、Ｌａｂｑｕａ
ｋｅミキサー（Ｌａｂｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、　Ｂｅｒ
ｋｌｅｙ、　４Ａ）で混合しながら５　Ｑ　ｍＭ　＠炭
酸アンモニウム１廐中で、６７°Ｃで７２時間、プロナ
ーゼＥ　（Ｓｉｇｍａ、　ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ。

Ｋ１０）１〜を用いてそれぞれ消化した。微生物の生育
を抑えるために、消化１検体轟夛、１μｌのトルエンを
加えた。２４時間後に、新たなプロナーゼＥ１ｆｆｌｆ
を加えた。消化後、それぞれの消化体のアリコートにつ
いて放射活性を測定した。放射活性を有するスライスか
ら消化体を除き、ｒルスライスを０．１％ＳＤＳ　５０
０μノ　で１回リンスし、消化体とリンス４４合わせ、
４　ＮＨ（Ｊ　４０μｌで−１−２とした。酸性化され
た溶液を、クロロホルム−メタノール（２：　１　＋’
Ｖ／ｖ）ｉ、５ｆｆｉｌで２回抽出した。有機層を集め
て、クロロホルム−メタノール−〇、０１ＮＨＣＪ（１
：１０：１０．ｖ／ｖ／ｖ）で１回洗浄し、有機層を窒
素気流で乾燥した。得られる残渣を、５０％メタノール
−５０％ＨＰＬＣバッファーＡ（後記参照）に再溶解し
た。抽出操作後に、もとの蛋白質消化体の放射活性の９
７％が回収された。サンプルを、Ｗａｚｅｒｓ　μｍＢ
ｏｎｄａｐａｋＣ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣに付
し、バッファーＡとして０．１係トリフルオロ酢酸１０
．０５％トリエチルアミン水浴液、バッファーＢとして
０．１係トリフルオロ酢酸のアセトニトリルｈａを用い
１分間当シ１％のアセトニトリル景が上昇する勾配で流
速１ｒｎｌ　／　ｍｉｎで溶出せしめた。１分間のフラ
クションヲ集め、液体シンチレーションカクンターで放
射活性を測定した。ミリストイル−〔３Ｈ〕グリシン標
準物質は、ＴｏｗｌｅｒとＧｌａｓｅｒ　。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｚｒｙ２５ａ　８７８−８８４（１
９８６）に記載されたと本質的に同様の方法によシ合成
し前記した如くにしてＨＰＬＣで分析した。

脂肪酸アシル化ペプチド標準物質の合成放射活性を有す
る対称性のミリスチン酸あるいはパルミチン酸の無水物
と、（）ｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ　−Ａ
ｌａ　−Ａｒ　ｇ−Ａｒ　ｇとをビリシン中で反応せし
めてアシル化ペプチド標準物質の合成を行った。〔３Ｈ
〕脂肪酸１Ｑ　Ｑ　ｚｃｉを、それぞれの脂肪酸クロラ
イド４μｊで処理し、次いでそれぞれの非放射活性脂肪
酸４．８ηを含むピリジン１５０μ！中にＭ＆′せしめ
た。２６６Ｃで６０分間反応を進行せしめた。

次いで、この溶液の６５　ｔｔｌを、Ｇｌｙ−Ａｓｎ−
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ　４
００−５００Ｍｇに加えた。Ｌａｂｑｕａｋｅミキサー
で混合しながら、反応を１晩進行せしめた。次いで、ピ
リジンを減圧下に留去し、得られる残渣を石油エーテル
０．６Ｍで２回抽出し、５０％メタノール水溶液４００
μｌに再溶解した。反応生成物を精製し、前記したと同
様にして逆相ＨＰＬＣで分析した。化学合成標準物質と
酵素生成物とは、いずれもプロナーゼＥで消化された。

またこれらを、前記したと同様にして２０．０００ダル
トンのアシル化蛋白質について逆相ＨＰＬＣで分析した
。但しこの場合消化を完全に行なうためにはプロナーゼ
２００μｇで十分であった。

酵母培養物を、前記したと同様にして生育せしめて、６
６０　ｎｍでのＯ，Ｄ、を１−３とした。培養液４Ｑｔ
ｎｌを、４６Ｃで７６’００　ｘｇで１０分間遠心して
細＠を集めた。上清液をデカンテーションし次いで、冷
却した１　０ｍＴｒｉｓ　（ｐ）１７．４　）　ｉＵに
細胞ペレットをピペットで移し、次いでポリプロピレン
製の円椎状の１．５Ｍ遠心チューブに移して４°Ｃで７
６００　ｘｇで１０分間遠心し℃、ＭＪｉ＠を再びペレ
ット化した。次いでａＵ＠を、コールドアツセイ溶解バ
ッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｌｓ　（ｐＨ７，４）ｔｉｍ
Ｍジテオスレイトール、０．１ｍＭエチレングリコール
−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ。

Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＣ）ＴＡ　）及び１０
μ９／ｍｌ　７ゾロテニン〕４００μｌにピペットで移
して再懸濁せしめた。０．５前がラスビーズ約４００μ
ｌを、再懸濁した細胞に加え、前記した放射活性ラベル
化細胞の崩壊の時と同様にして渦動せしめて細＠を溶解
した。ビーズが静置後、溶解物を集め、細胞の破片を、
４℃で１０００　ｘｇで１０分間遠心して除いた。次い
で上清液を、ＢｅＣｋｍａｎ７５ＴｉＯ−ター中で、４
℃で４５．０００　ｒｐｍで６０分間遠心した。上清液
を除き、粗膜ペレットを、コールドアッセイ溶解バッフ
ァー４００μｌにピペットで移して再懸濁した。３つの
細胞フラクションのアリコートについて、すぐに分析す
るかあるいは一６０°で保存した。粗膜ペレットの活性
は、−６０°で少なくとも３ケ月間安定であった。

蛋白質はＰｅｚｅｒｓｏｎの方法（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　８３１６４６−３５６（１９７７））によシ
測定した。

Ｎ−ミリストイルグリシルペプテドシンセターセゞ活性
の分析以下の如くにして、〔３Ｈ〕脂肪酸アシル化ＣｏＡを酵
素的に合成し、インキュベーション体に加えた。アシル
ＣｏＡシンセターゼ反応は以下のものから構成される（
アッセイチューブ１個当り）。即ち、〔３Ｈ〕ミリスチ
ン酸０．５μＣｉ；２ＸアツセイバツフアーＣ２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ　（ｐｉ（７，４）　、　２ｍＭゾテオスレイ
トール、　１０　ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ２　、’　０．２　ｍ
ＭＥＣ）ＴＡ　〕２５　ｔｔｌ　；　５　ｍＭ　Ａ’［
’ｐ蒸留水浴液５μ）（ＮａＯＨでｐｉ−１７，０に調
ｕ　）　ｙ　２０　ｍＭリチワムＣｏＡの蒸留水浴液２
．５　ｐｉ　；　ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓアシルＣｏＡ
シンセターゼ１ｍＵ　／　μｉの５　［１ｍＭ　Ｎ　−
２−ヒドロキシエチルヒヘラジンーＮ’−２−エタンス
ルホン酸浴液（阻７．３　）　１５μｌ：及び蒸留水２
．５μｌから構成される。反応を３０°Ｃで２０分間進
行せしめた。Ｈｏ５ａｋａらの方法［Ｍｅｚｈ、　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ、　７’Ｉａ３２５−３３３（１９８１））
の変法によ）測定した所、典型的には〔３Ｈ〕脂肪酸の
４０％−５０係が、この方法にニジそのＣｏＡエステル
に変換された。この変法は、６　ＮＨＣＪでｐ）１２．
０に酸性化し、５倍容量のヘプトンで６回抽出後に、反
応液中に残存する放射活性を測定して分析する方法であ
る。

この反応液５０μノヲ、アッセイ抽出バッファー（前記
参照）　４０　ｔｉｌｌ及び１　ｍＭ　Ｇｌｙ−Ａｓｎ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ　
１０　ｐｌを含むチューブに加えた。チューブ１個当シ
酵母細胞抽出物１０μｌ（典型的には蛋白質５０μ９）
を加えて６０℃で１０分間インキュベーションしてアッ
セイを開始した。１チユーブ当υメタノール１１０μｌ
及び１００％トリクロロ酢酸（ｗ／’ｖ　）　１０　ｔ
ｔｌ　ｔ−加えて氷で１０分間冷却してアッセイを終止
した。沈誠した蛋白質を、テーブルトップＥｐｅｎｄｏ
ｒｆ遠心機で８０００　ｘｇで６会商遠心して除いた（
この条件下では、合成Ｃ’ＨＩ　ミリストイルペプチド
あるいは〔３Ｈ〕バルミトイルペプチドの９５％は、ア
ッセイ混合物に加えた時溶解した１まである）。

上清液５０μｌを、メタノール７５μｌ及びＨＰＬＣバ
ッファーＡ　７５　μｉと混合し、３０　ＧｒｒＬＷａ
ｚｅｒｓ　μｍＢｏｎｄａｐａｋ　ＣＢカラムの６．９
目及び前記したと同じＨＰＬＣバッファーを用いて逆相
ＨＰＬＣによシ分析した。３５％アセトニトリルで溶出
をスタートし、次いで１分間当り１％のアセトニトリル
量が上昇する勾配で溶出せしめた。１分間のフラクショ
ンを集め、それぞれのフラクションの放射活性を、液体
シンチレーションカウンターで測定した。

〔３Ｈ〕−ミリストイル−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇは２４分後に溶
出し、〔３Ｈ〕バルミトイル−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇは３０分後
に浴出した。

結果前述した如くにして調整した［３Ｈ）　−ミ！ｊストイ
ルグリシルペプチド及び〔３Ｈ〕バルミトイルグリシル
ペプチドの化学合成標準物質は、サンプルの分析と同様
の条件下で、逆相ＨＰＬＣカラムから、それぞれ５９％
アセトニトリル、６５％アセトニトリルの時に浴出した
。細胞溶解調製物は、粗膜７ラクシヨンと溶解フラクシ
ョンに分別きれ、Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシ
ンセターゼ活性は、粗膜フラクションと溶解フラクショ
ンの両者で検出された。全比活性、溶解フラクションの
比活性及び膜フラクションの比活性は、それぞれ１０分
間アッセイでの蛋白質１μｇ当！Ｄ、１４１０゜１３２
０　、２２６０　ｄｐｎであった。最初の反応速度から
判断して、活性の６５％は粗膜フラクション中に存在し
ているものと考えられる。

酵素反応生成物と化学的に合成した標準物質〔３Ｈ〕−
ミリストイルペプチドは、同じであシ、グリシンに共有
結合したミリステートラ有していることが、前記した逆
相ＨＰＬＣで分析した時に証明された。

ペプチド基質に対するＮ−ミリストイルグリシルペプチ
ドの特異性を証明するために、他のグリシルペプチドが
（）ｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ａｒｇ−Ａｒｇのアシル化を競争的に抑制する能力を調
べた。

下記する表Ｉのテスト１から明らかなように、１ｍＭジ
ペプチド、１ｍＭテトラペプチド、１ｍＭデカペプチド
のいずれも、１８μＭペグチドのミリストイル化に対し
て何んらの効果も及はさなかった（約匂のｎ値）。しか
して、Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシンセターセ
゛は、オクタペプチド基質に対して特異性を示すことが
判る。

表−■ ミリストイルペプチドのテ　ス　ト　　　　　合成速度ＤＰＭＸ１０３／１０　ｍ１ｎ１　コントロール　　　　　　　　　　１１１−　ＡＴ
Ｐ　　　　　　　　　　　　　　　９−　ＣｏＡ　　　
　　　　　　　　　　　　１２　コントロール　　　　
　　　　　　　　８３加熱した膜フラクション　　　　
　　　２（５ｍ１ｎ／６５°）３　コントロール　　　　　　　　　　　２６．７＋　
ｉ　ｍＭ　ＧＮ　　　　　　　　　　　　２８．０＋　
１　ｍＭ　ＧＰＲＰ　　　　　　　　　　２５．６＋　
１ｍＭ　Ｇ５５ＫＳＰＫＤＰＳ　　　　　　２７．４酵
母からの粗膜７ラクシヨンを用いて上記表１の如く変化
せしめて、前記した如くにしてアッセイを行なった。テ
スト１では、アッセイのＡＴＰ及びＣｏＡに対する依存
性を、外因性の脂肪酸ＣｏＡ　リが一ゼの非存在下にテ
ストした。テスト２では、酵母の酵素は熱に不安定であ
ることが証明されており、テスト３では、Ｎ−末端グリ
シンを含む他のペプチドでは反応は抑制されないことが
証明されている。このテストでは、可能な抑制効果を最
大限に発揮せしめるために、通常用いる９０μＭではな
く１８μＭのペプチド基質を用いて測定した。

実施例６実施例１と本質的に同様にして、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ
の固相法によシ、本発明の他のペプチドを合成し次いで
酵母（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＪＲ１５３）のミ
リストイル化酵素に対する基質としての活性をテストし
た。アッセイチューブ１個当夛（３ＨＥ−ミリスチン酸
１μＣ１を用いる以外は、実施例２のアッセイ条件と同
様にして、酵素に対するペプチド基質の特異性をテスト
した。本実施例で用いた酵母の酵素は、酵母の培養細胞
の粗ホモゾエネートを５１−７０％（ＮＨ４）２８０４
で分別し、ＢＥＡ五−セファロース［Ｆ］ＣＬ−（ＳＢ
（ファルマシャ）を用いたイオン又換カラムクロマトグ
ラフィー次いでＣｏＡ　−アがロースアフィニティーマ
トリックス（ファルマシア）を用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーで部分精製して得たものである。ペプ
チドは衣用に示すように、それぞれの動力学的データＫ
ｎ１　ｎ　”ｍａＸ　Ｋよシ特徴付けを行なった。

＊：標準コントロールオクタペプテＰのＶｍａＸは、部
分精製した酵母の酵素１ＴＩＬｇ当）の１分間（（形成
されるミリストイル化ペプチドの量２８４０ｐｍｏｌで
あった。

実施例４ＢＣ３Ｈｌマウスの筋肉細胞から、寿だミリストイル化
酵素に対するオクタペプチド基質特異性金、実施例２と
類似の方法によυ、いくつかのオクタペプチドについて
テストした。このマクス筋肉細胞は、０１ｓｏｎら、Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５８　、２６４４−２
６５２（１９８３）に記載されたと本質的に同様の方法
によシ培養した。酵素のアッセイは、マウス筋肉細胞か
ら得た、核のない上？＃液のフラクションを用いて実施
した。トリクロロ酢酸−メタノールアッセイ上消液の５
０μｌについて、実施例２と本質的に同様にしてＨＰＬ
Ｃで分析した。

衣１では、このテストにおけるオクタペプチド基質の特
異性が示されている。

表１の標準コントロールペプチド（＊印を付けた）及び
最後のオクタペプチドは、他の３つのオクタペプチドに
比べて極めて高い活性を示した。

他の６つのオクタペプチドは、バックグランドＤＰＭ　
（１分間当シの分解量）に比べ１本質的に不活性であっ
た。

本明細書に用いたアミノ酸の略号は以下に示す意′＃、
を有する。

Ｌ−アラニン　　　　　　　Ａｌａ又はＡＬ−アルギニ
ン　　　　　　Ａｒｇ又はＲＬ−アスパラギン　　　　
　Ａｓｎ又はＮＬ−アスパラギン酸　　　　Ａｓｐ又は
ＤＬ−グルタミン　　　　　　Ｃ）Ｉｎ又はＱＬ−グリ
シン　　　　　　　Ｇｌｙ又はＧＬ−ロイシン　　　　
　　　Ｌｅｕ又はＬＬ−リシン　　　　　　　　Ｌｙｓ
又はＫＬ−フェニルアラニン　　　Ｐｈｅ又はＦＬ−プ
ロリン　　　　　　　Ｐｒｏ又はＰＬ−セリン　　　　
　　　　Ｓｅｒ又はＳＬ−チロシン　　　　　　　Ｔｙ
ｒ又はＹＬ−バリン　　　　　　　　Ｖａｌ又はＶ本明
細書の記述から、本発明の精神及び範囲内での他の例は
、当業者にとって明らかであろう。

そしてかかる例も、不明ｍＵ替の特許請求の範囲内のも
のである。しかして、本明細書に記載した如き、ミリス
トイル化酵素に対する基質としての生物学的活性に不利
な、あるいは決定的な影響を及ぼさない限り１０個々の
アミノ酸及び／又はペプチドの長さを変えることは任意
であり、こ７１らの変化したものも、本明細書の特許請
求の範囲内のものである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）以下に示すアミノ酸配列からなる群より選ばれた
アミノ酸配列を有する、ミリストイル化酵素の基質ペプ
チド又はその生理学的に許容し得るアミド誘導体もしく
は塩誘導体：【アミノ酸配列があります】又は【アミノ酸配列があります】（ここでＲはＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＳｅｒ；Ｓは
Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ又はＳｅｒ；ＴはＡｌａ又はＬｙｅ；ＷはＡｌａ又はＳｅｒ；ＸはＡｌａ、Ｔｙｒ、又はＬｙｓ；ＹはＡｒｇ又はＰｒｏ；ＺはＡｒｇ、Ｌｅｕ又はＬｙｅを表わし、但しＳ−Ｔ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−ＺがＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒである
ときＲはＡｓｎでない。）。
（２）以下に示すアミノ酸配列を有する特許請求の範囲
第１項記載の基質ペプチド：Ｇｌｙ−Ｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ（ここでＲはＧｌｎ又はＳｅｒを表わす）。
（３）ＲがＳｅｒである特許請求の範囲第２項記載の基
質ペプチド。
（４）ＲがＧｌｎである特許請求の範囲第２項記載の基
質ペプチド。
（５）以下に示すアミノ酸配列を有する特許請求の範囲
第１項記載の基質ペプチド：Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ。
（６）以下に示すアミノ酸配列を有する特許請求の範囲
第１項記載の基質ペプチド：Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ。
（７）以下に示すアミノ酸配列を有する特許請求の範囲
第１項記載の基質ペプチド：Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｅ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｙｓ。
（８）以下に示すアミノ酸配列を有する特許請求の範囲
第１項記載の基質ペプチド：Ｇｌｙ−Ｒ−Ｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ（ここでＲはＡｌａ又はＡｓｎ、ＳはＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＰｈｅを表わす）。
（９）ＲがＡｓｎであり、ＳがＰｈｅである特許請求の
範囲第８項記載の基質ペプチド。
（１０）アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ａｌａを有する特許請求の範囲第１項記載の
基質ペプチド。
（１１）アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｓｅｒを有する特許請求の範囲第１項記載の基質ペプ
チド。
（１２）特許請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか１
項記載のアミノ酸配列となるようにアミノ酸を縮合せし
めることを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第１１項
のいずれか１項記載の基質ペプチドを調製する方法。